Artykuł metodologiczny

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55599

⸱

17 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati, 2Department of Biological Sciences, Wright State University, 3Division of Neurosurgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Streszczenie

Dodatkowe mięśnie oddechowe pomagają utrzymać wentylację, gdy funkcja membrany jest osłabiona. Poniższy protokół opisuje metodę powtarzanych pomiarów przez tygodnie lub miesiące aktywności dodatkowych mięśni oddechowych przy jednoczesnym pomiarze wentylacji u nieznieczulonej, swobodnie zachowującej się myszy. Technika obejmuje chirurgiczne wszczepienie nadajnika radiowego i wprowadzenie elektrod do mięśni pochwy i czworobocznego w celu zmierzenia aktywności elektromiogramu tych mięśni wdechowych. Wentylacja jest mierzona za pomocą pletyzmografii całego ciała, a ruch zwierząt jest oceniany za pomocą wideo i jest zsynchronizowany z aktywnością elektromiogramu. Przedstawiono pomiary aktywności mięśni i wentylacji w mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego, aby pokazać, w jaki sposób narzędzie to może być wykorzystane do zbadania, jak aktywność mięśni oddechowych zmienia się w czasie i do oceny wpływu aktywności mięśni na wentylację. Opisane metody można łatwo dostosować do pomiaru aktywności innych mięśni lub do oceny aktywności dodatkowych mięśni oddechowych w dodatkowych mysich modelach choroby lub urazu.

Wprowadzenie

Dodatkowe mięśnie oddechowe (ARM) zwiększają wentylację w okresach dużego zapotrzebowania (np. ćwiczenia) i pomagają utrzymać wentylację, gdy funkcja membrany jest zagrożona w wyniku urazu lub choroby1,2. Chociaż zmiany w funkcji przepony zostały dobrze opisane u pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) i modelach mysich3,4,5,6, znacznie mniej wiadomo o aktywności lub funkcji ARM w ALS. Jednak jedno z badań sugerowało, że pacjenci z ALS, którzy rekrutują ARM, mają lepsze rokowanie niż ci z podobną dysfunkcją przepony, którzy tego nie robią7. Co więcej, aktywność ARM jest wystarczająca do oddychania w przypadku paraliżu przeponowego 8. Badania te wskazują, że strategie zwiększające funkcję ARM mogą poprawić oddychanie u pacjentów cierpiących na choroby nerwowo-mięśniowe, urazy rdzenia kręgowego lub inne stany, w których funkcja przepony jest upośledzona. Jednak mechanizmy kontrolujące rekrutację ARM do oddychania są w dużej mierze nieznane. Metody pomiaru funkcji oddechowych i zmian w aktywności ARM w czasie w zwierzęcych modelach chorób lub urazów są potrzebne do zbadania, w jaki sposób ARM są rekrutowane, a także do oceny terapii mających na celu poprawę rekrutacji i wentylacji ARM. Co więcej, zwiększona aktywność ARM zbiegająca się z postępującą utratą funkcji przepony może być użytecznym biomarkerem progresji choroby w chorobach nerwowo-mięśniowych, takich jak ALS7,9,10.

Ten protokół opisuje metodę nieinwazyjnego (po wstępnej operacji) i wielokrotnego pomiaru aktywności mięśni oddechowych i wentylacji u obudzonych, zachowujących się myszy. Zsynchronizowane zapisy elektromiografii (EMG), pletyzmografii całego ciała (WBP) i wideo pozwalają badaczowi ocenić, w jaki sposób zmiany w aktywności ARM wpływają na wentylację i określić, kiedy pacjent jest w spoczynku lub się porusza. Główną zaletą tej metody jest to, że można ją wykonać u rozbudzonych, zachowujących się myszach, podczas gdy niektóre alternatywne metody pomiaru EMG wymagają znieczulenia i/lub są procedurami terminalnymi11,12,13. Rejestrowanie aktywności EMG u obudzonych myszy w czasie może być również osiągnięte poprzez przewlekłe wszczepianie przewodów EMG, gdzie mysz jest przywiązana przewodami do systemu akwizycji14,15. Ponieważ wiązanie myszy może zakłócać normalny ruch lub zachowanie i może nie być kompatybilne ze standardową komorą pletyzmograficzną, opisana metoda wykorzystuje urządzenia telemetryczne do bezprzewodowego przesyłania sygnału EMG do systemu akwizycji. Nadajnik można włączać i wyłączać za pomocą magnesu, aby oszczędzać energię baterii i umożliwia wielokrotne pomiary aktywności EMG przez kilka miesięcy. Protokół ten można łatwo dostosować do pomiaru aktywności dodatkowych mięśni oddechowych lub nieoddechowych poprzez wprowadzenie przewodów EMG do różnych mięśni. Alternatywnie, jeden z dwóch przewodów może być użyty do pomiaru aktywności EEG w celu oceny stanu snu lub identyfikacji aktywności napadowej16. Technika ta została z powodzeniem wykorzystana do pomiaru zmian w aktywności ARM w spoczynku w trakcie progresji choroby w mysim modelu ALS oraz do identyfikacji kluczowych neuronów napędzających aktywność ARM u zdrowych myszy10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Cincinnati Children's Hospital Medical Center i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie do operacji implantacji urządzenia telemetrycznego

  1. Załóż środki ochrony osobistej (tj. odzież operacyjną, ochraniacze na obuwie, fartuch, siatkę na włosy, maskę i rękawiczki chirurgiczne).
    UWAGA: Operacja ta wymaga zachowania pola sterylnego.
  2. Włącz inkubator (serwokontrolowany nawilżacz/inkubator dla niemowląt ustawiony na 29 ​°C) i wyłóż go suchymi, białymi ręcznikami, aby zapewnić odpowiednie ogrzanie podczas rekonwalescencji.
  3. Przed operacją wysterylizuj wszystkie instrumenty chirurgiczne tlenkiem etylenu, a nadajnik wysterylizuj detergentem enzymatycznym i środkiem sterylizującym chemicznie (lub zgodnie z instrukcją producenta) przed użyciem.
    UWAGA: Instrumenty chirurgiczne powinny obejmować kleszczyki do laminektomii nr 2 (standardowe końcówki/proste/12 cm) (x4), kleszczyki o wąskim profilu (ząbkowane/zakrzywione/12 cm), nożyczki do rozdzielania tkanek (proste/tępo-tępe/1,5 cm) oraz uchwyt do skalpela z ostrzem. Zaleca się posiadanie oddzielnego zestawu wysterylizowanych instrumentów (dwóch kleszczyków nr 2 i nożyczek) przeznaczonych wyłącznie do manipulowania przewodami nadajnika, aby zachować narzędzia chirurgiczne w dobrym stanie.
  4. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie w polu operacyjnym odpowiednim środkiem dezynfekcyjnym. Umieść w polu operacyjnym stereomikroskop sekcyjny, aparat do znieczulenia izofluranem, narzędzia chirurgiczne i trymer (patrz Tabela materiałów).
  5. Aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia, umieść matę grzewczą lub koc wodny pod sterylnym ręcznikiem przed stereomikroskopem sekcyjnym.
  6. Przed użyciem upewnij się, że nadajnik jest w pełni sprawny.
    UWAGA: Mały magnes umieszczony w odległości do 2 cali od nadajnika włączy i wyłączy urządzenie. Gdy nadajnik jest włączony i znajduje się blisko odbiornika radiowego ustawionego na częstotliwość 50 Hz AM, emituje ciągły, wysoki dźwięk bzyczenia. Aby zaoszczędzić baterię, wyłącz ją przed implantacją w zwierzęciu.
  7. Przed operacją przygotuj wyprowadzenia elektrod, przycinając dystalne końce przewodów nożyczkami przeznaczonymi do manipulowania przewodami, tak aby pozostało około 3 cm przewodu (wystarczająco, aby dotrzeć do docelowego mięśnia) (Rysunek 1A). Alternatywnie, zwiń przewody proksymalnie względem urządzenia i zwiąż je szwami, tak aby pozostało około 3 cm rozwiniętego przewodu.
    UWAGA: Zachowaj odcięte części wyprowadzeń elektrod w celu przygotowania „zaślepek przewodów” (izolacyjnej obudowy plastikowej), zgodnie z opisem w kroku 1.9. W kroku 3 wyprowadzenia nadajnika zostaną wprowadzone przez mięsień, zatem dystalna, odsłonięta część przewodów musi zostać zamocowana i odizolowana za pomocą zaślepek.
  8. Za pomocą skalpela odetnij 0,5 cm plastikowej osłony, nie przecinając samego przewodu. Użyj narzędzi przeznaczonych do manipulowania przewodami, aby rozciągnąć końce wyprowadzeń 4–5 razy do ich oryginalnej długości, tak aby łatwo mieściły się w igle 25-gauge (Rysunek 1B-B''). Przytnij odsłonięty drut wyprowadzeń tak, aby miał 0,5 cm długości.
  9. Przed operacją przygotuj zaślepki przewodów (plastikowe rurki do zakrycia końcówek przewodów). Za pomocą skalpela odetnij rurki o długości 0,25 cm z plastikowej obudowy otaczającej fragmenty wyprowadzeń elektrod zachowane w kroku 1.7.
    UWAGA: Każda mysz poddawana implantacji wymaga czterech zaślepek, jednak najlepiej przygotować dwukrotność wymaganej liczby. Posiadanie dodatkowych, sterylnie przygotowanych zaślepek jest pomocne w przypadku, gdy zamocowanie zaślepki nie powiedzie się przy pierwszej próbie.
  10. Zapisz numer seryjny wszczepionego nadajnika i zachowaj oryginalne opakowanie z informacjami kalibracyjnymi. Każdy nadajnik ma inną kalibrację częstotliwości dla rejestracji EMG; wprowadź te dane do oprogramowania akwizycyjnego, aby uzyskać poprawne zapisy EMG.

2. Przygotowanie myszy do operacji

  1. Wybierz odpowiednią mysz do implantacji (t.j. SOD1(G93A) lub kontrolną) i zważ zwierzę.
    UWAGA: Zalecany wiek i masa ciała myszy (samca lub samicy) poddawanej temu zabiegowi to odpowiednio P56 - P120 oraz ≥ 24 g.
  2. Uśpij mysz pod narkozą z użyciem 3,5% izofluranu przy przepływie tlenu 2 L/min. Wykonaj ucisk palca u nogi oraz ucisk ogona, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
  3. Po znieczuleniu wyjmij mysz z komory indukcyjnej i utrzymuj anestezję za pomocą maski nosowej, ustawiając poziom izofluranu na 1,5% i przepływ tlenu na 1 L/min. Wykonaj ucisk palca u nogi i/lub ucisk ogona, aby upewnić się, że znieczulenie jest utrzymane.
  4. Zastosuj nawilżającą maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji.
  5. Wygol mysz, aby odsłonić pole operacyjne między uchem a barkiem (Rysunek 1C).
  6. Przytnij pazury u nóg po stronie ipsilateralnej względem miejsca operacji, aby zmniejszyć ryzyko wyciągnięcia przez mysz elektrod lub powstania ran w wyniku drapania podczas procesu gojenia.
  7. Przecieraj naprzemiennie pole operacyjne najpierw środkiem dezynfekcyjnym, a następnie izopropanolem. Powtórz tę czynność jeszcze 2 razy.

3. Implantacja urządzenia telemetrycznego do zapisu aktywności EMG mięśni mostkowo-obojczykowo-sutkowatego i czworobocznego

  1. Umieść zwierzę pod mikroskopem sekcyjnym, na boku, na sterylnym wkładzie pokrywającym podkładkę grzewczą, a stożek nosowy przymocuj taśmą. Należy pamiętać, że najlepiej implantować po stronie prawej, aby zredukować sygnał EKG pochodzący z serca.
    UWAGA: Monitoruj oddychanie i w razie potrzeby dostosuj poziom izofluranu, aby utrzymać regularną częstotliwość oddechów i odpowiednią chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia.
  2. Odciągnij przednią kończynę w stronę kończyny po tej samej stronie (ipsilateralnie) wzdłuż tułowia.
    UWAGA: Taka pozycja przemieszcza łopatkę kuzaudalnie, zapewniając dostęp chirurgiczny do mięśni szyjnych i mięśnia czworobocznego.
    1. Używając tępych pęsety zakrzywionej, odsuń przednią łapę po stronie miejsca operacyjnego i przymocuj ją taśmą (Rysunek 1C). Użyj mocnej chirurgicznej taśmy klejącej, aby upewnić się, że łapa jest stabilna przez cały czas trwania procedury.
  3. Załóż nową parę rękawiczek chirurgicznych. Używając skalpela, wykonaj nacięcie skośne o długości około 2 cm pomiędzy barkiem a uchem (czerwona linia na Rysunku 1C).
  4. Używając dwóch pęset laminekcyjnych nr 2 (po jednej w każdej dłoni), odsunij poduszeczkę tłuszczową i rozsuń mięśnie czworoboczne oraz mięsień płytkowy, aby odsłonić powięź pokrywającą mięśnie mostkowo-obronne i szyjne (Rysunki 1D i E).
  5. Wykorzystaj blady mięsień mostkowo-obronny oraz nerw przeponowy jako punkty orientacyjne do zidentyfikowania mięśni szyjnych. Należy zauważyć, że nerw przeponowy biegnie równolegle do mięśni szyjnych, natomiast mięsień mostkowo-obronny znajduje się niżej. Mięśnie szyjne biegną skośnie od kręgów szyjnych do żeber pod mięśniem czworobocznym. Elektrody biopotencjałowe zostaną wprowadzone do przedniego mięśnia szyjnego, który można zidentyfikować jako mięsień biegnący sąsiadująco z nerwem przeponowym (Rysunki 1F i G).
    UWAGA: Ostrożnie. Obszar ten jest silnie unaczyniony i należy zachować ostrożność, aby nie przeciąć tętnicy podobojczykowej. Należy unikać uszkodzenia nerwu przeponowego i splotu ramiennego.
  6. Po zidentyfikowaniu mięśni szyjnych i czworobocznych (Rysunek 1G), utwórz podskórną kieszeń na nadajnik na grzbiecie zwierzęcia, pomiędzy łopatkami.
    1. Używając nożyczek do rozdzielania tkanek, wprowadź tępe końce nożyczek tuż pod skórę i rozsuń je, aż powstanie otwór kieszeni o szerokości około 1,25 szerokości nadajnika (Rysunek 1H).
      UWAGA: Nadajnik powinien zostać wprowadzony przy minimalnym oporze, ale kieszeń nie powinna być tak duża, aby nadajnik mógł się w niej swobodnie przemieszczać. Jeśli kieszeń będzie zbyt mała, nadajnik może ocierać o skórę, powodując podrażnienie, które może skłonić zwierzę do drapania skóry i/lub wyrwania elektrod. Jeśli kieszeń będzie zbyt duża, mogą powstać seromy lub nadajnik może przemieścić się w niepożądane miejsce.
  7. Przepłucz miejsce ciepłą, sterylną solą fizjologiczną i wprowadź nadajnik płaską stroną do mięśnia. Ustaw nadajnik tak, aby leżał płasko, a przewody wychodziły z kieszeni równolegle do siebie, bez skręceń (Rysunek 1I). Zwiń nadmiar przewodu pod urządzeniem i wygładź go.
  8. Poprowadź przewody z nadajnika do mięśni szyjnych i czworobocznych w taki sposób, aby dwa zestawy elektrod biopotencjałowych leżały płasko i równolegle do siebie.
  9. Użyj pęsety laminekcyjnej, aby oddzielić przedni mięsień szyjny od mięśni otaczających, a następnie wprowadź igłę 25G przez mięsień szyjny, prostopadle do włókien mięśniowych.
    1. Wprowadź jedną elektrodę do końcówki igły, a następnie wyciągnij igłę z mięśnia, pozostawiając elektrodę w mięśniu aż do izolacji przewodu (Rysunki 1J i K). Odnotuj, które kolorowe elektrody zostały wprowadzone do których mięśni.
  10. Nałóż małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na odsłonięty koniec przewodu, blisko mięśnia w miejscu wprowadzenia elektrody, i szybko nasuń nakładkę elektrody na przewód tak, aby żaden fragment przewodu nie był odsłonięty pomiędzy nakładką a mięśniem (Rysunki 2A i B).
    UWAGA: Chociaż mocowanie elektrod EMG cyjanoakrylanem jest uznaną praktyką17,18, alternatywną metodą jest przymocowanie nakładki elektrody poprzez zawiązanie wokół niej węzła z jedwabnej nici chirurgicznej.
  11. Przytnij nadmiar przewodu dystalnie od nakładki i nałóż kroplę kleju cyjanoakrylowego na koniec nakładki/przewodu. Odczekaj do spolimeryzowania kleju przed zwolnieniem uchwytu (Rysunki 2C i D).
  12. Powtórz te same kroki (kroki 3.10-3.12), aby wprowadzić elektrodę o przeciwnej polaryzacji równolegle do pierwszej w tym samym mięśniu, w odległości 1 - 2 mm od pierwszej elektrody.
  13. Powtórz kroki 3.10 - 3.12, aby wprowadzić elektrody do mięśnia czworobocznego, znajdującego się bezpośrednio przedniej stronie mięśnia szyjnego (Rysunki 1L i M).
  14. Upewnij się, że przewody elektrod są zamocowane na miejscu i że mają odpowiedni zapas długości, aby zwierzę mogło wykonywać ruchy ciała bez pociągania za elektrody. Upewnij się, że nadmiar przewodu nie uciska skóry, ponieważ mogłoby to spowodować podrażnienie, które skłoni zwierzę do drapania lub wyrwania elektrod. W razie potrzeby przesuń elektrody, aby zapobiec potencjalnemu dyskomfortowi.
  15. Ostrożnie usuń taśmę przytrzymującą przednią kończynę. Odsuń poduszeczkę tłuszczową z powrotem na mięsień i przykryj nią wprowadzone elektrody. Zamknij nacięcie klejem cyjanoakrylowym, zbliżając do siebie brzegi skóry tak, aby linia cięcia się pokrywała. Ściśnij część brzegów skóry pęsetą zakrzywioną i nałóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego wzdłuż tej linii.
  16. Wstrzyknij 0,1 mL karprofenu podskórnie w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego, gdy zwierzę wciąż znajduje się pod wpływem znieczulenia.
    UWAGA: Kontynuuj podawanie 0,1 mL karprofenu raz dziennie przez 1 - 2 dni po operacji, a następnie w razie potrzeby.
  17. Wyjmij zwierzę ze stożka nosowego i umieść je w czystej klatce w wstępnie ogrzanym inkubatorze, aż zwierzę się obudzi i zacznie dobrowolnie poruszać się po klatce. Trzymaj zwierzę w inkubatorze przez co najmniej 15 min po przebudzeniu, monitorując jego ruchy i czujność.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Zwierzęta po operacji należy trzymać oddzielnie. Zwierzętom w fazie rekonwalescencji należy zapewnić żel dietetyczny oraz butelkę z wodą.
  2. Monitorować zwierzę przez pierwsze 30 min po operacji. Sprawdzać stan zwierzęcia co najmniej raz na godzinę przez 5 h po zabiegu. W dniach następujących po operacji kontrolować stan zwierzęcia co najmniej dwa razy dziennie.
  3. Obserwować pod kątem martwicy, infekcji wzdłuż nacięcia oraz wewnątrz jamy ciała zawierającej implant (tj. gorączka, obrzęk i zaczerwienienie) oraz tworzenia się seromy.
    UWAGA: Objawy te występują w ciągu pierwszego tygodnia po operacji. Zdrowe, wyleczone zwierzę miesiąc po operacji przedstawiono na Ryc. 1N. Chociaż rejestracje EMG można przeprowadzać natychmiast po implantacji, zwierzętom daje się co najmniej tydzień na wygojenie przed rejestracją EMG i pletyzmografią, ponieważ sygnały ECG mogą być bardzo wysokie bezpośrednio po implantacji.

5. Pozyskiwanie jednoczesnych sygnałów elektromiograficznych i pletyzmograficznych

  1. Włącz cały sprzęt akwizycyjny, w tym przepływ kompensacyjny.
    UWAGA: Szybkość przepływu dla myszy jest zazwyczaj ustawiona na 1,0 L/min.
  2. Zkalibruj komorę(y) pletyzmograficzną(e) za pomocą przepływomierza.
    UWAGA: Okresowo sprawdzaj komory pletyzmograficzne, aby upewnić się, że uszczelki nie są pęknięte ani uszkodzone. Raz w tygodniu pokrywaj gumowe uszczelki środkiem smarującym, takim jak smar próżniowy, aby utrzymać je w dobrym stanie.
  3. Wprowadź kalibrację nadajnika zgodnie ze specyfikacją producenta.
  4. Umieść mysz w komorze pletyzmograficznej na co najmniej 1 h, aby mogła się zaaklimatyzować przed rejestracją EMG i pletyzmografii. Dzięki zastosowaniu wielu komór możliwe jest rejestrowanie danych z jednej myszy, podczas gdy następna aklimatyzuje się w drugiej komorze. Nie włączaj nadajnika podczas okresu aklimatyzacji, aby oszczędzać energię baterii (Rysunek 1O).
  5. Przed rozpoczęciem rejestracji (ale po kalibracji) włącz nadajnik, przykładając silny magnes w odległości do 1 cala od wszczepionego urządzenia; czerwona lampka na przednim panelu odbiornika wskaże, że nadajnik jest włączony.
  6. Rozpocznij akwizycję, korzystając z menu rozwijanego o nazwie „Acquisition” i wybierając opcję „Start Acquisition”. Choć czas trwania rejestracji może różnić się w zależności od eksperymentu, typowa rejestracja pletyzmograficzna i EMG trwa 1 – 3 h.
    UWAGA: Nadajnik ma wewnętrzną częstotliwość próbkowania wynoszącą 240 Hz. W oprogramowaniu ustawiono szybszą częstotliwość 50 Hz w celu interpolacji między punktami i uzyskania gładszego przebiegu sygnału. Filtr dolnoprzepustowy (pełniący rolę filtra antyaliasingowego) oraz filtr górnoprzepustowy w implancie określają pasmo przenoszenia tego urządzenia telemetrycznego w zakresie od 1 do 50 Hz. Zakłócenia prądu przemiennego o częstotliwości 60 Hz nie powodują nadmiernego szumu w sygnale EMG, ponieważ implanty są zasilane bateryjnie, a organizm zwierzęcia ekranuje implant i przewody przed polami elektrycznymi. Pletyzmografia, EMG i wideo są automatycznie synchronizowane w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania akwizycyjnego.
  7. Po zakończeniu akwizycji wyłącz nadajnik za pomocą magnesu i wyjmij zwierzę z komory.
  8. Jeśli rozpoczynasz kolejną rejestrację, wyczyść komorę, wprowadź nową kalibrację nadajnika dla następnego zwierzęcia i rozpocznij drugą rejestrację. Po zakończeniu wszystkich akwizycji na dany dzień wyłącz nadajnik, wyczyść komorę pletyzmograficzną i wyłącz cały sprzęt akwizycyjny oraz przepływ kompensacyjny.

Układ elektrofizjologiczny dla gryzoni; preparatyka nerwu przeponowego; schemat doświadczalny i wyposażenie.
Rycina 1. Implantacja urządzenia telemetrycznego do pomiaru EMG mięśni oddechowych. (A) Nadajniki telemetryczne z dwiema parami elektrod biopotencjałowych do pomiaru EMG. Elektrody można przyciąć do pożądanej długości (na dole) lub zwinąć i schować pod nadajnikiem (na górze). (B) Przewody nadajnika. (B') Przewody z usuniętą plastikową izolacją w celu odsłonięcia drutów i wykonania końcówek przewodów (wstawka). (B'') Przewody z drutami rozciągniętymi 4–5-krotnie w stosunku do ich pierwotnej długości. Przewody należy przyciąć tak, aby miały długość 0,5 cm (nie pokazano). (C) Mysz przygotowana do zabiegu, z ogoloną okolicą operacyjną i prawidłowo ułożoną przednią łapą. Czerwona przerywana linia wskazuje miejsce nacięcia. (DMięśnie powierzchowne położone poduszką tłuszczową i powięzią, widoczne po początkowym nacięciu. T = mięsień czworoboczny. S = mięsień mostkowo-obojczykowo-mastowaty. P = mięsień szeroki szyi. Żółta strzałka = nerw przeponowy.E) Schematyczny rysunek mięśni i nerwu przeponowego przedstawionych na (D). Należy użyć pęsety do rozszerzenia mięśnia czworobocznego oraz mięśnia skórnego szyi, aby dotrzeć do położonego głębiej mięśnia łuskowatego, pokazanego na (F) i (G). (F) Punkty orientacyjne służące do identyfikacji położenia mięśni jedzeniowych i mięśnia czworobocznego. Na obrazie widoczna jest tętnica podobojczykowa (biała strzałka), nerw przeponowy/splot ramienny (czarna strzałka) oraz blady mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy (żółta strzałka). (G) Schemat przedstawiający położenie mięśni głębszych (t. j. mięsień pośrodkowy szyi, mięsień przedni szyi i mięsień mostkowo-obojczykowy), tętnicę podobojczykową oraz nerw przeponowy. Mięsień tylny szyi nie jest widoczny. Struktury te są dostępne jedynie po rozsunięciu mięśni powierzchownych (na rysunkach D i E).H) Wykonanie otworu na nadajnik za pomocą nożyczek z tępymi końcami. (I) Wprowadzony nadajnik w kieszeni podskórnej, z równolegle rozmieszczonymi elektrodami wychodzącymi z kieszeni. (J) Wprowadzenie igły 25G w mięsień scalenius, prostopadle do włókien mięśniowych, w celu utworzenia tunelu dla przewodu. (KObie elektrody wprowadzono do mięśnia skalenowego. Końcówki elektrod umieszczono na końcach i przyklejono na miejscu.L) Wprowadzenie igły 25G w mięsień czworoboczny, prostopadle do włókien mięśniowych, w celu utworzenia tunelu dla przewodu. (M) Wszystkie cztery elektrody wprowadzone do mięśnia czworobocznego i mięśni pochyłych, ułożone płasko przed zamknięciem nacięcia. (N) Całkowicie powrócona mysz z nadajnikiem umieszczonym podskórnie na grzbiecie. (O) Równoczesna rejestracja pletyzmografii, aktywności EMG mięśni oraz obrazu wideo przy użyciu odpowiednio: komory pletyzmograficznej (żółta strzałka), podkładki odbiorczej telemetrii (czerwona strzałka) oraz kamery (czarna strzałka). Do komory pletyzmograficznej podłączono wielofunkcyjny przepływ bazowy. poprzez plastikowa rurka (niebieska strzałka) do doprowadzania tlenu do myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat edycji genów; proces CRISPR przedstawiający sekwencję cięcia i naprawy DNA.
Rysunek 2. Mocowanie zakrętek ołowianych za pomocą kleju cyjanoakrylowego. (A) Nanieś małą kroplę cyjanoakrylanu (fioletowe koło) na odsłonięty fragment przewodu elektrody (E) proksymalnie względem mięśnia. (BSzybko nasuń przygotowaną osłonkę elektrody (LC) na odsłonięty przewód, pokrywając klej cyjanoakrylowy, tak aby osłonka elektrody znajdowała się bezpośrednio przy mięśniu.COdciąć niewielki fragment dystalnego końca końcówki elektrody oraz przewodu w taki sposób, aby nie pozostała żadna nieizolowana plastikiem, odsłonięta część elektrody.D) Nanieść jedną małą kroplę kleju cyjanoakrylowego na koniec kapsla elektrody. Usunąć odcięty dystalny koniec kapsla elektrody z organizmu zwierzęcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

6. Analiza EMG ramienia i pletyzmografii

  1. Otwórz oprogramowanie analityczne i przejrzyj interesujący plik (przejdź do sekcji „File” i wybierz „Open review file”). Przefiltruj sygnały EMG, używając filtru górnoprzepustowego 30 Hz; w tym celu kliknij prawym przyciskiem myszy na ślad EMG, wybierz „Analyze Attributes”, zaznacz zakładkę „Advanced Attributes 1” i zmień filtr górnoprzepustowy na 30 Hz.
    UWAGA: Ten etap filtrowania usuwa niespecyficzne informacje o niskiej częstotliwości.
  2. Zlokalizuj obszary braku aktywności myszy poprzez inspekcję wizualną, opierając się na braku ruchu w zsynchronizowanym pliku wideo oraz braku dużych, nieregularnych zmian ciśnienia wynikających z ruchu w śladzie pletyzmograficznym (czerwona ramka na Rysunku 3A); brak aktywności występuje, gdy mysz śpi lub jest rozbudzona, ale pozostaje w bezruchu.
  3. Zidentyfikuj serie (bouts) aktywności EMG niezależnie dla każdego mięśnia.
    1. Przeprowadź prostowanie i całkowanie przefiltrowanego sygnału EMG w okresie 30 ms (Rysunek 4).
      UWAGA: Ponieważ myszy oddychają z częstotliwością 3 Hz, każdy oddech reprezentuje około 1 wartości całkowanych.
    2. Wyznacz amplitudę bazową EMG, obliczając średnią z wartości prostowanych i całkowanych związanych z sygnałem EMG w okresie 3 s, gdy mysz jest nieaktywna, a ślad pletyzmograficzny wykazuje eupnoikę (oddychanie prawidłowe) (Rysunek 4).
    3. Zidentyfikuj „serie” aktywności zdefiniowane jako co najmniej 3 kolejne wartości prostowane i całkowane, które wykazują wzrost o co najmniej 50% powyżej bazowego sygnału EMG (wyznaczonego w kroku 6.3.2).
      UWAGA: Trzy kolejne wartości reprezentują okno 90 ms, jednak niektóre serie będą zawierać więcej niż 3 wartości powyżej progu i będą trwały dłużej niż 90 ms.
    4. Wykorzystaj zsynchronizowane wideo i ślad pletyzmograficzny, aby wykluczyć serie występujące podczas ziewania (Rysunek 3B), węszenia (Rysunek 3C) lub celowych ruchów myszy, takich jak obracanie głową lub pielęgnacja (grooming).
    5. Powtórz kroki 6.3.1 – 6.3.4 dla drugiego mięśnia.
  4. Oblicz częstotliwość serii dla każdego mięśnia. Zapisz a) czas rozpoczęcia i zakończenia każdego okresu nieaktywności oraz b) czas wystąpienia każdej serii zgodnie z powyższymi kryteriami. Zsumuj całkowity czas nieaktywności. Podziel całkowitą liczbę serii przez całkowitą liczbę minut czasu nieaktywności w trakcie sesji rejestracyjnej, aby obliczyć częstotliwość serii.
  5. Określ, czy zmiany w wentylacji są powiązane z aktywacją rejestrowanych mięśni.
    1. Wybierz parametry oddychania do pomiaru (np. szczytowy przepływ inspiracyjny, objętość oddechowa, objętość minutowa oraz liczba oddechów na minutę).
      UWAGA: Wszystkie możliwe opcje znajdują się w menu rozwijanym P3 Setup w sekcji „Derived Parameters”.
    2. Zidentyfikuj oddechy, które występują podczas aktywności w serii EMG oraz oddechy występujące podczas aktywności bazowej EMG (Rysunek 4).
    3. Utwórz segmenty parsera obejmujące oddechy pletyzmograficzne powiązane z aktywnością serii EMG oraz utwórz niezależne segmenty parsera powiązane z aktywnością bazową EMG. Upewnij się, że typ analizy ustawiono na „Parser Seg”.
      UWAGA: Wybór ten znajduje się w menu rozwijanym P3 Setup w sekcji „Data Reduction Setup”.
    4. Oznacz początek każdego segmentu parsera zdarzeniem, klikając prawym przyciskiem myszy na śladzie pletyzmograficznym. W menu rozwijanym określ serię zawierającą segmenty parsera jako „Event 1” i określ bazowe segmenty parsera jako „Event 2”, aby rozróżnić te dwie klasy segmentów.
    5. W menu „Functions” zapisz „Marks Section” oraz „Marks Derived Data”. W menu Data Parser zapisz „Parsed Review File” oraz „Parsed Derived Data”.
      UWAGA: Wybrane parametry oddychania dla każdego pojedynczego oddechu znajdują się w arkuszu Marks Derived Data w zakładce „Derivations”.
    6. Porównaj parametry oddechowe dla oddechów występujących podczas serii ARM (oznaczonych jako Event 1) z oddechami występującymi podczas aktywności bazowej (oznaczonych jako Event 2), aby określić, czy aktywność mięśniowa wiąże się ze zmianami w wentylacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany protokół został wykorzystany do implantacji urządzenia telemetrycznego oraz rejestracji EMG mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowatego i mięśnia czworobocznego, WBP oraz wideo u myszy w modelu ALS SOD1(G93A). Okresy, w których zwierzę było nieaktywne (np. nie poruszało się), zidentyfikowano na podstawie nagrania wideo i potwierdzono brakiem aktywności związanej z ruchem w zapisie WBP (Rysunek 3A). Okresy nieaktywności obejmują czas spędzony w fazie snu REM ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaprezentowana tu procedura pozwala na nieinwazyjny (po wstępnym chirurgicznym wszczepieniu nadajnika) pomiar aktywności mięśni oddechowych i wentylacji przez wiele miesięcy u tego samego zwierzęcia. Technika ta ma kilka zalet w porównaniu ze standardowymi technikami EMG u znieczulonych myszy: 1) eksperymenty wymagają mniejszej liczby myszy i zapewniają możliwość rejestrowania danych z tego samego miejsca u jednej myszy w różnych stadiach choroby (zamiast używania wielu myszy w różnych stadiach choroby); 2) analiza danyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez Cincinnati Children's Hospital Medical Center Medical Center Award dla S.A.C. oraz grant szkoleniowy NIH (T32NS007453) dla V.N.J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B6.Cg-TG (SOD1*G93A)1 Gur/JJackson Laboratory4435
Komora pletyzmograficznaBuxco Respiratory Products/ Data Sciences International601-1425-001
Odbiorniki telemetryczne (model RPC-1)Data Sciences International272-6001-001
Pompa przepływowa polaryzacyjna (model BFL0500)Data Sciences International601-2201-001
ACQ-7000 USBData Sciences InternationalPNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange MatrixData Sciences International271-0117-001
Nowy system analizy PonemahData Sciences InternationalPNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Oprogramowanie zakupowe v5.20Data Sciences InternationalPNM-P3P-520
Pakiet analizy pletyzmografii Ponemah Unrestricted Whole Breath v5.20Data Sciences InternationalPNM-URP100W
Skonfigurowany system oprogramowania PonemahSciences InternationalPNM-P3P-CFG
Moduł analizy (URP)Międzynarodowyuniwersalny PNM-URP100W
Sciences International13-7715-59
Sync BoardData Sciences International271-0401-001
synchronizacyjnyData Sciences International274-0030-001
Przetwornik-ciśnienie BuxcoData Sciences International600-1114-001
PrzepływomierzData Sciences International600-1260-001
Magnes i radio w zestawie startowymF20-EETData Sciences International276-0400-001
Kamera wideo Axis P1363   Data Sciences International275-0201-001
Terg-A-ZymeFisher Scientific50-821-785Detergent enzymatyczny
ActrilMinntech Corporation78337-000
Stereofoniczny mikroskop preparacyjny ze sterylizacją chemiczną (model MEB126)Leica10-450-508
Nawilżacz sterowany serwomechanizmem/inkubator dla niemowlątOHMEDA Ohio Care Plus6600-0506-803
TL11M2-F20-EET NadajnikiData Sciences International270-0124-001
Kleszcze do laminektomii Dumont #2 - Końcówki standardowe/proste/12 cm (x2) Fine Scientific Instruments11223-20Do przenoszenia przewodów
Dumont #2 Kleszcze do laminektomii - Standardowe końcówki / Proste / 12 cm (x2)Fine Scientific Instruments11223-20Do operacji
Kleszcze o wąskim wzorze - ząbkowane / zakrzywione / 12 cmFine Scientific Instruments17003-12
Nożyczki sprężynowe - Tough Cut / Proste / Ostre / 12,5 cm / 6 mm Krawędź tnącaFine Scientific Instruments15124-12
Nożyczki do separacji tkanek - proste/-/11,5 cmFine Scientific Instruments14072-10
Nożyczki do cienkich tkanin - twarde cięcie/zakrzywione/ostro-ostre/9 cm Fine Scientific Instruments14058-11Do cięcia drutów i obcinania paznokci
Rękojeść skalpela #3World Precision Instruments500236
Ostrze skalpelaFine Scientific Instruments10010-00Do przygotowania czapek ołowianych
Polysorb Pleciony Wchłanialny szewCovidenD4G1532XDo zwijania przewodów nadajnika
Klejenie Zoetis Inc.6606-65-1Klej cyjanoakrylowy
3 ml końcówka strzykawkowa - SoftVitality Medical118030055
Igła 25 G (x2)Becton Dickinson and Co.305-145
Aplikatory z bawełnianą końcówkąHenry Schein Animal Health100-9175
Zestaw maszynek do strzyżenia włosów Andis Easy CutAndis049-06-0271Elektryczna maszynka do golenia sprzedawana w Target
IsofluraneHenry Schein Animal Health29404Anesthetic 
Alkohol izopropylowy 70%Priorytetowa opieka 1MS070PC
Dermachlor 2% Peeling medyczny (chloroheksydyna 2%)Butler Schein55482
Sztuczne łzyHenry Schein Zdrowie zwierząt48272Smar Maść okulistyczna
Smar próżniowyDow Corning Corporation1597418
Koc wodnyJorVetJOR784BN
Data wzmacniacz Data

Bibliografia

  1. Johnson, R. A., Mitchell, G. S. Common mechanisms of compensatory respiratory plasticity in spinal neurological disorders. Respir Physiol Neurobiol. 189 (2), 419-428 (2013).
  2. Sieck, G. C., Gransee, H. M. Respiratory Muscles: Structure, Function & Regulation. , Morgan & Claypool Life Sciences. Lecture #34 (2012).
  3. Rizzuto, E., Pisu, S., Musaro, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1(G93A) Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng. 43 (9), 2196-2206 (2015).
  4. Kennel, P. F., Finiels, F., Revah, F., Mallet, J. Neuromuscular function impairment is not caused by motor neurone loss in FALS mice: an electromyographic study. Neuroreport. 7 (8), 1427-1431 (1996).
  5. Pinto, S., Alves, P., Pimentel, B., Swash, M., de Carvalho, M. Ultrasound for assessment of diaphragm in ALS. Clin Neurophysiol. 127 (1), 892-897 (2016).
  6. Stewart, H., Eisen, A., Road, J., Mezei, M., Weber, M. Electromyography of respiratory muscles in amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Sci. 191 (1-2), 67-73 (2001).
  7. Arnulf, I., et al. Sleep disorders and diaphragmatic function in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Am J Respir Crit Care Med. 161, 849-856 (2000).
  8. Bennett, J. R., et al. Respiratory muscle activity during REM sleep in patients with diaphragm paralysis. Neurology. 62 (1), 134-137 (2004).
  9. Pinto, S., de Carvalho, M. Motor responses of the sternocleidomastoid muscle in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 38 (4), 1312-1317 (2008).
  10. Romer, S. H., et al. Accessory respiratory muscles enhance ventilation in ALS model mice and are activated by excitatory V2a neurons. Exp Neurol. 287 (Pt. 2, 192-204 (2017).
  11. Moldovan, M., et al. Nerve excitability changes related to axonal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis: Insights from the transgenic SOD1(G127X) mouse model. Exp Neurol. 233 (1), 408-420 (2012).
  12. Pagliardini, S., Gosgnach, S., Dickson, C. T. Spontaneous sleep-like brain state alternations and breathing characteristics in urethane anesthetized mice. PLoS One. 8 (7), 70411(2013).
  13. Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111 (3), 694-703 (2014).
  15. Tysseling, V. M., et al. Design and evaluation of a chronic EMG multichannel detection system for long-term recordings of hindlimb muscles in behaving mice. J Electromyogr Kinesiol. 23 (3), 531-539 (2013).
  16. Weiergraber, M., Henry, M., Hescheler, J., Smyth, N., Schneider, T. Electrocorticographic and deep intracerebral EEG recording in mice using a telemetry system. Brain Res Brain Res Protoc. 14 (3), 154-164 (2005).
  17. Pilla, R., Landon, C. S., Dean, J. B. A potential early physiological marker for CNS oxygen toxicity: hyperoxic hyperpnea precedes seizure in unanesthetized rats breathing hyperbaric oxygen. J Appl Physiol. 114 (1985), 1009-1020 (1985).
  18. Morrison, J. L., et al. Role of inhibitory amino acids in control of hypoglossal motor outflow to genioglossus muscle in naturally sleeping rats. J Physiol. 552 (Pt. 3, 975-991 (2003).
  19. Tscharner, V., Eskofier, B., Federolf, P. Removal of the electrocardiogram signal from surface EMG recordings using non-linearly scaled wavelets). J Electromyogr Kinesiol. 21 (4), 683-688 (2011).
  20. Hof, A. L. A simple method to remove ECG artifacts from trunk muscle EMG signals. J Electromyogr Kinesiol. 19 (6), e554-e555 (2009).
  21. Lu, G., et al. Removing ECG noise from surface EMG signals using adaptive filtering. Neurosci Lett. 462 (1), 14-19 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar wentylacjimodel mysielektrody elektromiograficznepletyzmografia ca ego cia aimplantacja chirurgicznami sie przysionkowymi sie czworobocznymodel ALS

Powiązane artykuły