Artykuł metodologiczny

Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

DOI:

10.3791/55617

⸱

2 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutics, Washington National Primate Research Center, University of Washington, 2Division of Primate Resources, Washington National Primate Research Center, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek wątroby i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) u makaków, która pozwala na zwiększenie częstotliwości pobierania próbek i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych w porównaniu do wykonywania laparotomii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węzły chłonne krezkowe (MLN) i wątroba są narażone na działanie mikrobów i produktów mikrobiologicznych z przewodu pokarmowego (GI), co czyni je immunologicznie unikalnymi. Przewód pokarmowy i związany z nim MLN są miejscami wczesnej replikacji wirusa w zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV), a MLN są prawdopodobnie ważnymi miejscami rezerwuarowymi, które zawierają utajone zakażone komórki nawet po długotrwałej terapii antyretrowirusowej (ART). Wykazano, że wątroba odgrywa znaczącą rolę w odpowiedziach immunologicznych na lentiwirusy i wydaje się, że odgrywa znaczącą rolę w usuwaniu wirusa z krążenia. Modele naczelnych innych niż ludzie (NHP) dla HIV i zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) ściśle naśladują te aspekty zakażenia wirusem HIV, a seryjne pobieranie próbek podłużnych z pierwotnych miejsc replikacji wirusa i związanych z nimi odpowiedzi immunologicznych w tym modelu pomoże wyjaśnić krytyczne zdarzenia w zakażeniu, patogenezę i wpływ różnych strategii interwencyjnych na te zdarzenia. Obecnie opublikowane techniki pobierania próbek wątroby i MLN obejmują poważną operację i/lub sekcję zwłok, co ogranicza możliwość badania tych ważnych miejsc w sposób seryjny u tego samego zwierzęcia. Wcześniej opisaliśmy laparoskopową technikę pobierania MLN. W tym miejscu opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania podłużnych próbek wątroby i MLN przez te same dwie lokalizacje portów, które są wymagane do pobrania MLN. Zastosowanie tych samych dwóch portów minimalizuje wpływ na zwierzęta, ponieważ nie są wymagane żadne dodatkowe nacięcia. Technika ta może być stosowana ze zwiększoną częstotliwością pobierania próbek w porównaniu z poważnymi operacjami jamy brzusznej i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych oraz związanych z nimi miejscowych i ogólnoustrojowych reakcji zapalnych, które mogą komplikować interpretację wyników. Procedura ta może potencjalnie ułatwić badania z wykorzystaniem modeli NHP przy jednoczesnej poprawie dobrostanu zwierząt.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewód pokarmowy (GI) jest największą powierzchnią błony śluzowej ciała i jest narażony na niezliczone antygeny pochodzące z żywności, patogenów i endosymbiotycznych społeczności bakteryjnych, powszechnie określanych jako mikrobiom1,2. Krezkowe węzły chłonne (MLN) wyściełają przewód pokarmowy i są głównym miejscem funkcji immunologicznej promującej odpowiedzi zapalne lub tolerogenne na te różne antygeny. Fizyczna organizacja MLN tworzy podzielony na przedziały system, który może reagować na antygeny lokalnie bez wywoływania odpowiedzi ogólnoustrojowych3. Podobnie, krew z przewodu pokarmowego spływa do wątroby przez żyłę wrotną przed powrotem do krążenia, a zatem jest narażona na działanie drobnoustrojów i produktów mikrobiologicznych, które przemieściły się z przewodu pokarmowego do blaszki właściwej i dostały się do krwiobiegu4. Wątroba funkcjonuje również jako wtórny narząd limfatyczny i ma dużą liczbę komórek odpornościowych, w tym wyspecjalizowane makrofagi, do usuwania translokowanych drobnoustrojów5,6. Tak więc MLN i wątroba są głównymi narządami odpornościowymi narażonymi na bakterie komensalne i chorobotwórcze z przewodu pokarmowego, a także środowisko antygenów z innych źródeł, co czyni je wyjątkowymi i ważnymi z perspektywy immunologicznej.

MLN są krytycznymi miejscami do oceny wirusologicznych i immunologicznych skutków zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) lub patogennym wirusem niedoboru odporności (SIV) i prawdopodobnie są zaangażowane we wczesne rozprzestrzenianie się SIV po prowokacji doodbytniczej. Wiadomo, że tkanka limfatyczna związana z jelitami jest głównym miejscem trwałej replikacji wirusa HIV, pomimo skutecznej kontroli wiremii za pomocą nowoczesnych terapii przeciwretrowirusowych (ART)7. W modelach infekcji SIV wykazano, że MLN są ważnymi rezerwuarami utajonego wirusa i mogą być głównym rezerwuarem8,9. Wątroba jest również ważna w zakażeniu lentiwirusowym, o czym świadczy akumulacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIV w wątrobach makaków podczas ostrego zakażenia SIV10. Co więcej, jest to główny organ odpowiedzialny za usuwanie wirusa z krążenia11.

Zakażenie HIV i SIV wiąże się ze zmienioną mikrobiotą przewodu pokarmowego, zaburzoną integralnością nabłonka przewodu pokarmowego oraz zwiększoną translokacją drobnoustrojów i produktów mikrobiologicznych z jelita grubego na obrzeża i krążenie12,13. Procesy te są związane z miejscową i ogólnoustrojową aktywacją immunologiczną oraz zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością u osób zakażonych wirusem HIV14. W zakażeniu SIV translokowane bakterie zaobserwowano w klasie MLN15, podczas gdy akumulacja produktów mikrobiologicznych w wątrobie powoduje stan zapalny i uszkodzenie narządu16. Tak więc, w kontekście zakażeń HIV i SIV, MLN i wątroba mogą być bardzo pouczające dla zrozumienia procesów zapalnych napędzanych przez bakterie rezydujące w przewodzie pokarmowym.

Tutaj prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek MLN i wątroby u naczelnych (NHP). Wykazaliśmy skuteczne działanie tej techniki na dwóch zdrowych samicach makaków rezusów (RM), pobierając próbki od każdego zwierzęcia dwa razy, z 160-dniowym odstępem między każdą operacją. Następnie wykorzystujemy te próbki do oceny i porównania kluczowych populacji leukocytów i limfocytów w każdym narządzie za pomocą cytometrii przepływowej i wykazujemy wysoce spójne dane między tymi dwoma punktami czasowymi.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta były trzymane i opiekowane w obiektach akredytowanych przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care international (AAALACi), a wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego i Washington National Primate Research Center.

1. Przygotowanie chirurgiczne, znieczulenie i analgezja

  1. Sedacja i indukcja
    1. Uspokoić makaka wstrzyknięciem domięśniowym 10 mg/kg ketaminy i 0,015 mg/kg deksmedetomidyny (łącznie w jednej strzykawce). Upewnij się, że nie ma odruchów wycofania przed wyjęciem z klatki.
    2. Zaintubuj zwierzę i utrzymuj je w znieczuleniu ogólnym za pomocą izofluranu (1,0 - 2,5%) i 100% tlenu. Więcej informacji na temat intubacji i znieczulenia ogólnego u makaków można znaleźć w odnośnikach17,18,19.
  2. Wspomaganie i monitorowanie anestezjologii
    1. Wprowadzić cewnik do żył obwodowych i podać dożylnie płyny izotoniczne (takie jak mleczanowy roztwór Ringera) w ilości 5 ml/kg/h przez cały czas znieczulenia i operacji. Zastosuj sterylny lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
    2. Zapewnij środki przeciwbólowe, takie jak preparat buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (0,2 mg/kg, podskórnie).
      UWAGA: NLPZ (taki jak meloksykam lub ketoprofen) może być również podawany podczas rekonwalescencji anestezjologicznej, pod warunkiem, że protokół eksperymentalny zezwala na podawanie NLPZ i że zwierzę jest normotensyjne i dobrze nawodnione podczas znieczulenia.
    3. Monitoruj głębokość znieczulenia (np. ton szczęki), tętno, częstość oddechów, EKG, ciśnienie krwi, natlenienie tętna, końcowy oddechowy CO2 i temperaturę ciała podczas znieczulenia i operacji.
      UWAGA: Gdy brzuch jest nadmuchiwany, zwierzę może hipowentylować. Zapewnić wentylację mechaniczną, jeśli częstość oddechów spada lub końcowy poziom CO2 w oddychaniu przekracza 45 mmHg.
    4. Po zabiegu chirurgicznym należy podać atipamezol (0,15 mg/kg mc., domięśniowo) w celu odwrócenia deksmedetomidyny.
  3. Przygotowanie chirurgiczne
    1. Wykonaj wiele lewatyw z ciepłą wodą, aby zmniejszyć objętość kału w okrężnicy, aby ułatwić wizualizację i manipulację jelitami podczas zabiegu20.
    2. Użyj maszynki do strzyżenia z ostrzem numer 40, aby usunąć włosy z pola operacyjnego. Gol się od grzbietu żebrowego do kości łonowej i od lewej do prawej flanki.
    3. Aseptycznie przygotować pole operacyjne za pomocą odpowiednich środków antyseptycznych, takich jak naprzemienne peelingi z alkoholem chlorheksydynowym lub powidonem i alkoholem jodowym.
    4. Ułóż zwierzę na stole operacyjnym na jego grzbiecie, pod kątem w połowie odległości między leżeniem grzbietowym a prawym bocznym. Zwiąż ręce i nogi liną w wyprostowanej pozycji. Zapewnij końcowe przygotowanie chlorheksydyny i alkoholu, gdy zwierzę przejdzie na salę operacyjną i zostanie ustawione do operacji.

2. Chirurgia

Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji na temat laparoskopii u małych zwierząt, zobacz reference21.

  1. Przygotowanie instrumentu laparoskopowego
    1. Ułóż zwierzę sterylną zasłoną z okienkami.
    2. Za pomocą niesterylnego asystenta owiń aparat cyfrowy sterylną zasłoną aparatu i przymocuj do wieży. Przymocuj sztywną lunetę do głowicy kamery.
    3. Podłącz sterylny świetlny do sztywnego lunety i podłącz do źródła światła. Balans bieli aparatu zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Podłącz sterylną rurkę insuflatora do insuflatora.
  2. Wejście laparoskopowe
    1. Za pomocą skalpela #15 wykonaj ~ 5 mm nacięcie kłute przez skórę na głębokość mięśni brzucha, około 1 - 2 cm na lewo od pępka.
    2. Używając ręki niedominującej, unieś ścianę brzucha czaszki do miejsca nacięcia kłutego. Ręką dominującą umieść końcówkę igły Veress w nacięciu i ustaw końcówkę pod kątem czaszkowym.
      UWAGA: Kąt penetracji igły Veress będzie się różnić w zależności od stanu ciała zwierzęcia. Na przykład u grubego zwierzęcia igła Veressa będzie musiała zostać wprowadzona prawie prostopadle do ściany brzucha. U szczupłego zwierzęcia igła Veressa powinna być ustawiona pod kątem czaszki, aby zmniejszyć ryzyko kontaktu z wnętrznościami.
      1. Trzymając trzon (nie piastę) igły Veress, mocno wciśnij igłę, aby wniknęła w ścianę brzucha do jamy brzusznej. Wyraźne "kliknięcie" i spadek oporu będą odczuwalne, gdy ostra końcówka wnika w otrzewną, a końcówka igły Veress wyskakuje do przodu do jamy brzusznej.
        UWAGA: Jeśli igła prawidłowo wejdzie do jamy brzusznej, opór będzie niewielki, gdy zostanie wysunięta i wycofana o 1 - 2 cm.
    3. Podłączyć rurkę wdmuchiwacza CO2 do igły i otworzyć zawór odcinający. Zwiększ ciśnienie w jamie brzusznej nie więcej niż 10-12 mmHg, aby wytworzyć odmę otrzewnową.
      UWAGA: Brzuch osiągnął idealną insuflację, gdy rozszerzył się symetrycznie i nastąpiła utrata normalnego ostrego konturu brzegów żebrowych. Ciśnienie powinno zapewniać odpowiednią przestrzeń do wprowadzenia kaniuli/trokaru bez ryzyka kontaktu z wnętrznościami.
  3. Umieszczenie kaniuli
    1. Gdy brzuch jest całkowicie nadmuchiwany, wykonaj nacięcie ~ 5 - 7 mm ostrzem skalpela #15 przez skórę lewej części brzucha czaszki do mięśni brzucha ~ 2 - 4 cm ogonowo do ostatniego żebra.
    2. Umieść zespół trokar-kaniula 5 mm przez nacięcie skóry i ustaw go pod kątem ~ 45 - 60 stopni ogoniasto-przyśrodkowo. Wniknąć do jamy brzusznej na głębokość 1-2 cm. Wkręć gwintowaną kaniulę w brzuch, obracając kaniulę (~ 0,5 - 1 cm dalej) na głębokość 1,5 - 3 cm i wyjmij trokar.
    3. Wyjmij rurkę insuplatora z igły Veress, zakręć kran i wyjmij igłę. Podłącz rurkę insuflatora do kaniuli i otwórz kurek, aby utrzymać odmę otrzewnową na poziomie nie większym niż 10 - 12 mmHg.
    4. Przełóż sztywną lunetę przez kaniulę do jamy brzusznej.
    5. Pod wizualizacją kamery kontynuuj wykonywanie małego nacięcia ostrzem skalpela #15 przez mięśnie brzucha i otrzewną w poprzednim nacięciu skóry używanym do wprowadzenia igły Veress. Kamera służy do wizualizacji brzusznej strony nacięcia, aby uniknąć naczyń krwionośnych i zminimalizować krwawienie.
      UWAGA: Upewnij się, że nacięcie przez mięsień i otrzewną jest wystarczająco duże, aby ułatwić wejście sondy i zewnętrzizowanie krezki (~ 0,5 cm). Większe nacięcie może być wymagane w celu uzewnętrznienia krezki u zwierząt z nadmierną ilością tłuszczu krezkowego.
    6. Umieść zwierzę w pozycji Trendelenburga21 ze stopami uniesionymi pod kątem około 15 - 30 stopni nad głową. Jest to opcjonalne, ale może umożliwić łatwiejszy dostęp do krezkowych węzłów chłonnych jelita grubego, ponieważ przewód cienki przesunie się do pozycji bardziej czaszkowej.
  4. Biopsja węzła chłonnego krezkowego
    1. Pod wizualizacją kamery wprowadź solidną sondę przez nacięcie brzucha wykonane w kroku 2.3.5.
    2. Umieść sondę między siecią a jelitem i użyj zamaszystego ruchu, aby delikatnie zmieść sieć z jelita, aby umożliwić wizualizację leżącej pod spodem krezki. Kontynuując ruch zamiatający od ogona do czaszki. Sieć może być umieszczona w prawej części czaszki, tak aby znajdowała się poza polem operacyjnym
      3. .
    3. Użyj sondy, aby przesunąć okrężnicę zstępującą w kierunku lewej lub prawej ściany brzucha. Umożliwi to lepszą wizualizację krezki, aby pomóc w poszukiwaniu węzłów chłonnych krezkowych.
    4. Użyj sondy, aby przeczesać krezkę, aby zlokalizować krezkowe węzły chłonne wzdłuż okrężnicy i naczyń krezkowych.
      UWAGA: Węzły okrężnicy biegną wzdłuż krezkowej granicy jelita grubego, lewe węzły kolkowe można znaleźć w pobliżu punktów rozgałęzień naczyń, a węzły krezkowe dolne można znaleźć wzdłuż dolnych naczyń krezkowych. Węzły chłonne krezkowe są łatwo widoczne u szczupłych zwierząt. Po zakopaniu w tłuszczu krezkowym często nadają lekko podniesiony, lśniący wygląd leżącej nad nim krezce i mogą mieć bardziej szarawy brązowy kolor niż otaczający tłuszcz krezkowy. Dodatkowo węzły chłonne krezkowe mają tendencję do leżenia wzdłuż układu limfatycznego i naczyniowego krezki.
    5. Po zidentyfikowaniu węzła chłonnego wyjmij sondę i włóż kleszcze zapadkowe Maryland do jamy brzusznej. Użyj kleszczy, aby chwycić krezkę przylegającą do węzła docelowego. Pociągnij krezkę w kierunku nacięcia i wyjmij lunetę z kaniuli.
    6. Wyłącz insulatator i pozostaw otwarty kran kaniuli, aby rozhermetyzować jamę brzuszną, aby ułatwić eksterioryzację krezki. Wyciągnij krezkę na zewnątrz ciała przez nacięcie. Po uzewnętrznieniu chwyć krezkę zakrzywionymi hemostatami komarów lub kleszczami kciuka, aby zapewnić dostęp przez nacięcie.
    7. Zidentyfikuj węzeł (węzły) chłonny w obrębie zewnętrznej krezki, badając palpacyjnie w celu uzyskania mocniejszego węzła chłonnego i/lub bezpośrednią wizualizację bardziej szarego koloru lub guzkowatego wyglądu węzła chłonnego.
      1. Po zidentyfikowaniu wykonaj mały otwór (~ 3 - 5 mm) w krezce w pobliżu węzła za pomocą zakrzywionych hemostatów. Swobodne przyczepy do krezki za pomocą sekcji z zakrzywionymi hemostatami. W razie potrzeby podwiązać naczynia krwionośne niewchłanialnym szwem monofilamentowym 4-0. Użyj ostrego rozbioru skalpelem, aby usunąć węzeł chłonny. Umieść węzły w podłożu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 na lodzie.
    8. Zbadaj zewnętrzną krezkę pod kątem krwawienia. W przypadku stwierdzenia krwawienia należy zapewnić odpowiednią hemostazę, zamykając naczynia hemostatami lub ligaturami (niewchłanialny szew monofilamentowy 4-0) lub stosując kauteryzację. Zwolnij krezkę i wdmuchnij brzuch z powrotem do 10 - 12 mmHg, aby umożliwić krezka powrót do jamy brzusznej.
    9. Powtórz kroki od 2.4.1 do 2.4.8, aby uzyskać dodatkowe biopsje węzłów chłonnych.
  5. Biopsja wątroby
    1. Przywróć tabelę do pozycji poziomej.
    2. Umieść gwintowaną kaniulę w jamie brzusznej przez nacięcie używane wcześniej do pobrania biopsji węzłów chłonnych (nacięcie wykonane w kroku 2.3.5). Upewnij się, że nacięcie jest wystarczająco duże (~ 5 - 7 mm), aby umożliwić umieszczenie kaniuli bez wprowadzania trokaru. Przełóż sztywną lunetę przez tę kaniulę w kierunku czaszkowej jamy brzusznej i uwidocznij czaszkę, brzuch i wątrobę.
    3. Pod wizualizacją kamery wprowadzić kleszczyki biopsyjne przez kaniulę umieszczoną wcześniej w lewej części czaszki (nacięcie wykonane w kroku 2.3.1).
    4. Aby uzyskać biopsję wątroby, umieść kleszcze do biopsji pod wybranym brzegiem płata wątroby tak, aby ruchoma część szczęki była skierowana w stronę wątroby, otwórz kleszcze i pozwól, aby margines wpadł do otwartych szczęk. Upewnij się, że między wątrobą a kleszczami do biopsji nie ma sieci komórkowej. Dostosuj położenie kleszczyków i zamknij instrument nad żądanym obszarem próbki.
      1. Utrzymuj ciśnienie przez około 20 - 30 s, aby zapewnić hemostazę. Przy zamkniętych kleszczach wyjmij próbkę, delikatnie przeciągając kleszcze przez kaniulę. Spowoduje to delikatne oderwanie biopsji od wątroby. Umieścić biopsje wątroby w pożywce RPMI 1640 na lodzie.
        UWAGA: Rozmiar biopsji wątroby wynosi około 5 mm x 2 mm x 2 mm przy użyciu kleszczy do biopsji 5 mm.
    5. Zbadaj miejsce biopsji pod kątem krwotoku za pomocą wizualizacji kamery. W przypadku zaobserwowania krwotoku należy przepuścić przez kaniulę sterylny wacik zwilżony solą fizjologiczną i przyłożyć ucisk do miejsca biopsji. Alternatywnie, wypełnij miejsca biopsji sterylną pianką żelową, aby wspomóc hemostazę.
    6. Powtórz kroki od 2.5.3 do 2.5.5, aby uzyskać dodatkowe biopsje wątroby.
      UWAGA: W tym przypadku pobrano 3 biopsje na zwierzę podczas każdej procedury, co jest wystarczające do wszystkich dalszych analiz.
  6. Zamknięcie chirurgiczne
    1. Zbadaj jamę brzuszną pod kątem krwawienia.
      UWAGA: Do tej pory nie miało to miejsca. Jeśli jednak zauważy się nadmierne krwawienie, należy określić miejsce krwotoku i zapewnić odpowiednią hemostazę poprzez ucisk sterylnymi wacikami lub użycie pianki żelowej.
    2. Wyłączyć insulatator i otworzyć kurki kaniuli. Zastosuj delikatny ręczny nacisk na brzuch, aby całkowicie rozhermetyzować jamę otrzewnej. Wyjmij kaniule.
    3. Zamknij każde z nacięć ściany brzucha za pomocą 1 do 2 prostych szwów przerywanych na miejsce. Zalecany jest szew wchłanialny 4-0.
    4. Wykonaj blok rozbryzgowy, umieszczając 0,1-0,3 ml bupiwakainy w każdym nacięciu w celu znieczulenia miejscowego przed zamknięciem skóry.
    5. Zamknij skórę za pomocą 1-2 zakopanych szwów przerywanych (zalecany jest szew wchłanialny 4-0) na miejsce. Można zastosować klej tkankowy.

3. Przetwarzanie biopsji wątroby i analiza limfocytów

  1. Przechowuj kilka kawałków tkanki wątroby (o wymiarach około 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm) w probówkach do krioprezerwacji, w preferowanym roztworze do przechowywania RNA i 10% formalinie do przyszłych analiz molekularnych i histologicznych.
    1. Pozostałe biopsje wątroby umieścić w 50 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1x penicyliną/streptomycyną, 40 μg/ml dostępnego w handlu roztworu kolagenazy i 4 μg/ml DNAzy w sterylnym plastikowym kubku o pojemności 250 ml z pokrywką. Mieszać energicznie za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Równomiernie rozprowadzić, wlewając strawioną tkankę. Rozdrobnić strawioną tkankę (z kroku 3.1.1) na dwóch filtrach 70 μm, umieścić w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 50 ml w zawiesinę jednokomórkową za pomocą końcówki sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml. Doprowadzić objętość obu probówek do 50 ml w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1x penicyliną/streptomycyną (R10).
  3. Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant. Skoncentrować komórki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zawieszając komórki z obu probówek w 5 ml R10 i łącząc w jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą R10. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić wydajność komórkową.
    1. Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml R10, równomiernie rozprowadzić w dwóch okrągłodennych probówkach z polistyrenu o pojemności 5 ml i zwiększyć objętość każdej probówki do 4 ml za pomocą R10, dążąc do > 500 000 komórek w każdej probówce.
  4. Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS, delikatnie wirując. Dodać 1,5 μl możliwej do utrwalenia barwie z martwych komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Dodać następujące nierozcieńczone przeciwciała do barwienia powierzchni w mianach zalecanych przez producenta: CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 (klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8) i CD14-BV785 (klon M5E2). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  7. Dodać 4 ml PBS i odwirować przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 250 μl 1% paraformaldehydu w PBS.
    Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  8. Przeanalizuj populacje komórek za pomocą cytometru przepływowego, zgodnie z opisem w reference22.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowe metody przetwarzania laparoskopowo pobranego MLN, jak również wydajności komórkowej i częstości występowania leukocytów w tych narządach zostały wcześniej zgłoszone13. Rycina 1 przedstawia dane dotyczące wydajności i żywotności komórek, porównując biopsje MLN i wątroby pobrane w dwóch punktach czasowych w odstępie 160 dni od dwóch zdrowych samic RM przy użyciu tej techniki laparoskopowej. Stwierdziliśmy, że wydajność komórkowa z MLN była znacznie wyższa niż z wątroby (P = 0,0021), przy czym uzyskano średnio odpowiednio 33,5 x 106 i 6,74 x 106 komórek. Barwienie martwych komórek i analiza za pomocą cytometrii przepływowej wykazały, że >90% komórek wyizolowanych z obu narządów było zdolnych do życia.

Korzystając z cytometrii przepływowej, oceniliśmy i porównaliśmy obfitość leukocytów i limfocytów w MLN i wątrobie. Reprezentatywny schemat bramkowania dla wątroby pokazano na rysunku 2, gdzie najpierw bramkowaliśmy pojedyncze komórki, aby wykluczyć agregaty, następnie selekcję tylko żywotnych komórek, następnie selekcję komórek CD45 +, a na końcu komórki CD3 +. Z populacji CD3 + oceniliśmy obfitość limfocytów T CD4 + i CD8 +, podczas gdy oceniliśmy obfitość komórek CD14 + i CD20 + z populacji CD3-. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające populacje CD45 + i CD3 + z MLN i wątroby obu zwierząt w dniu 0 i dniu 160 przedstawiono na rysunku 3, podczas gdy rysunek 4 przedstawia obfitość leukocytów i limfocytów w dwóch próbkach obu zwierząt. MLN wykazał znacznie wyższą obfitość komórek CD45+ niż wątroba (średnio odpowiednio 76,9% i 7,66% komórek żywotnych, P = 0,0002). Nic dziwnego, że MLN wykazał znacznie wyższe proporcje limfocytów T CD3 + (P < 0,0001) i limfocytów T CD4 + (P = 0,0004). I odwrotnie, wątroba była znacznie wzbogacona o leukocyty CD14+ w porównaniu z MLN (P = 0,0036). MLN wykazał wyższą średnią limfocytów T CD8 +, ale nie było to istotne. Co zaskakujące, w przypadku tych dwóch zwierząt oba narządy wykazywały podobną obfitość komórek B CD20+. Wydajność komórkowa i liczebność różnych podzbiorów leukocytów i limfocytów z MLN w tym badaniu potwierdziły wcześniej podane wartości23.

figure-results-1
Rysunek 1. Całkowita wydajność komórkowa (na górze) i żywotność komórek (na dole) z seryjnie pobranych biopsji MLN i wątroby. MLN wykazał znacznie wyższą wydajność komórkową niż wątroba. Jednak oba typy próbek dostarczyły wystarczającej liczby komórek do dalszych analiz. Żywotność komórek, mierzona metodą cytometrii przepływowej przy użyciu możliwego do naprawienia barwienia aminami martwych komórek, wykazała, że oba typy próbek zazwyczaj dawały > 90% żywotności komórek po dysocjacji tkanek. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe między próbkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Strategia bramkowania reprezentatywnej cytometrii przepływowej. Najpierw wykluczono zagregowane komórki, a następnie wybrano tylko żywe komórki po barwieniu za pomocą możliwego do naprawienia barwienia aminami martwych komórek. Następnie wybrano leukocyty CD45 +, a następnie wybrano limfocyty T CD3 +. Z populacji CD3+ analizowano limfocyty T CD4+ i CD8+. Z populacji CD3- analizowano komórki CD14+ i CD20+. Ta strategia bramkowania została również wykorzystana w przypadku MLN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Wykresy cytometrii przepływowej z MLN i wątroby dwóch zwierząt podłużnie. Próbki MLN i wątroby pobrano w odstępie 160 dni od obu zwierząt. (A). MLN komórek CD45+ (leukocytów); (B) Komórki wątroby CD45+ (leukocyty); (C) Komórki MLN+ CD3+ (limfocyty T); (D) Komórki CD3 + wątroby (limfocyty T). W przypadku obu zwierząt MLN wykazał wyższy odsetek komórek CD45 + i CD3 + w porównaniu z wątrobą. Z biegiem czasu częstość występowania tych populacji była podobna dla obu zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Częstość występowania komórek CD45+ (po lewej) oraz różnych subpopulacji leukocytów i limfocytów (po prawej) w 23 indywidualnych próbkach. MLN wykazywały znacznie wyższe częstotliwości komórek CD45 +, CD3 + i CD4 +, podczas gdy wątroba wykazywała znacznie większą częstość leukocytów CD14 +, co świadczy o unikalnych funkcjach każdego narządu. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe między próbkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę seryjnego pobierania biopsji MLN i wątroby, która miała 100% wskaźnik sukcesu u tych i innych zwierząt nieopisanych w tym badaniu. Co więcej, stosowanie tej techniki na tych samych zwierzętach na przestrzeni czasu nie wiązało się z żadnymi zdarzeniami niepożądanymi. Rzeczywiście, nie było żadnych powikłań wynikających z zastosowania tej techniki w innych kohortach zwierząt, które były zakażone SIV, simian/ludzkim wirusem niedoboru odporności (SHIV) lub wirusem Zika (dane niepublikowane). Podobnie, operacja ta okazała się skuteczna nawet u zwierząt, które wcześniej przeszły poważną operację jamy brzusznej, oraz u zwierząt z małopłytkowością (dane niepublikowane). Wykazaliśmy, że próbki te można pobrać przez te same dwa porty, odwracając położenie kamery podczas przełączania z MLN na wątrobę, unikając konieczności wykonywania dodatkowych nacięć. Czynniki wpływające na pobór MLN zostały wcześniej zgłoszone13.

Na przestrzeni czasu przeprowadzono do czterech kolekcji po 3 mln biopsji wątroby i 3 biopsje wątroby każda, bez powikłań, zmian we wskaźnikach powodzenia lub zmian w zebranych danych. Ponadto ta laparoskopowa technika pobierania MLN/wątroby została z powodzeniem połączona z innymi procedurami, takimi jak pobieranie obwodowych LN, endoskopowe biopsje górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego, aspiracja szpiku kostnego, pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i nakłucie żyły w tym samym znieczuleniu, co pozwala na obszerną ocenę odpowiedzi wirusologicznych i immunologicznych w sposób seryjny (dane niepublikowane).

Cała procedura trwa zazwyczaj 30 - 45 minut i odbywa się poprzez dwa nacięcia ~ 0,5 cm. U zwierząt otyłych może być konieczne wykonanie większego nacięcia (~1 - 1,5 cm) w celu pobrania MLN i może wymagać dodatkowego czasu na wykonanie. Zwierzęta z rozległym tłuszczem krezkowym często wymagają znacznego doświadczenia, aby odróżnić MLN od otaczającego tłuszczu. MLN są często znajdowane wzdłuż naczyń krezkowych i wydają się być bardziej rozpowszechnione w pobliżu punktów rozgałęzień w naczyniach. Krytycznym aspektem tej techniki jest to, że wymaga ona, aby wybrany MLN miał wystarczającą ruchomość w krezce, aby mógł zostać wyeksterioryzowany przez nacięcie brzucha. W rezultacie technika ta nie może być stosowana do zbierania MLN w pobliżu nasady krezki. Ze względu na powiększenie, czasami łatwiej jest zidentyfikować MLN za pomocą kamery, a uchwycenie w bliskiej odległości od MLN może pomóc w zlokalizowaniu i zidentyfikowaniu węzła po jego uzewnętrznieniu.

Użycie pozycji Trendelenburga nie zawsze jest wymagane do pobrania MLN, a jeśli MLN można łatwo pobrać bez użycia pozycji Trendelenburga, może to ułatwić biopsję wątroby, ponieważ zapobiegnie przesuwaniu się narządów w czaszce. Czasami, po umieszczeniu w pozycji Trendelenburga, wątroba jest przesuwana w górę w stosunku do przepony i musi być delikatnie manipulowana z powrotem na miejsce przed pobraniem biopsji. Ponieważ port do pobrania MLN znajduje się po lewej stronie, biopsje wątroby są zwykle pobierane z lewego bocznego i lewego przyśrodkowego płata wątroby, ponieważ znajdują się one bliżej kaniuli.

Pobrane biopsje MLN i wątroby zapewniły wystarczającą wydajność komórek do różnych dalszych analiz i wykazały wysoką żywotność pobranych komórek. W tym przypadku komórki wybarwiono do analizy cytometrycznej przepływowej populacji leukocytów i limfocytów i wyjaśniono kluczowe różnice między tymi dwoma ważnymi narządami odpornościowymi. Na przykład MLN były znacznie wzbogacone o limfocyty T CD4 + w porównaniu z wątrobą, ze względu na znaczenie MLN jako centralnych punktów gromadzenia i rozpowszechniania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, a także znaczenie T CD4 + w zarządzaniu odpowiedziami zapalnymi i tolerogennymi na antygeny środowiska pochodzące z diety i mikroorganizmów rezydujących w GI24. Jednak wątroba została znacznie wzbogacona o leukocyty CD14+ w porównaniu z MLN. CD14 ulega ekspresji głównie na monocytach i makrofagach i jest kluczowym składnikiem kompleksu receptorowego dla bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)25. Rzeczywiście, zwiększone stężenia rozpuszczalnego CD14 w osoczu są związane z translokacją drobnoustrojów i aktywacją immunologiczną w HIV i patogennych zakażeniach SIV26. Zatem wyższe częstości występowania leukocytów CD14+ w wątrobie prawdopodobnie wynikają z większego obciążenia bakteryjnego tego narządu w porównaniu z MLN.

Tutaj demonstrujemy szybką i minimalnie inwazyjną technikę chirurgiczną do seryjnego pobierania biopsji MLN i wątroby przy użyciu tylko dwóch małych nacięć do laparoskopowego wprowadzenia, które nie doprowadziło do żadnych niepożądanych wyników. Próbki te stanowią użyteczną drogę do oceny kluczowych procesów immunologicznych, wirusologicznych i mikrobiologicznych zachodzących w MLN i wątrobie, które są odrębne i unikalne od odporności ogólnoustrojowej. Podobnie, biopsje wątroby mają kluczowe znaczenie dla długoterminowej oceny skutków HIV/SIV, terapii lekowych i translokowanych drobnoustrojów, które często łączą się, aby wywołać znaczne uszkodzenie wątroby16. Ponadto, ponieważ MLN i wątroba są narządami odpornościowymi narażonymi na mikrobiotę przewodu pokarmowego, możliwość oceny odporności tych narządów w czasie stanowi doskonałą platformę do zrozumienia roli, jaką mikrobiom odgrywa w utrzymaniu homeostazy immunologicznej gospodarza. Podsumowując, ocena wątroby i MLN ma ogromne znaczenie w kontekście skuteczności szczepionki i terapii, klirensu rezerwuaru wirusa SIV i ogólnej odporności błony śluzowej. Możliwość pobrania tych próbek za pomocą minimalnie inwazyjnego podejścia oznacza, że ryzyko wystąpienia stanu zapalnego związanego z zabiegiem jest mniejsze niż w przypadku obecnie opublikowanych technik i mniejszy wpływ na fizjologię zwierząt. W przyszłości ocenimy potencjał połączenia pobierania MLN i wątroby z pobieraniem śledziony przez te same dwie lokalizacje portów, aby umożliwić pobranie próbek innej ważnej i odrębnej części układu odpornościowego, która, jak wykazano, odgrywa znaczącą rolę w wielu modelach choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NIH numer P51OD010425.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sztuczne łzy Lubrykant Maść okulistycznaPatterson Veterinary97-890-8152
Priority Care Chlorheksydyna 2% ScrubPatterson Veterinary07-842-6153
Alkohol Vedco, Izopropyl 70%Patterson Veterinary07-869-6434
Vedco Vetadine ScrubPatterson Veterinary07-869-6772
Hospira Mleczana Ringer's 250 mLPatterson Veterinary07-800-9325
Serweta chirurgiczna do laparotomii u młodzieżyMedlineDYNJP3004
Access 40 L InsufflatorDyonics7205832
300XL Xenon Light SourceDyonics7206084
460P 3 – Kamera cyfrowa CCD z głowicąDyonics72200086
uniwersalna zasłona do kamery, 7" x 96"Usługi wsparcia endoskopowegoESS-6920
usługi wsparcia endoskopowego7,5 stopyUSA. OU225
wsparcia endoskopiirurki insuskopatoraTM-102
Uniwersalny sztywny zakres, 2,7 mm x 187,5 mm,usługi wsparcia endoskopowegoB30-0007-00
Osłona egzaminacyjna i ochronna do lunety 2,7 mm x 187,5 mm z jednym stałym kranemUsługi wsparcia endoskopiiB10-0025-00
Sztywny zakres, 5 mm x 300 mmUsługiwsparcia endoskopowegoB30-0071-00
Igła Veress, 2 mm x 80 mm Usługi wsparcia endoskopowego8302.08
Solidna sonda z oznaczeniami, 5 mm x 320 mmUsługi wsparcia endoskopowego8383.661
Maryland Kleszcze chwytające i preparujące z rękojeścią zapadkową o podwójnym działaniu, 3,5 mm x 240 mm   Usługi wsparcia endoskopowego8390.2054
Kleszcze do biopsji, 3,5 mm x 310 mmR. Wolf8391.4063
Kaniula z gwintem z tworzywa sztucznego z portem insuskopijnym, 3,5 mm x 60 mmUsługi wsparcia endoskopowego8903.072
Kaniula z gwintem z tworzywa sztucznego z portem insuskopijnym, 5,5 mm x 60 mmUsługi wsparcia endoskopii8919.333
Endoskopia trokarowa z końcówką Usługi wsparcia8903.101
wsparcia endoskopiitrokarowej z końcówką piramidalną8903.121
CO2AirgasCD USPE
RPMI 1640Fisher ScientificSH30027FSz roztworem stabilizującym L-glutaminę
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7021
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP4333
Liberase TM Research GradeSigma Aldrich5401119001Komercyjnie dostępny roztwór kolegialny
Dnaza I z trzustki bydlęcejSigma AldrichD5025
70 µ m sitka do komórekMorganville ScientificCSS0200
5 ml strzykawkaBD309646
50 ml stożkowe probówki wirówkoweThermoFisher Scientific339652
Surowica bydlęcaFisher ScientificSH3007003
5 ml probówki polistyrenowe z okrągłym dnemFisher Scientific14-959A
PBSFisher ScientificSH3025601
LIVE/DEAD Aqua Fixable Zestaw do barwienia martwych komórekThermoFisher ScientificL34957Aminowe barwienie martwych komórek
CD45-PerCP (klon D058-1283)BD Biosciences558411
PE-CF594 Mysz anty-Hu CD3 (klon SP34-2)BD Biosciences562406
BV605 Mysz Anti-Hu CD4 (klon OKT4)Biolegend317438
APC-H7 Mysz anty-Hu CD8 (klon SK1)BD Biosciences560179
PE-Cy5 Mysz Anti-Hu CD20 (klon 2H7)BD Biosciences555624
BV786 Mysz Anti-Hu CD14 (klon M5E2)BD Biosciences563698
16% PARAFORMALDEHYD AQ SOLUTNFisher Scientific50-980-487
Cytometr przepływowy LSR IIBDNA
Uniwersalny światłowód, Usługi 0 stopni Usługi płodu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
  3. Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
  4. Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
  5. Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
  6. Shuai, Z., et al. Adaptive immunity in the liver. Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).
  7. Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
  8. Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
  9. North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
  10. Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
  11. Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
  12. Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
  13. Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
  14. Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
  15. Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
  16. Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
  17. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
  18. Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
  19. Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
  20. Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
  21. Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
  22. Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
  23. Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535(2016).
  24. Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
  25. Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
  26. Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biopsja w trobypobieranie pr bek seryjnychchirurgia ma oinwazyjnamodel makakabadania nad HIVtranslokacja mikrobiologicznainsufflator CO2sztywny endoskop

Powiązane artykuły