A przedstawiono protokół produkcji tRNA(UUU) i analizy tRNA(UUU) w kompleksie z enzymem TcdA za pomocą testów opóźniających działanie żelu agarozowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pokazujemy metody ekspresji i oczyszczania tRNA(UUU) w Escherichia coli oraz analizę za pomocą testów opóźniających żel wiązania tRNA(UUU) z TcdA, dehydratazą N 6-treonylokarbamoyloadozyny (t6A), która cyklizuje łańcuch boczny treonylokarbamoilu przyłączony do A37 w pętli macierzystej antykodonu (ASL) tRNA do cyklicznego t6A (ct6Transkrypcja syntetycznego genu kodującego tRNA (UUU) jest indukowana w E. coli za pomocą 1 mM izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), a komórki zawierające tRNA są pobierane 24 godziny po indukcji. Frakcja RNA jest oczyszczana metodą kwaśnej ekstrakcji fenolowej. Czyste tRNA uzyskuje się za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej, która skutecznie oddziela małe cząsteczki tRNA od większych nienaruszonych lub rozdrobnionych kwasów nukleinowych. Aby przeanalizować wiązanie TcdA z tRNA (UUU), TcdA miesza się z tRNA (UUU) i rozdziela na natywnym żelu agarozowym w temperaturze 4 °C. Wolne tRNA(UUU) migruje szybciej, podczas gdy kompleksy TcdA-tRNA(UUU) ulegają opóźnieniu ruchomości, które można zaobserwować po zabarwieniu żelu. Pokazujemy, że TcdA jest enzymem wiążącym tRNA (UUU). Ten test opóźniania żelu może być wykorzystany do badania mutantów TcdA oraz wpływu dodatków i innych białek na wiązanie.
Wprowadzenie
Test opóźnienia żelu1 (znany również jako test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej, EMSA) to metoda elektroforetyczna przeznaczona do badania i charakteryzowania interakcji białko-kwas nukleinowy. Umożliwia analizę oddziaływań białko-DNA, a także białko-RNA, a w szczególności interakcji między tRNA a białkami wiążącymi tRNA, przy użyciu oczyszczonych składników lub złożonych mieszanin białek (np. lizatów komórkowych) lub kwasów nukleinowych (np. pul tRNA). Zastosowaliśmy testy opóźniania żelu do badania interakcji między oczyszczonym tRNA (UUU) a TcdA, dehydratazą N 6-treonylokarbamoyloadenozyny (t6A), która cyklizuje łańcuch boczny treonylokarbamoilu przyłączony do A37 w pętli rdzenia antykodonu (ASL) tRNA do cyklicznego t6 (ct6A) 2,3. TcdA jest również znany jako CsdL3,4. Gen tcdA/csdL tworzy klaster z genami csdA i csdE 5, które kodują desulfurazę cysteiny i akceptor siarki systemu desiarczanu cysteiny sulfinazy (CSD) i są wymagane do podtrzymania funkcji TcdA in vivo3.
Uzasadnieniem testów opóźniania żelu jest to, że podczas gdy wolne cząsteczki kwasu nukleinowego szybko migrują na przód żeli akrylamidowych lub agarozowych ze względu na ich duży ładunek ujemny, ruchliwość elektroforetyczna kompleksów białkowych tych samych kwasów nukleinowych jest znacznie zmniejszona. Zmniejszenie ruchliwości jest wizualizowane jako "przesunięcie" w kompleksach kwas-białko nukleinowe, które rozwiązują się jako dyskretne prążki. Dodatnio naładowany i większy kompleks kwas-białko nukleinowy wykazują większe przesunięcie lub zmniejszenie ruchliwości na żelu.
Ponieważ neutralizacja ładunku kompleksu jest zjawiskiem uniwersalnym dla kompleksów białkowo-nukleinowych, test opóźniania żelu może być stosowany do szerokiego zakresu kompleksów i typów kwasów nukleinowych. Metoda jest prosta, niedroga i może być przeprowadzana w laboratoriach przy minimalnym sprzęcie. Wymaga tylko niewielkich ilości białek i tRNA. Jest to przewaga nad alternatywnymi technikami biofizycznymi, które zwykle zużywają większe ilości próbki.
Test opóźnienia żelu jest szeroko stosowany do badania czynników transkrypcyjnych. Test został wykorzystany do analizy kinetyki wiązania, siły i swoistości czynników transkrypcyjnych dla wielu różnych sekwencji DNA. To właśnie w tej dziedzinie po raz pierwszy opracowano EMSA6,7. Testy opóźniania żelu z RNA8,9,10,11 i cząsteczki tRNA były również wykorzystywane w badaniach rybosomów i do analizy, tak jak robimy to tutaj, enzymów, które modyfikują nukleozydy tRNA po transkrypcji.
Wiele różnych parametrów wpływa na wynik testu opóźnienia żelu, takich jak temperatura, jakość próbki białka i tRNA oraz siła wiązania. Staranne zaplanowanie i przeprowadzenie eksperymentu ma kluczowe znaczenie dla interpretacji wyników wolnych kwasów nukleinowych i gatunków związanych z białkami. W tym przypadku użyliśmy syntetycznego genu kodującego tRNA (UUU) sklonowanego do wektora ekspresji, którego promotor nie ma miejsca wiązania rybosomów Shine-Dalgarno, co prowadzi do syntezy dużych ilości tRNA2. Ten szczegółowy protokół ma na celu zapewnienie jasnego przewodnika do przeprowadzania eksperymentów z opóźnianiem żelu tRNA przy jednoczesnym unikaniu typowych błędów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Przed użyciem zapoznaj się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS). Kilka substancji chemicznych użytych w tym protokole jest toksycznych i. Podczas przeprowadzania ekstrakcji tRNA za pomocą fenolu należy stosować odpowiednie praktyki, w tym stosowanie dygestorium i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, spodnie na całej długości, buty z zakrytymi palcami itp.). Protokół ten wykorzystuje nietoksyczne barwienie kwasem nukleinowym. Stosowanie alternatywnych barwników może wymagać dodatkowych środków ostrożności i specjalistycznej utylizacji środka barwiącego, jeśli jest toksyczny i/lub rakotwórczy (np. bromek etydyny).
1. Przygotowanie żelu agarozowego
- Zważ 2 g agarozy i dodaj ją do szklanej butelki, aby przygotować żel agarozowy 2% w/v.
- Dodać 100 ml 1x buforu biegowego kwasu tris-boranowego etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TBE) do butelki zawierającej agarozę. Rozpuść się przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej. W odstępach 30 s mieszaj zawartość, aby dobrze wymieszać i powtarzaj ten krok, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do około 50-60 °C.
- Zaklej taśmą otwarte krawędzie tacki na żel, aby utworzyć formę, umieść odpowiedni grzebień, aby utworzyć dołki i wlej do niego stopioną agarozę. Unikaj tworzenia się pęcherzyków i pozwól mu zastygnąć w temperaturze pokojowej.
- Po zestaleniu się tackę z żelem umieść w urządzeniu do elektroforezy i napełnij ją buforem TBE, aż żel zostanie całkowicie pokryty.
2. Przygotowanie tRNA
- Ekspresja tRNA(UUU) w E. coli
- Rano użyj fiolki z mrożoną E. coli BL21(DE3) przekształconą wektorem ekspresyjnym pET23d-EcUUU2 (zawiera gen kodujący E. coli tRNA(UUU)), aby pokryć płytkę o niskiej zawartości soli Luria Broth (LB) uzupełnioną 100 μg/ml ampicyliny. Odwrócić płytkę i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C do momentu pojawienia się kolonii (późne popołudnie).
- Zaszczepić jedną dobrze wyrośniętą, pojedynczą kolonię w 5 ml LB plus 100 μg/ml ampicyliny i hodować przez noc z prędkością 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
- Następnego ranka otocz komórki (6 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C), zastąp pożywkę 5 ml świeżego LB plus 100 μg/ml ampicyliny i ponownie zawiesij. Użyj tej zawiesiny do zaszczepienia 200 ml LB plus 100 μg/ml ampicyliny. Rosnąć przez 5 godzin z prędkością 220 obr./min w temperaturze 37 °C.
- Gdy gęstość optyczna kultury przy 590 nm (OD590) osiągnie 0,6 - 0,8, dodaj 1 mM IPTG do hodowli, aby wyzwolić ekspresję genu tRNA (UUU). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
- Zebrać komórki, odwirowując kulturę w temperaturze 6 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Liza i ekstrakcja
- Ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml buforze do lizy (0,3 M octan sodu, 10 mM EDTA). Od tego momentu należy stosować autoklawowane i utrzymywać wszystkie próbki zawierające tRNA w temperaturze 4 °C, aby zapobiec degradacji tRNA.
- Dodać 1 objętość kwaśnego fenolu (pH 4,3) do zawieszonych osadów komórkowych w dygestorium. Mieszać przez 1 minutę przez inwersję w celu lizy komórek i odwirować przy 10 000 x g (10 min, 4 °C).
- Zebrać górną fazę wodną zawierającą rozpuszczalne tRNA(UUU) (i mniejsze stężenia innych pul tRNA) za pomocą pipety, uważając, aby nie zassać fazy organicznej (dolnej). Wyrzuć dolną warstwę i osad, który składa się z fazy organicznej i resztek komórek, do odpowiedniego pojemnika.
- Wytrącić tRNA poprzez dokładne wymieszanie fazy rozpuszczalnej (wodnej) z 2,5 objętościowym 100% v/v etanolem przez inwersję przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odwirować mieszaninę przy 15 000 x g (30 min, 4 °C).
- Ostrożnie zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad bogaty w tRNA w 4 ml żelowego buforu filtracyjnego (20 mM fosforanu sodu lub fosforanu potasu, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Uruchom 5 μl zawieszonej puli tRNA na 2% w/v żelu agarozowym.
UWAGA: Dobrej jakości tRNA występuje jako pojedyncze prążki (wielkość cząsteczki między 50-100 pz).
- Oczyszczanie tRNA(UUU)
- Zgodnie ze standardową praktyką chromatograficzną12, załadować ponownie zawieszone tRNA(UUU) do kolumny filtracyjnej z żelu preparatywnego o wysokiej rozdzielczości (wymiary: 16 x 600 mm, objętość złoża: 120 ml, zakres rozdzielczości: 1 000-70 000 Da) uprzednio zrównoważonego w żelowym buforze filtracyjnym (faza ruchoma). Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min, aby eluować próbki.
UWAGA: Pipik tRNA(UUU) eluuje w przybliżeniu przy 75,5 ml. Zazwyczaj można uzyskać wydajność 0,5-1,0 mg/L tRNA hodowli. - Analizować próbki w reprezentatywnych objętościach elucji przez elektroforezę 5 - 10 μl każdej próbki na 2% w/v żelu agarozowym.
- Zgodnie ze standardową praktyką chromatograficzną12, załadować ponownie zawieszone tRNA(UUU) do kolumny filtracyjnej z żelu preparatywnego o wysokiej rozdzielczości (wymiary: 16 x 600 mm, objętość złoża: 120 ml, zakres rozdzielczości: 1 000-70 000 Da) uprzednio zrównoważonego w żelowym buforze filtracyjnym (faza ruchoma). Ustaw natężenie przepływu na 1 ml/min, aby eluować próbki.
3. Przygotowanie próbki
- Ekspresja i oczyszczanie TcdA według López-Estepa i wsp. 2.
UWAGA: Do badania można użyć do 250 μM TcdA. - Odpipetować odpowiednią ilość TcdA zgodnie z tabelą 1 do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Dodać 1,6 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) (stężenie końcowe) i delikatnie wymieszać za pomocą pipety. Zamknij pokrywkę i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Dodać 10 μM trifosforanu adenozyny (ATP) i 50 mM MgCl2 (stężenia końcowe). Wymieszać pipetą i inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać oczyszczone tRNA(UUU) (sekcja 2.3) zgodnie z tabelą 1, wymieszać pipetą i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
- Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 100 μl końcowej objętości. Dokładnie wymieszaj i dodaj glicerol do końcowego stężenia 10% v/v.
- Odwirować próbkę i krótko odwirować zawartość probówki (10 000 x g, 1 min, 4 °C).
4. Ładowanie żelem i rozwój elektroforezy
- Umieścić urządzenie do elektroforezy w tacy wypełnionej kruszonym lodem, aby utrzymać komorę w temperaturze 4 °C podczas przebiegu elektroforezy.
- Ostrożnie odpipetować 5 μl każdej próbki do odpowiedniego dołka. Dodaj odpowiedni marker wielkości DNA.
- Podłącz elektrody do odpowiednich szczelin zasilacza. Włącz zasilacz i ustaw napięcie na 100 V i uruchom żel na 90 minut.
5. Barwienie żelem w celu obserwacji interakcji tRNA-białko
- Przygotować roztwór barwiący, mieszając 50 ml KZM z 1 x odpowiednim barwnikiem DNA. Unikaj wystawiania roztworu barwiącego na działanie promieni słonecznych, przykrywając pojemnik do barwienia folią aluminiową.
UWAGA: Barwienia DNA są zwykle przechowywane jako 10 000 lub 20 000 razy skoncentrowane zapasy. - Po 90 minutach elektroforezy ostrożnie wyjmij żel z tacki i umieść go w pojemniku z roztworem barwiącym. Umieść go na bujaku przy niskiej prędkości bujania w temperaturze pokojowej na 30 minut.
- Wyjmij żel agarozowy z pojemnika do barwienia, ostrożnie postukaj nim w kawałek chusteczki celulozowej lub bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar płynu, i umieść go bezpośrednio na transiluminatorze. Włącz światło UV, aby uwidocznić prążki zawierające tRNA. Zrób zdjęcie żelu.
- Barwienie białek (opcjonalnie).
- Roztwór do barwienia DNA należy bezpiecznie wyrzucić (zgodnie z procedurami bezpieczeństwa) i zastąpić go 50 ml roztworu Coomassie Brilliant Blue (CBB). Umieść tacę na bujaczku w temperaturze pokojowej i bejcuj przez noc (>12 h). Wyrzuć roztwór barwiący CBB i zastąp go 50 ml PBS, aby usunąć nadmiar barwnika. Odplamianie przez 1 godzinę na bujaku.
- Wizualizuj kompleksy tRNA zawierające białka pod transiluminatorem światła i rób zdjęcia żelu, aby porównać go z obrazem żelu UV tRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Duże ilości tRNA(UUU) można uzyskać poprzez ekspresję genu tRNA w E. coli pod kontrolą silnego indukowalnego promotora T7. Ekspresowane tRNA(UUU) gromadzi się w cytoplazmie i jest wzbogacone względem puli naturalnie występujących tRNA. Aby uzyskać tRNA o czystości odpowiedniej do analiz EMSA, zastosowano dwuetapowy proces oczyszczania, składający się z etapu wychwytu/ekstrakcji oraz etapu filtracji żelowej/doczyszczania. Na etapie wychwytu/ekstrakcji wykorzystuje się fenol o pH 4...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany w niniejszym dokumencie test opóźniania działania w żelu białko-tRNA agarozy może być modyfikowany na wiele sposobów. Po pierwsze, procent agarozy w żelu może zostać zmniejszony, aby umożliwić separację i wizualizację kompleksów białko-tRNA znacznie większych niż analizowany tutaj (120 kDa). Po drugie, jeżeli białko docelowe jest termolabilne, należy podjąć dodatkowe środki ostrożności w celu zapewnienia, że temperatura jest utrzymywana poniżej maksymalnej dopuszczalnej temperatury poprzez przeniesienie aparatu d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
MCV jest członkiem programu CIB "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Badania, które doprowadziły do uzyskania tych wyników, otrzymały dofinansowanie ze środków hiszpańskiego Instituto de Salud Carlos III (PI12/01667 do MCV), hiszpańskiego Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R i SAF2015-72961-EXP do MCV), rządu regionalnego Madrytu (S2010/BD-2316 do MCV) oraz Komisji Europejskiej (Program Ramowy 7 (7PR)) projektu ComplexINC (umowa nr 279039 do MCV). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lizogen zawiera polimerazę T7 po indukcji IPTG. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d nadaje odporność na ampicylinę; Promotor T7. |
| bulionu LB, o niskiej zawartości soli (bulion Lennox L), granulowanego | konwencjonalnego | GL1703 | , o wysokiej zawartości soli. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| (z termostatem) | NBS | Excella E24 | Można użyć dowolnego inkubatora z wytrząsarką z regulacją temperatury. |
| Izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Octan sodu, bezwodny, >99% | Melford | B4017 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), Sól disodowa, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Działa szkodliwie w przypadku wdychania. |
| Wirówka (z chłodzeniem) | Eppendorf | 5430 | |
| Wirnik wirówki (z chłodzeniem) | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Wirówka | Sorvall | RC5C | |
| Wirnik wirówki | Sorvall | SLA-3000 | |
| Roztwór fenolu, nasycony 0,1 M buforem cytrynianowym, pH 4,3 ± 0,2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Toksyczność ostra (doustna, skórna, inhalacyjna), |
| Absolut etanolu do analizy, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Diwodorofosforan potasu, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agaroza | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroksymetylo)aminometan HCl] | Melford | T1513 | |
| Kwas borowy | Melford | B0503 | |
| Kuchenka mikrofalowa | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [chlorowodorek tris(2-karboksetylo)fosfiny] | Sigma-Aldrich | C4706 | Działa żrąco na metale i skórę. |
| ATP [Hydrat soli disodowej adenozyno-5 i trifosforanu], stopień I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2), bezwodny, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Chlorek sodu (NaCl), >99% | Odczynniki Fisher | BP358 | |
| Chlorek potasu (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Zasilacz | Consort | EV261 | |
| Jednostka do elektroforezy | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe barwienie kwasami nukleinowymi | Prawdziwe laboratorium | RBMSAFE | 20 000X stock |
| Transformator UV (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Marka Fisher | 13214789 |
Bibliografia
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
