Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Summary

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Abstract

Powrót do funkcjonalności rzadko następuje po urazie lub wywołanym chorobą zwyrodnieniu w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) z powodu hamującego środowiska i ograniczonej zdolności do neurogenezy. Opracowujemy strategię, która ma na celu jednoczesne zajęcie się utratą szlaków neuronalnych i aksonalnych w obrębie uszkodzonego OUN. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół wytwarzania mikrotkankowych sieci neuronowych (mikro-TENN), wszczepialnych konstruktów składających się z neuronów i wyrównanych dróg aksonalnych obejmujących światło macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wstępnie uformowanego cylindra hydrożelowego o średnicy setek mikronów, który może rozciągać się na centymetry długości. Agregaty neuronalne są ograniczone do skrajności trójwymiarowej obudowy i są rozpięte przez projekcje aksonalne. Mikro-TENNY są wyjątkowo dobrze przygotowane jako strategia rekonstrukcji ośrodkowego układu nerwowego, naśladując aspekty cytoarchitektury konektomu mózgu i potencjalnie dostarczając środków do wymiany sieci. Agregaty neuronalne mogą łączyć się w synapsę z tkanką gospodarza, tworząc nowe funkcjonalne przekaźniki w celu przywrócenia i/lub modulacji brakujących lub uszkodzonych obwodów. Konstrukty te mogą również działać jako proregeneracyjne "żywe rusztowania" zdolne do wykorzystywania mechanizmów rozwojowych do migracji komórek i odnajdywania ścieżek aksonalnych, dostarczając synergicznych strukturalnych i rozpuszczalnych wskazówek w oparciu o stan regeneracji. Micro-TENN są wytwarzane przez wlanie płynnego hydrożelu do cylindrycznej formy zawierającej wzdłużnie wyśrodkowaną igłę. Gdy hydrożel zżeluje się, igła jest usuwana, pozostawiając pustą mikrokolumnę. Roztwór ECM jest dodawany do światła, aby zapewnić środowisko odpowiednie do adhezji neuronów i wzrostu aksonów. Zdysocjowane neurony są mechanicznie agregowane w celu precyzyjnego wysiewu w obrębie jednego lub obu końców mikrokolumny. Metodologia ta niezawodnie tworzy samodzielne miniaturowe konstrukty z długimi wystającymi drogami aksonalnymi, które mogą podsumowywać cechy neuroanatomii mózgu. Immunoznakowanie synaptyczne i genetycznie kodowane wskaźniki wapnia sugerują, że mikro-TENNY mają rozległą dystrybucję synaptyczną i wewnętrzną aktywność elektryczną. W związku z tym mikro-TENN stanowią obiecującą strategię celowanej neurochirurgicznej rekonstrukcji ścieżek mózgowych i mogą być również stosowane jako modele biofideliczne do badania zjawisk neurobiologicznych in vitro.

Introduction

Wspólną cechą zaburzeń i chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), takich jak urazowe uszkodzenie mózgu (TBI), uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI), udar, choroba Alzheimera i choroba Parkinsona, jest odłączenie ścieżek aksonalnych i utrata komórek neuronalnych^1,2,3,4,5,6. Na przykład, gdy udar niedokrwienny nie jest leczony, szacuje się, że aksony są tracone w tempie 7 mil na minutę⁵. W przypadku TBI, którego doświadcza około 1,7 miliona osób roczn....

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Pensylwanii oraz Centrum Medyczne ds. Weteranów Michaela J. Crescenza i przestrzegały wytycznych zawartych w Polityce Publicznej Służby Zdrowia NIH dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (2015).

1. Opracowanie hydrożelu agarozowego (bezkomórkowego składnika mikro-TENNs)

1. Przygotowanie roztworu agarozy
   1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przygotuj zbiorniki na mikrokolumny, przenosząc 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosfo....

Results

Mikro-TENNY były monitorowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby ocenić ich cytoarchitekturę i wzrost aksonów (Rysunek 4). W obrębie jednokierunkowych mikro-TENN o długości 2 mm agregaty neuronalne były ograniczone do jednego końca mikrokolumny i rzutowały wiązkę aksonów przez wewnętrzne jądro. Aksony obejmowały całą długość kolumny przez 5 dni in vitro (DIV) (Figura 4A). Wystąpiło większe początkowe tempo wzrostu aksonów w dwukierun.......

Discussion

Uszkodzenie i choroba OUN zazwyczaj powodują utratę lub dysfunkcję długodystansowych ścieżek aksonalnych, które składają się na konektom mózgu, z jednoczesnym zwyrodnieniem neuronów lub bez niego. Jest to spotęgowane przez ograniczoną zdolność OUN do promowania neurogenezy i regeneracji. Pomimo dążenia do strategii naprawczych, takich jak dostarczanie czynnika wzrostu, komórek i biomateriałów, jako podejść indywidualnych lub kombinatorycznych, techniki te nie uwzględniają jednocześnie zarówno degeneracji komórek neuronal.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wycinarka laserowa	Universal Laser Systems	PLS4.75	Służy do wytwarzania wycinanej laserowo formy mikrokanałowej.
Laserowo wycinane urządzenie do produkcji mikrokolumn	Wykonane na zamówienie	--------------	Skontaktuj się z naszą grupą badawczą, jeśli jesteś zainteresowany. Wymiary i plany podane w rękopisie.
	--------------	--------------	#4-40 o średnicy gwintu 3,05 mm
Nakrętki	--------------	--------------	#4-40 o średnicy gwintu 3,05 mm
Igła do akupunktury (180 &mikro; m średnicy)	Lhasa Medical	sj.16X40	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru światła mikrokolumny.
szalka Petriego	Fisher	08772B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polistyrenowa jednorazowa pipeta serologiczna	Fisher	13-678-11D
Agaroza	Sigma	A9539-50G
Rurka kapilarna (398 &mikro; m średnicy)	Fisher	21170D	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru powłoki mikrokolumny.
Płyta grzejna	Fisher	SP88857200
Listwa magnetyczna	Fisher	1451352
Mikropipeta	Sigma	Z683884-1EA
Igła o rozmiarze 25 mm	Fisher	14-826-49
Mikroskalpel	Roboz Chirurgiczne	RS-6270
Nożyczki	Narzędzia do nauki	14081-09
Kleszcze	World Precision Instruments	501985
Sterylizator gorących koralików	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N	Używany do wszystkich etapów preparacji i do produkcji mikro-TENN.
Ogon szczura typu I kolagen	Corning	354236	Utrzymuj na poziomie 4 º C i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. Używaj lodu, aby utrzymać jego temperaturę podczas użytkowania.
Probówka do mikrowirówek	Fisher	02-681-256
Laminina myszy	Corning	354232	Utrzymuj na poziomie 4 & ordm; C i usuwaj tylko wtedy, gdy jest to potrzebne. Używaj lodu, aby utrzymać jego temperaturę podczas użytkowania.
Pożywka neuropodstawowa	Invitrogen	21103049	Podłoże bazowe do hodowli prenatalnych i embrionalnych komórek neuronalnych. Sklep w 4º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher	SS2661
Kwas solny (HCl)	Fisher	SA48-1
Papierek lakmusowy	Fisher	09-876-18
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Invitrogen	14170112	Przechowywać w temperaturze 4 &C.
0,25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Bydlęca deoksyrybonukleaza trzustkowa (DNaza) I	Sigma	10104159001	Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
B-27 Suplement	Invitrogen	12587010	Suplement dodawany do podłoża neurobazalnego do hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej. Przechowywać w temperaturze -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
L-glutamina	Invitrogen	35050061	Sklep pod adresem -20 º C i ciepły na 37 º C przed użyciem.
Sprague Dawley embrionalny dzień 18 szczurów	Charles River	Szczep 001
Pipeta Pasteura	Fisher	22-042816
Probówka wirówkowa 15 ml	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Wirówka	Fisher	05-413-115
Hemocytometr	Fisher	02-671-6
Drukarka 3D Objet30	Stratasys	--------------	Służy do wytwarzania piramidalnych form mikro-studzienek.
Wydrukowana w 3D piramidalna forma studni	Wykonane na zamówienie	--------------	Skontaktuj się z naszą grupą badawczą, jeśli jesteś zainteresowany. Wymiary i plany podane w rękopisie.
Polidimetylosiloksan (PDMS) i utwardzacz	Fisher	NC9285739	W zestawie z elastomerem i utwardzaczem. Stosować wewnątrz dygestorium chemicznego.
Lejek	Fisher	10-348C
1 ml gruszka do pipety	Sigma	Z509035
Mikroszpatułka	Fisher	S50821
12-dołkowa płytka hodowlana	EMESCO	1194-353043
Piekarnik	Fisher	11-475-154
Inkubator	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Przechowywać w temperaturze -80ºC. Dostępny w handlu wirus związany z adenowirusem (AAV) ze wskaźnikiem wapnia GCaMP6f.
Formaldehyd 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyd jest toksycznym związkiem, o którym wiadomo, że jest rakotwórczy i należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Triton X-100	Sigma	T8787	Niejonowy środek powierzchniowo czynny stosowany do przepuszczalności błon komórkowych.
Surowica końska	Gibco	16050-122
Mysie przeciwciało pierwotne tubuliny anty-Tuj-1 / beta-III	Sigma	T8578-200UL	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Królicze przeciwciało pierwszorzędowe antysynapsyny 1	Układy synaptyczne	106-001	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom osła 568	Invitrogen	A10037	Przechowywać w 4ºC.
Przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi 488	Invitrogen	A21206	Przechowywać w 4ºC.
Hoechst 33342, Trichlorowodorek	Invitrogen	H3570	Przechowywać pod adresem 4ºC.  Hoechst jest znanym mutagenem, który powinien być traktowany jako czynnik rakotwórczy. Dlatego należy go wyrzucić do osobnego pojemnika.
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny A1RSI	Nikon	--------------	Służy do wykonywania konfokalnych rekonstrukcji konstruktów znakowanych immunologicznie.
Mikroskop Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Służy do robienia zdjęć z kontrastem fazowym.  Z cyfrową akwizycją obrazu za pomocą aparatu QiClick połączonego z oprogramowaniem Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Szybki mikroskop fluorescencyjny	Mikroskop Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti w połączeniu z aparatem ANDOR Neo/Zyla do obrazowania wapnia.
Oprogramowanie NIS Elements AR 4.50.00	Nikon Instruments	--------------	Służy do identyfikacji stanów przejściowych wapnia na podstawie nagrań wykonanych za pomocą szybkiego mikroskopu fluorescencyjnego.