Zrozumienie, w jaki sposób komórki są modulowane przez ekspozycję na fale uderzeniowe, może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za urazami wywołanymi przez wybuch. Protokół ten wykorzystuje specjalnie skonstruowane rurki uderzeniowe do przykładania fal uderzeniowych o różnym ciśnieniu do monowarstw komórek i identyfikowania ich późniejszego wpływu na żywotność komórek.
Artykuł metodologiczny
Ocena pierwotnych efektów wybuchu in vitro
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Narażenie na wybuch może spowodować poważne urazy ważnych organów, takich jak płuca, uszy i mózg. Zrozumienie mechanizmów stojących za takimi urazami wywołanymi wybuchem ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę niedawną tendencję do stosowania materiałów wybuchowych we współczesnych działaniach wojennych i incydentach związanych z terroryzmem. Aby w pełni zrozumieć obrażenia wywołane wybuchem, musimy najpierw być w stanie odtworzyć takie zdarzenia wybuchowe w kontrolowanym środowisku przy użyciu powtarzalnej metody. W tej technice wykorzystującej rurki uderzeniowe fale uderzeniowe o różnym ciśnieniu mogą być rozchodzone po żywych komórkach hodowanych w 2D, a markery żywotności komórek mogą być natychmiast analizowane za pomocą testu wskaźnika redoks i obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek. Metoda ta wykazała, że zwiększenie szczytowego nadciśnienia podmuchu do 127 kPa może stymulować znaczny spadek żywotności komórek w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Próbki testowe nie ograniczają się do przylegających komórek, ale mogą obejmować zawiesiny komórek, próbki całego ciała i tkanek, poprzez drobne modyfikacje konfiguracji rurki uderzeniowej. Odtworzenie dokładnych warunków, w jakich doświadczają tkanki i komórki po wystawieniu na prawdziwy wybuch, jest trudne. Techniki takie jak ta przedstawiona w tym artykule mogą pomóc w zdefiniowaniu progów uszkodzenia i identyfikacji zmian transkrypcyjnych i epigenetycznych w komórkach, które powstają w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową.
Wprowadzenie
W związku z niedawnym trendem wykorzystywania improwizowanych ładunków wybuchowych w nowoczesnej wojnie i aktach terroryzmu wymierzonych w cywilów, zrozumienie wpływu wybuchów na ludzki organizm ma ogromne znaczenie. Obrażenia powstałe w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową mogą być ciężkie i śmiertelne, a fizyczne mechanizmy powstawania urazów dzielą się na cztery kategorie. Obrażenia pierwotne są wynikiem bezpośredniej ekspozycji na falę uderzeniową, która oddziałuje lokalnie na organizm w sposób kompresyjny, a następnie ekspansyjny, powodując uszkodzenia błon i tkanek miękkich1. Obrażenia wtórne obejmują urazy tępe lub rany penetrujące spowodowane uderzeniem obiektów o małej masie, które zostały wyrzucone z dużą prędkością przez falę uderzeniową. Obrażenia trzeciorzędne występują, gdy fala uderzeniowa posiada wystarczającą energię, aby wyrzucić obiekty o dużej masie lub ludzi przeciwko przeszkodom. Ostatnio, obrażenia czwartorzędowe definiuje się jako pozostałe, różnorodne urazy, które nie mieszczą się w pozostałych kategoriach, takie jak oparzenia błyskiem2. W wyniku ekspozycji na takie zdarzenia wybuchowe, obrażenia pierwotne obejmują urazy czaszkowo-mózgowe3,4,5, kostnienie heterotopijne6,7, urazy płuc spowodowane wybuchem8, utratę słuchu9 oraz inne10.
Powszechnie obserwowanym kształtem fali w zdarzeniach wybuchowych jest fala Friedlandera, reprezentująca wybuch w polu otwartym, w przeciwieństwie do wybuchu w przestrzeni zamkniętej. Kształt fali składa się z frontu fali uderzeniowej, który można zdefiniować jako gwałtowny i szybki wzrost ciśnienia dodatniego. Bezpośrednio po nim następuje blast wind, czyli ruch powietrza z wysoką prędkością, oraz fala rozprężenia, która obniża ciśnienie poniżej poziomu atmosferycznego. W obszarze pierwotnego wybuchu powstaje częściowa próżnia, co skutkuje powolnym powrotem powietrza. Fazy dodatnia i ujemna fali (Rysunek 1A) prowadzą do ruchu pchającego i ciągnącego fali uderzeniowej1. Aby pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw pierwotnych obrażeń wybuchowych, stworzono modele eksperymentalne generujące kształty fal, takie jak fala Friedlandera, na które narażone są komórki i tkanki podczas rzeczywistego wybuchu. Obecne systemy wymieniane w literaturze obejmują rury szokowe1,12,13,14,15,16,17, komory barowe18,19, pręt Kolskiego20, zaawansowane symulatory wybuchów21, pręt Split Hopkinson22 oraz odtworzenie alternatywnych zdarzeń wybuchowych w kontrolowanym środowisku przy użyciu azotanu pentaerytrytolu23. Pomimo szerokiej gamy dostępnych modeli, na stopień obrażeń wywołanych falami uderzeniowymi wpływa wiele zmiennych, w tym naprężenie wstępne przyłożone do poszczególnych typów komórek lub tkanek poddawanych ocenie oraz ich właściwości mechaniczne24. Podczas gdy badanie tkanek lub narządów może rzucić światło na deformację tkanek i grube zmiany morfologiczne powstałe w wyniku wybuchów, analiza na poziomie komórkowym pozwala odkryć zmiany transkrypcyjne i epigenetyczne wywołane przez falę uderzeniową.
Niniejszy artykuł metodyczny opisuje technikę generowania fal uderzeniowych o różnych wartościach ciśnienia na żywe komórki w monowarstwie. Pozwala to na natychmiastową charakterystykę żywotności komórek, co umożliwia określenie potencjalnych progów uszkodzeń wywołanych falami uderzeniowymi. Ponadto żywe komórki mogą zostać przeniesione z powrotem do standardowych warunków hodowli, co pozwala na ocenę długofalowych skutków biologicznych zdarzenia wybuchowego. Poniższy protokół opisuje dwie techniki oceny żywotności komórek, które można zastosować w hodowlach komórkowych.
Rycina 1: Aproksymacja fali Friedlandera. (A) Przybliżenie fali Friedlandera zaobserwowane w czujniku 3 w rurze uderzeniowej. (B) Reprezentatywne dane przedstawiające różne profile ciśnienia zarejestrowane przez czujniki 1, 2 i 3 w rurze uderzeniowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Protokół
1. Hodowla komórkowa i przygotowanie próbek
- Pozyskanie odpowiedniej linii komórkowej (np. komórki brodawki skórnej).
UWAGA: Niniejszy protokół został opracowany dla komórek adherentnych, z wykorzystaniem fibroblastów brodawki skóry właściwej szczura wyizolowanych z wibrys jako modelu. - Kulturować komórki w kolbie T-75 zawierającej minimalne podłoże niezbędne (MEM) α uzupełnione o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Przechowywać komórki w standardowych warunkach hodowli: 37 °C oraz 5% CO₂2 w warunkach zwiększonej wilgotności do momentu osiągnięcia 80% konfluencji.
- Odssać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki roztworem Dulbecco (PBS). Oddzielić komórki od kolby, inkubując je w 2 ml trypsyny/EDTA w standardowych warunkach hodowli przez 5 min. Krótko sprawdzić pod mikroskopem świetlnym/fazokontrastowym (z obiektywem 10X), czy komórki zostały skutecznie oddzielone od kolby.
- Dodać 4 ml pożywki hodowlanej w celu zneutralizowania reakcji trypsynizacji. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Wirować z prędkością 20 x g przez 4 min w celu osadzenia komórek. Powoli odessać supernatant, uważając, aby nie zresuspendować osadu. Resuspender osad w 5 ml pożywki.
- Przenieś a 20 µL przenieś alikwot zawiesiny komórkowej do czystej komory countingowej (hemocytometru) i policz komórki za pomocą mikroskopu wyposażonego w obiektyw 10X.
- Przygotuj komórki do analizy blastu, umieszczając trzy płytki 35 mm wewnątrz płytki 90 mm. Odpowiednio je oznakuj. Do każdej płytki 35 mm dodaj 2 ml pożywki i wysiej łącznie 5 x 104 komórek na płytkę, rozdzielając komórki równomiernie po całej powierzchni płytki. Próbki eksperymentalne inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli, aby zapewnić odpowiednie przytwierdzenie komórek przed ekspozycją na falę uderzeniową.
UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórki należy wysiać na sterylne szkiełka nakrywki.
2. Montaż rury uderzeniowej
Rycina 2Układ EVOC i zestaw rury uderzeniowej. (A) Zdjęcie zestawu EVOC. (B) Schemat aparatury rury uderzeniowej. Wymiary rury uderzeniowej obejmują średnicę wewnętrzną 59 mm oraz całkowitą długość, wliczając w to zestaw EVOC, wynoszącą 4,13 m. Łączna długość rury napędzanej oraz zestawu EVOC wynosi 2,71 m. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Podczas procedur montażowych należy nosić obuwie robocze z metalowym noskiem oraz fartuch laboratoryjny.
- Wprowadź dwa pręty centrujące przez dwa otwory na śruby znajdujące się w płaszczyźnie poziomej kołnierza wylotowego. Umieść arkusz uszczelki z gumy nitrylowej na końcach prętów centrujących w taki sposób, aby znajdowała się ona pomiędzy kołnierzem wylotowym a ex vivo układ do hodowli organów (EVOC).
UWAGA: Aparatura EVOC to specjalnie zaprojektowany uchwyt przeznaczony do stosowania z 35 mm szalkami Petriego (Rysunek 2A). - Przymocuj zestaw EVOC do kołnierza wylotowego rury udarowej, nasuwając uchwyt na pręty pozycjonujące; upewnij się, że zestaw jest ustawiony prawidłowo, tak aby sekcja trzymająca szalkę Petriego znajdowała się u jego podstawy.
- Włóż cztery śruby M24 wraz z podkładkami w pozostałe otwory. Ustaw nakrętki tak, aby dotykały kołnierza.
- Mocno dokręć nakrętki i śruby sekwencyjnie, w sposób symetryczny po przekątnej, wizualnie sprawdzając, czy platforma EVOC i rura uderzeniowa zostały prawidłowo wyrównane.
- Podłącz przetwornik ciśnienia do zestawu EVOC, a następnie połącz go ze źródłem prądu za pomocą kabla sygnałowego. Następnie, używając kabla BNC, podłącz źródło prądu do oscyloskopu.
- Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe i regulatory przepływu w rurze falowej są zamknięte. Otwórz wbudowaną zewnętrzną linię sprężonego powietrza i ręcznie przekręć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby naładować elektrozawór do ciśnienia 2,5 bar.
- Otwórz zawór bezpieczeństwa w butli z gazem sprężonym, obracając go przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. 180°.
- Powoli przekręć regulator ciśnienia, znajdujący się na górze butli z gazem, zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć ciśnienie do około 15 bar.
UWAGA: Punkt nastawy tego regulatora powinien znajdować się nieco powyżej najwyższego ciśnienia rozrywania najgrubszej membrany, która ma zostać użyta w doświadczeniu. - Przygotować przysłony, wycinając z plastikowej arkusza o grubości 0,125 mm kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm.
UWAGA: Grubość membrany będzie skorelowana z ciśnieniem pęknięcia, co zmieni ciśnienie szczytowe fali uderzeniowej (tj. grubsza membrana spowoduje powstanie fali uderzeniowej o wyższym ciśnieniu szczytowym; Tabela 1).
| Wymiary membrany z Mylar (cm) | Ciśnienie rozrywania (bar) | Zakres ciśnienia sensora 3 (kPa) |
| 10 x 10 x 0.023 | 2 ± 0.2 | 47 ± 7.5 |
| 10 x 10 x 0.050 | 4 ± 0.2 | 72 ± 7.5 |
| 10 x 10 x 0.125 | 9.5 ± 0.5 | 127 ± 12.5 |
Tabela 1: Ciśnienie rozrywania w zależności od grubości membrany i ciśnienia szczytowego.
- Wykonaj uchwyty z taśmy, przymocuj je do górnej i dolnej krawędzi przepony, a następnie za ich pomocą ostrożnie ustaw przeponę obok przedniego małego kołnierza przy komorze zamkowej. Przed zamknięciem zamka upewnij się, że przepona jest prosta i prawidłowo rozmieszczona.
- Zabezpiecz ten element za pomocą czterech śrub i nakrętek M24. Mocno dokręć nakrętki i śruby sekwencyjnie, w sposób symetryczny po przekątnej.
3. Przygotowanie komórek bezpośrednio przed ekspozycją na falę uderzeniową
- Przygotować komorę z laminarnym przepływem powietrza do pracy z tkankami, przeprowadzając sterylizację ultrafioletową. Oczyścić ją roztworem dezynfekującym i 70% etanolem. Zebrać wszystkie przedmioty niezbędne do manipulacji komórkami przed i po ekspozycji na falę uderzeniową i umieścić je w sterylnej komorze.
UWAGA: Obejmuje to świeże medium, przylepne membrany przepuszczalne dla gazów, sterylnie zapakowane nożyczki, pipety oraz końcówki do pipet. - Przenieść jedną szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą trzy próbki eksperymentalne z inkubatora do sterylnej komory.
- Wyciąć arkusz przylepnej membrany przepuszczalnej dla gazów (patrz Tabela materiałów) na sześć kwadratów, tak aby każdy z nich był wystarczająco duży, by pokryć górę jednej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
- Odssać medium z szalki Petriego o średnicy 35 mm, odłożyć pokrywkę na bok i przykryć szalkę dwoma fragmentami przylepnej membrany przepuszczalnej dla gazów, zapewniając szczelne przyleganie membrany do krawędzi szalki.
- Przenieść próbkę do zestawu EVOC i zamocować ją do podstawy uchwytu w taki sposób, aby góra szalki znajdowała się na linii wewnętrznej podstawy rury uderzeniowej.
4. Obsługa rury szokowej
- Podczas zwiększania ciśnienia w układzie rury uderzeniowej należy nosić ochronniki słuchu, gogle ochronne, obuwie ochronne oraz fartuch laboratoryjny.
- Przekręć pokrętło sterowania przepływem na regulatorze zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby umożliwić dopływ gazu do elastycznego węża łączącego butlę ze sprężonym powietrzem z rurą uderzeniową.
- Na dole panelu sterowania wybierz wlot „Double Breech” dla fali uderzeniowej o krótkim czasie trwania lub wlot „Driver Tube” w celu zwiększenia czasu trwania fali.
- Włącz źródło zasilania DC oraz oscyloskop w celu pozyskania danych przebiegu falowego. Ustaw częstotliwość próbkowania oscyloskopu na 50.0 MS/s przy długości zapisu 1 M punktów. Ustaw zakres 50 mV dla odpalenia przy 2 bar oraz 10 mV dla ciśnienia powyżej 4 bar.
- Włącz lampki ostrzegawcze za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania.
UWAGA: Informuje to innych badaczy, aby nie wchodzili do pomieszczenia podczas ładowania rury uderzeniowej. - Włącz przełącznik w skrzynce sterowania elektrozaworem, aby zamknąć elektrozawór.
UWAGA: Ta funkcja bezpieczeństwa zamyka zawór znajdujący się w komorze podwójnego zamka, umożliwiając naładowanie układu. - Na panelu sterowania powoli otwórz przepływ, przekręcając pokrętło przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby stopniowo zwiększać ciśnienie w komorze sprężania. Monitoruj ciśnienie na wyświetlaczu panelu sterowania.
- Po osiągnięciu ciśnienia rozrywania membrany, membrana pęknie i będzie słyszalny huk. Szybko zamknij przepływ, przekręcając pokrętło.
UWAGA: Fala uderzeniowa przemieści się wzdłuż rury nad próbkę komórek i wyjdzie na koniec rury. - Otwórz elektrozawór, wyłączając przełącznik w skrzynce sterowania elektrozaworem, a następnie wyłącz lampki ostrzegawcze (za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania).
- Przenieś próbkę komórek do komory z laminarnym przepływem powietrza, usuń przepuszczalne dla gazów membrany adhezyjne i napełnij naczynie 2 mL świeżej pożywki wzrostowej. Komórki można wykorzystać natychmiast do oceny, zgodnie z opisem w kroku 5, lub zwrócić do inkubatora do badań długoterminowych.
5. Żywotność komórek
- Oceń żywotność komórek po ekspozycji na fale uderzeniowe, stosując kombinację testu wskaźnika redoks oraz obrazowania fluorescencyjnego komórek żywych i martwych.
UWAGA: Do obrazowania fluorescencyjnego komórki muszą zostać wysiane na sterylne szkiełka nakrywki podczas etapu 1: Hodowla komórek i przygotowanie próbek. Szkiełka te można umieścić w 35-mm szalkach Petriego. - Bezpośrednio po uzupełnieniu szalek 2 mL pożywki po ekspozycji na fale uderzeniowe, przenieś 20 µL odczynnika wskaźnika redoks (patrz Tabela materiałów) do każdej szalki eksperymentalnej. Inkubuj w standardowych warunkach hodowli przez 4 h.
- Dla każdej szalki przenieś (w ciemnej, sterylnej komorze) 2 aliquoty po 100 µL do czarnej lub przezroczystej płytki 96-dołkowej, w zależności od tego, czy do oceny żywotności zostanie wykorzystana fluorescencja, czy absorbancja.
- Przenieś płytkę 96-dołkową do odpowiedniego czytnika płytek wyposażonego w właściwe filtry i odczytaj wyniki, używając pasm wzbudzenia 530ex/590em dla fluorescencji lub 570 nm wraz z referencją 60 nm dla absorbancji. Wyeksportuj i zapisz dane.
- Przeanalizuj dane, aby zidentyfikować różnice między próbkami poddanymi działaniu fal uderzeniowych a kontrolami nieeksponowanymi, co może wskazywać na spadek żywotności komórek.
UWAGA: W projekcie eksperymentalnym należy uwzględnić również kontrolę negatywną. Ponadto do obliczenia liczby komórek można wykorzystać interpolację krzywej wzorcowej. - Odsaj pożywkę zawierającą odczynnik wskaźnika redoks. Zastąp ją 2 mL świeżej pożywki i inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli przez 24 h.
- Powtórz powyższe kroki w razie potrzeby, aby uzyskać drugi punkt czasowy oceny żywotności.
- W celu obrazowania fluorescencyjnego komórek żywych i martwych, odsaj pożywkę i przemyj komórki dwukrotnie 1 mL PBS. Przenieś 10 µL kompletnego odczynnika z zestawu do obrazowania (patrz Tabela materiałów) do każdej próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem, przez 15 min.
- Odsaj odczynnik i przemyj raz 1 mL PBS. Używając pęsety precyzyjnej, ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkę z 35-mm szalki i połóż je stroną skierowaną w dół na szkiełku do mikroskopu.
- Wykonaj zdjęcia dla każdej próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 10X, apertura numeryczna 0,50) wyposażonego w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji (ex/em 488 nm/515 nm oraz 570 nm/602 nm).
UWAGA: Żywe komórki będą emitować intensywną, jednorodną, zieloną fluorescencję. Komórki martwe lub obumierające z uszkodzoną błoną komórkową wchłoną komponent zestawu dla komórek martwych, co spowoduje emisję czerwonej fluorescencji, zlokalizowanej głównie w regionie jądra komórkowego. - Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby ręcznie lub automatycznie policzyć liczbę komórek żywych i martwych na każdym zdjęciu.
Wyniki
Stosując opisaną powyżej metodę, komórki hodowane w monowarstwie poddano w trzech powtórzeniach działaniu fal uderzeniowych generowanych za pomocą rury uderzeniowej (Rysunek 2B). Oceńiono markery żywotności komórek. Wykorzystując test z wskaźnikiem redoks, stwierdzono, że zastosowanie fali uderzeniowej o ciśnieniu 127 kPa było w stanie znacząco obniżyć żywotność komórek brodawki skóry właściwej w porównaniu z grupą kontrolną po 24 h hodowli (Rysunek 3). Zastosowanie fali uderzeniowej ≤72 kPa nie spowodowało obniżenia żywotności. Aby potwierdzić te obserwacje, zastosowano analizę obrazowania fluorescencyjnego umożliwiającą znakowanie fluorescencyjne komórek żywych lub martwych odpowiednio zielonymi lub czerwonymi fluoroforami. Ilościowe oznaczenie komórek żywych i martwych na podstawie 13 obrazów fluorescencyjnych na każdą powtórkę biologiczną wykazało spadek żywotności komórek poddanych działaniu fali uderzeniowej 127 kPa w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 4). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, przyjmując, że wartość p <0,05 jest statystycznie istotna. Wielkość próby w każdej grupie wynosiła 9 dla testu z wskaźnikiem redoks oraz 39 dla ilościowej analizy obrazowania fluorescencyjnego.
Rycina 3Dane z testu z użyciem wskaźnika redoks przedstawiające przebieg czasowy żywotności komórek po narażeniu na falę uderzeniową. Po 24 h w grupie eksponowanej na falę uderzeniową o sile 127 kPa zaobserwowano znacznie mniej komórek w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną. Kontrola negatywna, polegająca na 30-sekundowej obróbce 2% środkiem dezynfekcyjnym (patrz Tabela Materiałów), wykazała znacznie mniejszą liczbę komórek zarówno w czasie T0, jak i po 24 h w porównaniu ze wszystkimi pozostałymi grupami. Każdy słupek przedstawia średnią ± 1 odchylenie standardowe (SD); powtórzenia biologiczne, N = 3; powtórzenia techniczne, n = 3. **** = p <0,01. * = p <0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4Obrazowanie fluorescencyjne. (A) Dane ilościowe zebrane z obrazów fluorescencyjnych żywych i martwych komórek, wykonanych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego 24 h po ekspozycji na falę uderzeniową. Obserwowano znacznie mniej żywych komórek w próbce eksponowanej na falę uderzeniową o ciśnieniu 127 kPa (średnia = 93,42) w porównaniu do grup 47 kPa (średnia = 98,18), 72 kPa (średnia = 98,87) oraz grupy kontrolnej (średnia = 9,10). W grupie kontrolnej negatywnej po 24 h nie zaobserwowano żywych komórek (średnia = 0). (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne. Kolor zielony oznacza żywe komórki, natomiast kolor czerwony oznacza komórki martwe. Każdy wykres pudełkowy przedstawia kwartyle górny i dolny z wąsami Tukeya; powtórzenia biologiczne, N = 3; powtórzenia techniczne, n = 13. **** = p <0,01. Pasek skali = 300 µm. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Pierwotne urazy powstałe w wyniku narażenia na zdarzenia wybuchowe nie są jeszcze w pełni poznane. Identyfikacja i zrozumienie mechanizmów, które wywołują urazy wywołane wybuchem, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu 3,4 i kostnienie heterotopowe 6,7, są ważnymi pierwszymi krokami do opracowania skutecznych metod profilaktyki. Aby pomóc w osiągnięciu tego celu, opracowano szereg systemów eksperymentalnych do replikacji ekspozycji na zdarzenia wybuchowe 11,12,13,14,18,19. Opisana tutaj technika wykorzystuje sprzęt rurkowy (rysunek 2) zdolny do wystrzeliwania fal uderzeniowych pod różnymi ciśnieniami na próbki całego ciała (tj. gryzoni), tkanek lub komórek. Zdolność do ładowania pojedynczych typów komórek, a nie całych tkanek, daje możliwość analizowania różnych odpowiedzi komórkowych, ponieważ uszkodzenia mogą wystąpić jednocześnie za pośrednictwem szeregu mechanizmów 1,2. Na przykład, aby modelować urazowe uszkodzenie mózgu, ocena poszczególnych typów komórek, takich jak neurony i astrocyty, może pozwolić na identyfikację uszkodzenia specyficznego dla komórki. Również odpowiedź całego narządu można ocenić za pomocą tkanki mózgowej. Zarówno poszczególne typy komórek, jak i próbki tkanek mają wartość i mogą dostarczać różnych informacji. Możliwa jest również zmiana ilości powietrza, które jest pod ciśnieniem w celu wytworzenia wstrząsu, wybierając podwójny wlot zamka lub rury sterownika. Kontroluje to czas trwania fali uderzeniowej. Inną możliwością jest zmiana materiału i grubości membrany w celu zmiany ciśnienia szczytowego25.
Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, są efekty końcowe zakłóceń, które mogą występować, gdy obudowa próbki znajduje się w pobliżu wyjścia rurki uderzeniowej, takiej jak ta, którą można znaleźć na platformie EVOC opisanej w obecnym systemie. Chandra i wsp. przyjrzał się profilom fali uderzeniowej znajdującym się w różnych miejscach na rurze uderzeniowej napędzanej kompresją i stwierdził, że kształt fali Friedlandera był najlepiej odwzorowany w miejscu głęboko w rurze uderzeniowej15. Kuriakose i wsp. Badano również wtórne obciążenie próbki i stwierdzono, że umieszczenie płyty końcowej na końcu rurki uderzeniowej było w stanie wyeliminować niepożądane fale odbite16. Biorąc pod uwagę dane zawarte w tych publikacjach 15,16, przyszłe modyfikacje mające na celu ulepszenie systemu rur uderzeniowych opisane w tym artykule mogą obejmować umieszczenie zestawu EVOC w głębszym miejscu w napędzanej rurze lub, alternatywnie, włączenie płyty końcowej do rury amortyzatora. Ograniczeniem opisanej metody może być stosunkowo niska przepustowość próbek. Jeden użytkownik może bezpiecznie obsługiwać rurkę uderzeniową przy wydajności około 6-8 próbek na godzinę. Obecnie system jest zaprojektowany z myślą o zastosowaniu pojedynczych szalek Petriego o średnicy 35 mm. W związku z tym większe eksperymenty zawierające wiele grup i kontrprób biologicznych mogą być trudne do osiągnięcia.
Ten artykuł o metodach pokazuje, w jaki sposób na żywotność przylegających komórek brodawek skórnych wpłynęła ekspozycja na pojedynczą falę uderzeniową. Krótkotrwała fala uderzeniowa (<10 ms) o natężeniu ≤72 kPa nie wpłynęła na żywotność w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 3 i Rysunek 4). Natomiast fala uderzeniowa o natężeniu 127 kPa spowodowała znaczny spadek żywotności w ciągu 24 godzin po wybuchu, co wykazano zarówno za pomocą testu wskaźnika redoks (Rysunek 3), jak i analizy obrazu fluorescencyjnego (Rysunek 4). Miller i in. stwierdzili podobne zmniejszenie żywotności komórek w organtypowych hodowlach plastrów hipokampa szczurów, gdy komórki były wystawione na działanie fali uderzeniowej o natężeniu 147 kPa lub 278 kPa przy użyciu otwartej, napędzanej helem rurki uderzeniowej14. W przeciwieństwie do tego, VandeVord i in. stwierdzili, że nie było wpływu na żywotność astrocytów szczurów wystawionych na krótkotrwałe nadciśnienie >200 kPa, chociaż zastosowano barokomorę zamiast rurki szokowej18. Należy zauważyć, że ciśnienie zewnętrzne jest zależne od fali uderzeniowej, chociaż tworzy ona złożone fale naprężeń w ciele, co sprawia, że charakter obciążenia jest w dużym stopniu zależny od właściwości mechanicznych tkanki lub komórki. Wymagane są dodatkowe badania charakterystyki odpowiedzi komórkowej na zdarzenia blastyczne. Ponadto, oceniając ekspozycję na falę uderzeniową na poziomie komórkowym, jak pokazano w tej technice, można zidentyfikować i dalej badać reakcje biologiczne wywołane urazem, takie jak zaburzenia szlaków sygnałowych lub zmiany epigenetyczne.
Podsumowując, praca ta opisuje zastosowanie rurki uderzeniowej ze stali nierdzewnej i zmodyfikowanego zestawu EVOC do włączenia pierwotnych kultur komórkowych. Fale uderzeniowe o różnym ciśnieniu mogą być generowane i rozchodzone po żywych komórkach, aby odtworzyć efekty występujące w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową. Protokół ten pokazuje, jak oceniać żywotność komórek, ale można również badać długoterminowe zmiany w poszczególnych typach komórek. Idąc dalej, planujemy ocenić zróżnicowane efekty, jakie złożone fale uderzeniowe mogą wywołać w różnych typach komórek, w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat pierwotnych urazów wywołanych wybuchem.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe Centrum Badań nad Obrażeniami Wybuchowymi Królewskiego Legionu Brytyjskiego dla HA oraz finansowanie od Rady Badań Medycznych (M01858X/1) dla CAH.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| MEM α, nukleozydy | ThermoFisher | 22571020 | |
| Płodowa surowica bydlęca, certyfikowany, pochodzący z USA | ThermoFisher | 16000044 | do tworzenia kompletnych pożywek wzrostowych. |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Penicylina-Streptomycyna | ThermoFisher | 15070-063 | Suplement do tworzenia kompletnych pożywek wzrostowych. |
| Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej | ThermoFisher | 15400-054 | Rozcieńczyć 1:10 przed użyciem. |
| Kolba CytoOne T-75, z powłoką TC, wentylowana | Starlab | CC7682-4875 | |
| TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2 | Potrójna czerwon | TCD010035 | |
| Petriego (PS) 90 x 14,2 mm bez odpowietrznika | VWR UK | 391-0453 | |
| Przepuszczalne dla gazu uszczelki samoprzylepne | ThermoFisher | AB-0718 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | ThermoFisher | R37601 | |
| Odczynnik żywotności komórek Alamarblue | Fisher Scientific | 13494309 | |
| Tabletki Virkon | VWR UK | 115-0020 | Służy do tworzenia 2% roztworu jako odczynnika do kontroli żywotności. |
| Kleszcze Dumont | SurgicalTools | 11295-10 | Służy do usuwania szkiełek nakrywkowych z szalki Petriego. |
| Szkło nakrywkowe, kwadratowe | VWR UK | 631-0125 | |
| Szkiełka mikroskopowe | VWR UK | 631-1553 | |
| 96 Płytka studzienkowa, pełna | AppletonWoods | CC760 | Płytka do pomiarów fluorescencji. |
| 96 Płytka studzienkowa, przezroczysta, (PS) | VWR UK | 734-1799 | Płytka do pomiarów absorbancji. |
| Leica DMi1 Zestaw do statywu do aparatu | Leica Microsystems | Mikroskop optyczny używany do hodowli komórkowych. | |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton Mikromikroskop | Zeiss | stosowany do obrazowania LIVE/DEAD. | |
| Czytnik EnVision Multilabel | PerkinElmer | 2104-0010A | Czytnik płytek do odczytów fluorescencji/absorbancji. |
| Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,023 mm | RS Components | 785-0782 | Służy do tworzenia membrany rurki uderzeniowej. |
| Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,05 mm | RS Components | 785-0786 | Służy do tworzenia membrany rurki amortyzatora. |
| Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,125 mm | RS Components | 785-0798 | Służy do tworzenia membrany rurki uderzeniowej. |
| Zasilacz źródła prądu | Dytran Intruments Inc. | Źródło zasilania 4103C | dla czujnika 2300V1. |
| Czujnik ciśnienia IEPE | Dytran Intruments Inc. | 2300V1 | Czujnik ciśnienia umieszczony na rurze uderzeniowej. |
| Cyfrowy oscyloskop fosforowy | Tektronix | DPO 4104B | Służy do zbierania i zapisywania danych czujnika 2300V1. |
Bibliografia
- Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
- Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
- Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
- Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
- Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
- Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
- Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
- Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
- Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618(2013).
- Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
- Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
- Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32(2012).
- Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
- Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20(2015).
- Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
- Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597(2016).
- Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
- VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
- Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
- Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
- Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518(2014).
- Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
- Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
- Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025(2014).
Przedruki i uprawnienia
