Method Article

Ocena pierwotnych efektów wybuchu in vitro

DOI:

10.3791/55618

⸱

September 18th, 2017

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie, w jaki sposób komórki są modulowane przez ekspozycję na fale uderzeniowe, może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za urazami wywołanymi przez wybuch. Protokół ten wykorzystuje specjalnie skonstruowane rurki uderzeniowe do przykładania fal uderzeniowych o różnym ciśnieniu do monowarstw komórek i identyfikowania ich późniejszego wpływu na żywotność komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narażenie na wybuch może spowodować poważne urazy ważnych organów, takich jak płuca, uszy i mózg. Zrozumienie mechanizmów stojących za takimi urazami wywołanymi wybuchem ma ogromne znaczenie, biorąc pod uwagę niedawną tendencję do stosowania materiałów wybuchowych we współczesnych działaniach wojennych i incydentach związanych z terroryzmem. Aby w pełni zrozumieć obrażenia wywołane wybuchem, musimy najpierw być w stanie odtworzyć takie zdarzenia wybuchowe w kontrolowanym środowisku przy użyciu powtarzalnej metody. W tej technice wykorzystującej rurki uderzeniowe fale uderzeniowe o różnym ciśnieniu mogą być rozchodzone po żywych komórkach hodowanych w 2D, a markery żywotności komórek mogą być natychmiast analizowane za pomocą testu wskaźnika redoks i obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek. Metoda ta wykazała, że zwiększenie szczytowego nadciśnienia podmuchu do 127 kPa może stymulować znaczny spadek żywotności komórek w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Próbki testowe nie ograniczają się do przylegających komórek, ale mogą obejmować zawiesiny komórek, próbki całego ciała i tkanek, poprzez drobne modyfikacje konfiguracji rurki uderzeniowej. Odtworzenie dokładnych warunków, w jakich doświadczają tkanki i komórki po wystawieniu na prawdziwy wybuch, jest trudne. Techniki takie jak ta przedstawiona w tym artykule mogą pomóc w zdefiniowaniu progów uszkodzenia i identyfikacji zmian transkrypcyjnych i epigenetycznych w komórkach, które powstają w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biorąc pod uwagę niedawny trend w kierunku użycia improwizowanych urządzeń wybuchowych w nowoczesnej wojnie i działaniach terrorystycznych na cywilach, zrozumienie wpływu wybuchów na ludzkie ciało ma ogromne znaczenie. Urazy powstałe w wyniku narażenia na zdarzenia wybuchowe mogą być śmiertelne i śmiertelne, a fizyczne procesy urazów dzielą się na cztery kategorie. Urazy pierwotne wynikają z bezpośredniego narażenia na falę uderzeniową, która oddziałuje lokalnie z ciałem w sposób ściskający, a następnie ekspansywny, powodując rozerwanie błon i tkanek miękkich1. Urazy wtórne obejmują urazy lub rany penetrujące spowodowane uderzeniem w przedmioty o małej masie napędzane z dużą prędkością przez falę uderzeniową. Urazy trzeciorzędowe występują, gdy fala uderzeniowa ma wystarczającą energię, aby rzucać przedmiotami o dużej masie lub osobami na obiekty. Wreszcie, czwartorzędowe urazy są definiowane przez inne różne urazy, które nie pasują do innych kategorii, takie jak oparzenia błyskawiczne2. Po narażeniu na takie zdarzenia wybuchowe, główne obrażenia obejmują urazowe uszkodzenie mózgu3,4,5, heterotopowe kostnienie6,7, uszkodzenie płuc po wybuchu8, utrata słuchu9, i inne10.

Często obserwowanym kształtem fali z wybuchu jest fala Friedlandera, reprezentująca eksplozję w polu swobodnym, w przeciwieństwie do eksplozji w zamkniętej przestrzeni. Kształt fali składa się z czoła podmuchu, który można zdefiniować jako gwałtowny i gwałtowny wzrost nadciśnienia. Bezpośrednio po tym następuje podmuch wiatru powietrza poruszającego się z dużą prędkością i fala uwalniająca, która obniża ciśnienie poniżej poziomu atmosferycznego. W rejonie początkowej eksplozji pozostawia się częściową próżnię, co powoduje powolny przepływ wsteczny powietrza. Dodatnia i ujemna faza fali (rysunek 1A) powodują ruch push-pull fali uderzeniowej1. Aby pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów stojących za pierwotnymi uszkodzeniami spowodowanymi wybuchem, stworzono eksperymentalne modele do wytwarzania kształtów fal, takich jak fala Friedlandera, z którymi komórki i tkanki będą musiały się zmierzyć, gdy zostaną wystawione na prawdziwe zdarzenie wybuchu. Obecne systemy wymienione w literaturze obejmują lampy uderzeniowe11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, Kolsky bar20, zaawansowane symulatory wybuchu21, podział ciśnienia Hopkinsona class22, oraz odtwarzanie alternatywnych zdarzeń wybuchu w kontrolowanym środowisku przy użyciu tetraazotanu pentaerytrytolu23. Pomimo szerokiej gamy dostępnych modeli, wiele zmiennych wpływa na uszkodzenia powstałe w wyniku fal uderzeniowych, w tym naprężenia wstępne przyłożone do poszczególnych typów komórek lub tkanek poddawanych ocenie oraz właściwości mechaniczne tych typów komórek lub tkanek24. Podczas gdy badanie tkanek lub narządów może rzucić światło na deformację tkanek i poważne zmiany morfologiczne powstałe w wyniku wybuchów, analiza na poziomie komórkowym może ujawnić zmiany transkrypcyjne i epigenetyczne, na które wpływa fala uderzeniowa.

Ten artykuł o metodach opisuje technikę rozchodzenia się fal uderzeniowych w różnych ciśnieniach nad żywymi komórkami w monowarstwie. Pozwala to na natychmiastową charakterystykę żywotności komórek, wyjaśniając potencjalne progi uszkodzeń spowodowanych falami uderzeniowymi. Co więcej, żywe komórki mogą zostać przywrócone do standardowych warunków hodowli i można ocenić długoterminowe skutki biologiczne zdarzenia wybuchowego. Poniższy protokół opisuje dwie techniki żywotności komórek, które można zastosować na komórkach w hodowli.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przybliżenie fali Friedlandera. (A) Przybliżenie fali Friedlandera zaobserwowane na czujniku 3 na rurze uderzeniowej. (B) Reprezentatywne dane przedstawiające różne profile ciśnienia obserwowane na czujnikach 1, 2 i 3 na rurze uderzeniowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie próbki

  1. Uzyskać odpowiednią linię komórkową (np. komórki brodawek skórnych).
    UWAGA: Obecny protokół został opracowany dla komórek adherentnych, z fibroblastami brodawek skórnych szczura wyizolowanymi z wibrysów użytymi jako model.
  2. Hodować komórki w kolbie T-75 zawierającej minimalną ilość pożywki niezbędnej (MEM) α uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% streptomycyną penicyliny. Utrzymuj komórki w standardowych warunkach hodowli 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym środowisku, aż osiągną 80% konfluencji.
  3. Odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki w roztworze soli fizjologicznej (PBS) buforowanej fosforanami Dulbecco. Oddzielić komórki od kolby, inkubując je w 2 ml trypsyny/EDTA w standardowych warunkach hodowli przez 5 minut. Krótko sprawdzić, czy komórki pomyślnie oddzieliły się od kolby za pomocą mikroskopu z kontrastem świetlnym/fazowym (z soczewką obiektywową 10X).
  4. Dodać 4 ml pożywki hodowlanej, aby zneutralizować reakcję trypsynizacji. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  5. Wirować przy 200 x g przez 4 minuty w celu osadzenia komórek. Powoli zasysać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. Zawiesić osad w 5 ml podłoża.
  6. Przenieść 20 μl podwielokrotności zawiesiny komórek do czystego hemocytometru i policzyć komórki za pomocą mikroskopu wyposażonego w soczewkę obiektywową 10X.
  7. Przygotuj komórki do wybuchu, umieszczając trzy szalki o średnicy 35 mm w naczyniu o średnicy 90 mm. Oznacz je odpowiednio. Dodaj 2 ml pożywki do każdej płytki o średnicy 35 mm i zasiaj w sumie 5 x 104 komórek na naczynie, równomiernie rozprowadzając komórki wokół naczynia. Próbki doświadczalne należy inkubować przez noc w standardowych warunkach hodowli, aby umożliwić odpowiednie przyłączenie komórek przed ekspozycją na falę uderzeniową.
    UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórki należy wysiać na sterylne szklane szkiełka nakrywkowe.

2. Zespół rurki uderzeniowej

figure-protocol-1
Rysunek 2: Zespół zestawu EVOC i rury amortyzującej. (A) Zdjęcie zestawu EVOC. (B) Schemat aparatu z rurką uderzeniową. Wymiary rury amortyzatora obejmują średnicę wewnętrzną 59 mm i długość całkowitą wraz z zestawem EVOC wynoszącą 4,13 m. Długość napędzanej rury i zestawu EVOC wynosi 2,71 m. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Podczas montażu należy nosić buty robocze ze stalowymi noskami i fartuch laboratoryjny.
  2. Włóż dwa pręty wyrównujące przez dwa otwory na znajdujące się w płaszczyźnie poziomej kołnierza wylotowego. Umieść arkusz uszczelki z kauczuku nitrylowego na końcu prętów wyrównujących tak, aby znajdował się między kołnierzem wylotowym a platformą do hodowli organów ex vivo (EVOC).
    UWAGA: Zestaw EVOC jest specjalnie zaprojektowanym urządzeniem przeznaczonym do użytku z szalkami Petriego o średnicy 35 mm (Rysunek 2A).
  3. Przymocuj zestaw EVOC do kołnierza wylotowego rury amortyzującej, przesuwając uchwyt po prętach wyrównujących, upewniając się, że jest prawidłowo zorientowany, tak aby sekcja podtrzymująca szalkę Petriego znajdowała się u jej podstawy.
  4. Włóż cztery M24 i podkładki do pozostałych otworów. Ustaw nakrętki tak, aby dotykały kołnierza.
  5. Mocno dokręć nakrętki i sekwencyjnie w symetryczny sposób po przekątnej, sprawdzając wzrokowo, czy zestaw EVOC i rura amortyzatora zostały pomyślnie wyrównane.
  6. Podłącz przetwornik ciśnienia do zestawu EVOC i podłącz go do źródła prądu za pomocą czujnika. Następnie za pomocą BNC podłącz źródło prądu do oscyloskopu.
  7. Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe i regulatory przepływu na rurze amortyzatora są zamknięte. Otwórz wbudowany zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i ręcznie przekręć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby naładować elektrozawór do 2.5 bara.
  8. Otwórz zawór bezpieczeństwa na butli ze sprężonym gazem, obracając go w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o 180°.
  9. Powoli przekręć regulator ciśnienia, znajdujący się na górze butli z gazem, zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć ciśnienie do około 15 barów.
    UWAGA: Punkt nastawy tego regulatora powinien być nieco wyższy od najwyższego ciśnienia rozrywającego najgrubszej membrany, która ma być użyta w doświadczeniu.
  10. Przygotuj membrany, tnąc arkusz tworzywa sztucznego o grubości 0,125 mm na kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm.
    UWAGA: Grubość membrany będzie skorelowana z ciśnieniem rozrywającym, zmieniając szczytowe ciśnienie fali uderzeniowej (tj. grubsza membrana spowoduje falę uderzeniową o większym ciśnieniu szczytowym; Tabela 1).
Wymiary membrany Mylar (cm) Ciśnienie rozrywające (bar) Zakres ciśnienia czujnika 3 (kPa) Wymiary: 10 x 10 x 0,023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 Wymiary: 10 x 10 x 0,050 4 ± 0,2 72 ± 7,5 Wymiary: 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 127 ± 12,5

Tabela 1: Ciśnienie rozrywające odpowiadające grubości membrany i ciśnieniu szczytowemu.

  1. Utwórz uchwyty z taśmy, przymocuj je do górnej i dolnej części membrany i użyj ich do ostrożnego umieszczenia membrany obok przedniego małego kołnierza przy komorze zamkowej. Upewnij się, że membrana jest prosta i prawidłowo ustawiona przed zamknięciem zamka.
  2. Zabezpiecz to za pomocą czterech i nakrętek M24. Mocno dokręć nakrętki i sekwencyjnie w sposób symetryczny po przekątnej.

3. Przygotowanie komórek tuż przed ekspozycją na falę uderzeniową

  1. Przygotuj kaptur z przepływem laminarnym tkanek, wykonując sterylizację ultrafioletem. Wyczyść go roztworem dezynfekującym i 70% etanolem. Zbierz wszystkie przedmioty potrzebne do obsługi komórek przed/po ekspozycji na falę uderzeniową i umieść je w sterylnym kapturze.
    UWAGA: Obejmuje to świeże podłoże, samoprzylepne membrany przepuszczające gazy, sterylne nożyczki, pipety i końcówki do pipet.
  2. Przenieść jedną szalkę Petriego o średnicy 90 mm zawierającą trzy próbki doświadczalne z inkubatora do sterylnego kaptura.
  3. Pociąć samoprzylepny, przepuszczający gaz arkusz membrany (patrz Tabela Materiałów) na sześć kwadratów, tak aby każdy był wystarczająco duży, aby pokryć wierzch jednej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
  4. Odessać pożywkę z płytki Petriego o średnicy 35 mm, odłożyć pokrywkę na bok i przykryć dwoma samoprzylepnymi sekcjami membrany przepuszczającej gazy, upewniając się, że między membraną a krawędzią naczynia jest szczelne uszczelnienie.
  5. Przenieś próbkę do wiertnicy EVOC i przymocuj ją do podstawy oprawy tak, aby górna część naczynia była wyrównana z wewnętrzną podstawą rurki uderzeniowej.

4. Działanie rurki uderzeniowej

  1. Podczas zwiększania ciśnienia w systemie rurki uderzeniowej należy nosić ochronniki słuchu, okulary ochronne, obuwie ochronne i fartuch laboratoryjny.
  2. Przekręć pokrętło regulacji przepływu na regulatorze zgodnie z ruchem wskazówek zegara, pozwalając gazowi spłynąć do elastycznego węża łączącego butlę ze sprężonym powietrzem z rurką uderzeniową.
  3. U dołu panelu sterowania wybierz wlot "Podwójny zamek" dla krótkotrwałej fali uderzeniowej lub wlot "Rura sterownika" dla wydłużonego czasu trwania fali.
  4. Włącz źródło zasilania prądem stałym i oscyloskop, aby uzyskać dane o przebiegu. Ustaw częstotliwość próbkowania oscyloskopu na 50.0 MS/s, z długością rekordu 1 M punktów. Ustaw zakres 50 mV dla odpalania przy 2 barach i 100 mV dla powyżej 4 barów.
  5. Włącz światła bezpieczeństwa za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania.
    UWAGA: To mówi innym badaczom, aby nie wchodzili do pomieszczenia, gdy rurka wstrząsowa się ładuje.
  6. Włącz przełącznik na elektrozaworze sterującym, aby zamknąć elektrozawór.
    UWAGA: Ta funkcja bezpieczeństwa zamyka zawór znajdujący się na podwójnej komorze zamkowej, umożliwiając ładowanie systemu.
  7. Na panelu sterowania powoli otwórz regulator przepływu, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby stopniowo zwiększać ciśnienie w komorze sprężania. Monitoruj ciśnienie za pomocą wyświetlacza panelu sterowania.
  8. Po osiągnięciu ciśnienia rozrywającego membranę membrana pęknie i będzie słychać "huk". Szybko zamknij regulator przepływu, obracając pokrętło.
    UWAGA: Fala uderzeniowa będzie przemieszczać się w dół probówki nad próbką komórki i na zewnątrz końca probówki.
  9. Otwórz elektrozawór, wyłączając przełącznik na elektromagnetycznej skrzynce sterowniczej i wyłącz lampkę bezpieczeństwa (za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania).
  10. Przenieś próbkę komórek do sterylnego kaptura, usuń samoprzylepne membrany przepuszczające gazy i napełnij naczynie 2 ml świeżej pożywki wzrostowej. Komórki mogą być natychmiast wykorzystane do oceny, jak opisano w kroku 5, lub zwrócone do inkubatora w celu przeprowadzenia badań długoterminowych.

5. Żywotność komórki

  1. Oceń żywotność komórek po ekspozycji na falę uderzeniową, stosując kombinację testu wskaźnika redoks i obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek.
    UWAGA: W przypadku obrazowania fluorescencyjnego komórki muszą być wysiewane na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych podczas sekcji 1: Hodowla komórkowa i przygotowanie próbki. Można je umieścić na szalkach Petriego o średnicy 35 mm.
  2. Przenieść 200 μl odczynnika redoks (patrz Tabela Materiałów) do każdej płytki doświadczalnej bezpośrednio po napełnieniu jej 2 ml średniej ekspozycji na falę uderzeniową. Inkubować w standardowych warunkach hodowli przez 4 godziny.
  3. Dla każdej szalki przenieść (w ciemnym sterylnym kapturze) 2 podwielokrotności po 100 μl na czarną lub przezroczystą 96-dołkową płytkę, w zależności od tego, czy do oceny żywotności zostanie użyta fluorescencja czy absorbancja.
  4. Przenieść 96-dołkową płytkę do odpowiedniego czytnika płytek wyposażonego w odpowiednie filtry i odczytać za pomocą pasm wzbudzenia 530ex/590em dla fluorescencji lub 570 nm w połączeniu z odniesieniem 600 nm dla absorbancji. Eksportuj i zapisz dane.
  5. Przeanalizuj dane, aby zidentyfikować wszelkie różnice między próbkami wystawionymi na działanie fali uderzeniowej a nienarażonymi próbkami kontrolnymi, ponieważ może to wskazywać na spadek żywotności komórek.
    UWAGA: W projekcie doświadczenia powinna być również uwzględniona kontrola ujemna. Ponadto interpolacja krzywej standardowej może być wykorzystana do obliczenia liczby komórek.
  6. Odessać pożywkę zawierającą odczynnik wskaźnikowy redoks. Zastąp go 2 ml świeżej pożywki i inkubuj komórki w standardowych warunkach hodowli przez 24 godziny.
  7. W razie potrzeby powtórz powyższe kroki, aby uzyskać drugi punkt czasowy żywotności.
  8. W celu obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek należy odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki w 1 ml PBS. Przenieść 100 μl kompletnego odczynnika znajdującego się w zestawie do obrazowania (patrz tabela materiałów) do każdej próbki i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez 15 minut.
  9. Odessać odczynnik i przemyć raz przy użyciu 1 ml PBS. Za pomocą cienkich szczypiec punktowych ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia 35 mm i umieść je stroną zadrukowaną do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym.
  10. Obrazy każdej próbki należy uzyskać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (soczewka obiektywowa 10x, apertura numeryczna 0,50) wyposażonego w odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji (ex/em 488 nm/515 nm i 570 nm/602 nm).
    UWAGA: Żywe komórki będą emitować intensywną, jednolitą, zieloną fluorescencję. Martwe lub umierające komórki z naruszoną błoną komórkową będą wchłaniać martwy składnik zestawu, powodując emisję czerwonej fluorescencji, występującej głównie w obszarze jądrowym komórki.
  11. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby ręcznie lub automatycznie zliczyć liczbę żywych i martwych komórek z każdego obrazu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metody opisanej powyżej, komórki hodowane w monowarstwie były trzykrotnie wystawione na działanie fal uderzeniowych generowanych za pomocą rurki uderzeniowej (Rysunek 2B). Oceniono markery żywotności komórek. Korzystając z testu wskaźnika redoks, stwierdzono, że zastosowanie fali uderzeniowej o natężeniu 127 kPa było w stanie znacznie zmniejszyć żywotność komórek brodawek skórnych w porównaniu z grupą kontrolną po 24 godzinach w hodowli (Rysunek 3). Zastosowanie fali uderzeniowej ≤ 72 kPa nie zmniejszyło żywotności. Aby potwierdzić te obserwacje, wykorzystano test obrazu fluorescencyjnego zdolny do fluorescencyjnego znakowania żywych lub martwych komórek odpowiednio zielonymi lub czerwonymi fluoroforami. Kwantyfikacja żywych i martwych komórek z 13 obrazów fluorescencyjnych na replikę biologiczną wykazała zmniejszenie żywotności komórek u osób wystawionych na falę uderzeniową 127 kPa w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 4). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, przy czym p <0,05 uznano za statystycznie istotne. Wielkość próby na grupę wyniosła 9 dla testu wskaźnika redoks i 39 dla ilościowej analizy obrazowania fluorescencyjnego.

figure-results-1
Rysunek 3: Dane z testu wskaźnika redoks pokazujące przebieg w czasie żywotności komórek po ekspozycji na falę uderzeniową. Znacznie mniej komórek zaobserwowano po 24 godzinach w grupie wystawionej na działanie fali uderzeniowej o natężeniu 127 kPa w porównaniu z nieleczoną kontrolą. Kontrola ujemna, która składała się z 30-sekundowego leczenia 2% środkiem dezynfekującym (patrz tabela materiałów), wykazała znacznie mniej komórek zarówno w T0, jak i 24 h w porównaniu ze wszystkimi innymi grupami. Każdy słupek reprezentuje średnią ± 1 odchylenie standardowe (SD); kontrpróby biologiczne, N = 3; kontrprób technicznych, n = 3. = p <0,0001. * = p <0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Obrazowanie fluorescencyjne. (A) Dane ilościowe zebrane z fluorescencyjnych obrazów żywych i martwych komórek uchwyconych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego po 24 godzinach ekspozycji na falę uderzeniową. Znacznie mniej żywotnych komórek zaobserwowano w próbce wystawionej na falę uderzeniową o natężeniu 127 kPa (średnia = 93,42) w porównaniu z grupami 47 kPa (średnia = 98,18), 72 kPa (średnia = 98,87) i kontrolna (średnia = 99,10). W ujemnej grupie kontrolnej po 24 godzinach nie zaobserwowano żadnych żywotnych komórek (średnia = 0). (B) Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne. Kolor zielony pokazuje żywe komórki, a czerwony martwe komórki. Każdy wykres pudełkowy pokazuje górny i dolny kwartyl z wąsami Tukeya; kontrpróby biologiczne, N = 3; kontrprób technicznych, n = 13. = p <0,0001. Podziałka liniowa = 300 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne urazy powstałe w wyniku narażenia na zdarzenia wybuchowe nie są jeszcze w pełni poznane. Identyfikacja i zrozumienie mechanizmów, które wywołują urazy wywołane wybuchem, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu 3,4 i kostnienie heterotopowe 6,7, są ważnymi pierwszymi krokami do opracowania skutecznych metod profilaktyki. Aby pomóc w osiągnięciu tego celu, opracowano szereg systemów eksperymentalnych do replikacji ekspozycji na zdarzenia wybuchowe 11,12,13,14,18,19. Opisana tutaj technika wykorzystuje sprzęt rurkowy (rysunek 2) zdolny do wystrzeliwania fal uderzeniowych pod różnymi ciśnieniami na próbki całego ciała (tj. gryzoni), tkanek lub komórek. Zdolność do ładowania pojedynczych typów komórek, a nie całych tkanek, daje możliwość analizowania różnych odpowiedzi komórkowych, ponieważ uszkodzenia mogą wystąpić jednocześnie za pośrednictwem szeregu mechanizmów 1,2. Na przykład, aby modelować urazowe uszkodzenie mózgu, ocena poszczególnych typów komórek, takich jak neurony i astrocyty, może pozwolić na identyfikację uszkodzenia specyficznego dla komórki. Również odpowiedź całego narządu można ocenić za pomocą tkanki mózgowej. Zarówno poszczególne typy komórek, jak i próbki tkanek mają wartość i mogą dostarczać różnych informacji. Możliwa jest również zmiana ilości powietrza, które jest pod ciśnieniem w celu wytworzenia wstrząsu, wybierając podwójny wlot zamka lub rury sterownika. Kontroluje to czas trwania fali uderzeniowej. Inną możliwością jest zmiana materiału i grubości membrany w celu zmiany ciśnienia szczytowego25.

Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, są efekty końcowe zakłóceń, które mogą występować, gdy obudowa próbki znajduje się w pobliżu wyjścia rurki uderzeniowej, takiej jak ta, którą można znaleźć na platformie EVOC opisanej w obecnym systemie. Chandra i wsp. przyjrzał się profilom fali uderzeniowej znajdującym się w różnych miejscach na rurze uderzeniowej napędzanej kompresją i stwierdził, że kształt fali Friedlandera był najlepiej odwzorowany w miejscu głęboko w rurze uderzeniowej15. Kuriakose i wsp. Badano również wtórne obciążenie próbki i stwierdzono, że umieszczenie płyty końcowej na końcu rurki uderzeniowej było w stanie wyeliminować niepożądane fale odbite16. Biorąc pod uwagę dane zawarte w tych publikacjach 15,16, przyszłe modyfikacje mające na celu ulepszenie systemu rur uderzeniowych opisane w tym artykule mogą obejmować umieszczenie zestawu EVOC w głębszym miejscu w napędzanej rurze lub, alternatywnie, włączenie płyty końcowej do rury amortyzatora. Ograniczeniem opisanej metody może być stosunkowo niska przepustowość próbek. Jeden użytkownik może bezpiecznie obsługiwać rurkę uderzeniową przy wydajności około 6-8 próbek na godzinę. Obecnie system jest zaprojektowany z myślą o zastosowaniu pojedynczych szalek Petriego o średnicy 35 mm. W związku z tym większe eksperymenty zawierające wiele grup i kontrprób biologicznych mogą być trudne do osiągnięcia.

Ten artykuł o metodach pokazuje, w jaki sposób na żywotność przylegających komórek brodawek skórnych wpłynęła ekspozycja na pojedynczą falę uderzeniową. Krótkotrwała fala uderzeniowa (<10 ms) o natężeniu ≤72 kPa nie wpłynęła na żywotność w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 3 i Rysunek 4). Natomiast fala uderzeniowa o natężeniu 127 kPa spowodowała znaczny spadek żywotności w ciągu 24 godzin po wybuchu, co wykazano zarówno za pomocą testu wskaźnika redoks (Rysunek 3), jak i analizy obrazu fluorescencyjnego (Rysunek 4). Miller i in. stwierdzili podobne zmniejszenie żywotności komórek w organtypowych hodowlach plastrów hipokampa szczurów, gdy komórki były wystawione na działanie fali uderzeniowej o natężeniu 147 kPa lub 278 kPa przy użyciu otwartej, napędzanej helem rurki uderzeniowej14. W przeciwieństwie do tego, VandeVord i in. stwierdzili, że nie było wpływu na żywotność astrocytów szczurów wystawionych na krótkotrwałe nadciśnienie >200 kPa, chociaż zastosowano barokomorę zamiast rurki szokowej18. Należy zauważyć, że ciśnienie zewnętrzne jest zależne od fali uderzeniowej, chociaż tworzy ona złożone fale naprężeń w ciele, co sprawia, że charakter obciążenia jest w dużym stopniu zależny od właściwości mechanicznych tkanki lub komórki. Wymagane są dodatkowe badania charakterystyki odpowiedzi komórkowej na zdarzenia blastyczne. Ponadto, oceniając ekspozycję na falę uderzeniową na poziomie komórkowym, jak pokazano w tej technice, można zidentyfikować i dalej badać reakcje biologiczne wywołane urazem, takie jak zaburzenia szlaków sygnałowych lub zmiany epigenetyczne.

Podsumowując, praca ta opisuje zastosowanie rurki uderzeniowej ze stali nierdzewnej i zmodyfikowanego zestawu EVOC do włączenia pierwotnych kultur komórkowych. Fale uderzeniowe o różnym ciśnieniu mogą być generowane i rozchodzone po żywych komórkach, aby odtworzyć efekty występujące w wyniku ekspozycji na falę uderzeniową. Protokół ten pokazuje, jak oceniać żywotność komórek, ale można również badać długoterminowe zmiany w poszczególnych typach komórek. Idąc dalej, planujemy ocenić zróżnicowane efekty, jakie złożone fale uderzeniowe mogą wywołać w różnych typach komórek, w celu pogłębienia naszej wiedzy na temat pierwotnych urazów wywołanych wybuchem.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe Centrum Badań nad Obrażeniami Wybuchowymi Królewskiego Legionu Brytyjskiego dla HA oraz finansowanie od Rady Badań Medycznych (M01858X/1) dla CAH.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM α, nukleozydyThermoFisher22571020
Płodowa surowica bydlęca, certyfikowany, pochodzący z USAThermoFisher16000044do tworzenia kompletnych pożywek wzrostowych.
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiSigma AldrichD8537
Penicylina-Streptomycyna ThermoFisher15070-063Suplement do tworzenia kompletnych pożywek wzrostowych.
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejThermoFisher15400-054Rozcieńczyć 1:10 przed użyciem.
Kolba CytoOne T-75, z powłoką TC, wentylowanaStarlabCC7682-4875
TC Dish (PS) 35 mm, 8.5 cm2Potrójna czerwonTCD010035
Petriego (PS) 90 x 14,2 mm bez odpowietrznikaVWR UK391-0453 
Przepuszczalne dla gazu uszczelki samoprzylepneThermoFisherAB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)ThermoFisherR37601
Odczynnik żywotności komórek AlamarblueFisher Scientific13494309
Tabletki VirkonVWR UK115-0020Służy do tworzenia 2% roztworu jako odczynnika do kontroli żywotności.
Kleszcze DumontSurgicalTools11295-10Służy do usuwania szkiełek nakrywkowych z szalki Petriego.
Szkło nakrywkowe, kwadratoweVWR UK631-0125
Szkiełka mikroskopoweVWR UK631-1553
96 Płytka studzienkowa, pełnaAppletonWoodsCC760Płytka do pomiarów fluorescencji.
96 Płytka studzienkowa, przezroczysta, (PS)VWR UK734-1799Płytka do pomiarów absorbancji.
Leica DMi1 Zestaw do statywu do aparatuLeica MicrosystemsMikroskop optyczny używany do hodowli komórkowych.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton MikromikroskopZeissstosowany do obrazowania LIVE/DEAD.
Czytnik EnVision MultilabelPerkinElmer2104-0010ACzytnik płytek do odczytów fluorescencji/absorbancji.
Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,023 mm RS Components785-0782Służy do tworzenia membrany rurki uderzeniowej.
Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,05 mm RS Components785-0786Służy do tworzenia membrany rurki amortyzatora.
Mylar Electrical & Folia termoizolacyjna, 304 mm x 200 mm x 0,125 mm RS Components785-0798Służy do tworzenia membrany rurki uderzeniowej.
Zasilacz źródła prąduDytran Intruments Inc.Źródło zasilania 4103Cdla czujnika 2300V1.
Czujnik ciśnienia IEPEDytran Intruments Inc.2300V1Czujnik ciśnienia umieszczony na rurze uderzeniowej.
Cyfrowy oscyloskop fosforowyTektronixDPO 4104BSłuży do zbierania i zapisywania danych czujnika 2300V1.
suplement a szalka fluorescencyjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
  2. Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
  3. Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
  4. Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
  5. Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  6. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
  7. Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
  8. Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
  9. Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618(2013).
  10. Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
  11. Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
  12. Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32(2012).
  13. Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
  14. Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20(2015).
  15. Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
  16. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597(2016).
  17. Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
  18. VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
  19. Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
  20. Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
  21. Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518(2014).
  22. Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
  23. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  24. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  25. Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blast EffectsShock TubeCell ViabilityRedox Indicator AssayFluorescent ImagingPrimary CellsShock Wave ExposureCell CulturePressure TransducerOscilloscope

Related Articles