Artykuł metodologiczny

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje procedurę zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzanie ich bezpośrednio w ciekłym azocie. Protokół ten podkreśla również nowy kriowial, który może uniknąć "ogólnego efektu" gazowego azotu, gdy ciekły azot styka się z powierzchnią tkanki próbki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad fizjologią mięśni szkieletowych stoją przed technicznym wyzwaniem odpowiedniego przetwarzania próbek w celu uzyskania sekcji z wyraźnie widocznymi przedziałami cytoplazmatycznymi. Kolejną przeszkodą jest ścisłe przyleganie włókien mięśniowych do otaczających tkanek. Ponieważ proces utrwalania tkanek i osadzania parafiny prowadzi do kurczenia się włókien mięśniowych, zamrażanie jest optymalnym sposobem utwardzania tkanki mięśniowej do cięcia. Jednak często spotykany problem, jakim jest tworzenie się kryształków lodu, występuje podczas przygotowywania zamrożonych skrawków ze względu na wysoką zawartość wody w mięśniach. Przedstawiony tutaj protokół jako pierwszy opisuje prostą i skuteczną metodę prawidłowego zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzenie ich w ciekłym azocie. Problem z użyciem samego ciekłego azotu polega na tym, że powoduje on powstawanie bariery gazowej azotu obok tkanki, która działa jak izolator i hamuje chłodzenie tkanek. Aby uniknąć efektu "koca parowego", zaprojektowano nowy kriowial, który zwiększa prędkość przepływu cieczy po powierzchni tkanki. Osiągnięto to poprzez wybicie łącznie 14 otworów wlotowych w ściance fiolki. Zgodnie z dynamiką pęcherzyków, większe natężenie przepływu cieczy skutkuje mniejszymi pęcherzykami i mniejszymi szansami na utworzenie bariery gazowej. Kiedy ciekły azot wpływa do kriowialu przez otwory wlotowe, prędkość przepływu wokół tkanki jest wystarczająco duża, aby wyeliminować barierę gazową. W porównaniu z metodą zamrażania tkanek mięśniowych przy użyciu wstępnie schłodzonego izopentanu, protokół ten jest prostszy i bardziej wydajny i może być stosowany do zamrażania mięśni w sposób przepustowy. Ponadto metoda ta jest optymalna dla instytucji, które nie mają dostępu do izopentanu, który jest skrajnie łatwopalny w temperaturze pokojowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mięśnie szkieletowe są najcenniejszym składnikiem zwierzęcia produkującego mięso z punktu widzenia żywienia i przetwarzania. W przemyśle mięsnym istnieją dwa szczególnie krytyczne aspekty: efektywność wzrostu mięśni i jakość uzyskanego mięsa. Jako główny składnik mięśni, włókna mięśniowe są bezpośrednio związane z wydajnością wzrostu i jakością świeżego mięsa u zwierząt1. Na przykład całkowita liczba włókien (TNF) i pole przekroju poprzecznego włókien (CSAF) w większości determinują masę mięśniową i jakość mięsa; również skład rodzaju błonnika (FTC) silnie wpływa na jakość świeżego mięsa2. Dlatego manipulacja cechami włókien mięśniowych u zwierząt jest wysoce skuteczną metodą zwiększania podstawowej rentowności i konkurencyjności gospodarstw1.

Do tej pory zidentyfikowano kilka wewnętrznych i zewnętrznych czynników manipulujących charakterystyką włókien mięśniowych1. Manipulację tą można osiągnąć poprzez ukierunkowaną selekcję zwierząt z określonymi genami, takimi jak gen miostatyny u bydła3, gen Callipyge u owcy4 oraz geny RYR1 i IGF2 u świń5. Również kontrola diety i leczenie określonymi hormonami odgrywają ważną rolę w charakterystyce włókien mięśniowych6. W ten sposób podejście, które łączy czynniki genetyczne i żywieniowe, może być w stanie poprawić zawartość chudego mięsa i jego jakość. Jednak badania nad włóknami mięśniowymi są ograniczone w przemyśle mięsnym, ponieważ wyjaśnienie budowy włókien mięśniowych nadal stanowi wyzwanie.

Właściwości włókien mięśniowych są identyfikowane za pomocą metod histochemicznych, takich jak test miozyny adenozynotrifosfatazy (ATPazy). Metoda ta opiera się na fakcie, że enzymy znajdujące się w cienkich (6-8 μm) zamrożonych odcinkach włókien mięśniowych mogą ulegać reakcji chemicznej z niektórymi produktami. Jednak zawartość wody w mięśniach jest większa niż 75% u świń, królików, myszy i ludzi, niezależnie od pozycji (tj. grzbiet, brzuch lub kończyna tylna)7. Tak wysoka zawartość wilgoci w mięśniach powoduje często spotykany problem – zamarzanie artefaktów – podczas przygotowywania kriosekcji, jak opisano wcześniej8,9. Z naszego doświadczenia wynika, że w większości przypadków odpowiednie zamrożenie tkanek mięśniowych na linii produkcyjnej w rzeźni jest prawie niemożliwe.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą i efektywną metodę stosowaną w naszym laboratorium do zamrażania tkanek mięśniowych do kriosekcji w sposób wysokoprzepustowy. Główną atrakcją tej metody jest nowy kriowial, który jest przeznaczony do błyskawicznego zamrażania tkanek mięśniowych w ciekłym azocie. Obecny przebieg pracy może jednocześnie ułatwić zamrażanie i przetwarzanie tkanek w celu uzyskania doskonałej kriosekcji mięśni, z wyraźnie widocznym przedziałem cytoplazmatycznym i ścisłym przyleganiem włókien mięśniowych do otaczającej tkanki. Ponadto protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy opcji analizy tkanek, ponieważ ciekły azot nie miesza się z tkankami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecna metoda została opracowana i zatwierdzona do zbierania i przechowywania ponad 1000 próbek mięśni do barwienia histologicznego w naszym laboratorium. Wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i ich użytkowaniem były zgodne z wytycznymi ustanowionymi przez Ministerstwo Rolnictwa Chin.

1. Sprzęt do pobierania próbek

  1. Oznacz tożsamość próbki na każdej fiolce kriogenicznej.
    Uwaga: Fiolka kriogeniczna jest specjalnie zaprojektowana do zamrażania świeżych próbek tkanek do procedury kriosekcji (ryc. 1A). Fiolki są wykonane z polipropylenu w fabryce form (rysunek 1C).
  2. Zaopatrz się w następujący sprzęt: ciekły azot w odpowiednim zbiorniku z ciekłym azotem, okulary ochronne lub przyłbicę, rękawice do zamrażania, kleszcze 10 cm, pęseta 25 cm, chłodziarka styropianowa (wymiary wewnętrzne: dł. 20 cm x szer. 12 cm x wys. 13,5 cm; wymiary zewnętrzne: dł. 24 cm x szer. 16 cm x wys.), folia z tworzywa sztucznego (dł. 2,5 cm x szer. 0,8 cm x grubość 0,1 mm), skalpel i okładki do oprawy A4 z PVC (21 cm x 29,5 cm) (Rysunek 1B).

2. Przygotowanie próbek mięśni

  1. Napełnij chłodnicę styropianu ciekłym azotem 5 minut przed pobraniem próbki.
    UWAGA: Duża kolumna ciekłego azotu jest niezbędna, ponieważ część ciekłego azotu gotuje się i zamienia w gaz, gdy dotykają jej świeże próbki. Aby zmniejszyć częstotliwość przenoszenia ciekłego azotu w celu uzupełnienia ubytku, należy wcześniej nabyć chłodnicę styropianową o odpowiedniej wielkości, w zależności od liczby próbek.
  2. Po uzyskaniu próbki delikatnie umieść ją na kawałku osłony wiążącej z PVC A4 i obserwuj kierunek włókien mięśniowych.
    UWAGA: Tutaj użyliśmy przekroju poprzecznego mięśnia najdłuższego grzbietu od pierwszego do ostatniego kręgu lędźwiowego u świń. Okazy mają około 12 cm długości, 8 cm szerokości i 5 cm wysokości.
  3. Za pomocą skalpela wykonaj dwa równoległe nacięcia przez próbkę w kierunku włókien mięśniowych, o długości około 3 cm i odległości 0,6 cm od siebie. Przytnij nacięty mięsień w prostokąt o szerokości około 0,6 cm x wysokości 0,6 cm x długości 1,5 cm.
    UWAGA: Wiarygodność pomiaru pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych zależy głównie od orientacji włókien naciętego mięśnia.
  4. Za pomocą kleszczyków o długości 10 cm delikatnie umieść próbkę na kawałku folii z tworzywa sztucznego, tak aby oś podłużna naciętego mięśnia była równoległa do dłuższej krawędzi folii (rysunek 2A).
    UWAGA: Folia z tworzywa sztucznego ma dwie funkcje: funkcję przytrzymywania, która pomaga w ustaleniu orientacji włókien mięśniowych oraz funkcję adhezji, która zapobiega pęknięciom próbki w wyniku szybkiego zamarzania.
  5. Za pomocą kleszczy umieść tkankę mięśniową w dolnej środkowej części oznakowanej fiolki kriogenicznej, tuż między otworami wlotowymi, a następnie szczelnie zakręć fiolkę (ryc. 2B).

3. Zamrażanie i przechowywanie próbek mięśni

  1. Za pomocą pęsety o długości 25 cm szybko zanurz całą fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie we wstępnie schłodzonej chłodnicy styropianowej, czekając, aż ciekły azot przestanie się gotować (około 10-20 s).
    UWAGA: Kriowial będzie unosił się na wodzie, gdy ciekły azot się zagotuje, więc ostrożnie zanurz fiolkę we wrzącym ciekłym azocie na 10-20 s.
  2. Przenieść próbki mięśni do zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

4. Przygotowanie slajdów

  1. Schłodzić kriostat do temperatury od -20 °C do -22 °C.
  2. Wyjmij i wyrzuć stare ostrze mikrotomu, wytrzyj uchwyt noża i płytkę zabezpieczającą przed przewróceniem się w kriostacie, zainstaluj nowe ostrze mikrotomu w kriostacie i ustaw grubość cięcia na 8 μm.
  3. Przenieść próbkę mięśni w fiolce kriogenicznej ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu, transportując ją w ciekłym azocie lub na suchym lodzie.
  4. Odczekać 30 minut, aż próbka zrównoważy się z temperaturą kriostatu.
    UWAGA: Wszelkie urządzenia, które mogą dotknąć próbki, muszą być wstępnie schłodzone, ponieważ wysoka temperatura może spowodować tworzenie się kryształków lodu w próbce.
  5. Zamontować próbkę w uchwycie próbki w optymalnym roztworze glikoli i żywic rozpuszczalnych w wodzie (OCT) o optymalnej temperaturze skrawania. Cięcie odcinków 8 μm.
    UWAGA: Dostosuj kąt cięcia prostopadle do orientacji włókien mięśniowych, ponieważ CSAF to pole przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.
  6. Zamontuj sekcje w kierunku środka mikroszkiełka o temperaturze pokojowej. Natychmiast umieść szkiełko w pojemniku na szkiełka w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Nie pozwól, aby szkiełko wyschło w temperaturze pokojowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilustracja kriowialna i powszechny sprzęt laboratoryjny do zamrażania mięśni podczas przygotowywania zamrożonych skrawków są pokazane na rysunku 1. Kriowiale są wykonane z polipropylenu w fabryce form. Każda fiolka ma w sumie 14 otworów wlotowych: jeden znajduje się na wieczku; drugi znajduje się na dole; a pozostałe 12 tworzy cztery równoległe linie, każda z czterema otworami pod kątem 90° względem siebie. Te otwory wlotowe mogą przyspieszyć prędkość przepływu ciekłego a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy nowy, wielootworowy kriowial do zamrażania i przechowywania tkanek mięśniowych w celu przeprowadzenia histologicznej oceny funkcji mięśni. Krytycznym zmodyfikowanym krokiem w tym protokole jest to, że próbka w wielootworowym kriowiale jest bezpośrednio zanurzona w ciekłym azocie. Według naszej wiedzy jest to najprostszy i najszybszy sposób uzyskania doskonałych zamrożonych próbek do kriosekcji mięśniowej spośród istniejących metod zamrażania (patrz reprezentatywne wyniki).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC): 31301950 i 31671288.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikrotom kriostatu  MikroskopLeica Leica CM1950
 NikonNikon DS-U3
  Fiolka kriogeniczna    Folia z tworzywa sztucznegoZaprojektowany przez nas
Powszechnie używane
cyfrowy Ciekły azot Skalpel używany powszechnie Kleszcze używane powszechnie 10 cm Pęseta 25 cm używane powszechnie Szkło bezpieczne używane komunalnie Rękawice do zamrażania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mro enie w ciek ym azocieprzygotowanie tkanki mi niowejeliminacja bariery parowejkrojenie tkanekkrojenie w kriosztacieanaliza aktywno ci ATPasealternatywa dla izopentanufizjologia mi ni szkieletowychprotok mro enia tkanek

Powiązane artykuły