Siłownik oparty na komórkach mięśnia sercowego i samostabilizujący się biorobot - część 2

Podsumowanie

W tym badaniu, biologiczny aktywator i samostabilizujący się, pływający biorobot z funkcjonalizowanymi elastomerowymi ramionami wspornikowymi są obsiewane kardiomiocytami, hodowane i charakteryzowane pod kątem ich biochemicznych i biomechanicznych właściwości w czasie.

Streszczenie

W ostatnich latach opracowano urządzenia hybrydowe, które składają się z żywej komórki lub komponentu tkankowego zintegrowanego z syntetycznym mechanicznym szkieletem. Urządzenia te, zwane biorobotami, są zasilane wyłącznie siłą generowaną przez aktywność skurczową żywego komponentu i ze względu na swoje liczne nieodłączne zalety mogą stanowić alternatywę dla konwencjonalnych w pełni sztucznych robotów. W pierwszej części tego dwuczęściowego artykułu opisujemy metody zasiewu i charakterystyki siłownika biologicznego oraz biorobota, które zostały zaprojektowane, wyprodukowane i sfunkcjonalizowane. Wytworzony siłownik biologiczny i urządzenia biorobotowe składające się z bazy z polidimetylosiloksanu (PDMS) i cienkowarstwowego wspornika zostały sfunkcjonalizowane w celu przyłączenia komórek za pomocą fibronektyny. Po funkcjonalizacji kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów wysiewano na ramieniu wspornikowym PDMS o dużej gęstości, w wyniku czego powstał zlewający się arkusz komórek. Urządzenia były codziennie obrazowane i analizowany był ruch ramion wspornikowych. Na drugi dzień po wysiewie zaobserwowaliśmy zginanie ramion wspornikowych pod wpływem sił wywieranych przez komórki podczas spontanicznych skurczów. Po analizie ilościowej wygięcia wspornika zaobserwowano stopniowy wzrost naprężeń powierzchniowych wywieranych przez komórki w miarę ich dojrzewania w czasie. Podobnie zaobserwowaliśmy ruch biorobota spowodowany uruchomieniem ramienia wspornikowego PDMS, które działało jak płetwa. Po ilościowym określeniu profili pływania urządzeń zaobserwowano różne tryby napędu, na które wpływ miał kąt spoczynku płetwy. Kierunek ruchu i częstotliwość uderzeń były również określane przez kąt spoczynku płetwy i obserwowano maksymalną prędkość pływania wynoszącą 142 μm/s. W tym manuskrypcie opisujemy procedurę wypełniania wytworzonych urządzeń kardiomiocytami, a także oceny aktywności aktywatora biologicznego i biorobota.

Wprowadzenie

Bioroboty to urządzenia oparte na żywych komórkach, które są wbudowane w mechaniczny szkielet, który zazwyczaj składa się z miękkich, elastycznych materiałów, takich jak PDMS lub hydrożele¹. Komórki ulegają rytmicznym skurczom, spontanicznie lub w odpowiedzi na bodźce, a tym samym działają jako aktywator. Energia generowana w wyniku skurczu komórek napędza różne bioroboty. Komórki serca ssaków (kardiomiocyty) i komórki mięśni szkieletowych są często wykorzystywane do uruchamiania biorobotów ze względu na ich właściwości skurczowe. Oprócz komórek kardiomiocytów i mięśni szkieletowych wykorzystano inne typy komórek, takie jak tkanki mięśniowe owadów ² i eksplantowane tkanki mięśniowe³. Tkanki mięśniowe owadów umożliwiają działanie siłowników biologicznych w temperaturze pokojowej.

Funkcja i wydajność biorobota są głównie determinowane przez siłę i spójność biologicznego aktywatora (tj. komórek mięśniowych), podczas gdy mechaniczna struktura szkieletu przede wszystkim determinuje mechanizmy lokomocji, stabilności i mocy. Ponieważ urządzenia te są napędzane wyłącznie siłami generowanymi przez ogniwa, nie ma zanieczyszczeń chemicznych ani odgłosów pracy. Dzięki temu stanowią energooszczędną alternatywę dla innych konwencjonalnych robotów. W różnych źródłach literatury omówiono różne metody integracji żywych komórek i tkanek z biorobotami^1,4,5. Postępy w technikach mikrofabrykacji i inżynierii tkankowej umożliwiły opracowanie biorobotów, które mogą chodzić, chwytać, pływać lub pompować^5,6. Ogólnie rzecz biorąc, komórki są hodowane bezpośrednio na mechanicznym (polimerowym) szkielecie jako zlewający się arkusz komórek lub są formowane w trójwymiarowe struktury uruchamiające w rusztowaniach, takich jak pierścienie i paski. Najczęściej bioroboty są wytwarzane przy użyciu arkuszy kardiomiocytów^6,7, ponieważ komórki te mają wrodzoną zdolność do wykazywania spontanicznego skurczu bez bodźców zewnętrznych. Z drugiej strony, doniesienia na temat arkuszy komórek mięśni szkieletowych są ograniczone ze względu na ich zapotrzebowanie na bodźce do inicjowania skurczów in vitro w celu zainicjowania depolaryzacji błony⁸.

Ten protokół najpierw opisuje, jak zasiać kardiomiocyty na funkcjonalnym aktywatorze biologicznym wykonanym z cienkiego wspornika PDMS. Następnie szczegółowo opisano rozsiewanie i analizę profili pływackich. Kantyl jest funkcjonalizowany białkiem adhezyjnym komórkowym, takim jak fibronektyna, i jest wysiewany zlewająco z kardiomiocytami. Gdy komórki osadzone na urządzeniu kurczą się, powodują wyginanie wspornika, a tym samym działanie jako siłownik. Z biegiem czasu, w miarę dojrzewania komórek, śledzimy zmiany naprężeń powierzchniowych na urządzeniu, analizując filmy z wygięcia wspornika. Opracowany w ten sposób aktywator biologiczny może być wykorzystany do określenia właściwości kurczliwych dowolnego typu komórek, takich jak fibroblasty lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, w miarę ich różnicowania.

Wiele wcześniejszych badań nad biorobotami skupiało się na rozwoju biologicznych siłowników, podczas gdy optymalizacja architektury biorobota i możliwości funkcjonalnych była w dużej mierze zaniedbywana. Ostatnio kilka badań wykazało implementację trybów pływania w biorobotach, które są inspirowane naturą. Na przykład zmodyfikowano pływające bioroboty z ruchem opartym na wiciach⁶, jellyfish propulsion⁹ i bio-hybrid rays⁴. W przeciwieństwie do innych prac w literaturze, tutaj skupiamy się na różnicowaniu właściwości mechanicznego szkieletu, aby stworzyć samostabilizującą się strukturę. Biorobot opracowany w tym badaniu jest w stanie utrzymać stałe nachylenie, przechylenie i głębokość zanurzenia podczas pływania. Parametry te można modyfikować poprzez zmianę grubości każdego kompozytu bazowego. Etapy produkcji związane z opracowaniem siłownika PDMS, zanurzalnego biorobota i funkcjonalizacji urządzenia są szczegółowo opisane w części 1 tego dwuczęściowego artykułu, a także w naszej ostatniej pracy⁷. Opracowana w ten sposób technika może utorować drogę do opracowania nowatorskich, wysoce wydajnych biorobotów do różnych zastosowań, takich jak dostarczanie ładunków.

Proces izolacji zastosowany w tym badaniu jest podobny do procesu opisanego we wcześniejszym worku¹⁰, jak również w ostatnio opublikowanym worku⁷. Metody mikrowytwarzania stosowane do wytwarzania siłowników PDMS i urządzeń biorobotów są szczegółowo opisane w części 1 tego dwuczęściowego manuskryptu. Sekcja protokołu tego manuskryptu opisuje etapy związane z umieszczaniem kardiomiocytów na wyprodukowanym siłowniku PDMS i biorobocie po ich funkcjonalizacji za pomocą białek adhezyjnych komórek.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone przy użyciu zatwierdzonego protokołu i zgodnie z przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Notre Dame.

1. Zasiewanie komórek i hodowla

1. Przed rozpoczęciem przygotuj wymagane przedmioty: mały lejek, pipety i ciepłe zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem penicylinowym (kompletny DMEM).
2. Weź kolby T-25 wraz z funkcjonalizowanym urządzeniem (siłownikiem biologicznym lub biorobotem) w środku. Zapoznaj się z sekcją 4 części 1 tego dwuczęściowego manuskryptu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania, funkcjonalności i przechowywania urządzenia przed wysiewem komórek.
3. Przygotuj lejek, który można wykonać, zwijając mały, kwadratowy arkusz z tworzywa sztucznego. Umieść go nad siłownikiem biologicznym lub biorobotem wewnątrz kolby T-25. Dostosuj średnicę szerszego końca, aby pasował do całego urządzenia, a wysokość tak, aby dobrze przylegała, gdy górna część kolby jest dokręcona.
   1. W przypadku biorobotów należy użyć magnesu, aby utrzymać urządzenie na miejscu na dnie kolby przez cały proces wysiewu.
      nuta: W tym przypadku użyto pojedynczego magnesu neodymowego (o średnicy 1,26 cala), ale każdy magnes o podobnej wielkości i sile może być również użyty do przytrzymania biorobota za pomocą magnetycznej podstawy z kompozytu niklowo-PDMS.
   2. Sterylizuj UV plastikowy arkusz przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
4. Upewnij się, że między podstawą lejka a kolbą nie ma dużej szczeliny.
5. Ponownie zawiesić kardiomiocyty w DMEM całkowicie o gęstości 1,6 x 10⁷ komórek/ml i powoli wrzucić 400 μl zawiesiny na urządzenie przez lejek. Użyj hemocytometru lub innego licznika komórek, aby określić liczbę uzyskanych komórek.
6. Powoli przenieś system z powrotem do inkubatora, nie naruszając pracy urządzenia i znajdującego się w nim lejka. Hodowla przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
7. Po okresie inkubacji powoli wyjąć lejek, delikatnie przemyć próbkę PBS i ponownie napełnić kolbę 10 ml świeżego DMEM complete.
   nuta: W przypadku biorobotów usuń magnes, aby urządzenie unosiło się na powierzchni.

2. Charakterystyka biochemiczna

1. Oznaczenie strumienia wapnia
   nuta: Test strumienia wapnia przeprowadza się w celu oceny wzajemnych połączeń komórkowych. Procedura ładowania komórek fluorescencyjnym barwnikiem specyficznym dla jonów wapnia jest zgodna z procesem opisanym we wcześniej ustalonym protokole¹¹.
   1. Najpierw przygotuj wymagane materiały, ester fluo-4-acetometylu wapnia (AM), niejonowy poliol środka powierzchniowo czynnego (patrz Tabela materiałów) i roztwór soli Tyrode'a.
   2. Za pomocą długiej pęsety delikatnie przenieś urządzenie z kolby hodowlanej na 35-milimetrową szalkę Petriego z 2 ml roztworu soli Tyrode'a.
   3. Do oddzielnej probówki wirówkowej pobrać 1 ml ciepłego roztworu Tyrode'a (podgrzanego do 37 °C) i dodać 3-5 μl podstawowego barwnika wapniowego fluo-4 AM (stężenie robocze: 3-5 μM) i równą część niejonowego poliolu powierzchniowo czynnego (stężenie robocze: 0,2 %). Zastąp roztwór próbki ciepłym roztworem Tyrode'a uzupełnionym barwnikiem wskaźnikowym wapnia, fluo-4 i 0,2% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym. Inkubować przez 25 - 30 minut w temperaturze 37 °C.
   4. Usunąć roztwór barwnika i delikatnie przemyć próbkę świeżym roztworem Tyrode. Ponownie inkubować próbkę w 2 ml świeżego DMEM przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C przed obrazowaniem.
      nuta: Wyniki tego testu i związany z nim film są dostępne we wcześniej opublikowanym work⁷.
2. Immunofluorescencja
   nuta: Podwójne barwienie immunologiczne wszystkich próbek przeprowadzono zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem¹².
   1. Najpierw przygotuj 10% kozią surowicę (GS) w buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) w diH₂O, 0,1% detergent do lizy komórkowej (patrz tabela materiałów) w PBS, przeciwciała pierwszorzędowe (przeciwciała monoklonalne przeciwko mysi troponinę-I serca i przeciwciała monoklonalne przeciwko królikowi koneksyny-43), przeciwciała drugorzędowe (koniugat Alexa 594 i koniugat anty-mysi IgG (H + L) Alexa 488) i DAPI.
      ostrożność: Paraformaldehyd jest rakotwórczy.
   2. Wyjąć badaną próbkę z kolby i delikatnie umyć ją dwukrotnie PBS. Zapoznaj się z sekcją 4 w części 1 tego dwuczęściowego manuskryptu, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania i funkcjonalności próbki.
   3. Dodać kroplę PBS na małe szkiełko nakrywkowe (średnica: 12 mm lub 15 mm). Delikatnie przytrzymaj podstawę urządzenia pęsetą i odetnij cienkie ramiona PDMS (wspornik, Rysunek 1) nożyczkami od końca, w którym łączy się z górną częścią podstawy. Przenieś ramiona wspornikowe na kroplę stroną przylegającą do komórek skierowaną do góry. Kropla PBS zapobiegnie wysychaniu komórek.
   4. Utrwal próbki za pomocą 4% PFA i wykonaj podwójne barwienie immunologiczne próbek, jak opisano wcześniej¹².
   5. Po barwieniu immunologicznym umieścić próbki na czystym szkiełku podstawowym za pomocą odczynnika do montażu zapobiegającego blaknięciu i odstawić w spokoju w ciemności na 24 godziny.
   6. Powtórzyć procedurę dla wszystkich próbek.
      nuta: Wyniki tego testu i związane z nim obrazy zostały szczegółowo omówione we wcześniej opublikowanej pracy⁷.

3. Obrazowanie

1. Umieścić kolbę T-25 pionowo w inkubatorze CO₂ i przygotować system obrazowania wewnątrz inkubatora. Nagraj urządzenie za pomocą kamery (patrz Tabela materiałów) z obiektywem zmiennoogniskowym (patrz Tabela materiałów). Jako źródło światła użyj paska świateł LED.
   nuta: Zastosowano tutaj pasek diod LED ze światłem białym, ale wszelkie normalne diody LED również będą działać.
2. Podłącz aparat do systemu operacyjnego i otwórz oprogramowanie specyficzne dla aparatu (patrz tabela materiałów). Kliknij obraz kamery pod zakładką "Plik" w górnym panelu, aby otworzyć wszystkie opcje kamery i wybierz odpowiednią kamerę.
3. Wybierz "na żywo" z listy zakładek w górnym panelu w oprogramowaniu.
4. Ręcznie ustaw ostrość obrazu, regulując pokrętło obiektywu. Wybierz "Przytnij do obszaru zainteresowania (ROI)" z górnego panelu. Następnie ręcznie narysuj prostokąt w klatce wideo, otaczający siłownik biologiczny i ramiona wspornikowe, aby zaznaczyć ROI.
   nuta: Wybór odpowiedniego zwrotu z inwestycji minimalizuje rozmiar plików graficznych.
   1. W przypadku biorobotów przechwyć cały ekran, aby zarejestrować ruch pływacki urządzenia.
      nuta: Nie ma potrzeby rysowania zwrotu z inwestycji dla biorobotów
5. Przed rozpoczęciem nagrywania wybierz "Ustawienia aparatu" z jednej z zakładek w górnym panelu ekranu. Ustaw liczbę klatek na sekundę, dostosowując ekspozycję i proporcje pikseli obrazu na żywo, przesuwając pasek dla każdego z nich lub ręcznie wprowadzając wartości. Ustaw liczbę klatek na sekundę na około 30 ± 2 kl./s.
   nuta: Zmiana ekspozycji i proporcji pikseli zmienia jasność i kontrast obrazu na żywo.
6. Kliknij przycisk "Nagraj" w górnym panelu oprogramowania, aby rozpocząć nagrywanie filmów z siłowników w rozdzielczości 1 000 x 1 000 pikseli przez dokładnie 30 sekund. Powtórz proces dla wszystkich próbek.

4. Analiza obrazu siłowników biologicznych na stacjonarnej podstawie

1. Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania do programowania (np. Matlab) z uruchomionym niestandardowym skryptem. Więcej informacji można znaleźć w Tabeli Materiałów i Pliku Uzupełniającym.
   nuta: Skrypt wyświetla każdą klatkę nagranych filmów, odbiera dane wejściowe myszy użytkownika w celu zarejestrowania koordynacji punktów wspornika na obrazach, oblicza średnicę i środek okręgu, który przechodzi przez wprowadzone punkty za pomocą dopasowania najmniejszych kwadratów, a następnie eksportuje wszystkie wprowadzone i obliczone dane do dalszego wykorzystania.
   1. Otwórz oprogramowanie do programowania, klikając ikonę. Kliknij "Plik" -> "Otwórz" na pasku menu u góry i wybierz plik skryptu .m do analizy obrazu. Upewnij się, że zarejestrowane obrazy TIFF znajdują się w tym samym folderze co plik .m. Kliknij "Uruchom", aby uruchomić skrypt.
      nuta: Pojawi się interaktywny wyświetlacz do modyfikacji.
   2. Naciśnij "play", aby uruchomić właściwy program. Kliknij przycisk "otwórz" i zlokalizuj plik TIFF, który ma być analizowany.
   3. Kliknij przycisk "baza", a następnie kliknij punkt, w którym wspornik łączy się z podstawą u góry; naciśnij Enter. Spowoduje to umieszczenie kwadratowego znacznika na obrazie dla każdej klatki, aby wskazać położenie podstawy wspornika.
   4. Kliknij przycisk "Skala", a następnie ręcznie kliknij jedną krawędź szklanego koralika. Przesuń wskaźnik myszy na przeciwną stronę szklanego koralika i naciśnij "Enter."
      nuta: Powinno to narysować linię, która mierzy średnicę szklanego koralika. Ponieważ szklany koralik ma średnicę 3 mm, będzie to odnosić 3 mm do wyświetlanych pikseli.
   5. Kliknij przycisk "Analizuj". Kliknij wzdłuż wspornika w niewielkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika.
   6. Kliknij przycisk "Analizuj". Następnie kliknij wzdłuż wspornika w niewielkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika. Kontynuuj klikanie wzdłuż wspornika, w tym końcówki, a po zakończeniu naciśnij Enter. Spowoduje to umieszczenie znaku "x" w każdym klikniętym punkcie na wsporniku.
      nuta: Na podstawie koordynacji znacznika kwadratowego i znaczników x, środek i średnica okręgu zostaną obliczone przy użyciu funkcji dopasowania najmniejszych kwadratów (patrz załączony plik uzupełniający dla użytego skryptu). Okrąg, który przechodzi przez znaczniki x i kreator kwadratów, zostanie automatycznie nałożony na obraz.
   7. Sprawdź, czy nałożony okrąg prawidłowo śledzi profil wspornika.
      nuta: Gdy wspornik jest bardzo płaski, trudno jest ocenić, czy profil wspornika jest prawidłowo śledzony. Patrz rysunek 3.
   8. Kliknij przycisk "następna klatka". Spowoduje to przełączenie do następnej klatki w pliku TIFF. Podstawa i skala są już ustawione z poprzedniego kroku.
   9. Powtarzaj kroki od 4.1.5 do 4.1.7, aż wszystkie klatki w pliku TIFF zostaną ukończone. Po przetworzeniu wszystkich ramek kliknij przycisk "Eksportuj".
      nuta: Spowoduje to utworzenie pliku arkusza kalkulacyjnego z nazwą pliku TIFF dla wspornika, który został właśnie przeanalizowany. Edytuj nazwę pliku, aby uwzględnić, która strona (lewa lub prawa) wspornika była analizowana.
2. Obliczanie naprężenia w arkuszu kalkulacyjnym.
   1. Oblicz naprężenie powierzchniowe "σ" na wsporniku, korzystając z następującego równania:
      
      gdzie E, R, v i h są odpowiednio modułem Younga, promieniem krzywizny, współczynnikiem Poissona i grubością wspornika.
      nuta: Grubość wspornika można zmienić, aby zmienić czułość. W tym badaniu wartości były następujące: E = 750 kPa, v = 0,49 i h = 25 μm^13,14.
   2. Oblicz naprężenie powierzchniowe, korzystając z równania w kroku 4.2.1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego .xls. Należy pamiętać, że dane wyjściowe zawierają wiele kolumn pokazujących najpierw współrzędne x i y podstawy i okręgu, a następnie promień krzywizny. Oblicz współrzędne x i y każdego klikniętego punktu na podstawie poniższych.
      nuta: Wykreślenie naprężeń na klatkach obrazu poklatkowego pokazuje zmiany siły wywieranej na wspornik w czasie. Koryta pokazują naprężenia na wspornik podczas rozluźnienia kardiomiocytów lub naprężenia statyczne wywierane na wspornik z powodu sił ciągnących komórki. Szczyty pokazują dynamiczne naprężenie wspornika, które zostało wymuszone przez bicie kardiomiocytów. Wartość ta odpowiada maksymalnej wielkości siły generowanej przez skurcz kardiomiocytów.

5. Analiza biorobotów pływających

1. Zapisz pozycję biorobota za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
   nuta: Zapoznaj się z listą materiałów, aby zapoznać się z oprogramowaniem używanym w tej sekcji.
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (np. ImageJ). Naciśnij "Plik" i "Otwórz" i wybierz plik wideo biorobota pływającego. Kliknij "OK" i pozwól programowi załadować plik. Otwórz oprogramowanie arkusza kalkulacyjnego.
   2. Na załadowanym filmie z biorobotem znajdź odniesienie do znanych wymiarów (np. szklany koralik o średnicy 3 mm, który był osadzony w siłowniku biologicznym).
      nuta: Każdy obiekt o znanym wymiarze będzie działał. Spowoduje to określenie proporcji pikseli do długości w każdym filmie.
   3. Użyj narzędzia "Prosto", aby narysować linię w poprzek szklanego koralika. Kliknij "Analizuj" i wybierz "Ustaw skalę". Ustaw pole "Znana odległość" na "3,000 μm" i kliknij "OK."
      nuta: Spowoduje to ustawienie współrzędnych x i y na mikrometry.
   4. Wybierz punkt na urządzeniu, który nie chwieje się między ramkami, aby działał jako znacznik.
      nuta: Zaleca się wybranie rogu podstawy.
   5. Wskaż wybrany punkt w ppkt 5.1.4 w pierwszej klatce. Zapisz współrzędne x i y w arkuszu kalkulacyjnym.
   6. Przełącz się z powrotem do okna oprogramowania do analizy obrazu i naciśnij strzałki w prawo, aby przejść do następnej klatki. Ponownie wskaż znacznik (z kroku 5.1.4) i zapisz współrzędne x i y w arkuszu kalkulacyjnym.
   7. Powtórz krok 5.1.6 dla wszystkich klatek.
2. Oblicz parametry pływania biorobota, korzystając z arkusza kalkulacyjnego współrzędnych⁷.
   1. Oblicz okres między klatkami na podstawie znanej liczby klatek na sekundę każdego filmu.
   2. Oblicz zmianę współrzędnych x i y między klatkami, aby znaleźć przebytą odległość, w tym odległość całkowitą.
   3. Oblicz amplitudę skurczu od maksymalnej zmiany wzdłuż osi y. Określ częstotliwość dudnienia dla każdego biorobota na podstawie odwrotności okresu między dwoma skurczami.
   4. Oblicz prędkość pływania każdego urządzenia na podstawie całkowitego czasu i odległości przebytej w kierunku x.
   5. Powtórz krok 5.2 dla każdego analizowanego filmu z biorobotem.
   6. Normalizuj każdy mierzony parametr.
      nuta: Znormalizuj wszystkie wartości, aby lepiej zwizualizować różnice. Protokół ten demonstruje normalizację w odniesieniu do biorobota pracującego w trybie poziomym ze skurczami o niskiej częstotliwości (poziomy LF) (Rysunek 4)⁷.

6. Analiza ekspresji białek

Uwaga: Zamontowane próbki przygotowane w krokach 2.2.4 i 2.2.5 zostały zobrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Obrazy były rejestrowane w powiększeniach 20X, 40X i 60X sekwencyjnie w trzech kanałach jednocześnie: 460 nm, 488 nm i 594 nm. Zestaw 5 obrazów został uchwycony w 40-krotnym powiększeniu, z różnych pozycji dla każdej próbki, a każdy kanał został zapisany jako indywidualny. Plik TIFF. Ustawienie ekspozycji zależało od powiększenia użytego obiektywu i było ustawione na stałe dla wszystkich ujęć przy tym powiększeniu.

1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i wybierz "Plik" -> "Otwórz", aby załadować obrazy.
2. Narysuj prostokątny wielokąt na ramce obrazu, aby zaznaczyć ROI. Wybierz "Analizuj" -> "Zmierz", aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji.
3. Powtórzyć krok 6.2, aby pobrać pomiary intensywności ze wszystkich próbek i obliczyć odpowiednią średnią intensywność dla każdego warunku.
   nuta: W tym przypadku inny warunek odnosi się do różnych punktów czasowych, na przykład w dniu 1, dniu 2 i do dnia 6.
4. Eksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy statystycznej i tworzenia wykresów danych.

Wyniki

Biologiczny aktywator wykonany z cienkiego wspornika PDMS (o grubości 25 μm) i kardiomiocytów stanowi rdzeń pływającego biorobota, jak pokazano na schemacie i zrzucie ekranu urządzeń na rysunku 1. Komórki zaczynają wykazywać skurcze po 24 godzinach w hodowli, a zginanie ramion wspornikowych zaobserwowano do 2 dnia. Profil boczny urządzenia był rejestrowany codziennie, a naprężenia powierzchniowe były określane ilościowo na podstawie zginania ramion wspornikowych za pomocą...

Dyskusja

Opisana tutaj procedura opisuje skuteczną metodę wysiewu dla siłowników i biorobotów opartych na PDMS, która ułatwia przyłączanie kardiomiocytów. Ponadto opisano proces pozyskiwania obrazu i późniejszej analizy, który charakteryzuje zachowanie komórek i wydajność urządzeń.

Zaobserwowaliśmy spontaniczne kurczenie się komórek na ramionach wspornikowych po 24 godzinach; Intensywność skurczów stale rosła w czasie i osiągnęła maksimum w 6 dniu, po czym intensywność powoli spadała. Chociaż ramiona w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chemikalia i odczynniki
Kardiomiocyty (pierwotne komórki serca)	Charles River	NA	Wyizolowane z 2-dniowych noworodków Sprague Dawley szczurów
Dulbecco" s zmodyfikowany orzeł" s media (DMEM)	Hyclone Laboratories	16750-074	z 4500 mg/L glukozy, 4,0 mM L-glutaminy i 110 mg/L pirogronianu sodu
Płodu III surowica Hyclone industries	, GE	16777-240	Płodowa surowica bydlęca (FBS)
Dulbecco' s bufor fosforanowy (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408-100ML
Sól sodowa penicyliny-G	Sigma-Aldrich	P3032
Surowica kozia	Sigma-Aldrich	G9023
4,6-diamidyno-2-fenyloindolowy dihydrocholride w proszku (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Roztwór Sigma-Aldrich	F1141	(1 mg / ml)
Zestaw Calcein-AM i ethidium homodimer-1 (test na żywo/martwy)	Sondy molekularne	L3224
Calcium Fluo-4, AM	Sondy molekularne	F14217	wskaźnika wapnia
Roztwór soli Tyrodes Roztwór buforowy	Sigma-Aldrich	T2397
Sondy molekularne	Pluronic F-127	P3000MP	niejonowy środek powierzchniowo czynny-20% roztwór w dimetylosiloksanie (DMSO)
16% parafomaldehyd	Mikroskopia elektronowa	15710	Uwaga: Drażniący i palny
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X-100 100 ml	detergent do lizy komórek, (glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo-fenylowy), t-oktylofenoksyetoksyetanol, eter tert-oktylofenylowy glikolu
polietylenowego) Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold	Sondy molekularne	P10144	Środek montażowy
Sondy molekularne	falloidyny Alexa Fluor 594	A12381	Marker filamentu aktynowego
Przeciwciało wtórne koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L), sprzężone	sondy molekularne	A-11012
Sondy molekularne	pha	A-11001
Przeciwciało anty-koneksynowe 43	Abcam	ab11370	Marker połączenia szczelinowego
Troponina przeciwsercowa I przeciwciało	Abcam	ab10231	Białko kurczliwe
16% roztwór paraformaldehydu klasy EM	Mikroskopia elektronowa	100503-916
Polidimetylosiloksan (PDMS)	Elsevier		Sylgard 184
Materiały i wyposażenie
Camera	Thor Labs	DCC1545M
światło LED taśma	NA	NA	Dowolna biała dioda LED bez emisji widma
Mikroskop konfokalny	Nikkon C2	NA	Mikroskop konfokalny z zestawem trzech filtrów.
Obiektyw zmiennoogniskowy	Infinity	Model# 252120
Software
Matlab	Mathworks	NA	Używany w sekcji 4) do analizy siłownika biologicznego.
Image J	National Institute of Health	NA	Oprogramowanie do przetwarzania obrazów oparte na języku Java. Używany w sekcji 5) do analizy biorobotów. Darmowe oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów w języku java. (https://imagej.nih.gov/ij/)
Thor Cam	Thor Labs	NA	Camera oprogramowanie operacyjne