Artykuł metodologiczny

Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

11.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55592

⸱

7 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport opisuje metodę wywoływania przewlekłego eksperymentalnego autoimmunologicznego suchego oka u szczurów Lewisa poprzez immunizację emulsją ekstraktu z gruczołu łzowego szczura, albuminy jaja kurzego i kompletnego adiuwantu Freunda, a następnie wstrzyknięcie ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych sześć tygodni później.

Streszczenie

Suche oko to bardzo częsty stan, który powoduje zachorowalność i obciążenie opieki zdrowotnej oraz obniża jakość życia. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiedni model zwierzęcy z zespołem suchego oka w celu przetestowania nowych metod leczenia autoimmunologicznych schorzeń suchego oka. Protokół ten opisuje przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem. Szczury Lewisa uodporniono emulsją zawierającą ekstrakt z gruczołów łzowych, albuminę jaja kurzego i kompletny adiuwant Freunda. Drugie uodpornienie tymi samymi antygenami w niekompletnym adiuwantzie Freunda podano dwa tygodnie później. Szczepienia te podawano podskórnie u nasady ogona. Aby wzmocnić odpowiedź immunologiczną na powierzchni oka i gruczołów łzowych, ekstrakt z gruczołu łzowego i albumina jaja kurzego wstrzyknięto do otworu podspojówkowego i gruczołów łzowych 6 tygodni po pierwszym szczepieniu. U szczurów rozwinęły się cechy suchego oka, w tym zmniejszona produkcja łez, zmniejszona stabilność łez i zwiększone uszkodzenie rogówki. Profilowanie immunologiczne za pomocą cytometrii przepływowej wykazało przewagę efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + w gałce ocznej.

Wprowadzenie

Suche oko (DED) to wieloczynnikowa choroba łez i powierzchni oka, która powoduje objawy dyskomfortu, zaburzenia widzenia i niestabilność filmu łzowego, co może prowadzić do uszkodzenia powierzchni oka. Towarzyszy mu zwiększona osmolarność filmu łzowego i stan zapalny powierzchni oka1. Objawy związane z DED to pieczenie, pieczenie, ziarnistość, uczucie ciała obcego, łzawienie, zmęczenie oczu i suchość2,3. Dwie główne przyczyny DED to zmniejszona produkcja łez przez gruczoł wydzielający łzy oraz nadmierne parowanie filmu łzowego4. U pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak zespół Sjögrena, toczeń rumieniowaty układowy i reumatoidalne zapalenie stawów, immunologiczne uszkodzenie gruczołów Meiboma zmniejsza ekspresję lipidów niezbędnych dla stabilności łez. Ponadto immunologiczne uszkodzenie powierzchni oka zmniejsza produkcję mucyn ważnych dla zwilżalności powierzchni. Procesy te łącznie powodują przewlekłą suchość oka5,6,7.

Wymiana łez i terapia przeciwzapalna są podstawą terapii. Jednak obecne terapie przeciwzapalne DED (tj. kortykosteroidy i cyklosporyna) są zasadniczo immunosupresyjne, co prowadzi do poważnych działań niepożądanych8,9,10. Istnieje zapotrzebowanie na odpowiedni model zwierzęcy do testowania nowych środków immunomodulujących w leczeniu autoimmunologicznego zespołu suchego oka.

Myszy ze specyficznymi wadami genetycznymi11,12,13, myszy pozbawione określonych genów14,15, oraz transgeniczne myszy z nadekspresją genów immunoregulacyjnych zostały wykorzystane jako modele autoimmunologicznego zespołu suchego oka16,17. Indukowane antygenem autoimmunologiczne modele zwierzęce zostały również opisane u myszy18, rabbits19 i rats20,21. W tym miejscu opisujemy indukowany antygenem model przewlekłego autoimmunologicznego zespołu suchego oka. Model ten jest modyfikacją dwóch wcześniejszych modeli; Jeden używał ekstraktów z gruczołów łzowych, a drugi używał autoantygenu (tj. KLk1B22) z gruczołów łzowych20,21.

Choroba została wywołana przez podskórne uodpornienie 6 do 8 tygodniowych samic szczurów Lewisa albuminą jaja kurzego, kompletnym adiuwantem Freunda i emulsją zawierającą ekstrakty gruczołów łzowych od szczurów Sprague-Dawley (Rysunek 1). Drugie uodpornienie tym samym antygenem w niekompletnym adiuwantzie Freunda podano dwa tygodnie później. Aby zrekrutować komórki odpornościowe specyficzne dla antygenu do gruczołu łzowego i powierzchni oka, mieszaninę ekstraktu z gruczołu łzowego i albuminy jaja kurzego (1 mg / ml) wstrzyknięto do podspojówki otworu i gruczołów łzowych w 6-7tygodniu (ryc. 1). U ponad 85% szczurów rozwinęły się charakterystyczne cechy suchego oka 70 dni po pierwszym szczepieniu. Cechy te obejmują zmniejszoną produkcję łez (ryc. 2), zwiększone barwienie fluoresceiny rogówki (ryc. 3) i zmniejszoną stabilność łez (ryc. 4). Profilowanie immunologiczne limfocytów T w gałkach ocznych normalnych szczurów za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia przewagę limfocytów T pamięci efektorowej CD3 + (ryc. 5 i 6). Szczury z autoimmunologicznym DED wykazują wzrost liczby efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + i odpowiadający mu spadek liczby naiwnych i centralnych komórek T pamięci (Figura 6).

Protokół

Zwierzęta były traktowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i Oświadczeniem ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth.

1. Przygotowanie ekstraktu z gruczołów łzowych

UWAGA: Szczury zostały znieczulone dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Prawidłowe znieczulenie zostało potwierdzone przez szczypanie palców u nóg i ogonów. Żel okulistyczny nakładano na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu po każdym zabiegu. Znieczulone szczury umieszczono pod światłem dalekiej podczerwieni, aby utrzymać zwierzęta w cieple, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. Podczas zabiegów i czasu rekonwalescencji zwierzęta były ściśle monitorowane przez badaczy. Wszystkie materiały i narzędzia chirurgiczne były sterylne przed użyciem. Pod koniec eksperymentu szczury poddano eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (80 mg/kg). Całkowita eutanazja została zweryfikowana przez brak tętna serca i brak odruchu mrugania przez dotknięcie gałki ocznej. Szczury trzymano w standardowych warunkach: temperatura pokojowa, 21-23 °C; wilgotność względna, 30-70%; cykl jasny i ciemny, na przemian 12 godzin (od 7 rano do 7 wieczorem).

  1. Ułóż poddane eutanazji samice szczurów Sprague-Dawley (w wieku od 8 tygodni do 16 tygodni) płasko, jednym uchem opartym o stół, a drugim skierowanym do góry. Wykonaj 10-milimetrowe nacięcie góra-dół pod odsłoniętym uchem za pomocą nożyczek sprężynowych. Usunąć gruczoł łzowy, wycinając go z otaczającej tkanki łącznej i z kanału drenażowego.
    1. Przechowywać gruczoły w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Rozmrozić gruczoły na lodzie. Zmiel jak najdrobniej na lodzie nożyczkami. Dodać 150 μl PBS z 1x inhibitorem proteazy na gruczoł łzowy.
  2. Sonikować próbki na lodzie przez 5 minut przy 20 kHz z sonikator ustawionym na 10 s włączenia, 10 s wyłączony przy 30% amplitudzie. Odwirować próbki poddane sonikacji przez 20 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.
  3. Odpipetować supernatant i przenieść go do nowej probówki. Porcję supernatantu rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Zmierzyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego 22, zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Przygotowanie emulsji i toksyny krztuścowej

  1. emulsja
    1. Dodać 40 mg zabitego termicznie Mycobacterium tuberculosis H37Ra do 10 ml kompletnego adiuwantu Freunda zawierającego 1 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra i dobrze wymieszać.
      UWAGA: Ostatni kompletny adiuwant Freunda zawiera 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
    2. Zważyć albuminę jaja kurzego, rozpuścić ją w PBS i przygotować mieszaninę antygenów zawierającą 2 mg/ml albuminy jaja kurzego i 10 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych. Dążąc do uzyskania objętości iniekcji wynoszącej 200 μl dla każdego zwierzęcia, należy przygotować mieszankę wzorcową na podstawie liczby zwierząt.
    3. Przenieść niekompletny adiuwant Freunda lub kompletny adiuwant Freunda do probówki o pojemności 50 ml, upewniając się, że objętość adiuwantu do mieszaniny antygenów jest w stosunku 1:1. Dodawać mieszaninę antygenu kropla po kropli do adiuwanta, wirując z największą prędkością, która nie powoduje rozlania. Kontynuuj wirowanie przez 5 minut po dodaniu całego antygenu.
    4. Przenieść emulsję do strzykawki o pojemności 5 ml i połączyć ją z inną strzykawką o pojemności 5 ml za pomocą łącznika strzykawki. Przepchnąć emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać.
      UWAGA: Emulsja jest gotowa, jeśli pojedyncza kropla pozostaje w postaci kuli po umieszczeniu w wodzie. Należy stosować wyłącznie świeżo przygotowaną emulsję lub emulsję przechowywaną przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Toksyna krztuścowa
    1. Rozpuść 50 μg toksyny krztuścowej w 500 μl wody, aby uzyskać końcowe stężenie 100 ng/μL. Votex pojemnik należy przechowywać przez 30 sekund, aby upewnić się, że toksyna całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Nie sterylizuj przez filtrację, ponieważ spowoduje to utratę materiału. Nie zamrażać. Roztwór ten pozostaje aktywny przez co najmniej 6 miesięcy w temperaturze 4 °C.
    2. Rozcieńczyć 100 ng/μl toksyny krztuścowej do 3 ng/μl za pomocą PBS. Przenieść 100 μl rozcieńczonej toksyny krztuścowej do 1 ml strzykawki do wstrzykiwań Luer-lock za pomocą igły 27 G.

3. Szczepienia szczurów Lewisa

  1. W dniu 0 wymieszaj emulsję kilka razy. Rozprowadzić 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwantie Freunda, do 1-mililitrowych strzykawek Luer-lock z igłami 27G. Emulsję wstrzyknąć podskórnie u podstawy ogonów szczura bez znieczulenia.
    UWAGA: Ogon nie musi być wstępnie rozgrzany przed wstrzyknięciem. Każdy szczur jest uodparniany 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w kompletnym adiuwant Freunda z 500 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
  2. W dniu 14 wstrzyknąć 200 μl emulsji, która zawiera 1 mg ekstraktu z gruczołów łzowych i 200 μg albuminy jaja kurzego w niekompletnym adiuwant Freunda, w taki sam sposób, jak w dniu 0. Wstrzyknąć 300 ng toksyny krztuścowej do 100 μl PBS dootrzewnowo na szczura tego samego dnia.

4. Wstrzyknięcie mieszaniny antygenu do spojówki otworu i gruczołu łzowego w celu rekrutacji komórek odpornościowych specyficznych dla antygenu i wywołania miejscowego stanu zapalnego

  1. Oblicz ilość albuminy jaja kurzego i ekstraktu z gruczołów łzowych na podstawie liczby szczurów w eksperymencie. Zważyć wymaganą ilość albuminy jaja kurzego i połączyć ją z rozmrożonym ekstraktem gruczołu łzowego przygotowanym w kroku 1, tworząc roztwór antygenu zawierający 1 mg/ml albuminy jaja kurzego i 1 mg/ml ekstraktu z gruczołów łzowych.
  2. Znieczulić szczury ketaminą (75 mg/kg) i ksylazyną (10 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Uszczypnij palce u nóg szczurów, aby upewnić się, że uzyskano odpowiednie znieczulenie (tj. po uszczypnięciu nie obserwuje się żadnego ruchu reagującego). Wstrzyknąć 5 μl antygenu do spojówki podspojówkowej otworu oka. Wstrzyknąć 20 μl antygenu do gruczołu łzowego.

5. Ocena cech zespołu suchego oka

UWAGA: Dla kroków 5.1-5.3, znieczulone szczury powinny być delikatnie trzymane ręką w rękawiczce w pozycji pionowej na płaskiej powierzchni, aby uniknąć ruchu.

  1. Zmierz objętość łez za pomocą czerwonej nici fenolowej.
    1. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać nić, a drugiej, aby pociągnąć dolną powiekę szczura. Umieść nić w proksymalnym rogu dolnej półki na 1 minutę, a następnie usuń gwint.
      UWAGA: Łzy sprawiają, że zwilżona część nici ma kolor czerwony.
    2. Zrób zdjęcie długości zwilżonej części nici obok linijki z oznaczeniami milimetrowymi. Zmierz długość zwilżania z dokładnością do dziesiątej części milimetra za pomocą oprogramowania do obrazowania (np. ImageJ).
  2. Zmierz gładkość rogówki/rozdarcia.
    1. Umieść szczura pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Nałóż 5 μl soli fizjologicznej na rogówkę szczura. Mrugaj biernie, przesuwając górną i dolną powiekę palcami w rękawiczce ~5 razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną.
    2. Ustaw oświetlacz pierścieniowy na środku powierzchni rogówki pod powiększeniem 1.6x. Uzyskiwanie zdjęć po 10 s.
      UWAGA: Oświetlacz pierścieniowy wyświetla dwa okrągłe rzędy obrazów punktowych na rogówkach zwierzęcia. Regularne odstępy między niezniekształconymi kropkami sugerują gładką warstwę rogówki/łzy.
  3. Zmierz uszkodzenie rogówki za pomocą barwienia fluoresceiną.
    1. Dodać 2 μl 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Pasywnie otwórz i zamknij powieki szczura 3 razy palcem w rękawiczce, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka.
    2. Po 1 minucie nabierz 1 ml soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml (bez nasadki do igły), umieść strzykawkę około 2-3 mm przed rogówką i delikatnie wlej sól fizjologiczną do oka.
    3. Uzyskuj obrazy pod filtrem kobaltowo-niebieskim (tj. ~400 nm) mikroskopu do obrazowania okulnego z wyłączonymi światłami tła.
      UWAGA: Obrazy zostały następnie przeanalizowane za pomocą systemu oceniania zmodyfikowanego w stosunku do poprzednich publikacji23. Obrazy były następnie analizowane poprzez subiektywne stopniowanie liczby, obszaru i intensywności zielonych plam od 0 do 2, gdzie 0 oznacza ich brak, 1 oznacza punktowe barwienie mniejsze niż 50 plam, a 2 oznacza punktowe barwienie więcej niż 50 plam.
  4. Poddać szczury eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (80 mg/kg). Usuń górną i dolną powiekę za pomocą nożyczek. Napraw i wypadnij gałki oczne, naciskając kleszcze na tkanki okołogałkowe. Uwolnij gałkę ziemską, przecinając mięśnie zewnątrzgałkowe, nerw wzrokowy i spojówkę otworu.
  5. Napraw pozycję gałki ocznej szczura za pomocą kleszczy i otwórz ją nacięciem obwodowym wzdłuż równika. Wyjmij soczewkę i ciało szkliste. Wypreparowane gałki oczne umieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  6. Zbierz gruczoły łzowe, jak opisano w kroku 1.1. Natychmiast przenieś wypreparowane tkanki gałki ocznej i gruczoły łzowe do laboratorium, aby przygotować się do analizy cytometrii przepływowej.
  7. Wyizolowano komórki odpornościowe za pomocą metod trawienia kolagenazy i dispazy II24,25. Kontynuuj korzystanie z cytometrii przepływowej do profilowania subpopulacji limfocytów T w tkankach gałki ocznej26.
    UWAGA: Panel przeciwciał to: anty-CD45APC-cyjanina7 (OX-1), anty-CD3 BV421 (1F4), anty-CD4 PE-cyjanina7 (OX-35), anty-CD45RC Alexa647 (OX-22), anty-CD62 PE (HRL1), anty-CD44 FITC (OX-50) i barwnik żywotności komórek 7-AAD. W populacji CD45 + CD3 + 7AAD- bramkowane były limfocyty T naiwne (CD3 + CD45RC + CD45RC + CD62L).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat eksperymentu. Zarówno w 48., jak i w 70. dniu oceniano cechy kliniczne zespołu suchego oka u zimmunizowanych szczurów. Objętość łez reprezentuje długość zwilżonej części nitki z czerwienią fenolową. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne obrazy nitek z czerwienią fenolową od szczurów z grupy kontrolnej oraz z grupy z DED. Długość nitek z czerwienią fenolową w grupie DED jest mniejsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość łez.

Fluroscyna wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki. W związku z tym uszkodzenie rogówki ocenia się za pomocą barwienia rogówki fluoresceiną. Plamy fluoresceinowe na powierzchni rogówki szczurów z DED oceniano w skali od 0 do 2 i porównywano ze szczurami kontrolnymi. Szczury z DED wykazują silniejsze barwienie fluoresceinowe niż szczury kontrolne (Rysunek 3), co sugeruje uszkodzenie rogówki.

Gładkość rogówki u szczurów z DED oraz w grupie kontrolnej oceniano za pomocą iluminatora pierścieniowego. Jeśli powierzchnia rogówki jest gładka, a stabilność filmu łzawowego wysoka, obraz pierścienia iluminatora na powierzchni oka jest okrągły i regularny. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilność filmu łzawowego. Stopień zniekształcenia pierścienia oceniano w skali od 0 do 2. W grupie DED odnotowano wyższy poziom zniekształcenia pierścienia (Ryc. 4), co wskazuje na mniejszą stabilność filmu łzawowego.

U szczurów stwierdza się występowanie zespołu suchego oka, gdy co najmniej dwie cechy kliniczne tego schorzenia są nieprawidłowe. spośród 24 immunizowanych szczurów, u 21 zwierząt w 48. dniu rozwinął się DED. Wyniki były spójne podczas oceny w 70. dniu.

Analiza cytometrii przepływowej wykazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w prawidłowych tkankach gałek ocznych szczura są efektorowe komórki T pamięci (Rysunek 5). W gałkach ocznych szczurów z DED około 70% limfocytów T CD3+ to efektorowe komórki T pamięci, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%. Gałki oczne szczurów z DED wykazują znacznie wyższą liczbę efektorowych komórek T pamięci niż gałki oczne szczurów kontrolnych (Rysunek 6).

Schemat osi czasu eksperymentu dla immunizacji i oceny DED, szczegółowo przedstawiający iniekcje i profilowanie.
Rysunek 1: Schemat planu doświadczalnego. LG: gruczoł łzowy; DED: zespół suchego oka; CFA: kompletny adiuwant Freunda; IFA: niekompletny adiuwant Freunda. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wyniki mikroskopii nerwów rogówki: grupa kontrolna vs. stan DED, obraz mikroskopowy do analizy nerwów.
Rycina 2: Pomiar objętości filmu łzowego za pomocą nici z czerwienią fenolową. Nitkę z czerwienią fenolową umieszczono w kącie przyśrodkowym obu oczu szczura na 1 min, a następnie usunięto. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia nitki z czerwienią fenolową wraz z linijką dla grupy kontrolnej oraz grupy z DED. Do pomiaru długości zwilżonej części nitek z czerwienią fenolową wykorzystano program ImageJ. Pasek skali = 1 mm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Uszkodzenie nabłonka rogówki, grupa kontrolna vs DED, analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.
Rycina 3: Reprezentatywne obrazy uszkodzeń nabłonka rogówki zmierzone za pomocą barwienia fluoresceiną. Każda rogówka szczura została zabarwiona 0,2% fluoresceiną przez 1 min, a następnie przepłukana co najmniej 1 ml soli fizjologicznej. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do obrazowania oka przy użyciu kobaltowego światła niebieskiego. Pierwsza kolumna przedstawia reprezentatywne obrazy rogówek kontrolnych. Druga kolumna zawiera reprezentatywne obrazy zabarwienia rogówek szczurów z cechami DED. Zielone fluorescencyjne plamki wskazują uszkodzenia nabłonka rogówki. Wszystkie obrazy zostały wykonane w tej samej skali kolorystycznej. Ilościowe oznaczenie zabarwienia fluoresceiną przeprowadzono na podstawie powierzchni i gęstości zielonych plamek. Pasek skali = 1 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stabilność filmu łzawego rogówki; Zespół Suchego Oka (ZSO) vs grupa kontrolna; mikroskopia fluorescencyjna; zdrowie oczu; analiza filmu łzawego.
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy rogówki przedstawiające odblask iluminatora pierścieniowego. Wygładzenie rogówki i filmu łzowego szczura zmierzono za pomocą iluminatora pierścieniowego. Stopień zniekształcenia pierścienia na zarejestrowanych obrazach jest miarą względnej stabilności filmu łzowego. Lewa kolumna przedstawia reprezentatywne obrazy u zwierząt z grupy kontrolnej, a prawa kolumna reprezentatywne obrazy po indukcji zespołu suchego oka. Pasek skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat cytometrii przepływowej; bramkowanie limfocytów T CD3+ z analizą sortowania CD3+7-AAD oraz CD3+CD45RC-.
Rycina 5: Wykresy kropkowe uzyskane z analizy cytometrii przepływowej. Limfocyty T wyizolowane z tkanek gałki ocznej barwiono panelem przeciwciał. W przypadku CD45+CD3+7AAD- populacja, CD3+7-AAD- Wykonano bramkowanie limfocytów T. Wśród komórek CD3+7-AAD- Określono populacje naiwnych limfocytów T, limfocytów T pamięci centralnej oraz limfocytów T pamięci efektorowej. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy populacji komórek CD3+; DED vs kontrola; komórki naiwne, TCM, TEM; wynik eksperymentu.
Rysunek 6: Profil subpopulacji limfocytów T w gałkach ocznych. CD3+CD45RC+ naiwne limfocyty T, CD3+CD45RC-CD4+CD62L- efektorowe limfocyty T pamięci (TEM) komórek oraz CD3+CD45RC-CD4+CD62L+ limfocyty T pamięci centralnej (TCM) komórki przedstawiono jako procent CD3+ limfocyty T. Wyniki pochodzą od 3 szczurów kontrolnych i 6 szczurów z DED. Podobne wyniki uzyskano z analizy limfocytów T z izolowanych gruczołów łzowych (dane nie przedstawiono). Do porównań statystycznych wykorzystano nieparzysty test t Studenta. Słupki błędów reprezentują SD. * p <0,05, ** p <0.01. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Kluczowym etapem tego protokołu jest zapewnienie jednorodności emulsji. W dobrze przygotowanych emulsjach antygeny są całkowicie pokryte olejem, co zapewnia powolne uwalnianie wstrzykniętego antygenu i ciągłą stymulację immunologiczną. Inną krytyczną cechą tego protokołu jest wykorzystanie szczurów Lewisa. Szczury Lewisa są bardziej wrażliwe na rozwój chorób autoimmunologicznych niż inne szczepy27.

Protokół ten został zmodyfikowany na podstawie dwóch wcześniej opublikowanych protokołów, w których stosowano tylko ekstrakt z gruczołów łzowych lub rekombinowany Klk1b2220,21. W obecnym protokole albumina jaja kurzego i ekstrakt z gruczołu łzowego są używane jako antygen, a komórki odpornościowe specyficzne dla antygenu są przyciągane do powierzchni oka i gruczołu łzowego, wywołując miejscowe uszkodzenie tkanki. Zespół suchego oka rozwija się powoli, osiągając ~85% do 48 dnia po początkowym szczepieniu. Prowokacja antygenowa oka i gruczołu łzowego w 48 dniu zaostrza suchość oka i zapewnia jej przewlekłość do 70 dnia.

W porównaniu z rekombinowanym Klk1b22 w modelu DED indukowanym przez Klk, ekstrakt z gruczołu łzowego i albumina jaja kurzego stosowane w obecnym modelu są tańsze i łatwiejsze do uzyskania. Ekstrakt z gruczołów łzowych zawiera również inne białka, oprócz Klk, które mogą indukować autoimmunizację, więc ekstrakt ten jest teoretycznie silniejszy niż metoda Klk w indukowaniu DED. Próbowaliśmy również uodparniać szczury tylko ekstraktem z gruczołów łzowych; chociaż te uodpornione szczury rozwinęły DED, nie było znaczącego wzrostu efektorowych limfocytów T pamięci w tkankach gałki ocznej w porównaniu z grupą kontrolną.

Ograniczeniem tej techniki jest to, że uzyskanie modelu zajmuje 70 dni. Limfocyty T pamięci efektorowej są głównymi podzbiorami limfocytów T w normalnym oku szczura. W tym modelu autoimmunologiczny DED powoduje wzrost liczby efektorowych limfocytów T pamięci CD3 + w gałce ocznej. Leki, które preferencyjnie hamują efektorowe limfocyty T pamięci, takie jak selektywne inhibitory kanału potasowego Kv1.3, mogą zatem przynieść korzyści terapeutyczne w autoimmunologicznej DED28.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów. L.T. otrzymał wcześniejsze finansowanie i/lub prezenty od firm Alcon, Allergan, Santen, Bausch and Lomb, Eyelens i Eyedetec.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Pani Tin Min Qi oraz dr Veluchamy Amutha Barathi i jej zespołowi za pomoc w obchodzeniu się ze zwierzętami. Prace te były wspierane przez NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF/FG586P/2014 oraz NMRC/CSA/045/2012.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay KitThermal Scientific23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Becton, Dickinson i spółka231141
uzupełnić adiuwant FreundaBecton, Dickinson i spółka231131
albuminę jaja kurzegoSigma-AldrichA5503-10G
niekompletny adiuwant Freunda Sigma-AldrichF5506-6X10ML
toksyna krztuścowa Sigma-AldrichP7208-50UG
roztwór sodowy fluoresceinyBausch & Lomb U.K LimitedNA
strong>NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
SonicatorSonics Vibra-Cell
fenol czerwona nićTianjin Jingming Nowy rozwój technologiczny Co., LTD.NA
Mikroskop stereoskopowy z oświetlaczem światła pierścieniowego i kamerąMikroskop Carl ZeissNA
Micro IV Phoenix Research Labs, Ameryka
< Północna

Bibliografia

  1. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
  2. Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
  3. Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
  4. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
  5. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).
  6. Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
  7. Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
  8. Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
  9. Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
  10. Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
  11. Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
  12. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
  13. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
  14. Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
  15. Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  16. Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
  17. Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
  18. Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
  19. Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
  20. Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
  21. Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
  22. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  23. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
  24. Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
  25. Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
  26. Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
  27. Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
  28. Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakt z gruczo u zowegoanaliza cytometrycznaimmunizacja podsk rnawtryskiwanie podsp j wkoweocena uszkodze rog wkipomiar obj to ci ezszczurzy model okaprofilowanie immunologiczne
Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.