LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Xavier Gallart-Palau; Aida Serra; Siu Kwan Sze

doi:10.3791/55626

Method Article

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

Xavier Gallart-Palau*¹ , Aida Serra*¹ , Siu Kwan Sze¹

¹Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół długotrwałej elektrostatycznej chromatografii odpychającej-hydrofilowej z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS). Jest to nowatorska metodologia, która po raz pierwszy umożliwia kwantyfikację i charakterystykę izoform deamidacji glutaminy i asparaginy za pomocą proteomiki typu shotgun.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka deamidacji białek jest niezbędna do zrozumienia roli (ról) i możliwości tej modyfikacji potranslacyjnej białka (PTM) w patologii człowieka i innych kontekstach biochemicznych. W celu przeprowadzenia charakterystyki deamidacji białek, opracowaliśmy niedawno nowatorską metodę długotrwałej chromatografii odpychania elektrostatycznego i oddziaływania hydrofilowego, chromatografii z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS), która może oddzielić produkty izoformy glutaminy (Gln) i asparaginy (Asn) od związków modelowych do wysoce złożonych próbek biologicznych. LERLIC-MS/MS jest zatem pierwszą strategią proteomiczną typu shotgun do separacji i kwantyfikacji izoform deamidacji Gln. Wykazujemy również, jako nowość, że przedstawiony tutaj protokół przetwarzania próbek stabilizuje produkt pośredni sukcynimidu, umożliwiając jego scharakteryzowanie przez LERLIC-MS/MS. Zastosowanie LERLIC-MS/MS, jak pokazano w tym artykule wideo, może pomóc w wyjaśnieniu obecnie nieznanych układów molekularnych deamidacji białek. Ponadto projekt LERLIC-MS/MS dostarcza dalszych informacji na temat reakcji enzymatycznych, które obejmują deamidację w różnych tłach biologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidacja to potranslacyjna modyfikacja białka (PTM), która wprowadza ujemny ładunek do szkieletu białkowego poprzez modyfikację reszt asparaginy (Asn) i/lub glutaminy (Gln)¹. Ta modyfikacja, wpływając na reszty Asn, generuje produkty izomeryczne, kwas izoasparaginowy (isoAsp) i kwas n-asparaginowy (Asp) w wspólnym stosunku 3:1². Niezależnie od tego, stosunek ten może zostać zmieniony przez interwencję enzymu naprawczego metylotransferazy L-izoaspartylu (PIMT)³^,⁴. Podobnie, deamidacja reszt Gln generuje izomeryczne izoformy kwasu gamma-glutaminowego (γ-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pakowanie kolumny kapilarnej z długowymienną wymianą anionową (LAX)

(Uwaga: Chociaż kolumna LAX może być pakowana w domu, jak opisujemy w tym protokole, kolumny LAX są również dostępne na rynku, zobacz Tabelę materiałów i odczynników dla dalszych szczegółów).

Zawiesić 50 mg słabego materiału opakowaniowego z anionowymiennikiem w 3,5 ml buforu do pakowania (tabela 1) w celu przygotowania gnojowicy.
Zamontuj koniec kolumny kapilarnej (rurka o długości 50 cm - średnicy wewnętrznej (ID) 200 μm) za pomocą złączki żeńskiej, tulejki i nakrętki żeńskiej. Umieść ekran o średnicy zew....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidacja pozostałości Gln i Asn jest uważana za modyfikację białka zwyrodnieniowego (DPM) związaną z kilkoma przewlekłymi i śmiertelnymi chorobami¹⁴. Wykazano, że ten PTM może przewidywać okres półtrwania i stany degradacji przeciwciał i innych cząsteczek w ludzkim ciele i podobnym tle biologicznym¹^,¹⁵. Znaczenie deamidacji białek wykracza poza kontekst biomedyczny, stąd ta modyfikacja jest obecna w różny.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule wideo przedstawiamy krok po kroku protokół LERLIC-MS/^{MS 3}, metodę przeprowadzania dogłębnej charakterystyki i dokładnego określania zakresu deamidacji białek i procesów enzymatycznych związanych z tą modyfikacją białka. LERLIC-MS/MS opiera się na zastosowaniu długiego (50 cm) LAX na zasadzie chromatografii odpychająco-hydrofilowej (ERLIC)²⁷. Zastosowanie długiej kolumny, jak pokazano w naszym badaniu³, maksymalizuje potencjał ERLIC do .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Ministerstwa Edukacji Singapuru (Poziom 2: Grant ARC9/15), Narodowej Rady Badań Medycznych Singapuru (NMRC-OF-IRG-0003-2016) oraz NTU-NHG Ageing Research Grant (Grant ARG/14017). Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność i najszczersze podziękowania dla dr Andrew Alperta i zespołu PolyLC za uprzejme dostarczenie nam materiałów opakowaniowych, które umożliwiły to badanie.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
PolyCAT 3 i mikro; m 100-Å (materiał sypki)	PolyLC Inc.	Na specjalne zamówienie
Długa kolumna kapilarna jonowymienna 50 cm - 200 &mikro; m ID	PolyLC Inc.	na specjalne zamówienie
1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm długości	SGE Analytical Science pod kierownictwem Trajan Scientific Australia	620050
Złączka żeńsko-żeńska do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16"	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Nakrętka żeńska do mikroferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Mikroferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Bomba ciśnieniowa NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC system	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Rurki Safe-lock	Eppendorf	T9661-1000EA
Koraliki ze stali nierdzewnej. 0,9 i 2,0 mm. 1 funt Niesterylne.	Next Advance	SSB14B
Wirówka stołowa	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R Standardowa
cyfrowa podgrzewana kąpiel obiegowa, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Opakowanie wrz C18 Wkład odsalający 50 mg	Wody	WAT020805
Koncentrator Vacumm	Eppendorf	Koncentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Spektrometr masowy Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	Inkubator TCSI-SS2
INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Promega	V5111
Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych	Roche	11836170001 (ROCHE)
Roztwór buforowy fosforanowy 10x (rozcieńczony do 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Octan amonu	Sigma-Aldrich	A1542
Deoksycholan sodu	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Jodoacetamid	Sigma-Aldrich	i6125
Kwas mrówkowy	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Wodorotlenek amonu	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitryl klasy	HPLC Sigma-Aldrich	675415
Izopropanol HPLC klasy	Sigma-Aldrich	675431
Woda HPLC klasy	Sigma-Aldrich	14263

Rurki PEEKsil

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles