Tutaj opisujemy nowe podejście do zadawania urazów mózgu u Drosophila melanogaster. Nasza metoda ma tę zaletę, że bezpośrednio dostarcza powtarzalne uderzenia z regulowaną siłą do samej głowy. Dalsze badania układu bezkręgowców pomogą rzucić światło na patogenezę przewlekłej encefalopatii pourazowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nowa metoda modelowania przewlekłej encefalopatii pourazowej u Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE) jest uznaną chorobą neurodegeneracyjną, która jest ściśle związana z narażeniem na powtarzające się łagodne urazowe uszkodzenie mózgu (mTBI). Mechanizmy odpowiedzialne za jego złożone zmiany patologiczne pozostają w dużej mierze nieuchwytne, pomimo niedawnego konsensusu w sprawie zdefiniowania kryteriów neuropatologicznych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowania modelu CTE u Drosophila melanogaster (Drosophila ) w próbie zidentyfikowania kluczowych genów i szlaków, które prowadzą do charakterystycznej hiperfosforylowanej akumulacji tau i śmierci neuronów w mózgu. Uderzenia o regulowanej sile w celu zadawania łagodnych zamkniętych obrażeń są dostarczane bezpośrednio do głowicy muchy, poddając głowę gwałtownemu przyspieszaniu i zwalnianiu. Nasza metoda eliminuje potencjalne problemy związane z innymi modelami Drosophila mTBI (np. śmierć zwierzęcia może być wywołana uszkodzeniem innych części ciała lub narządów wewnętrznych). Mniej pracochłonna i kosztowna opieka nad zwierzętami, krótka żywotność i rozbudowane narzędzia genetyczne sprawiają, że muszka owocowa idealnie nadaje się do badania patogenezy CTE i umożliwia wykonywanie badań genetycznych i farmakologicznych na dużą skalę, obejmujących cały genom. Przewidujemy, że trwająca charakterystyka modelu dostarczy ważnych mechanistycznych spostrzeżeń na temat zapobiegania chorobom i podejść terapeutycznych.
Wprowadzenie
Przewlekła encefalopatia pourazowa (CTE) została niedawno uznana za odrębne zaburzenie neurodegeneracyjne, odrębne od innych tauopatii, takich jak choroba Alzheimera1. W przeciwieństwie do choroby Alzheimera i innych powszechnych tauopatii, których najważniejszymi czynnikami ryzyka są zaawansowany wiek i historia demencji w rodzinie, CTE, jak wskazuje jego nazwa, sugeruje ścisły związek z historią urazów mózgu, najprawdopodobniej obserwowanych u sportowców sportów kontaktowych, takich jak bokserzy i piłkarze, a także u weteranów wojskowych2, 3,4,5. Uważa się, że jest inicjowany przez powtarzające się wstrząsowe i podwstrząsowe uderzenia w głowę. Pacjenci mogą wykazywać objawy przedmiotowe i przedmiotowe, takie jak deficyty poznawcze, zmiany nastroju i zachowania oraz dysfunkcje ruchowe, które w znacznym stopniu pokrywają się z chorobą Alzheimera, otępieniem czołowo-skroniowym, otępieniem z ciałami Lewy'ego i chorobą Parkinsona6. W przeciwieństwie do tego, badania pośmiertne tkanki mózgowej ujawniają wyraźny wzór hiperfosforylowanej akumulacji tau otaczającej małe naczynia krwionośne na głębokości bruzd korowych, patognomoniczna cecha nieobserwowana w innych stanach zwyrodnieniowych7. Jednak do tej pory bardzo niewiele wiadomo na temat patogenezy prowadzącej do manifestacji choroby. Wynika to w dużej mierze z braku wiernego modelu zwierzęcego - dopiero niedawno wygenerowano modele gryzoni5,8. Te organizmy modelowe mają wady związane z kosztowną intensywną opieką i stosunkowo długą żywotnością, które nie nadają się do badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi.
W porównaniu do ich ssaczych odpowiedników, zwierzęta bezkręgowe, takie jak Drosophila, stanowią doskonałą alternatywę, z ich opłacalną konserwacją, obszernymi narzędziami do analizy genetycznych uwarunkowań i stosunkowo krótką żywotnością9. Co ciekawe, mózgi much i ludzi mają ewolucyjnie zachowane szlaki molekularne i komórkowe, a także podobieństwa anatomiczne10,11,12. Wcześniej zgłoszono dwa pomysłowe modele Drosophila do badania urazowego uszkodzenia mózgu13,14. Pierwsze urządzenie "High Impact Trauma" (HIT) zaprojektowane przez Katzenbergera i współpracowników zawierało swobodnie poruszające się muchy w plastikowej fiolce, która była przywiązana do wolnego końca metalowej sprężyny13,15. Kiedy plastikowa fiolka została przechylona pionowo i zwolniona, uderzyła w poliuretanową podkładkę i spowodowała uraz u much, gdy odbijały się od ścianki fiolki i odbijały się. W przeciwieństwie do tego, Barekat i jego koledzy zaprojektowali inną metodę dostarczania przy użyciu platformy homogenizatora Omni Bead Ruptor-2414. Muchy obezwładniono za pomocą CO2 i umieszczono w probówce z nakrętką o pojemności 2 ml, która została przymocowana do homogenizatora i poddana zaprogramowanym warunkom wstrząsania. Jedną z korzyści płynących z używania systemu homogenizatora tkanek jest to, że eksperymentator może modulować intensywność urazu, czas trwania urazu i liczbę napadów urazu. Oba reżimy mają jednak tę samą wadę: pierwotne urazy głowy są zadawane losowo pod względem miejsca uderzenia i siły. Ponadto obie metody skutkowały znaczną śmiertelnością, spowodowaną nieuniknionymi ubocznymi uszkodzeniami innych części ciała i narządów wewnętrznych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę indukowania mTBI u muszek owocowych. Nasza aparatura składa się z impaktora balistycznego napędzanego gazem. W porównaniu z istniejącymi modelami Drosophila14,15, nasza metoda ma wyjątkową zaletę, że zapewnia mierzalne uderzenie, skierowane tylko na swobodnie poruszającą się głowicę muchy, co pozwala na dokładną kontrolę różnych czynników, takich jak siła uderzenia, odstęp czasu między uderzeniami i całkowita liczba doznanych uderzeń.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Montaż urządzenia uderzeniowego (Rysunek 1)
- Wyjąć tłok ze strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml. Przeciąć beczkę na znaku 1 ml.
- Usunąć barierę aerozolową (3 mm wysokości x 4 mm średnicy) z końcówki pipety o pojemności 200 μl i użyć jej jako udaru. Umieścić impaktor w cylindrze strzykawki. Delikatnie postukaj w cylinder, aby przesunąć impaktor do końca końcówki, płaską stroną zakrywając otwór dyszy.
- Przymocuj końcówkę lufy do plastikowej rurki, która jest podłączona do regulatora przepływu dwutlenku węgla (CO2) stacji anestezjologicznej Drosophila.
- Trzymaj lufę pionowo i clamp ją do standardowego stojaka clamp holder, tak aby impaktor pozostał na dnie lufy.
- Zmodyfikuj końcówkę pipety o pojemności 200 μl, aby uzyskać uchwyt na muchy.
- Wytnij 4 mm od końcówki, aby zrobić otwór o średnicy 0,8 mm, pozwalając na odsłonięcie tylko główki muchy.
UWAGA: Klatka piersiowa i wszystkie inne części korpusu muchy pozostaną wewnątrz końcówki pipety.
- Wytnij 4 mm od końcówki, aby zrobić otwór o średnicy 0,8 mm, pozwalając na odsłonięcie tylko główki muchy.
- Zmodyfikuj końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl i nasadkę igły strzykawkowej o pojemności 1 ml, aby utworzyć łącznik.
- Odciąć 44 mm od otworu końcówki. Weź nasadkę na igłę strzykawki o długości 6 mm i wciśnij ją mocno w pozostały segment końcówki pipety o pojemności 1 000 μl.
2. Działanie urządzenia uderzeniowego
- Znieczulij pojedynczą 2-dniową dorosłą samicę muchy za pomocą CO2 na podkładce przeciwmuchowej.
- Delikatnie przenieś go do uchwytu na muchy za pomocą cienkiej szczoteczki. Delikatnie postukaj w uchwyt, tak aby głowica muchy była widoczna na zewnątrz końcówki. Jeśli trąbka muchowa jest odsłonięta na zewnątrz końcówki, delikatnie wsuń ją z powrotem do końcówki za pomocą igły strzykawkowej o pojemności 1 ml.
UWAGA: Upewnij się, że trąba muchowa jest trzymana w uchwycie. W przeciwnym razie mucha może umrzeć z powodu urazu trąbki ssącej. - Dokręcić uchwyt muchowy do cylindra strzykawki za pomocą łącznika tak, aby głowica muchy była skierowana w dół.
- Ustaw ciśnienie gazu na 100 kPa. Dostosuj natężenie przepływu zgodnie z projektem eksperymentu.
- Szybko włączaj i wyłączaj przełącznik regulatora przepływu, aby impaktor uderzył raz w głowicę muchy.
- Podnieś uchwyt na muchy i przesuń go nad podkładką na muchy. Odwróć uchwyt na muchę i delikatnie postukaj w bok, aby wypuścić muchę. Pozostawić muchę w pustej fiolce do wyzdrowienia.
3. Śledzenie ruchu wspomagane wideo
- Wypełnij szalkę Petriego o średnicy 6 cm przezroczystym elastomerem silikonowym, aby uzyskać arenę śledzenia. Pozostaw 3 mm odstępu między silikonem a pokrywką naczynia, aby muchy mogły swobodnie chodzić, ale nie latać.
- Za każdym razem znieczulaj cztery muchy z grupy pozorowanej lub leczonej i umieszczaj je na arenie. Pozostaw muchy w temperaturze 22 °C na 1 godzinę.
- Umieść kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD) nad arenami i nagrywaj przez 5 minut.
- Analizuj zarejestrowane trajektorie ruchu za pomocą oprogramowania Ctrax (dostępnego bezpłatnie w Caltech)16. Eksportuj śledzone dane w formacie zgodnym z językiem programowania (np. Matlab) i analizuj dane na podstawie odległości przebytej na klatkę17. Obliczyć średnią odległość przebytą pieszo dla każdej muchy i połączyć ją ze wszystkimi innymi zarejestrowanymi muchami/grupą, aby uzyskać średnią skumulowaną odległość przebytą przez populację plików w tej samej grupie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby opracować model CTE z wykorzystaniem dorosłych Drosophila, określiliśmy skuteczność naszego urządzenia w zadawaniu pojedynczego zamkniętego urazu głowy. W celu wyeliminowania zmienności związanej z genotypem, płcią lub wiekiem, w eksperymencie wykorzystaliśmy 2-dniowe samice much Canton-S WT. Siłę uderzenia mogliśmy łatwo kontrolować poprzez regulację natężenia przepływu CO2 przy stałym ciśnieniu gazu 100 kPa. Muchy poddane pojedynczemu uderzeniu przy najwyższym n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Modele zwierzęce, które wiernie odwzorowują cechy CTE, w tym zmiany neurofizjologiczne, cechy neuropatologiczne i deficyty neurobehawioralne, są niezbędne do odkrycia mechanizmów chorobowych oraz opracowania celów diagnostycznych i terapeutycznych. Zrozumiałe jest, że żaden zwierzęcy model ludzkiej choroby nie jest doskonały w naśladowaniu wszystkich klinicznie istotnych punktów końcowych. Uważamy jednak, że solidny model CTE powinien spełniać następujące trzy wymagania: (1) uderzenie musi być bezpośrednio zastosowane do...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Praca ta była wspierana przez fundusz startowy wydziału Johns Hopkins University School of Medicine dla L.C.
Podziękowania
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Bariera aerozolowa | USA Scientific | 1120-8810 | Używana jako impaktor |
| 200 μ L Końcówka do pipet | USA Scientific | 1111-0706 | Używana jako uchwyt na głowicę muchową |
| 1000 μ L Końcówka do pipet | USA Scientific | 1122-1830 | Używana jako łącznik |
| 1 mL Strzykawka tuberkulinowa | Becton Dickinson | 309625 | |
| 60 mm Szalki Petriego | Fisher Scientific | FB0875713A | Używany jako areny śledzące |
| Regulator przepływu | Genesee Scientific | 59-122WC | |
| Standardowy uchwyt zaciskowy/stojak | EISCO Scientific | CH0688 | |
| Drobna szczotka | Genesee Scientific | 59-204 | |
| Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Sylgard Silikonowy elastomer | Dow Corning | 4019862 | |
| CCD Camera | Microsoft | HD-5000 | |
| Ctrax Walking Fly Tracker | Caltech | Ctrax 0.2.11 | |
| Zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu MATLAB | R2015b |
Bibliografia
- McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
- Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
- Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
- Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
- Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
- Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).
- McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
- Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
- Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
- Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
- Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
- Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252(2016).
- Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
- Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
