Artykuł metodologiczny

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

DOI:

10.3791/55621

⸱

22 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 2Department of Molecular Cardiology, Cleveland Clinic Foundation, 3Department of Cancer Biology, Cardeza Vascular Research Center, Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie embrionalne komórki macierzyste (ESC) wyizolowane z wewnętrznej masy blastocysty (zazwyczaj w dniu E3.5), mogą być używane jako system modelowy in vitro do badania wczesnego rozwoju embrionalnego. W przypadku braku czynnika hamującego białaczkę (LIF) EKM domyślnie różnicują się w neuronalne komórki prekursorowe. Można je zgromadzić w trójwymiarowym (3D) sferycznym skupisku zwanym ciałem embrionalnym (EB) ze względu na jego podobieństwo do zarodka we wczesnym stadium. EB mogą być wysiewane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, gdzie rozszerzają się poprzez wzrost dwuwymiarowych (2D) przedłużeń lub wszczepiane w matryce kolagenowe 3D, gdzie kontynuują wzrost jako sferoidy i różnicują się w trzy listki zarodkowe: endodermalne, mezodermalne i ektodermalne. Kultura kolagenu 3D naśladuje środowisko in vivo bardziej niż EB 2D. Hodowla 2D EB ułatwia analizę za pomocą immunofluorescencji i immunoblottingu w celu śledzenia różnicowania. Opracowaliśmy dwuetapowy protokół różnicowania neuronalnego. W pierwszym etapie EB są generowane techniką wiszącej kropli i jednocześnie są indukowane do różnicowania przez ekspozycję na kwas retinowy (RZS). W drugim kroku różnicowanie neuronalne przebiega w formacie 2D lub 3D przy braku RA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty. Komórki te są pluripotencjalne, tzn. mają zdolność różnicowania się w dowolny typ komórek organizmu, z którego pochodzą. Różnicowanie ESC in vitro cieszy się dużym zainteresowaniem jako eksperymentalny system do badania ścieżek i mechanizmów rozwojowych. Oferuje potężny i elastyczny system modelowy do testowania nowych podejść terapeutycznych do korekcji dysfunkcji komórek i tkanek. EB podsumowują wiele aspektów różnicowania komórek podczas wczesnej embriogenezy. W szczególności EB mogą być stosowane, gdy letalność zarodka utrudnia określenie komórkowej podstawy wad embrionalnych1,2. EB mogą być formowane zarówno przez technikę wiszącej kropli, jak i płynnej zawiesiny3. Zaletą tych pierwszych jest możliwość generowania EB o stałej wielkości i gęstości, co ułatwia odtwarzalność eksperymentalną.

Interakcja z białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) może wpływać na ruchliwość i przeżywalność przylegających komórek. W systemie hodowli 2D fibronektyna jest często stosowana w celu zwiększenia adhezji komórek do podłoża. Fibronektyna jest podstawowym składnikiem blaszki rozpoznawanym przez 10 typów heterodimerów integryny powierzchniowej komórki4.

RA to mały lipofilowy metabolit witaminy A, który indukuje różnicowanie neuronalne5,6. Wysokie stężenia RZS sprzyjają neuronalnej ekspresji genów i hamują ekspresję genów mezodermalnych podczas tworzenia EB7,8. RZS jest wytwarzany przez utlenianie witaminy A do retinaldehydu przez dehydrogenazę alkoholu lub retinolu, a następnie utlenianie retinaldehydu do produktu końcowego przez dehydrogenazę retinaldehydu9. Różnicowanie neuronalne wymaga transportu RZS z cytoplazmy do jądra przez komórkowe białko wiążące RZS 2 (CRABP2). W jądrze RZS wiąże się z pokrewnym kompleksem receptorowym składającym się z heterodimeru RAR-RXR klasy 10. Powoduje to rekrutację koaktywatorów transkrypcji i inicjację transkrypcji9,11. Ponadto RA sprzyja degradacji fosforylowanego (aktywnego) SMAD1, antagonizując w ten sposób sygnalizację BMP i SMAD12. Oprócz tych działań, RA zwiększa ekspresję Pax6, czynnika transkrypcyjnego, który obsługuje różnicowanie neuronalne13. Sygnalizacja RA jest modulowana przez sirtuinę-1 (Sirt1), enzym zależny od jądrowego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+), który deacetyluje CRABP2, zakłócając jego translokację do jądra, a tym samym wiązanie RA z heterodimerem RAR-RXR14,15,16.

Naszym celem w projektowaniu opisanego tutaj protokołu EB leczonego RZS jest optymalizacja różnicowania neuronalnego, aby ułatwić analizę in vitro szlaków sygnałowych, które regulują różnicowanie ESC w neuronalne komórki prekursorowe. Jedną z zalet tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcji komórek za pomocą immunofluorescencji. 3D EB nie są dobrze penetrowane przez przeciwciała i są trudne do zobrazowania. Dysocjacja EB na monowarstwę 2D w określonych punktach czasowych podczas różnicowania neuronalnego ułatwia znakowanie immunologiczne i obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEF)

  1. Przygotuj pożywkę MEF, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (DMEM, o wysokiej zawartości glukozy), uzupełnioną 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  2. Pokryj 100 mm szalki do hodowli komórkowych 0,5% roztworem żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Policz MEF za pomocą cytometru. Usunąć roztwór żelatyny i natychmiast wlać pożywkę MEF podgrzaną do temperatury 37 °C. Szybko rozmrozić fiolki z MEF nasączone mitomycyną C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie wysiać 2,8 x 106 MEF na 100 mm naczynie pokryte żelatyną. Dostosuj odpowiednio numer komórki, jeśli używasz naczyń o innych rozmiarach. Inkubować MEF przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Zmień podłoże następnego dnia. Hodowla przez 2-3 dni, aż warstwa MEF się zlewa.

2. Kultura ESC myszy

  1. Przygotuj pożywkę ESC, zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) uzupełnioną 15% FBS i 103 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 0,1 mM aminokwasów endogennych, 55 mM 2-merkaptoetanolu, penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), gentamycyny (200 μg/ml) i 0,2% antybiotyku mykoplazmowego.
  2. Usunąć pożywkę MEF z naczynia przygotowanego w kroku 1 i zastąpić ją wstępnie podgrzanym podłożem ESC o temperaturze 37 °C.
  3. Rozmrozić fiolkę z ESC i komórki nasienne na wierzchu warstwy MEF. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż ESC osiągną konfluencję.
  4. Przygotuj nowe naczynia do hodowli komórkowych zawierające zlewającą się monowarstwę MEF. Aby przejść przez ESC, przemyj raz PBS i odłącz 0,25% trypsyny/EDTA na 2-5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zatrzymaj trypsynizację, dodając świeży IMDM z 15% FBS do oddzielających się komórek, przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić ESC świeżym IMDM i przejść jedną piątą komórek do każdej nowej płytki pokrytej MEF; inkubować, aż komórki osiągną konfluencję (zwykle 4-5 dni).

3. Wycofaj MEFy i ESC do hodowli na płytkach pokrytych żelatyną

  1. Gdy ECS osiągną konfluencję, odłącz je i MEF z 0,25% trypsyny/EDTA, jak w kroku 2.4, ponownie zawieś komórki w świeżym IMDM, przenieś na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego i inkubuj przez 40 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Ostrożnie przenieść ESC i pożywkę zawierającą MEF na nową płytkę pokrytą żelatyną za pomocą pipety o pojemności 5 ml, unikając wielokrotnego pipetowania. Komórki pozostające na szalkach Petriego to MEF, ponieważ ESC nie przylegają.
  3. Przechodź przez ESC co 3-4 dni. Rzadsze pasażowanie może zmniejszyć pluripotencję ESC. Nie przekraczaj 60% zbiegu, ponieważ może to sprzyjać różnicowaniu.
  4. Powtórz kroki 3.2-3.3 trzy lub więcej razy, w zależności od potrzeb, aż MEF-y nie będą już wykrywalne przez mikroskop hodowli komórkowych, przy użyciu obiektywu 20X, aby upewnić się, że MEF-y nie są obecne.
  5. Sprawdź pluripotencję ESC, sprawdzając hodowlę ESC, aby sprawdzić, czy komórki tworzą gęste kolonie o typowej morfologii wielokątnej ESC (Figura 1A). Przetestuj pnialność komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)17, immunoblotting17, lub immunofluorescencji podstawowych czynników transkrypcyjnych pluripotencji17 (Rysunek 2).

4. Formacja EB

  1. Przygotować roztwór podstawowy all-trans-RA o stężeniu 10 mM w DMSO i rozlać na 1,5 ml chronionych przed światłem probówek do mikrofugów. Roztwór jest stabilny w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch tygodni. Chroń go przed światłem.
  2. Trypsynizować ESC jak w kroku 2.4; ponownie platerować w świeżym IMDM bez LIF, jako zawiesinę jednokomórkową.
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę 5 x 105 komórek/ml w IMDM z 0,5 μM RA.
  4. Umieść 100 kropli 20 μl na 100-milimetrową szalkę Petriego za pomocą 8-kanałowej pipety i końcówek o pojemności 200 μl, odwróć szalki i napełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli. Chronić pożywki hodowlane zawierające RZS przed światłem.
  5. Kultura EB w wiszących kroplach w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 dni.

5. Kultura EB 2D

  1. Okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryć 30 μg/ml fibronektyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku na płytce 24-dołkowej i dodaj 1 ml IMDM na studzienkę.
  2. Zbierz 3 jednodniowe wiszące krople EB jeden po drugim za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i wysiewaj je na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, po 20 EB na dołek, używając tych samych końcówek do pipet.
    UWAGA: 3-dniowe EB są lepsze niż 4-dniowe EB, ponieważ lepiej przylegają do szkiełek nakrywkowych.
  3. Kontynuuj kulturę z IMDM-15% FBS bez LIF. Wymieniaj podłoże co 3-4 dni. W razie potrzeby zebrać zużyte podłoże do analizy wydzielania białka.

6. Wykrywanie wydzielanych białek

  1. Przenieść 500 μl pożywki EB do filtrów odśrodkowych o natężeniu 10 kDa, wirować z prędkością 20 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Sprawdzaj pożywkę pozostałą wewnątrz filtrów odśrodkowych co 15-20 minut, aby zapobiec nadmiernemu wzbogaceniu. Przerwać wirowanie, gdy objętość pozostałej pożywki spadnie do 25 μl.
  3. Zebrać pozostałą stężoną pożywkę po odwróceniu filtra i wirowaniu w temperaturze 160 x g w temperaturze 4 °C, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Wykryj wydzielane białka poprzez immunoblotting z określonymi przeciwciałami17.

7. 3D Kultura EB

  1. Zbierz EB hodowane przez 4 dni w wiszących kroplach zgodnie z opisem w kroku 5.2 i umieść je w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml (30 EB na probówkę).
  2. Przygotuj roztwór żelu kolagenowego zgodnie z instrukcjami zestawu do hodowli kolagenu 3D (patrz Tabela materiałów/wyposażenia). Rozcieńczyć odpowiednie objętości roztworu kolagenu i 5x DMEM (składnik zestawu); Dodaj roztwór neutralizujący (składnik zestawu) i natychmiast dobrze wymieszaj, a następnie trzymaj go na lodzie.
  3. Odpipetować odpowiednią objętość schłodzonego roztworu kolagenu do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej EB i delikatnie przenieść do dołków 6-dołkowej płytki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Unikaj robienia bąbelków.
  4. Natychmiast przenieść płytkę do temperatury 37 °C, 5% CO2 , na 60 minut, aby zainicjować polimeryzację kolagenu.
  5. Nałóż płytkę zawierającą EB za pomocą IMDM.
  6. Zmieniaj podłoże co 3-4 dni.

8. Dysocjacja EB

  1. Zebrać 4 EBs (z kroku 4) jeden po drugim, za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i przenieść je na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego zawierającą IMDM z 15% FBS; hodowlę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez kolejne 4 dni. Sprawdzaj EB dwa razy dziennie, aby upewnić się, że nie przyczepiają się do spodu; delikatnie potrząśnij naczyniem, aby zapobiec przyczepianiu się EB do dna.
  2. Odwirować EB przy 185 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w wirówce stołowej.
  3. Usunąć supernatanty. Ilość granulatu w każdej probówce nie powinna przekraczać 100 μl.
  4. Dodać do granulowanych EBs 1 ml 0,25% kolagenazy typu I na probówkę, uzupełnioną 20% FBS w PBS.
  5. Mieszaninę kolagenazy EB inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , delikatnie pipetując co 20 minut, używając końcówek do pipet o pojemności 1 ml.
  6. Delikatnie umyj komórki 3x za pomocą PBS. Jeśli obecne są agregaty komórkowe, użyj sitka do komórek z siatką 100 μm, aby je usunąć.
  7. Ponownie naniec komórki na pokrytych żelatyną szalkach o średnicy 60 mm w IMDM. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

9. Transfekcja zdysocjowanych EB

  1. W przypadku qRT-PCR i immunoblottingu pokryj 6-dołkową płytkę 0,5% żelatyną.
  2. W celu immunofluorescencji pokryj szkiełka nakrywkowe 30 μg/ml fibronektyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku na 24-dołkowej płytce. Dodaj IMDM.
  3. Zasiewaj 4,75 x 105 lub 1 x 105 zdysocjowanych komórek EB (kroki 8,4-8,7) na dołek odpowiednio na płytkach 6- lub 24-dołkowych.
  4. Wyhoduj komórki do 70% konfluencji przed transfekcją.
  5. Transfekcję komórek za pomocą nieliposomalnego odczynnika optymalnego dla lipidowych komórek macierzystych17 (patrz Tabela Materiałów/Sprzętu), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Używany przez nas odczynnik zazwyczaj osiągał skuteczność transfekcji na poziomie 50% (patrz Reprezentatywne wyniki).
  6. Próbki należy przeanalizować metodą qRT-PCR lub metodą immunoblottingu17 odpowiednio 2 lub 3 dni po transfekcji.

10. Analiza różnicowania EB przez immunofluorescencję

  1. Przemyj 2D EB lub zdysocjowane 3D EB za pomocą PBS i utrwal 4% paraformaldehydem w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj stałe komórki 3 razy PBS, aby usunąć pływające resztki komórek.
    UWAGA: Paraformaldehyd działa drażniąco na skórę i oczy; Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z nim.
  2. Dodaj 1% triton X-100 w PBS, aby przepuszczalność komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3x PBS.
  3. Usuń PBS i zablokuj za pomocą 5% BSA w PBS na 30 minut.
  4. Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w 1% BSA/PBS uzupełnione 0,03% trytonem X-100. Zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowym roztworem przeciwciała. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć komórki 3x PBS.
  5. Zastosuj przeciwciało drugorzędowe w PBS zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć komórki 3x PBS.
  6. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą podłoża zapobiegającego blaknięciu do mikroskopii optycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oct4, Nanog i SOX2 są głównymi czynnikami transkrypcyjnymi, które nadają ESC samoodnowę i pluripotencję. Zastosowaliśmy powyższy protokół do porównania różnicowania neuronalnego ESC od typu dzikiego i od szczepu genetycznie zmodyfikowanych myszy, u których Syx, gen kodujący specyficzny dla RhoA czynnik wymiany Syx, jest zakłócony. Mieliśmy związek z Syx w angiogenezie18. Zauważyliśmy różnice w zachowaniu EB zagregowanych z ESC Syx+/+ i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole przedstawiamy stosunkowo prostą i przystępną metodę badania różnicowania neuronalnego mysich ESC. W poprzednich protokołach RZS dodawano do pożywki odpowiednio w 2 lub 4 dniu wiszącej kropliEB 8 lub przez kulturę zawiesinową7 lub bezpośrednio po agregacji wiszącej kropli EB21. W opracowanym przez nas protokole RA został dodany wcześniej. Pomimo wcześniejszego wprowadzenia RZS do EB utworzonych przez hodowlę zawiesiny, protokół ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów ani interesów finansowych

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez grant NIH R01 HL119984 dla A.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
MEFsEMD MilliporePMEF-CFESC warstwa zasilająca
ESCEMD MilliporeCMTI-2
Naczynie do hodowli komórkowych (60 mm)Eppendorf30701119Hodowla komórkowa
Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)Falcon353003Szalka Petriego do hodowli komórkowych
(100 mm)Corning351029Wiszące krople
Płytka 24-dołkowaGreiner Bio-One6621602D EBs
6-dołkowa płytkaEppendorf30720113Transfection
Dark 1,5 ml Probówka wirówkowaCelltreat Scientific Products229437RA
Szkło nakrywkowe mikroskopuFisherbrand12-545-80Okrągły, średnica 12 mm
Szkiełka mikroskopowe Superfrost-plusFisherbrand12-550-15
Zestaw do hodowli kolagenu 3DEMD MilliporeECM675Kultura 3D
Odczynnik do transfekcji EffecteneQiagen301427Transfekcja komórek macierzystych
Microcon  Filtry odśrodkowe (10 kDa)EMD MiliporyMRCPRT010Stężenie białka
Nazwa  FirmaNumer katalogowyUwagi
Odczynniki
DMEMLonza12-709FPosiewy MEFs
IMDMGibco12440-046Posiewy ESC
Surowica bydlęca płodu (FBS)EMD MilliporeES-009-BHodowla ESC
ŻelatynaSigma-AldrichG2625Powłoka do naczyń
LIFR& D Systems8878-LF-025Aby utrzymać pluripotencję ESC
MEM Roztwory aminokwasów endogennychGibco11140050Hodowla komórkowa
2-merkaptoetanoluGibco21985023Hodowla komórkowa
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Hodowla komórkowa
GentamycynaGibco15750060Hodowla komórkowa
MycoZap Plus-PRLonzaVZA-2022Hodowla komórkowa
0,25% Trypsyna-EDTAGibco25200-072Hodowla komórkowa
DMSOSigma-AldrichD2650
Kwas all-trans-retinowySigma-AldrichR2625-50MGIndukcja różnicowania neuronalnego
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7030-50GBlokowanie i rozcieńczanie przeciwciał 
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-100MLPrzepuszczalność błony komórkowej
Sitko komórkoweCorning352360
Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPILife Tech.P36931Odczynnik montażowy
16% paraformaldehydu Mikroskopia elektronowa Nauki15710Utrwalanie komórek
FibronektynaR& D Systems1030-FNPowłoka do naczyń
PBSGibco10010049
Kolagenaza typ IWorthington Biochem. CorpLS004196EB dysocjacja
Nazwa  FirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała pierwotne
Nestin (Rat-401)Santa Cruz Biotechsc-33677Wykrywanie różnicowania neuronalnego
Oct4Santa Cruz Biotechsc-5279Wykrywanie różnicowanie neuronalne
NanogBethyl LaboratoriesA300-398AWykrywanie różnicowania neuronalnego
Sygnalizacja komórkowaSox23579Wykrywanie różnicowania neuronalnego
Tubulina b3 (AA10)Santa Cruz Biotechsc-80016Wykrywanie różnicowania neuronalnego
Nazwa  FirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała wtórne
Donkey anti-Mouse-Alexa555Life Tech.A31570Immunofluorescencyjny
osioł anty-mysz-Alexa488 Technologia życiowa.A21202Immunofluorescencja
Nazwa  FirmaNumer katalogowyUwagi
>Instrumenty
Mikroskop szerokokątnyNikonEclipse TS100Obrazowanie hodowli komórkowych
Mikroskop konfokalnyNikonC2Obrazowanie immunofluorescencyjne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  2. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  3. Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
  4. Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
  5. Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
  6. Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
  7. Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
  8. Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
  9. Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
  10. Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
  11. Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
  12. Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
  13. Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
  14. Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
  15. Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
  16. Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
  17. Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76(2016).
  18. Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
  19. Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
  20. Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
  21. Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
  22. Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
  23. Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
  24. Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
  25. Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
  26. Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie kwasem retinowymtworzenie cia embrionalnychtechnika wisz cej kroplihodowla 2D i 3Dpolimeryzacja elu kolagenowegoanaliza immunofluorescencyjnaanaliza sekrecji bia ekekspresja nestyny

Powiązane artykuły