Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda badania skuteczności mycia rąk w usuwaniu pojawiających się zakaźnych patogenów

18.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55604

⸱

7 czerwca 2017

 , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, Tufts University

W tym artykule

Podsumowanie

Mycie rąk jest powszechnie zalecane, aby zapobiec przenoszeniu chorób zakaźnych. Jednak niewiele jest dowodów na to, które metody mycia rąk są najskuteczniejsze w usuwaniu patogenów chorób zakaźnych. Opracowaliśmy metodę oceny skuteczności metod mycia rąk w usuwaniu mikroorganizmów.

Streszczenie

Mycie rąk jest powszechnie zalecane, aby zapobiec przenoszeniu chorób zakaźnych. Istnieje jednak niewiele porównywalnych dowodów na ogólną skuteczność metod mycia rąk. Ponadto istnieje niewiele dowodów porównujących metody mycia rąk w celu określenia, które z nich są najbardziej skuteczne w usuwaniu zakaźnych patogenów. Potrzebne są badania, aby dostarczyć dowodów na różne podejścia do mycia rąk, które mogą być stosowane podczas wybuchów epidemii chorób zakaźnych. W artykule opisano laboratoryjną metodę oceny skuteczności metod mycia rąk w usuwaniu mikroorganizmów z rąk oraz ich trwałości w wodzie do płukania. Ręce ochotników są najpierw nacierane badanym organizmem, a następnie myte przy użyciu każdej metody mycia rąk, która ich interesuje. Ogólnie rzecz biorąc, mikroorganizmy zastępcze są używane do ochrony ludzi przed chorobami. Liczba organizmów pozostających na rękach ochotników po umyciu jest badana przy użyciu zmodyfikowanej metody "soku z rękawiczek": ręce umieszcza się w rękawicach z eluentem i szoruje w celu zawieszenia mikroorganizmów i udostępnienia ich do analizy za pomocą filtracji membranowej (bakterie) lub testu płytki nazębnej (wirusy/bakteriofagi). Woda do płukania wytworzona podczas mycia rąk jest bezpośrednio zbierana do analizy. Skuteczność mycia rąk określa się ilościowo, porównując wartość redukcji logarytmu między próbkami pobranymi po umyciu rąk a próbkami bez mycia rąk. Trwałość wody do płukania określa się ilościowo, porównując próbki wody do płukania z różnych metod mycia rąk z próbkami pobranymi po umyciu rąk samą wodą. Chociaż metoda ta jest ograniczona ze względu na konieczność wykorzystania organizmów zastępczych w celu zachowania bezpieczeństwa ochotników, wychwytuje aspekty mycia rąk, które są trudne do odtworzenia w badaniu in vitro, i wypełnia luki w badaniach nad skutecznością mycia rąk i trwałością organizmów zakaźnych w wodzie do płukania.

Wprowadzenie

Mycie rąk jest powszechnie zalecane, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się chorób, szczególnie tych przenoszonych drogą fekalno-oralną lub powietrzną, w tym biegunek i chorób układu oddechowego1. Co zaskakujące, istnieje niewiele porównywalnych dowodów na skuteczność metod mycia rąk, takich jak mycie rąk wodą z mydłem (HWWS) i środkiem do dezynfekcji rąk na bazie alkoholu (ABHS), w usuwaniu organizmów z rąk. Wstępne badania wykazały, że mechaniczne działanie mycia rąk, w przeciwieństwie do metody mycia rąk, może odpowiadać za usuwanie większości organizmów2,3. Ponadto istnieje niewiele dowodów porównawczych na temat tego, która metoda mycia rąk jest najskuteczniejsza. W nieformalnym przeglądzie literatury zidentyfikowano 14 badań, w których porównano skuteczność mydła i środka do dezynfekcji rąk w usuwaniu organizmów. Spośród tych badań, pięć wykazało, że ABHS jest bardziej skuteczny4,5,6,7,8, siedem stwierdziło, że HWWS jest bardziej skuteczny9,10,11,12,13,14,15, a dwie nie wykazały znaczącej różnicy między metodami16,17. Wyniki te są niespójne i nie odnoszą się do utrzymującego się ryzyka choroby wynikającego z utrzymywania się organizmów w wodzie do płukania po umyciu rąk. Ogólnie rzecz biorąc, dowody na porównawczą skuteczność metod mycia rąk w usuwaniu patogenów wywołujących choroby zakaźne są ograniczone.

To ograniczone dowody doprowadziły do niepewności co do tego, które metody są najbardziej odpowiednie w warunkach epidemii. Na przykład podczas wybuchu epidemii wirusa Ebola (EVD) w Afryce Zachodniej w latach 2013-2016 kilku dużych międzynarodowych służb ratowniczych przedstawiło sprzeczne zalecenia dotyczące HWWS, ABHS lub 0,05% roztworów chloru. Lekarze bez Granic (MSF) zalecają stosowanie 0,05% roztworu chloru do mycia rąk, natomiast Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca HWWS lub ABHS (jeśli ręce nie są widocznie zabrudzone). Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) się nawet do stwierdzenia, że chlor nie powinien być stosowany, chyba że nie są dostępne żadne inne opcje, ponieważ jest mniej skuteczny niż inne metody ze względu na zapotrzebowanie na chlor wywierane przez skórę18,19,20,21,22. Ponadto roztwory chloru są zwykle wytwarzane z czterech różnych związków chloru, w tym podchlorynu o wysokim teście (HTH), lokalnie wytwarzanego i stabilizowanego podchlorynu sodu (NaOCl) oraz dichloroizocyjanuranu sodu (NaDCC). Przegląd systematyczny zlecony przez WHO w odpowiedzi na wybuch epidemii EVD w Afryce Zachodniej wykazał ostatnio tylko cztery badania badające porównawczą skuteczność mycia rąk chlorem23. Badania te również przyniosły sprzeczne wyniki i w żadnym z tych badań nie stosowano zalecanego stężenia chloru 0,05% do mycia rąk ani nie badano mikroorganizmów podobnych do wirusa Ebola10,24,25,26,27. W związku z tym stwierdzono, że zalecenia nie są oparte na dowodach i nie jest jasne, które zalecenia są najbardziej skuteczne.

Potrzebne są dodatkowe badania, aby porównać metody mycia rąk w celu zapobiegania rozprzestrzenianiu się zakaźnych patogenów, ponieważ interwencje związane z myciem rąk są ważnym narzędziem zapobiegającym przenoszeniu chorób epidemicznych. Te zalecenia dotyczące mycia rąk muszą być oparte na dowodach. W związku z tym opracowano metodę badania skuteczności mycia rąk i trwałości wody do płukania, wykonywaną przy użyciu substytutów lub niezakaźnych patogenów2,28,29. Poniżej przedstawiono przykładowe wyniki, w których wykorzystano Phi6 jako substytut wirusa Ebola i Escherichia coli jako powszechny organizm wskaźnikowy. W protokole tym przedstawiono badania skuteczności mycia rąk oraz trwałości wody do płukania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Badanie opisane w niniejszej pracy (z wykorzystaniem Phi6 i E. coli jako substytutów wirusa Ebola) zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board w Tufts Medical Center oraz Tufts University Health Sciences Campus (#12018); Harvard University przekazał nadzór nad przeglądem do Tufts Institutional Review Board.

UWAGA: Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu należy wykonać dwa kroki. Po pierwsze, należy zidentyfikować i wybrać substytut o 1. poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-1) lub nieinfekcyjną wersję badanego patogenu, która jest bezpieczna do stosowania u ludzi30. Substytut BSL-1 lub nieinfekcyjny patogen jest niezbędny w tym protokole, ponieważ organizm zostanie wykorzystany do inokulacji nieosłoniętych dłoni ochotników. Po drugie, przed rekrutacją ochotników lub rozpoczęciem eksperymentu należy uzyskać zgodę lokalnej Komisji Bioetycznej (Institutional Review Board) na prowadzenie badań z udziałem ludzi. Wiele aspektów tego protokołu można dostosować do konkretnych potrzeb badawczych interesujących autora.

1. Rekrutacja kwalifikujących się ochotników

  1. Zrekrutuj ochotników, wywieszając papierowe ogłoszenia na publicznych tablicach informacyjnych oraz wysyłając wiadomości e-mail do grup, których członkowie mogą być zainteresowani udziałem. Ogłoszenia te powinny zawierać cel badania, dane kontaktowe oraz kryteria kwalifikacji.
  2. Spotkaj się z ochotnikami, aby ocenić ich kwalifikacje. Potwierdź, że ochotnicy są zdrowi, w wieku od 18 do 65 lat, nie są obecnie w ciąży ani nie przyjmują antybiotyków oraz że nie mają uszkodzeń lub schorzeń skóry, znanych alergii na środki do mycia rąk ani historii problemów ze zdrowiem psychicznym związanych z higieną.
  3. Poproś zakwalifikowanych ochotników o przeczytanie formularzy zgody. Odpowiedz na wszelkie zadane przez nich pytania i poproś ochotnika oraz badacza o podpisanie dwóch egzemplarzy formularza. Zachowaj jeden egzemplarz i przekaż drugi ochotnikowi.
  4. Przeprowadź ankietę wstępną, obejmującą pytania o dane demograficzne, osobistą historię schorzeń skóry oraz informacje o niedawnych nawykach mycia rąk. Zbadaj dłonie pod kątem objawów zapalenia skóry, urazów skóry lub wstępnych nieprawidłowości skórnych31.
  5. Zaplanuj dla ochotników dwie sesje testowe dla każdego badanego organizmu (jedną dla testu z obciążeniem glebą i jedną bez). Poinstruuj ochotników, aby przez siedmiodniowy okres wypłukiwania przed testami unikali stosowania produktów przeciwdrobnoustrojowych, aby zapobiec zakłóceniom wynikającym z używania produktów osobistych.
    1. Przekaż ochotnikom produkty przeciwdrobnoustrojowe (szampon, odżywkę i mydło) do stosowania zamiast ich zwykłych produktów. Dostarcz wytrzymałe rękawice winylowe i poinstruuj badanych, aby nosili je podczas używania produktów takich jak środki do sprzątania domu.

2. Przygotowanie roztworów do mycia rąk powszechnie stosowanych w reagowaniu kryzysowym (mydło, ABHS, 0,05% HTH, NaDCC i roztwory NaOCl)

UWAGA: Roztwory chloru można przygotować do 12 h przed eksperymentem, jednak ulegną one degradacji, jeśli będą przechowywane >12 h.

  1. Wybrać i zakupić mydło odpowiednie dla kontekstu, w którym przeprowadzane są testy.
    UWAGA: W większości przypadków, w sytuacjach kryzysowych związanych z chorobami zakaźnymi w krajach rozwijających się, będzie to mydło w kostce.
  2. Wybrać i zakupić roztwór ABHS odpowiedni dla kontekstu, w którym przeprowadzane są testy.
    UWAGA: Wybrany środek ABHS powinien zawierać alkohol etylowy w stężeniu równym lub wyższym niż 70%, aby zapewnić skuteczność.
  3. Przygotować 0,05% roztwór podchlorynu wapnia (Ca(ClO)2), dodając granularny proszek Ca(ClO)2 do wody ultraczystej. Określić wymaganą objętość roztworu na podstawie liczby osób poddawanych testom.
    1. Korzystając z poniższego równania, obliczyć ilość proszku potrzebną do przygotowania żądanej ilości roztworu w określonej objętości wody, przy danym procencie dostępnego chloru:
      Obliczenia chlorowania; równanie dla masy proszku Ca(ClO)2 w procesie dezynfekcji wody.
      UWAGA: Proszek Ca(ClO)2 zazwyczaj zawiera 60-80% dostępnego chloru.
  4. Przygotować 0,05% roztwór dichloroisocyjanuranu sodu (NaDCC), dodając granularny proszek NaDCC do wody ultraczystej.
    1. Korzystając z poniższego równania, obliczyć ilość proszku potrzebną do przygotowania żądanej ilości roztworu w określonej objętości wody, przy danym procencie dostępnego chloru:
      Obliczanie stężenia NaDCC, równanie; 500 mg Cl/L, L wody, g proszku NaDCC, wzór konwersyjny.
      UWAGA: Proszek NaDCC zazwyczaj zawiera około 50% dostępnego chloru.
  5. Przygotować stabilizowany 0,05% roztwór NaOCl, dodając roztwór stokowy podchlorynu sodu do wody ultraczystej.
    1. Potwierdzić stężenie roztworu stokowego NaOCl (prawdopodobnie 5-8%) za pomocą metody miareczkowania zgodnie z instrukcją producenta (np. miareczkowanie jodometryczne; zestaw sugerowany w Liście Materiałów).
    2. Na podstawie wyników metody badawczej obliczyć ilość roztworu do dodania do wody, korzystając z poniższego równania:
      Wzór obliczeniowy stężenia dla przygotowania roztworu stokowego NaOCl.
  6. Przygotować stabilizowany 0,05% roztwór NaOCl, dodając do wody ultraczystej roztwór podchlorynu sodu wytworzony za pomocą elektrochlorynatora, wodę ultraczystą oraz chlorek sodu (NaCl) klasy laboratoryjnej.
    1. Przygotować 1% roztwór chloru z wody ultraczystej i NaCl, używając elektrochlorynatora zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Użyć metody miareczkowania (np. miareczkowania jodometrycznego), aby potwierdzić stężenie roztworu stokowego NaOCl32.
    3. Na podstawie wyników testu obliczyć ilość roztworu do dodania do wody, korzystając z poniższego równania:
      Wzór obliczeniowy stężenia dla przygotowania roztworu stokowego NaOCl.
  7. Potwierdzić stężenie każdego z chlorowych roztworów do mycia rąk za pomocą metody miareczkowania (np. miareczkowania jodometrycznego) i skorygować roztwory poprzez dodanie wody lub proszku/roztworu źródła chloru, aż osiągną one wartość w granicach 10% błędu od stężenia docelowego (0,045-0,055%).

3. Przygotowanie organizmów oraz ładunku glebowego i ich połączenie w celu wytworzenia inokulum

UWAGA: W poniższych podrozdziałach E. coli oraz Phi6 zostały użyte jako przykładowe organizmy bakteryjne i wirusowe na potrzeby opisu metod.

  1. Przygotować organizm wykorzystywany do badań w stężeniu przekraczającym 10 x 108 CFU/mL dla bakterii oraz przekraczającym 10 x 107 PFU/mL dla wirusów.
    1. Aby przygotować E. coli, wysiać niepatogenny szczep E. coli na płytki z agarem Luria-Bertani (LB) i inkubować w 37 °C przez 24 h w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Przechowywać w 4 °C.
      UWAGA: Można to zrobić na kilka dni przed rozpoczęciem eksperymentu.
      1. Na dzień przed rozpoczęciem eksperymentu pobrać pojedynczą kolonię z płytki i za pomocą sterylnej pętli zaszczepić 10 mL bulionu LB. Inkubować przez noc w 37 °C z wytrząsaniem.
      2. W dniu eksperymentu, rano, przygotować świeżą kulturę, dodając 1 mL kultury z nocnej inkubacji do 20 mL świeżego bulionu LB. Inkubować przez około 2,5 h, aż gęstość komórek przekroczy 108 CFU/mL.
      3. Użyć spektrofotometru do oszacowania stężenia kultury.
        UWAGA: Należy zastosować wcześniej ustalony współczynnik konwersji z krzywej wzorcowej dla użytego szczepu E. coli, aby zapewnić stężenie powyżej 108 CFU/mL33. Jeśli gęstość komórek będzie zbyt niska, należy ponownie umieścić kulturę w inkubatorze i powtarzać pomiary aż do uzyskania pożądanego stężenia.
    2. Potwierdzić stężenie metodą filtracji membranowej34.
      UWAGA: Wykonać rozcieńczenia seryjne kultury w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w taki sposób, aby po przefiltrowaniu na płytce uzyskano możliwą do policzenia liczbę kolonii (dokładna liczba zależy od zastosowanego medium).
      1. Przygotować palnik oraz zestaw do filtracji z jałowymi lejkami filtrującymi i przyłączem próżniowym. Pincetę wysterylizować poprzez opalenie w etanolu. Używając pincety, umieścić filtr 0,45-µm na zestawie do filtracji siatką do góry. Zwilżyć filtr niewielką ilością sterylnego PBS.
      2. Umieścić lejek na podstawie i dodać roztwór próbki do przetworzenia, pipetując go lub wlewając bezpośrednio na filtr. Włączyć próżnię, aż cała próbka przejdzie przez membranę. Przepłukać ścianki lejka sterylnym PBS i ponownie włączyć próżnię.
        UWAGA: Próbki powinny mieć objętość od co najmniej 100 µL do 100 mL. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 10 mL, należy dodać do lejka filtrującego około 20 mL PBS przed filtrowaniem, aby zapewnić jednorodne przefiltrowanie próbki.
      3. Zdjąć lejek, wysterylizować pincetę w płomieniu i podnieść filtr z podstawy. Ostrożnie położyć filtr na agarze LB w szalce Petriego siatką do góry, dbając o to, aby filtr przylegał płasko do powierzchni. Odwrócić płytki i inkubować przez 24 h w 37 °C.
      4. Po 24 h wyjąć płytki z inkubatora i policzyć kolonie E. coli. Wykorzystać te dane oraz znany czynnik rozcieńczenia i objętość roztworu, aby obliczyć stężenie przefiltrowanego roztworu w CFU/mL.
    3. Namnożyć Phi6 w organizmie gospodarza Pseudomonas syringae metodą podwójnej warstwy agaru35.
      1. Dodać 100 µL zawiesiny stokowej Phi6 i 100 µL kultury nocnej P. syringae bezpośrednio do 6 mL miękkiego agaru Nutrient Broth Yeast (NBY, 0,3%). Wylać go na płytki z twardym agarem NBY (1,5%) i inkubować przez noc w 26 °C. Przygotować odpowiednią liczbę płytek, aby uzyskać wystarczającą ilość inokulum do eksperymentu, szacując wydajność na około 4 mL zawiesiny wirusowej z jednej płytki.
      2. Następnego dnia dodać 5 mL PBS na wierzch warstwy miękkiego agaru. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 4 h, pobrać roztwór pipetą i przefiltrować przez filtr 0,45-µm. Przechowywać w 4 °C.
        UWAGA: Roztwór ten będzie służył jako inokulum wirusowe.
    4. Użyć testu plackowego, aby potwierdzić, że stężenie przekracza 107 PFU/mL35. Wykonać rozcieńczenia seryjne zawiesiny wirusowej w PBS w taki sposób, aby 100 µL dało możliwą do policzenia liczbę placków na płytce.
      1. Pipetować 100 µL odpowiednio rozcieńczonej próbki oraz 100 µL nocnej kultury gospodarza bezpośrednio do probówki zawierającej 6 mL miękkiego agaru NBY. Wylać miękki agar na twardy agar NBY i inkubować w 26 °C przez 24 h.
      2. Następnego dnia wyjąć płytki z inkubatorów i policzyć liczbę placków na płytce. Wykorzystać te dane oraz znany czynnik rozcieńczenia i objętość roztworu, aby obliczyć stężenie przefiltrowanego roztworu w PFU/mL.
  2. Przygotować trójskładnikowe obciążenie glebowe, mające na celu imitowanie ludzkiej surowicy.
    1. Połączyć 7,80 mg/mL albuminy surowicy bydlęcej, 10,92 mg/mL tryptonu i 2,52 mg/mL mucyny bydlęcej, aby uzyskać wymaganą objętość obciążenia glebowego. Po wymieszaniu obciążenia glebowego, przefiltrować je przez filtr 0,22-µm w celu sterylizacji. Przechowywać w 4 °C do momentu użycia. Nie sterylizować termicznie, ponieważ białka ulegną denaturacji.
  3. Przygotować 0,9% roztwór NaCl do mieszania inokulum dla wariantów bez obciążenia glebowego.
  4. Bezpośrednio przed badaniem przygotować inokulum składające się w 68% z zawiesiny bakteryjnej lub wirusowej i w 32% z obciążenia glebowego. Na przykład użyć 1,02 mL zawiesiny bakteryjnej lub wirusowej z kroków 3.1.1.2 lub 3.1.3.2 oraz 0,48 mL obciążenia glebowego (krok 3.2.1) lub 0,9% roztworu NaCl (krok 3.3). Delikatnie wymieszać przez obracanie lub w wirówce typu vortex.
    UWAGA: 1,5 mL tego inokulum zostanie użyte dla każdego ochotnika w każdym wariancie, dlatego należy upewnić się, że całkowita objętość przygotowanego inokulum jest wystarczająca dla planowanej liczby badań.

4. Przygotowanie ochotników do eksperymentu

UWAGA: Należy określić organizm oraz warunki obciążenia glebą do przetestowania w danym dniu. Ci sami ochotnicy mogą być wykorzystani do testowania wielu warunków, jednak każdy ochotnik powinien zostać poddany tylko jednej serii testów w ciągu 48 h.

  1. Przed rozpoczęciem testów potwierdź, że wolontariusze nadal spełniają kryteria kwalifikacji, weryfikując ustnie, czy przestrzegali 7-dniowego okresu odstawienia środków przeciwdrobnoustrojowych oraz potwierdzając wizualnie, że na ich skórze nie pojawiły się żadne przerwania ciągłości tkanek ani nieprawidłowości.
  2. Za pomocą generatora liczb losowych przypisz każdemu wolontariuszowi prawą lub lewą rękę do pobierania próbek w tym dniu testów. Wyznacz kolejność, w jakiej będą wykonywane poszczególne warunki mycia rąk.
    UWAGA: Na przykład ABHS może otrzymać numer 3 i zostanie wykonane jako trzecie.
  3. Na początku testów wykonaj raz „mycie oczyszczające”, aby usunąć z skóry brud i tłuszcze, tak aby każdy kolejny test był przeprowadzany w równoważnych warunkach.
    1. Aby wykonać mycie oczyszczające, przeprowadź każdy etap eksperymentu (sekcja 5 poniżej), używając pustego inokulatu (sam bulion LB lub PBS) i pobierając próbkę bez mycia rąk.

5. Procedura eksperymentalna

  1. Aby zbadać pH skóry każdego ochotnika (w celu kontroli zmienności), należy przyłożyć płaską sondę do pomiaru pH skóry do powierzchni dłoniowej oraz w przestrzeni między palcem wskazującym a środkowym. Należy upewnić się, że elektroda przylega płasko do skóry. Należy zapisać odczyt pH.
  2. Inokulacja dłoni.
    1. Ochotnicy powinni złożyć obie dłonie w formie miseczki. Należy nanieść na dłonie 1.5 mL inokulatu, powoli pipetując 750 µL do każdej dłoni.
    2. Ochotnicy powinni delikatnie pocierać dłonie o siebie, aż wszystkie powierzchnie dłoni zostaną pokryte inokulatem, starając się przy tym ograniczyć tarcie do minimum.
    3. Ochotnicy powinni trzymać dłonie nieruchomo i z dala od ciała przez kolejne 30 s, aby umożliwić wyschnięcie inokulatu. Inokulat może nie wyschnąć całkowicie.
  3. Mycie rąk.
    1. Podczas wszystkich następnych etapów mycia, wodę z płukania dłoni należy zbierać do dużego worka do pobierania próbek. Do worka należy dodać 4.5 mL 12% roztworu tiosiarczanu sodu, aby zneutralizować chlor w momencie kontaktu, a następnie przetworzyć próbkę w ciągu 2 h.
      UWAGA: Tiosiarczan sodu należy dodać do wszystkich próbek (również tych bez chloru), aby kontrolować ewentualny wpływ tego związku na organizm.
    2. Po inokulacji (rozdział 5.2), należy umyć ręce zgodnie z kolejną metodą w wyznaczonym porządku.
      1. W przypadku Kontroli A nie należy przeprowadzać etapu mycia rąk i należy przejść bezpośrednio do kroku 5.5.
      2. W przypadku Kontroli B ręce należy umyć wyłącznie wodą ultrapure w temperaturze pokojowej (około 21 °C), przepuszczając ją przez lejek o znanej prędkości przepływu.
        UWAGA: W tym przypadku zastosowano prędkość przepływu 1.5 L/m oraz 500 mL wody.
      3. W przypadku mycia rąk z mydłem, należy zwilżyć dłonie 10 mL wody ultrapure. Ochotnicy powinni spienić mydło w dłoniach, a następnie pocierać dłonie o siebie przez kolejne 20 s. Ręce należy opłukać, przepuszczając 500 mL wody ultrapure w temperaturze pokojowej przez lejek z prędkością przepływu 1.5 L/m.
      4. W przypadku wszystkich roztworów chloru (np. ABHS, HTH, NaDCC i NaOCl), należy przelać 200 mL roztworu chloru przez lejek z prędkością przepływu 1.5 L/m, a ochotnik powinien dokładnie potrzeć dłonie.
  4. Płukanie dłoni przy użyciu zmodyfikowanej procedury „glove juice”.
    1. Bezpośrednio po myciu rąk, dłoń każdego ochotnika (tzn. dłoń (prawą lub lewą) wybraną do testu w kroku 4.2) należy umieścić w worku do próbek zawierającym 75 mL eluentu (np. PBS) aż do nadgarstka. Górną część worka należy ściśle zacisnąć wokół nadgarstka.
      UWAGA: Do pobierania próbek należy użyć eluentu zawierającego wystarczającą ilość tiosiarczanu sodu, aby zneutralizować chlor użyty do mycia rąk. PBS jest powszechnie stosowanym eluentem, który jest odpowiedni dla wielu organizmów.
    2. Ochotnicy powinni delikatnie pocierać dłoń w roztworze przez 30 s, dbając o dotarcie w przestrzenie między palcami i pod paznokcie. Należy delikatnie masować dłoń z zewnątrz worka przez 30 s, aby upewnić się, że cała dłoń została dokładnie wypłukana w eluencie, aż do nadgarstka.
    3. Worek należy zamknąć i przetworzyć zgodnie z odpowiednim testem opisanym w rozdziale 6 w ciągu 2 h.
  5. Dekontaminacja.
    1. Przed powtórzeniem procesu dla każdej metody mycia rąk, ochotnicy powinni dokładnie umyć ręce w zlewie przy użyciu mydła i ciepłej wody. Dłonie ochotników należy spryskać 70% etanolem, aż zostaną pokryte z obu stron. Następnie należy pozwolić im wyschnąć.
    2. Należy powtórzyć wszystkie kroki z rozdziału 5 dla każdego warunku mycia rąk, używając wyłącznie dłoni wybranej losowo w kroku 4.2 (Rycina 1).

6. Ilościowe oznaczenie

  1. Wykonaj analizy odpowiednie dla wybranego organizmu (np. filtrację membranową dla bakterii lub metodę plaque assay dla wirusów, opisane powyżej w odpowiednio sekcjach 3.1.2 i 3.1.4).
  2. Po przeliczeniu płytek zapisz szacowaną wartość CFU/mL lub PFU/mL dla każdego testu do dalszych analiz (sekcje 3.1.2 i 3.1.4).

7. Analiza

  1. Wykorzystując wyniki z kroku 6.2, oblicz wartość redukcji logarytmicznej mikroorganizmów na dłoniach dla każdego mikroorganizmu, stanu zanieczyszczenia glebą, osoby badanej oraz metody mycia rąk.
    1. W celu oceny skuteczności mycia rąk porównaj stężenie bakterii/wirusa w każdej próbce po myciu rąk z kontrolą A (brak mycia rąk). W celu oceny trwałości w wodzie z płukania porównaj każdą próbkę wody z płukania z kontrolą B (mycie samą wodą). Zastosuj następujący standardowy wzór:
      Redukcja logarytmiczna (mycie rąk) = Logarytm dziesiętny, notacja matematyczna, stosowana w równaniach i analizie danych. Wzór na stosunek skuteczności mycia rąk, porównanie CFU lub PFU na mL, analiza mikrobiologiczna.
      Redukcja logarytmiczna (woda z płukania) = Logarytm dziesiętny, notacja matematyczna, stosowana w równaniach i analizie danych.Wzór na skuteczność mycia rąk; stosunek porównujący CFU lub PFU/mL dla różnych metod mycia; równanie.
      UWAGA: Redukcję logarytmiczną można również wyrazić jako log10(bez mycia rąk) - log10(z myciem rąk)
  2. Zastosuj jednoczynnikową analizę wariancji z powtórzeniami (ANOVA) w celu oceny istotnych różnic w obliczonych wartościach redukcji logarytmicznej pomiędzy metodami mycia rąk oraz test post-hoc Tukeya HSD dla istotnych modeli w celu parowej oceny istotnych różnic (p <0,05)36.
    1. Przed przeprowadzeniem analizy ANOVA oceń sferyczność każdego zbioru danych (np. za pomocą testu Bartletta). Zastosuj poprawkę (np. poprawkę Greenhouse-Geissera), gdy test wykaże naruszenie sferyczności37.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy protokół (Rysunek 1) zrealizowano z udziałem 18 ochotników, z których każdy został przetestowany zarówno z użyciem E. coli, jak i Phi6. Stwierdzono istotne różnice między wynikami mycia rąk w przypadku E. coli (zarówno z obciążeniem glebą, jak i bez) oraz Phi6 z obciążeniem glebą (Rysunek 2 i Rysunek 3). Dla E. coli bez obciążenia glebą mycie rąk przy uży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda zapewnia podejście do badania skuteczności mycia rąk w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie ochotników i zastępczych, niezakaźnych organizmów. Za pomocą tej metody udało się wykazać różnice w: 1) skuteczności metod mycia rąk oraz 2) trwałości organizmu w wodzie do płukania. Celem przedstawienia niniejszego protokołu jest zapewnienie ogólnych ram, które można dostosować do testowania szerokiej gamy organizmów zastępczych i metod mycia rąk związanych z cho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Amerykańską Agencję Rozwoju Międzynarodowego, Biuro Pomocy Zagranicznej w przypadku Katastrof (AID-OFDA-A-15-00026). Marlene Wolfe otrzymała wsparcie od National Science Foundation (grant 0966093).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mydło w kostceMydłoDove
Płyn do dezynfekcji rąk na bazie alkoholuPurellAdvanced Instant Płyn do dezynfekcji rąk z 70% alkoholem
HTH w proszkuAcros Organics300340010
NaDCC w proszkuMedentechKlorsept granulat
NaOCl SolutionAcros Organics419550010
ElektrochlorAquaChlor
Tirator jodometrycznyHach1690001
Albumina surowicy bydlęcejMP BiomedicalsNC0117242
TryptoneFisherBP1421-100
Mucyna bydlęcaEMD Milipore49-964-3500MG
0,22 i mikro; m FiltrEMD MiliporeGVWP04700
NaClFisherBP358-1
Sonda pH skóryHanna InstrumentsH199181
Duża torba na próbkiWhirlpak NascoB01447WA
Butelka lejkowaThermo Scientific3120850001Możesz wywiercić otwór o odpowiedniej wielkości w wieczku butelki, aby utworzyć lejek, który będzie dozował wodę o odpowiednim natężeniu przepływu
EtanolThermoScientific615090010Wymieszaj z wodą, aby wytworzyć 70% etanolu
Butelka z rozpylaczemQorpakPLC06934
E. coliATCC25922
LB BulionFisher BioReagentsBP1426-2
LB AgarFisher BioReagentsBP1425-500
Sterylna pętlaGlobe Scientific22-170-204
Phi6HER102
Bulion odżywczyBD DifcoBD 247110
Spektrofotometr GeneQuant 100General Electric28-9182-04
Tiosiarczan soduFisher ChemicalS445-3
Filtr membranowy (47 mm, 0,45 &mikro; m)EMD MilliporeHAWP04700
m-ColiBlue24 pożywka bulionowaEMD MilliporeM00PMCB24
szalka Petriego z podkładką (47 mm)Fisherbrand09-720-500
Kolektor próżniowyThermo Scientific/Nalgene09-752-5
Lejki filtracyjneThermo Scientific/Nalgene09-747
Pseudomonas syringaeHER1102
Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanemThermo Scientific10010031może być również mieszany ze związków źródłowych według dowolnej podstawowej receptury
w kostce White Beauty Baretylowym Mała torba na próbki Whirlpak Nasco B01323WA

Bibliografia

  1. Kampf, G., Kramer, A. Epidemiologic Background of Hand Hygiene and Evaluation of the Most Important Agents for Scrubs and Rubs. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 863-893 (2004).
  2. Miller, T., Patrick, D., Ormrod, D. Hand decontamination: influence of common variables on hand-washing efficiency. Healthc Infect. 16 (1), 18(2013).
  3. Jensen, D. A., Danyluk, M. D., Harris, L. J., Schaffner, D. W. Quantifying the effect of hand wash duration, soap use, ground beef debris, and drying methods on the removal of Enterobacter aerogenes on hands. J Food Prot. 78 (4), 685-690 (2015).
  4. Girou, E., Loyeau, S., Legrand, P., Oppein, F., Brun-Buisson, C. Efficacy of handrubbing with alcohol based solution versus standard handwashing with antiseptic soap: randomised clinical trial. BMJ. 325 (7360), 362(2002).
  5. Kac, G., Podglajen, I., Gueneret, M., Vaupré, S., Bissery, A., Meyer, G. Microbiological evaluation of two hand hygiene procedures achieved by healthcare workers during routine patient care: a randomized study. J Hosp Infect. 60 (1), 32-39 (2005).
  6. Lages, S. L. S., Ramakrishnan, M. A., Goyal, S. M. In-vivo efficacy of hand sanitisers against feline calicivirus: a surrogate for norovirus. J Hosp Infect. 68 (2), 159-163 (2008).
  7. Holton, R. H., Huber, M. A., Terezhalmy, G. T. Antimicrobial efficacy of soap and water hand washing versus an alcohol-based hand cleanser. Tex Dent J. 126 (12), Retrieved from: http://www.tda.org/Publications/Texas-Dental-Journal 1175-1180 (2009).
  8. Salmon, S., Truong, A. T., Nguyen, V. H., Pittet, D., McLaws, M. -L. Health care workers' hand contamination levels and antibacterial efficacy of different hand hygiene methods used in a Vietnamese hospital. Am J Infect Control. 42 (2), 178-181 (2014).
  9. Steinmann, J., Nehrkorn, R., Meyer, A., Becker, K. Two in-vivo protocols for testing virucidal efficacy of handwashing and hand disinfection. Int J Hyg Environ Health. 196 (5), Retrieved from: https://www.journals.elsevier.com/international-journal-of-hygiene-and-environmental-health 425-436 (1995).
  10. Weber, D. J., Sickbert-Bennett, E., Gergen, M. F., Rutala, W. A. Efficacy of selected hand hygiene agents used to remove Bacillus atrophaeus (a surrogate of Bacillus anthracis) from contaminated hands. JAMA. 289 (10), 1274-1277 (2003).
  11. Grayson, M. L., Melvani, S., et al. Efficacy of Soap and Water and Alcohol-Based Hand-Rub Preparations against Live H1N1 Influenza Virus on the Hands of Human Volunteers. Clin Infect Dis. 48 (3), 285-291 (2009).
  12. Oughton, M. T., Loo, V. G., Dendukuri, N., Fenn, S., Libman, M. D. Hand hygiene with soap and water is superior to alcohol rub and antiseptic wipes for removal of Clostridium difficile. Infect Control Hosp Epidemiol. 30 (10), 939-944 (2009).
  13. Liu, P., Yuen, Y., Hsiao, H. -M., Jaykus, L. -A., Moe, C. Effectiveness of liquid soap and hand sanitizer against Norwalk virus on contaminated hands. Appl Environ Micro. 76 (2), 394-399 (2010).
  14. Savolainen-Kopra, C., Korpela, T., et al. Single treatment with ethanol hand rub is ineffective against human rhinovirus--hand washing with soap and water removes the virus efficiently. J Med Virol. 84 (3), 543-547 (2012).
  15. Tuladhar, E., Hazeleger, W. C., Koopmans, M., Zwietering, M. H., Duizer, E., Beumer, R. R. Reducing viral contamination from finger pads: handwashing is more effective than alcohol-based hand disinfectants. J Hosp Infect. 90 (3), 226-234 (2015).
  16. Steinmann, J., Paulmann, D., Becker, B., Bischoff, B., Steinmann, E., Steinmann, J. Comparison of virucidal activity of alcohol-based hand sanitizers versus antimicrobial hand soaps in vitro and in vivo. J Hosp Infect. 82 (4), 277-280 (2012).
  17. de Aceituno, A. F., Bartz, F. E., et al. Ability of Hand Hygiene Interventions Using Alcohol-Based Hand Sanitizers and Soap To Reduce Microbial Load on Farmworker Hands Soiled during Harvest. J Food Protect. 78 (11), 2024-2032 (2015).
  18. Sterk, E. Médecins Sans Frontières - Filovirus Haemorrhagic Fever Guideline. , Available from: http://jid.oxfordjournals.org/content/204/suppl_3/S791.full (2008).
  19. World Health Organization. WHO Report. Ebola Virus Disease ( EVD ) Key questions and answers concerning water, sanitation and hygiene. , Available from: http://www.who.int/water_sanitation_health/WASH_and_Ebola.pdf 1-5 (2014).
  20. World Health Organization. Guidelines on Hand Hygiene in Health Care. First Global Patient Safety Challenge, Clean Care is Safer Care. , Available from: http://whqlibdoc.who.int/publications/2009/9789241597906_eng.pdf (2009).
  21. Boyce, J. M., Pittet, D. Guideline for Hand Hygiene in Health-Care Settings Recommendations of the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee and the HICPAC/SHEA/APIC/IDSA Hand Hygiene Task Force. Infect Control Hosp Epidemiol. 23 (12 Suppl), Society for Healthcare Epidemiology of America. S3-S40 (2002).
  22. Emmanuel, J., Ndoye, B. UNDP Medical Waste Experts Assessment and Recommendations Regarding Management of Ebola-Contaminated Waste. , United Nations Development Programme. Available from: https://noharm-global.org/sites/default/files/documents-files/3127/Report%20to%20WHO%20WASH%20and%20Geneva%20on%20Ebola%20final.pdf (2015).
  23. Hopman, J., Kubilay, Z., Allen, T., Edrees, H., Pittet, D., Allegranzi, B. Efficacy of chlorine solutions used for hand hygiene and gloves disinfection in Ebola settings: a systematic review. Antimicrob Resist Infect Control. 4 (1), 1(2015).
  24. Lowbury, E. J. L., Lilly, H. A., Bull, J. P. Disinfection of hands: removal of transient organisms. BMJ. 2 (5403), 230-233 (1964).
  25. Edmonds, S. L., Zapka, C., et al. Effectiveness of Hand Hygiene for Removal of Clostridium difficile Spores from Hands. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (3), 302-305 (2013).
  26. Rotter, M. L. 150 years of hand disinfection-Semmelweis' heritage. Hyg Med. (22), 332-339 (1997).
  27. Hitomi, S., Baba, S., Yano, H., Morisawa, Y., Kimura, S. Antimicrobial effects of electrolytic products of sodium chloride--comparative evaluation with sodium hypochlorite solution and efficacy in handwashing. Kansenshōgaku Zasshi. 72 (11), 1176-1181 (1998).
  28. ASTM International. Standard E1174-13. Standard Test Method for Evaluation of the Effectiveness of Health Care Personnel Handwash Formulations. , Available from: https://www.astm.org/ (2013).
  29. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Evaluation of eluents for the recovery of an enveloped virus from hands by whole-hand sampling. J Appl Microbiol. 118 (5), 1210-1216 (2015).
  30. Sinclair, R. G., Rose, J. B., Hashsham, S. A., Gerba, C. P., Haas, C. N. Criteria for Selection of Surrogates Used To Study the Fate and Control of Pathogens in the Environment. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1969-1977 (2012).
  31. Held, E., Skoet, R., Johansen, J. D., Agner, T. The hand eczema severity index (HECSI): A scoring system for clinical assessment of hand eczema. A study of inter- and intraobserver reliability. Br J Dermatol. 152 (2), 302-307 (2005).
  32. Chlorine Total, Iodometric Method Using Sodium Thiosulfate, Method 8209 Digital Titrator. , Available from: http://www.hach.com/asset-get.download-en.jsa?id=7639983937 (2016).
  33. GeneQuant 100 User Manual. , Available from: http://biochromspectros.com/media/wysiwyg/support_page/support-genequant-100/Genequant-100-UM.pdf (2016).
  34. United States Environmental Protection Agency. Method 1604: Total Coliforms and Escherichia coli in Water by Membrane Filtration Using a Simultaneous Detection Technique (MI Medium). , Available from: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-08/documents/method_1604_2002.pdf (2002).
  35. Adams, M. H., Anderson, E. S. Bacteriophages. , Interscience Publishers. New York. (1959).
  36. Kao, L. S., Green, C. E. Analysis of Variance: Is There a Difference in Means and What Does It Mean? The Journal of surgical research. 144 (1), 158-170 (2008).
  37. Schutz, R. W., Gessaroli, M. E. The Analysis of Repeated Measures Designs Involving Multiple Dependent Variables. Research Quarterly for Exercise and Sport. 58 (2), 132-149 (1987).
  38. Woolwine, J. D., Gerberding, J. L. Effect of testing method on apparent activities of antiviral disinfectants and antiseptics. Antimicrob Agents Chemother. 39 (4), 921-923 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Skuteczność mycia rąkusuwanie patogenów zakaźnychmikroorganizmy zastępczemetoda glove juicefiltracja membranowatest plackowyanaliza wody z płukaniawartość redukcji logarytmicznejśrodek do dezynfekcji rąkmycie rąk z użyciem chloru
Metoda badania skuteczności mycia rąk w usuwaniu pojawiających się zakaźnych patogenów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.