Method Article

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół długotrwałej elektrostatycznej chromatografii odpychającej-hydrofilowej z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS). Jest to nowatorska metodologia, która po raz pierwszy umożliwia kwantyfikację i charakterystykę izoform deamidacji glutaminy i asparaginy za pomocą proteomiki typu shotgun.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka deamidacji białek jest niezbędna do zrozumienia roli (ról) i możliwości tej modyfikacji potranslacyjnej białka (PTM) w patologii człowieka i innych kontekstach biochemicznych. W celu przeprowadzenia charakterystyki deamidacji białek, opracowaliśmy niedawno nowatorską metodę długotrwałej chromatografii odpychania elektrostatycznego i oddziaływania hydrofilowego, chromatografii z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS), która może oddzielić produkty izoformy glutaminy (Gln) i asparaginy (Asn) od związków modelowych do wysoce złożonych próbek biologicznych. LERLIC-MS/MS jest zatem pierwszą strategią proteomiczną typu shotgun do separacji i kwantyfikacji izoform deamidacji Gln. Wykazujemy również, jako nowość, że przedstawiony tutaj protokół przetwarzania próbek stabilizuje produkt pośredni sukcynimidu, umożliwiając jego scharakteryzowanie przez LERLIC-MS/MS. Zastosowanie LERLIC-MS/MS, jak pokazano w tym artykule wideo, może pomóc w wyjaśnieniu obecnie nieznanych układów molekularnych deamidacji białek. Ponadto projekt LERLIC-MS/MS dostarcza dalszych informacji na temat reakcji enzymatycznych, które obejmują deamidację w różnych tłach biologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidacja to potranslacyjna modyfikacja białka (PTM), która wprowadza ujemny ładunek do szkieletu białkowego poprzez modyfikację reszt asparaginy (Asn) i/lub glutaminy (Gln)1. Ta modyfikacja, wpływając na reszty Asn, generuje produkty izomeryczne, kwas izoasparaginowy (isoAsp) i kwas n-asparaginowy (Asp) w wspólnym stosunku 3:12. Niezależnie od tego, stosunek ten może zostać zmieniony przez interwencję enzymu naprawczego metylotransferazy L-izoaspartylu (PIMT)3,4. Podobnie, deamidacja reszt Gln generuje izomeryczne izoformy kwasu gamma-glutaminowego (γ-Glu) i kwasu alfa-glutaminowego (α-Glu) w oczekiwanym stosunku 1:73,5, ale stosunek ten może zostać zmieniony przez działanie wszechobecnego enzymu transglutaminazy 2 i innych transglutaminaz, w tym transglutaminazy 1, enzymu niedawno zidentyfikowanego jako związany z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi w mózgu6.

Pochodzenie deamidacji może być albo spontaniczne, albo enzymatyczne, to pierwsze jest szczególnie powszechne na resztach Gln, w których transglutaminazy i inne enzymy pośredniczą w międzycząsteczkowym sieciowaniu poprzez transamidację (zobacz 3 więcej szczegółów na temat transamidacji Gln i jej implikacji w kilku przewlekłych i śmiertelnych chorobach ludzkich). Dlatego deamidacja jest PTM, który ma decydujący wpływ na strukturę i funkcję dotkniętych molekuł4,7,8 i wymaga dogłębnej charakterystyki chemicznej3 w świetle jego różnorodnych konsekwencji biochemicznych, w tym jego usługi jako zegara molekularnego starzenia9.

Chociaż deamidacja reszt Asn została stosunkowo dobrze scharakteryzowana przez proteomikę typu shotgun bottom-up1,10, deamidacja reszt Gln nadal nie ma odpowiedniej metody charakterystyki poza trudną analizą modelowych związków za pomocą fragmentacji rodników opartej na elektronach11. Niedawno opracowaliśmy nowatorską, jednowymiarową strategię proteomiki typu shotgun (LERLIC-MS/MS)3, która umożliwia separację izoform deamidacji Gln i Asn ze złożonych próbek biologicznych i związków modelowych w jednej analizie. LERLIC-MS/MS opiera się na separacji peptydów trawionych tryptycznie za pomocą długodystansowej (50 cm) kolumny jonowymiennej (LAX) pracującej w trybie chromatografii elektrostatycznej odpychająco-hydrofilowej (ERLIC) i sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Ta nowa strategia analityczna została wykorzystana do scharakteryzowania i względnego ilościowego określenia zakresu każdej deamidowanej reszty w tkankach ludzkiego mózgu3. Niemniej jednak, przedstawiony tutaj protokół zapewni obrazowanie wideo LERLIC-MS/MS mające na celu zbadanie specyfiki deamidacji białek w kontekście biochemicznym będącym przedmiotem zainteresowania.

OŚWIADCZENIE ETYCZNE

Wszystkie procedury tego protokołu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pakowanie kolumny kapilarnej z długowymienną wymianą anionową (LAX)

(Uwaga: Chociaż kolumna LAX może być pakowana w domu, jak opisujemy w tym protokole, kolumny LAX są również dostępne na rynku, zobacz Tabelę materiałów i odczynników dla dalszych szczegółów).

  1. Zawiesić 50 mg słabego materiału opakowaniowego z anionowymiennikiem w 3,5 ml buforu do pakowania (tabela 1) w celu przygotowania gnojowicy.
  2. Zamontuj koniec kolumny kapilarnej (rurka o długości 50 cm - średnicy wewnętrznej (ID) 200 μm) za pomocą złączki żeńskiej, tulejki i nakrętki żeńskiej. Umieść ekran o średnicy zewnętrznej 1/16 cala i wielkości porów 1 mikron wewnątrz złączki żeńskiej. (Uwaga: Zastosowane tutaj sito musi mieć mniejszy rozmiar porów niż rozmiar cząstek materiału uszczelniającego, aby zapobiec wyciekowi materiału z kolumny).
  3. Wypełnij kapilarę gnojowicą za pomocą pompy ciśnieniowej pracującej pod ciśnieniem 4,500 psi. (Uwaga: Pakować kolumnę tak długo, aż materiał opakowaniowy będzie widoczny przy wejściu kolumny).
  4. Zamontować drugi koniec kolumny kapilarnej zgodnie z opisem w ppkt 1.2.

2. Przygotowanie próbki

Ten protokół opisuje zastosowanie LERLIC-MS/MS do analizy tkanek ludzkiego mózgu jako modelowego proteomu. (Uwaga: W przypadku użycia innych tkanek lub próbek proteomicznych należy dostosować procedury przygotowania próbek).

  1. Homogenizacja tkanek:
    a. Przemyć tkanki mózgu (50 do 100 mg) 1x roztworem buforu fosforanowego przez pięć minut trzykrotnie.
    b. Homogenizować tkankę w stosunku 1:1:2,5 tkanka/kulki metaliczne/bufor homogenizacyjny SDC (Tabela 2) (w/w/v) przez 5 minut w temperaturze 4 °C w probówkach z bezpieczną blokadą przy maksymalnej intensywności przy użyciu homogenizatora tkankowego. (Uwaga: Bufor homogenizacyjny SDC może zawierać inhibitory proteazy, jak wcześniej wskazano w3)
    c. Odwirować homogenat tkankowy, otrzymany w poprzednim etapie, w temperaturze 10 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
    d. Powtórzyć kroki b-c dla pozostałych osadów i połączyć supernatanty tyle razy, ile to konieczne, aż nie zaobserwuje się żadnych osadów. (Uwaga: Jeśli musisz powtórzyć kroki b-c więcej niż dwa razy, przenieś próbkę i kulki do nowej probówki z bezpiecznym zamkiem, aby zapobiec utracie próbki podczas etapu wirowania).
    e. Określ ilościowo stężenie białka w otrzymanych homogenatach za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA)12.
  2. Trawienie tryptyczne wspomagane deoksycholanem sodu (SDC) w roztworze13 homogenatów mózgu.
    a. Dodać końcowe stężenie 10 mM ditiotreitolu (DTT) (przy użyciu roztworu podstawowego wskazanego w roztworze 5 w tabeli 3) do otrzymanego homogenatu, aby zainicjować redukcję wiązań dwusiarczkowych białek.
    b. Inkubować homogenat przez 30 minut w łaźni nastawionej na 60 °C.
    c. Dodać do homogenatu końcowe stężenie 20 mM jodoacetamidu (IAA) przy użyciu roztworu podstawowego wskazanego w roztworze 7 w tabeli 4.
    d. Inkubować homogenat zawierający IAA w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 min.
    e. Rozcieńczyć mózg homogenat dwukrotnie, używając buforu rozcieńczającego (roztwór 6 w tabeli 3).
    f. Inkubować próbkę do drugiego etapu redukcji przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    g. Dodać trypsynę zmodyfikowaną do sekwencjonowania rozpuszczoną w roztworze 2 w tabeli 2 w stosunku białka do enzymu 1:50 (w/w).
    h. Homogenat trawić trypsyną przez całonocną inkubację w temperaturze 30 °C.
    ja. Następnego dnia wygasić trawienie enzymatyczne, dodając 0,5% końcowego stężenia kwasu mrówkowego (FA). (Uwaga: Dodanie FA spowoduje wytrącanie się soli SDC w warunkach kwaśnych.)
    j. Delikatnie wytrząsnąć próbki zawierające osady SDC.
    k. Sole SDC należy granulować, odwirowując próbki w temperaturze 12 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut
    l. Zebrać supernatant i przenieść ciecz do nowej, czystej probówki. (Uwaga: Podczas pipetowania na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie zawiesić ponownie i/lub nie zebrać soli z granulatu SDC.)
    m. Ponownie rozpuścić osad SDC w buforze do ponownego rozpuszczania SDC (Tabela 5) pod energicznym wirowaniem przez 1 min.
    n. Powtórz kroki j-l dwukrotnie, aby odzyskać wytrącone peptydy i połączyć supernatanty. (Uwaga: Zobacz Serra et al. 201613, aby uzyskać więcej informacji na temat protokołu trawienia tryptycznego wspomaganego SDC w roztworze dostosowanego tutaj.)
  3. Odsalanie próbek trawionych tryptycznie.
    a. Przeprowadzić odsalanie przefermentowanych próbek za pomocą wkładu 1 g C-18. (Uwaga: Użycie wkładu o dużej objętości (5 ml) niezależnie od ilości uzyskanego białka gwarantuje prawidłowe oczyszczenie pozostałych soli SDC w próbkach przed wstrzyknięciem LC-MS/MS.)
    b. Kondycjonować wkład 1 g C-18 za pomocą 5 ml acetonitrylu (ACN).
    c. Przepuścić 5 ml buforu czyszczącego (Tabela 6) przez kondycjonowany wkład 1 g C-18 w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika organicznego.
    d. Załaduj próbkę do 1 g wkładu C-18.
    e. Wykonaj 3 - 5 kroków oczyszczania próbki w kolumnie C-18 o masie 1 g, używając 5 ml buforu czyszczącego w każdym kroku.
    f. Eluować odsolone peptydy z 1 g wkładu C-18 przy użyciu 5 ml buforu elucyjnego (Tabela 7).
    g. Wysuszyć eluowane peptydy w koncentratorze próżniowym.
    c. Rozpuścić wysuszoną próbkę w końcowej objętości 200 μl buforu elucyjnego. (Uwaga: Stosować energiczne i długie (> 10 min) wirowanie, a następnie sonikację w kąpieli sonizacyjnej przez 30 minut, aby całkowicie ponownie zawiesić wysuszone peptydy w buforze do wstrzykiwań.)
    d. Dostosuj objętość iniekcji próbki dla LERLIC-MS/MS, aby przeanalizować od 1 do 3 μg białka.

3. Jednowymiarowa separacja LERLIC-MS/MS

  1. Warunki chromatografii cieczowej:
    Fazy mobilne:
    A: 0,1% FA w wodzie (tabela 8).
    B: 0,1% FA w ACN (Tabela 9)
    Natężenie przepływu: 0,4 μl/min
    Kolumna: Kolumna kapilarna LAX (długość 50 cm - średnica wewnętrzna 200 μm)
    a. Stosuj następujące nachylenie 1200 min: 95% B przez 40 min, 95 − 85% B przez 434 min, 85− 70% B przez 522 min, 70− 35% B przez 124 min, 35− 3% B przez 45 min, izokratyczny przy 3% B przez 5 min, 3 – 95% B przez 7 min i utrzymywany izokratyczny na poziomie 95% B przez 23 min.
    b. Przeprowadzić separację peptydów za pomocą kapilary LAX, jak wskazano w Serra & Gallart-Palau i wsp.3 przy użyciu ultra-wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.
  2. Konfiguracja spektrometru masowego:
    a. Skonfiguruj szczegóły zdarzenia skanowania, aby przeprowadzić akwizycję danych na przemian między pełną spektrometrią mas z transformacją Fouriera (FT-MS) i spektrometrią mas z transformacją Fouriera (FT-MS/MS) z następującymi parametrami:
    a.1. Tryb akwizycji danych: dodatni
    a.2 Parametry FT-MS:
    Zakres masy: 350 − 2 000 m/z
    Rozdzielczość: 60 000
    Mikroskany: 1 na spektrum
    Automatyczna kontrola wzmocnienia: 1 × 106
    a.3 Parametry FT-MS/MS:
    Tryb fragmentacji: Wysokoenergetyczna dysocjacja kolizyjna (HCD)
    a.4 Zakres masy: 150 − 2 000 m/z
    a.5 Rozdzielczość: 30 000 < br / > a.6 Górne jony N: 10
    Mikroskany: 1 na spektrum
    Stan naładowania: > 2 +
    Szerokość izolacji: 2 Da
    a.7 Automatyczna kontrola wzmocnienia: 1 × 106
    b. Wykonaj detekcję peptydów za pomocą spektrometrii mas, jak wskazano w3 przy użyciu orbitrapowego spektrometru masowego wyposażonego w źródło jonów nanoelektronrozpylania pracującego pod napięciem 1,5 kV.

4. Analiza danych

  1. Przeszukaj bazę danych białek na podstawie danych uzyskanych w LERLIC-MS/MS przy użyciu następujących parametrów przy użyciu specjalnego oprogramowania proteomicznego: (Uwaga: Zobacz3, aby uzyskać więcej informacji.)
    a. Tolerancja jonów: 10 ppm
    b. Tolerancja jonów fragmentacyjnych: 0,05 Da
    c. Wskaźnik fałszywych odkryć (FDR): 1%
    d. Baza danych: UniProt Human database
    e. Poprawiono modyfikacje: Karbamydometylacja w Cys
    f. Zmienne modyfikacje (jeśli jest to wymagane przez oprogramowanie): Utlenianie (Met), Deamidacja (Asn i Gln).
  2. Pewna charakterystyka i kwantyfikacja izomerycznych produktów deamidowanych w danych LERLIC-MS/MS:
    a. Eksport wyników wyszukiwania w bazie danych z LERLIC-MS/MS do oprogramowania spreedsheet w celu analizy.
    b. Znajdź i wyodrębnij całą listę zdeamidowanych peptydów i ich niezdeamidowanych odpowiedników.
    c. Korzystając z wykazu otrzymanych peptydów jako odniesienia, wyekstrahować chromatogramy jonowe (XIC) tych peptydów za pomocą odpowiedniego oprogramowania przy 5 ppm tolerancji masy. (Uwaga: Zobacz3, aby uzyskać więcej informacji na temat oprogramowania używanego do ekstrakcji XIC.)
    d. Zbadaj wzrokowo otrzymane XIC, aby zidentyfikować oddzieloną elucję dwupikową produktów izomerycznych, jak wskazano3. (Uwaga: Produkty izomeryczne tych peptydów zidentyfikowanych na poziomie MS/MS można łatwo znaleźć, kierując się obecnością dwóch różnych czasów retencji w wynikach wyszukiwania w bazie danych).
    e. Względne oznaczanie ilościowe produktów izomerycznych z każdego zdeamidowanego miejsca/peptydu musi być przeprowadzone w oparciu o powierzchnię piku każdego zidentyfikowanego izomeru w otrzymanych XIC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidacja pozostałości Gln i Asn jest uważana za modyfikację białka zwyrodnieniowego (DPM) związaną z kilkoma przewlekłymi i śmiertelnymi chorobami14. Wykazano, że ten PTM może przewidywać okres półtrwania i stany degradacji przeciwciał i innych cząsteczek w ludzkim ciele i podobnym tle biologicznym1,15. Znaczenie deamidacji białek wykracza poza kontekst biomedyczny, stąd ta modyfikacja jest obecna w różny...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule wideo przedstawiamy krok po kroku protokół LERLIC-MS/MS 3, metodę przeprowadzania dogłębnej charakterystyki i dokładnego określania zakresu deamidacji białek i procesów enzymatycznych związanych z tą modyfikacją białka. LERLIC-MS/MS opiera się na zastosowaniu długiego (50 cm) LAX na zasadzie chromatografii odpychająco-hydrofilowej (ERLIC)27. Zastosowanie długiej kolumny, jak pokazano w naszym badaniu3, maksymalizuje potencjał ERLIC do ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Ministerstwa Edukacji Singapuru (Poziom 2: Grant ARC9/15), Narodowej Rady Badań Medycznych Singapuru (NMRC-OF-IRG-0003-2016) oraz NTU-NHG Ageing Research Grant (Grant ARG/14017). Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność i najszczersze podziękowania dla dr Andrew Alperta i zespołu PolyLC za uprzejme dostarczenie nam materiałów opakowaniowych, które umożliwiły to badanie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 i mikro; m 100-Å (materiał sypki)PolyLC Inc.Na specjalne zamówienie
Długa kolumna kapilarna jonowymienna 50 cm - 200 &mikro; m IDPolyLC Inc.na specjalne zamówienie
1/16" OD x 200 µ m ID x 50 cm długościSGE Analytical Science pod kierownictwem Trajan Scientific Australia 620050
Złączka żeńsko-żeńska do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16"Upchurch ScientificUPCHF-125
Nakrętka żeńska do mikroferuleUpchurch ScientificUPCHP-416
MikroferuleUpchurch ScientificUPCHF-132
Bomba ciśnieniowa NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC systemShimadzuProminence UFLC
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Rurki Safe-lockEppendorf T9661-1000EA
Koraliki ze stali nierdzewnej. 0,9 i 2,0 mm. 1 funt Niesterylne.Next AdvanceSSB14B
Wirówka stołowa Hettich ZentrifugenRotina 380 R Standardowa
cyfrowa podgrzewana kąpiel obiegowa, 120VACPolyScience 8006 6L8006A11B
Opakowanie wrz C18 Wkład odsalający 50 mgWodyWAT020805
Koncentrator VacummEppendorf Koncentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 
Spektrometr masowy Orbitrap EliteThermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray Michrom-Bruker Inc.Inkubator TCSI-SS2
INCUCELL MMM GroupINCUCELL111
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowaniaPromegaV5111
Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowychRoche11836170001 (ROCHE)
Roztwór buforowy fosforanowy 10x (rozcieńczony do 1x)Sigma-AldrichP5493
Octan amonuSigma-AldrichA1542
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
JodoacetamidSigma-Aldrichi6125
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507 (HONEYWELL)
Wodorotlenek amonuSigma-Aldrich338818 (HONEYWELL)
Acetonitryl klasyHPLC Sigma-Aldrich675415
Izopropanol HPLC klasySigma-Aldrich675431
Woda HPLC klasySigma-Aldrich14263
Rurki PEEKsil

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  2. Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
  3. Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
  4. Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
  5. Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
  6. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  7. Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27(2016).
  8. Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
  9. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
  10. Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
  11. Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
  12. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  13. Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
  14. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
  15. Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
  16. Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106(2016).
  17. Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005(2016).
  18. Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
  19. Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
  20. Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
  21. Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
  22. Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20(2016).
  23. Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
  24. Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
  25. Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
  26. Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798(2016).
  27. Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
  28. Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).
  29. Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
  30. Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LERLIC MS MSGlutamine DeamidationAsparagine DeamidationShotgun ProteomicsProtein DeamidationSuccinimide IntermediateAnion Exchange ChromatographyPeptide SeparationProteome AnalysisPosttranslational Modification

Related Articles