Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55591

⸱

5 lipca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute, 3Singapore National Eye Center, 4Duke-NUS Medical School, 5Yong Loo Lin School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Streszczenie

Tradycyjnie, cytologia powierzchni oka jest badana za pomocą technik takich jak technologia szpatułkowa i technologia szczotek. Problem z tymi technikami polega na tym, że mogą one wywoływać zmiany pourazowe na powierzchni oka, które mogą prowadzić do bliznowacenia, deformacji powiek, niedoboru rąbkowych komórek macierzystych, a w niektórych przypadkach powodować duży dyskomfort u pacjenta. Aby uniknąć tych problemów klinicznych, opracowano cytologię wyciskową (IC) w celu diagnozowania zespołu suchego oka, a później nowotworów, choroby atopowej, wiosennego zapalenia rogówki i spojówki. Zazwyczaj klinicyści ręcznie tną bibuły filtracyjne do wymaganych kształtów i nakładają je na powierzchnię oka. Tutaj opisujemy, jak wykonać IC za pomocą dostępnego na rynku urządzenia medycznego. Technika ta została wyjaśniona tutaj, a następnie następuje immunofenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej. Ta technika wymaga mniej ręcznej obsługi i powoduje mniej obrażeń powierzchni oka.

Wprowadzenie

Cytologia wyciskowa (IC) została po raz pierwszy przeprowadzona w 1977 roku przez Thatcher et al1. Do pobrania komórek spojówek od pacjentów użyto plastikowego krążka wyciskowego, zamiast innych technik dostępnych w tamtym czasie, takich jak skrobanie, pobieranie wymazów lub pipetowanie1. Obecna technika IC wykorzystuje chłonną bibułę filtracyjną 2 do odciskania spojówki opuszkowej i powiekowej oraz zbierania najbardziej powierzchownej warstwy komórek spojówki. Komórki te, osiągnąwszy końcowy etap różnicowania, są nieustannie wylewane do łez3. W próbkach IC znaleziono trzy główne populacje komórek: komórki nabłonkowe4, komórki kubkowe3,5, oraz tkanka limfatyczna związana z błoną śluzową, tj. efektorowe limfocyty T związane z nabłonkiem lub komórki dendrytyczne6. Komórki powierzchni oka w próbkach IC można analizować za pomocą mikroskopii, blottingu immunologicznego i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR)7. Cytometria przepływowa została ostatnio wykorzystana do analizy komórek odpornościowych zebranych przez zeskrobanie błony IC8. Co ciekawe, IC6,9 był używany do oceny wielu chorób powierzchni oka, w tym zapalenia rogówki i spojówki, niedoboru witaminy A, pemfigoidu bliznowacieliowego, choroby atopowej, limbicznego zapalenia rogówki i spojówki górnej, wiosennego zapalenia rogówki i spojówki oraz metaplazji płaskonabłonkowej. IC został również wykorzystany do oceny wpływu noszenia soczewek kontaktowych, wykrywania drobnoustrojów powierzchni oka oraz testowania skuteczności terapeutycznej i tolerancji interwencji terapeutycznych w badaniach podłużnych10,11,12.

Wyrób medyczny (EyePrim) jest wspierany przez rodzaj membrany 0,2 μm z polieterosulfonu (PES), która została wcześniej zatwierdzona do techniki cytologii wycisku oka z cytometrią przepływową (OSIC-flow) i otwiera możliwości wykorzystania pobierania próbek podłużnych do monitorowania postępu choroby i odpowiedzi na leczenie (np., szczegółowa analiza leukocytów śródnabłonkowych zdefiniowanych jako domniemane markery choroby postępującego zwłóknienia spojówek w pemfigoidzie błony śluzowej)13. Pierwsi badacze używali autoklawowanych filtrów PES, które wymagały ręcznego wycisku. W rezultacie wydajność była zmienna i zależna od użytkownika. Zaletą tego urządzenia medycznego jest łatwość użycia, standaryzowane ciśnienie (Pa lub N/m2) oraz możliwość powtarzalności, odtwarzalności i konsekwentnej regeneracji komórek. Ta technika jest przydatna w przychodni, ponieważ jest niechirurgiczna, łatwa do wykonania i szybka. Jest to wyrób medyczny klasy I (sterylny) zgodnie z dyrektywą 93/42/CEE, CE 0499 (SNCH). Wymaga jedynie znieczulenia miejscowego podczas zabiegu, co zapewnia zachowanie integralności powierzchni oka. Po IC komórki mogą być natychmiast przetworzone do cytometrii przepływowej. Ponadto możliwe jest przeszkolenie techników niebędących okulistami i pielęgniarek w zakresie pobierania próbek z powierzchni oka.

Pomimo ulepszenia IC w stosunku do innych technik, nadal pozostaje kilka wyzwań. Na przykład mogą występować różnice wynikające z obszaru pobierania próbek i różnic regionalnych w spojówce opuszkowej w zależności od położenia IC. Innym źródłem zmienności jest stosowanie różnych wartości ciśnienia podczas IC. Inne kwestie metodologiczne wiążą się ze standaryzacją przetwarzania komórek: dotyczą one czasu trwania i metody utrwalania oraz warunków ewentualnego przechowywania, co może mieć wpływ na stabilność pobieranego materiału.

Ogólnym celem tej techniki jest opracowanie metody izolacji próbek wycisków ocznych, która jest łatwa w użyciu, nieinwazyjna i może być zastosowana do immunologicznej charakterystyki próbek klinicznych.

Protokół

Wszystkie próbki oczu użyte w tym badaniu zostały pobrane z Kliniki Suchego Oka w Narodowym Centrum Okulistycznym w Singapurze, zatwierdzonej przez SingHealth Centralized Institutional Review Board i Nanyang Technological University Institutional Review Board, Singapur.

UWAGA: Badani przeszli testy kliniczne w celu oceny stopnia stanu zapalnego i nasilenia dysfunkcji łez przed wykonaniem IC. Testy kliniczne obejmowały nieinwazyjny czas rozpadu łez (NI-TBUT)14 i zaczerwienienie spojówek (przekrwienie)15,16 oceniane za pomocą przyrządu diagnostycznego, test Schirmera17, standardowy kwestionariusz oceny suchości oczu (SPEED) przez pacjenta18 oraz barwienie rogówki19.

1. Pobieranie próbek oczu przez IC

  1. Po ustaleniu stanu klinicznego należy znieczulić oczy uczestnika, nakładając 1-2 krople znieczulenia miejscowego, chlorowodorku proparakainy, na spojówkę opuszkową górną i sklepienie dolne. Odczekaj 4 - 5 minut, aż uczucie pieczenia środka znieczulającego ustąpi.
  2. Pobrać próbki zarówno z spojówki opuszkowej nosa, jak i skroniowej za pomocą dwóch urządzeń do cytologii wyciskowej.
    UWAGA: Jedno urządzenie służy do pobierania dwóch próbek wyciskowych. W tym przypadku wykorzystano dwa urządzenia do pobrania czterech membran wyciskowych.
    1. Umieść urządzenie do cytologii wyciskowej stycznie na spojówce. Delikatnie naciśnij przycisk i przytrzymaj przez 2 - 3 s.
      UWAGA: Do urządzenia dołączona jest membrana. Ciśnienie jest zwalniane automatycznie po naciśnięciu przycisku. Wystarczy kilka sekund, aby zwolnić ciśnienie i wyjąć urządzenie.
  3. Uwolnić membranę do probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml pożywki hodowlanej (pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% penicyliny-streptomycyny (Pen Strep)) za pomocą skalpela.
  4. Odizolować komórki od błony urządzenia poprzez ciągłe skrobanie przez około 1 minutę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.
    UWAGA: Skrobanie jest zakończone, gdy powierzchnia membrany stanie się nierówna. Liczba komórek z każdej błony jest zmienna (100 - 500 komórek/błonę). Próbki należy przetworzyć w ciągu 2 - 3 godzin od pobrania.

2. Immunofenotypowanie komórek metodą cytometrii przepływowej

  1. Odwirować komórki przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia pożywki. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 50 μl buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) + 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)).
  2. Wybarwić komórki panelem przeciwciał (np. CD3 fiolet brylantowy (BV) 510 (UCHT1), CD4 allofikocyjaninę-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 fikoerytrynę (PE)-A, CD45RO PE-cyjaninę 7 (PE-Cy7)-A i żywy/martwy znak komórki 7-ADD) w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 minut w ciemności. Przeciwciała należy stosować bezpośrednio z zapasu zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Do pomiaru stężenia przeciwciał należy użyć 2,5 μl CD3-BV510, 1,25 μl CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD i 10 μL CCR7-PE. Użyć komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) do miareczkowania różnych stężeń przeciwciał. Do miareczkowania należy przyjąć stężenie przeciwciał wymienione w protokole producenta i użyć połowy i jednej czwartej zalecanego stężenia. Stosować minimalne stężenie przeciwciał, aby uniknąć rozlania się na inne kanały fluorochromowe. Zaobserwowano wyraźne sygnały przy wspomnianych stężeniach przeciwciał. Kompensacja została przeprowadzona poprzez testowanie PBMC początkowo zgodnie z protokołem wspomnianym w Williams i wsp. 20 Do testów, PBMC inkubowano z tym samym zestawem przeciwciał, co tutaj, i kompensowano je poprzez porównanie pojedynczych i wielokrotnych barwień przeciwciał.
  3. Po okresie inkubacji dodać 1 ml buforu barwiącego do probówki, dobrze wymieszać i odwirować przy 450 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego.
  4. Uruchom próbki na maszynie do cytometrii przepływowej.
    1. Przed uzyskaniem danych skalibruj napięcia kanału cytometru przepływowego za pomocą koralików do ustawiania i śledzenia cytometru (CS&T), aby znormalizować akwizycję danych w różnych dniach zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych cytometrii przepływowej, kliknij przycisk "Konfiguracja i kontrola jakości", wybierz prawidłowy numer partii koralików CS&T, załaduj kulki, a następnie kliknij przycisk "Start".
    2. Ponownie zawieś komórki, delikatnie stukając w rurkę przed załadowaniem próbek do maszyny. Otwórz oprogramowanie do zbierania danych i kliknij "Podgląd". Gdy stawka progowa jest stabilna, kliknij "Acquire". Monitoruj poziom próbki i kliknij "Stop", gdy próbki się wyczerpią.
      UWAGA: Uzyskaj 10 000 zdarzeń na próbkę.
    3. Po uzyskaniu 10 000 zdarzeń wygeneruj wykres punktowy SSC-A i FSC-A w arkuszu.
      1. Kliknij przycisk "Brama wielokątna" i narysuj bramkę (jest to P1) nad wszystkimi zdarzeniami o wartości FSC-A > 5 x 104, aby wykluczyć zanieczyszczenia. Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu", a następnie wybierz "P1". Kliknij FSC-A na osi x wykresu punktowego P1, zmień ją na CD3-BV510. Narysuj ''Bramę wielokąta'', aby wybrać populację CD3+ i nazwać ją ''P2''.
      2. Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij FSC-A na osi x wykresu punktowego P2 i zmień ją na 7-AAD. Narysuj ''Bramę wielokąta'' dla populacji 7-AAD- i wybierz ''P3''. P3 to żywe komórki CD3 +.
      3. Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij CD3-BV510 na osi x i CD4-APCH7 na osi y wykresu punktowego P3. Narysuj prostokątne bramki na górnej i dolnej stronie kwadrantu i wybierz odpowiednio ''P4'' i ''P5''. P4 to żywe CD3 + CD4 +, a P5 to żywe komórki T CD3 + CD4.
      4. Kliknij przycisk "Utwórz wykres punktowy", aby wygenerować nowy wykres punktowy, kliknij prawym przyciskiem myszy wykres kropkowy, wybierz "Właściwości", aby otworzyć okno "Edytor wykresu". Kliknij CD45RO PE-Cy7 na osi x i CCR7-PE na osi y wykresów P4 i P5. Narysuj ''Poczwórna brama'' na tym wykresie punktowym.
        UWAGA: Górna lewa strona, górna prawa strona, dolna prawa strona i dolna lewa strona to odpowiednio naiwne, pamięć centralna (TCM), pamięć efektorowa (TEM), końcowo różnicowana pamięć efektorowa (TEMRA) limfocyty T.

Wyniki

Zastosowanie IC za pomocą tego urządzenia klinicznego pozwoliło nam wyizolować komórki odpornościowe powierzchni oka przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonej struktury tej powierzchni. Rysunek 1 opisuje sposób przeprowadzenia procedury IC. Oznaczono na nim różne miejsca oka, z których pobrano próbki. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny wynik cytometrii przepływowej uzyskany od 10 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Do bramkowania należy wykorzystać SSC oraz 7-AAD w celu odróżnienia komórek żywych od martwych. Komórki 7-AAD- są identyfikowane jako komórki żywe. Komórki żywe są następnie charakteryzowane za pomocą markerów CD3+ oraz CD4+. Ponadto populacje CD4+ i CD4- zostały każda z osobna dalej scharakteryzowane jako Naïve, TEM, TCM oraz TEMRA przy użyciu markerów CCR7 i CD45RO. Wśród limfocytów T CD3+ na powierzchni oka człowieka przeważają efektorowe komórki pamięci T. Wcześniejsze eksperymenty wykazały również, że komórki pamięci CD8+ stanowią główną populację limfocytów T w nabłonku spojówki u zdrowych osób20. Rysunek 3 pokazuje, że efektorowe komórki pamięci T CD4+ i CD8+ (TEM oraz TEMRA) stanowią główną podgrupę na powierzchni oka u 10 badanych zdrowych osób z grupy kontrolnej. Każda populacja wymieniona na rysunku jest oznaczona odpowiednim fenotypem markerów i nazwą (Naïve, TCM, TEM, TEMRA). Liczby zaznaczone na czerwono oznaczają procentowy udział danej populacji. Dane na tym rysunku są przedstawione jako średnia ± SEM

Cytologia odciskowa, pobieranie próbek z spojówki, schemat z oznaczonymi stronami skroniową i nosową.
Rycina 1: Pobieranie próbek IC z powierzchni oka za pomocą urządzenia do cytologii odciskowej. Próbki pobrano z bocznej części twardówki, jak pokazano na schemacie.

Analiza cytometrii przepływowej wykazująca markery CD3, CD4; sześć wykresów kropkowych przedstawiających bramkowanie populacji komórek.
Rysunek 2: Wykres kropkowy z analizy cytometrii przepływowej. Wyselekcjonowano żywe komórki 7-AAD- . W pierwszej kolejności dokonano bramkowania komórek CD3+, a następnie tę populację podzielono na podgrupy CD4+ oraz CD4-. Udziały podgrup naiwnych (CCR7+CD45RO-), pamięci centralnej (CCR7+CD45RO+) i pamięci efektorowej (CCR7-CD45RO+; CCR7-CD45RO-) określono przy użyciu markerów CCR7 i CD45RO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres cytometrii przepływowej przedstawiający populacje podzbiorów limfocytów T CD3+CD4+ i CD3+CD8+ według fenotypu.
Rycina 3: Podtypy komórek odpornościowych w limfocytach T CD4+ i CD8+ zdrowej ludzkiej powierzchni oka. Rozkład naiwnych podzbiorów CD4+ i CD8+, komórek pamięci centralnej (TCM) oraz komórek pamięci efektorowej (TEM i TEMRA) w spojówce zdrowych osób kontrolnych; każdy punkt danych reprezentuje oddzielną osobę, przedstawiono średnią ± SEM. Procent populacji jest zaznaczony na czerwono pod nazwą każdej z populacji. Całkowity procent populacji wynosi 98%, ponieważ populacja CD4+ TEMRA nie została uwzględniona na wspomnianym wykresie punktowym (zmodyfikowano na podstawie Bose et al.21). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Jest to łatwa, szybka i mniej inwazyjna technika, która może być stosowana w przychodniach do stosunkowo szybkiego profilowania immunologicznego, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, takich jak skrobanie, wymaz, pipetowanie lub chłonna bibuła filtracyjna 1,2. Wariant tej techniki jest już stosowany w warunkach badawczych22. Przyszłościowe zastosowanie proponowanej metodologii dotyczy stratyfikacji pacjentów w badaniach klinicznych z chorobami oczu, zwłaszcza wymagającymi immunofenotypowania.

Głównym wyzwaniem związanym z tą techniką jest stosunkowo niewielka liczba komórek odpornościowych pobranych po pobraniu i zeskrobaniu wycisków. Całkowita liczba limfocytów T CD3 + odzyskanych z czterech wycisków na osobę wahała się od ~ 500 - 1,000 komórek. Próbki oka przemywano przed analizą cytometrii przepływowej minimalną liczbę razy, aby uniknąć dalszej utraty komórek. Kluczowymi krokami i wyzwaniami, które pozostają w protokole, są efektywne pobieranie próbek z oka i prawidłowe zeskrobywanie błony w celu uzyskania większej liczby komórek. Niemniej jednak jest mało prawdopodobne, aby to ograniczenie skłaniało się ku jakiemukolwiek specyficznemu fenotypowi immunologicznemu. Rozwiązywanie problemów przeprowadzone w tym miejscu w celu maksymalizacji wydajności komórek polegało na zmniejszeniu liczby etapów mycia po i przed inkubacją przeciwciał.

Istnieją inne ograniczenia w korzystaniu z IC. U pacjentów z silnie zrogowaciałą lub zwłókniejącą powierzchnią oka, taką jak w zespole Stevena Johnsona, wydajność komórkowa może być jeszcze mniejsza niż w tym badaniu. Proporcja komórek odpornościowych może ulec zmianie, jeśli próbki są przechowywane, a nie analizowane tego samego dnia. Trudno jest przewidzieć, czy niektóre typy komórek są bardziej odporne na przechowywanie niż inne. Poprzednie badania wykazały podwyższony poziom ekspresji HLA-DR w komórkach nabłonka spojówki23, więc interesująca byłaby ocena korelacji między HLA-DR a poziomami określonych komórek odpornościowych. Komórki odpornościowe mogą być również związane z poziomem ekspresji chemokin. Kwestie te powinny zostać poruszone w przyszłych badaniach.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Nandini Nallappan i Sharon Yeo za pomoc w technicznych krokach. Badanie zostało sfinansowane z grantu na rozpoczęcie działalności dla KGC z Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University oraz z nagrody Senior Clinician Scientist Award przyznanej przez Narodową Radę ds. Badań Medycznych (NMRC) Ministerstwa Zdrowia Singapuru dla LT (NMRC/ CSA/ 045/ 2012) oraz z grantu NMRC i zarządzanego przez Narodowe Centrum Innowacji Zdrowia dla KGC i LT (NHIC-12D-1409007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynniki
anty-ludzkie CD3 BV510BD Biosciences563109
anty-ludzkie CD4 APCH7BD Biosciences641398
anty-ludzkie CD45RO PECy7BD Biosciences337168
roztwór 7-AADBD Biosciences555816
anty-ludzki CCR7 PEBD Biosciences552176
PippetesEppendorfNA
Znieczulenie miejscoweAlkainaNA
Fluoresceina roztwór soduBausch & Lomb U.K LimitedNA
strong>NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipments
Keratograph 5MOculusNA
Lampa szczelinowa BioMicroscopeHaag StreitBM900
EyePrimOpia TechnologiesNA
FACS VerseBD BioSciencesNA
strong>NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Softwares
GraphPad 6.0PrismNA
FACSPerse oprogramowanie analityczneBDNA
<<

Bibliografia

  1. Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. Conjunctival impression cytology. Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).
  2. Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).
  3. Baudouin, C. The pathology of dry eye. Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).
  4. Nelson, J. D., Wright, J. C. Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease. Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).
  5. Brignole, F., et al. Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders. Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).
  6. Knop, E., Knop, N. The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection. J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).
  7. Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology. Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).
  8. Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry. Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
  9. Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article. Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).
  10. Calonge, M., et al. Impression cytology of the ocular surface: a review. Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).
  11. Haller-Schober, E. M., et al. Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome. Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).
  12. Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. Impression cytology of the ocular surface. Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).
  13. Williams, G. P., et al. Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).
  14. Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. Clinical evaluation of the Oculus Keratograph. Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).
  15. Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods. Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).
  16. Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).
  17. Shapiro, A., Merin, S. Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects. American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).
  18. Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine. Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).
  19. Behrens, A. Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations. Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).
  20. Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells. Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).
  21. Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease. Sci Rep. 7, 45312(2017).
  22. Williams, G. P., et al. The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases. Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).
  23. Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis. Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

cytologia z odbitkikomórki powierzchni okafenotypowanie komórekcytometria przepływowaizolacja komórek odpornościowychkomórki spojówkinieinwazyjne pobieranie próbekkomórki T pamięcizapalenie okacytologia powierzchniowa
Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.