Ta praca szczegółowo opisuje krok po kroku metodę przygotowania bogatych w polifenole ekstraktów z liofilizowanego proszku jagodowego. Ponadto zawiera dokładny opis sposobu stosowania tych bogatych w polifenole ekstraktów w hodowli komórkowej w obecności hormonu peptydowego angiotensyny II (Ang II) przy użyciu komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekstrakcja i oczyszczanie polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego do leczenia komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania epidemiologiczne wskazują, że zwiększone spożycie flawonoidów koreluje ze zmniejszoną śmiertelnością z powodu chorób sercowo-naczyniowych (CVD) w Stanach Zjednoczonych (USA) i Europie. Jagody są powszechnie spożywane w USA i mają wysoką zawartość polifenoli. Wykazano, że polifenole wchodzą w interakcje z wieloma celami molekularnymi i wywierają liczne pozytywne funkcje biologiczne, w tym działanie przeciwutleniające, przeciwzapalne i kardioprotekcyjne. Polifenole wyizolowane z jeżyny (BL), maliny (RB) i maliny czarnej (BRB) zmniejszają stres oksydacyjny i starzenie się komórek w odpowiedzi na angiotensynę II (Ang II). Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis protokołu stosowanego do przygotowania ekstraktów polifenolowych z liofilizowanych jagód. Ekstrakcje polifenoli z liofilizowanego proszku jagodowego przeprowadzono przy użyciu 80% wodnego etanolu i metody ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami. Surowy ekstrakt poddano dalszemu oczyszczaniu i frakcjonowaniu przy użyciu odpowiednio chloroformu i octanu etylu. Działanie zarówno surowych, jak i oczyszczonych ekstraktów przetestowano na komórkach mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) w hodowli.
Wprowadzenie
Polifenole to związki zawierające co najmniej jeden pierścień fenolowy w swojej strukturze i są obficie obecne w królestwie roślin1. Ludzie od tysiącleci spożywają rośliny w celach leczniczych, nie zdając sobie sprawy z istnienia takich związków2. Wiele owoców i warzyw ma pewne wspólne związki polifenolowe, choć w różnych ilościach, w tym flawonoidy, stylbeny i kwasy fenolowe3. Chociaż polifenole są często kojarzone z kolorowymi owocami i warzywami, nie jest to do końca prawda. Na przykład zeaksantyna i ksantyna są obecne w warzywach, które nie są zbyt kolorowe, takich jak cebula i czosnek, które ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Przygotuj 80% etanol (100 ml), mieszając 80 ml absolutnego etanolu (klasy biologicznej molekularnej) i 20 ml sterylnej wody do hodowli komórkowych.
- Aby przygotować ekstrakt polifenolowy (10 mg/ml), należy odważyć 10 mg CE lub PE. Dodaj 1 ml zwykłego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) pod kapturem do hodowli komórkowych. Wiruj roztwór. Podwielokrotność rozliczyć w porcjach po 200 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Przygotować bufor do lizy.
- Dodać 5 ml 1 M roztworu podstawowego HEPES (pH 7,4; 50 mM wersja ostateczna), 1 ml 5 M roztworu podstawowego NaCl (50 mM wer....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wcześniej wykazano, że ekstrakty polifenolowe wyizolowane z BL, RB i BRB hamowały starzenie się VSMC w odpowiedzi na Ang II21. Wykazano, że te oczyszczone ekstrakty polifenolowe modulują sygnalizację Ang II poprzez redukcję fosforylacji Akt, kinazy p38 MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) oraz ERK1/2. BL zapobiega starzeniu poprzez zmniejszenie ekspresji oksydazy NADPH (Nox) 1, enzymu produkującego aniony ponadtlenkowe, którego ekspresja jest silnie zwiększana p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Polifenole wyizolowane z jagód zawierają różne składy. Opisany tutaj protokół ekstrakcji na bazie etanolu pozwolił na identyfikację różnych poziomów kwasów fenolowych i flawonoidów obecnych w surowych i oczyszczonych ekstraktach polifenolowych BL (tab. 1). CE został wzbogacony w kwas galusowy, kwas ferulowy, kwas 4-O-kawoilochinowy i kwas 5-O-kawoilochinowynowy. Proces oczyszczania nie zmienił istotnie poziomu kwasu galusowego i kwasu p-kumarowego. Zwiększył jednak poziom kwasu 3-O-kawoilochinowego ze 17.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez American Heart Association (14GRNT20180028) oraz Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Angiotensyna II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Leczenie VSMC |
| i beta-aktyny | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Przeciwciało pierwszorzędowe (1:5000) |
| Owoce jeżyny | Mercer Foods | Liofilizowana jeżyna w proszku | |
| Katalaza | Calbiochem | 219010 | Przeciwciało pierwszorzędowe (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Przygotowanie oczyszczonych ekstraktów polifenolowych |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Hodowla VSMC |
| Etanol (absolutna klasa biologii molekularnej) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparat ekstraktów polifenolowych |
| Octan etylu | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Przygotowanie oczyszczonych ekstraktów polifenolowych |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S Przeciwciało | pierwszorzędowe (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8,0 | Teknova, Inc. | E0306 | Bufor do lizy |
| Liofilizator | Labconco | VirTis Benchtop K | Przygotowanie ekstraktów polifenolowych |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Hodowla komórkowa |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Bufor do lizy |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Bufor do lizy |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Bufor do lizy |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Bufor do lizy |
| Na4P2O7 , dziesięciowodny | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Bufor do lizy |
| fosfo ERK1/2 | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | 9101S Przeciwciało | pierwotne (1:1000) |
| Koktajl inhibitorów proteazy | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Bufor do lizy |
| Odczynnik barwnikowy do oznaczania białek | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Pomiar stężenia białka Membrana |
| transferowa PVDF | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blot |
| Parownik obrotowy | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 | Przygotowanie ekstraktów polifenolowych |
| Sterylna woda | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Przygotowanie ekstraktów polifenolowych |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Przygotowanie ekstraktów komórkowych |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Przeciwciało pierwszorzędowe (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Otrzymywanie ekstraktów polifenolowych |
Bibliografia
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
