W tym badaniu, biologiczny aktywator i samostabilizujący się, pływający biorobot z funkcjonalizowanymi elastomerowymi ramionami wspornikowymi są obsiewane kardiomiocytami, hodowane i charakteryzowane pod kątem ich biochemicznych i biomechanicznych właściwości w czasie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Siłownik oparty na komórkach mięśnia sercowego i samostabilizujący się biorobot - część 2
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W ostatnich latach opracowano urządzenia hybrydowe, które składają się z żywej komórki lub komponentu tkankowego zintegrowanego z syntetycznym mechanicznym szkieletem. Urządzenia te, zwane biorobotami, są zasilane wyłącznie siłą generowaną przez aktywność skurczową żywego komponentu i ze względu na swoje liczne nieodłączne zalety mogą stanowić alternatywę dla konwencjonalnych w pełni sztucznych robotów. W pierwszej części tego dwuczęściowego artykułu opisujemy metody zasiewu i charakterystyki siłownika biologicznego oraz biorobota, które zostały zaprojektowane, wyprodukowane i sfunkcjonalizowane. Wytworzony siłownik biologiczny i urządzenia biorobotowe składające się z bazy z polidimetylosiloksanu (PDMS) i cienkowarstwowego wspornika zostały sfunkcjonalizowane w celu przyłączenia komórek za pomocą fibronektyny. Po funkcjonalizacji kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów wysiewano na ramieniu wspornikowym PDMS o dużej gęstości, w wyniku czego powstał zlewający się arkusz komórek. Urządzenia były codziennie obrazowane i analizowany był ruch ramion wspornikowych. Na drugi dzień po wysiewie zaobserwowaliśmy zginanie ramion wspornikowych pod wpływem sił wywieranych przez komórki podczas spontanicznych skurczów. Po analizie ilościowej wygięcia wspornika zaobserwowano stopniowy wzrost naprężeń powierzchniowych wywieranych przez komórki w miarę ich dojrzewania w czasie. Podobnie zaobserwowaliśmy ruch biorobota spowodowany uruchomieniem ramienia wspornikowego PDMS, które działało jak płetwa. Po ilościowym określeniu profili pływania urządzeń zaobserwowano różne tryby napędu, na które wpływ miał kąt spoczynku płetwy. Kierunek ruchu i częstotliwość uderzeń były również określane przez kąt spoczynku płetwy i obserwowano maksymalną prędkość pływania wynoszącą 142 μm/s. W tym manuskrypcie opisujemy procedurę wypełniania wytworzonych urządzeń kardiomiocytami, a także oceny aktywności aktywatora biologicznego i biorobota.
Wprowadzenie
Bioroboty to urządzenia oparte na żywych komórkach, które są wbudowane w mechaniczny szkielet, który zazwyczaj składa się z miękkich, elastycznych materiałów, takich jak PDMS lub hydrożele1. Komórki ulegają rytmicznym skurczom, spontanicznie lub w odpowiedzi na bodźce, a tym samym działają jako aktywator. Energia generowana w wyniku skurczu komórek napędza różne bioroboty. Komórki serca ssaków (kardiomiocyty) i komórki mięśni szkieletowych są często wykorzystywane do uruchamiania biorobotów ze względu na ich właściwości skurczowe. Oprócz komórek kardiomiocytów i mięśni szkieletowych wykorzystano inne typy komórek, takie jak tkanki mięśniowe owadów 2 i eksplantowane tkanki mięśniowe3. Tkanki mięśniowe owadów umożliwiają działanie siłowników biologicznych w temperaturze pokojowej.
Funkcja i wydajność biorobota są głównie determinowane przez siłę i spójność biologicznego aktywatora (tj. komórek mięśniowych), podczas gdy mechaniczna struktura szkieletu przede wszystkim determinuje mechanizmy lokomocji, stabilności i mocy. Ponieważ urządzenia te są napędzane wyłącznie siłami generowanymi przez ogniwa, nie ma zanieczyszczeń chemicznych ani odgłosów pracy. Dzięki temu stanowią energooszczędną alternatywę dla innych konwencjonalnych robotów. W różnych źródłach literatury omówiono różne metody integracji żywych komórek i tkanek z biorobotami1,4,5. Postępy w technikach mikrofabrykacji i inżynierii tkankowej umożliwiły opracowanie biorobotów, które mogą chodzić, chwytać, pływać lub pompować5,6. Ogólnie rzecz biorąc, komórki są hodowane bezpośrednio na mechanicznym (polimerowym) szkielecie jako zlewający się arkusz komórek lub są formowane w trójwymiarowe struktury uruchamiające w rusztowaniach, takich jak pierścienie i paski. Najczęściej bioroboty są wytwarzane przy użyciu arkuszy kardiomiocytów6,7, ponieważ komórki te mają wrodzoną zdolność do wykazywania spontanicznego skurczu bez bodźców zewnętrznych. Z drugiej strony, doniesienia na temat arkuszy komórek mięśni szkieletowych są ograniczone ze względu na ich zapotrzebowanie na bodźce do inicjowania skurczów in vitro w celu zainicjowania depolaryzacji błony8.
Ten protokół najpierw opisuje, jak zasiać kardiomiocyty na funkcjonalnym aktywatorze biologicznym wykonanym z cienkiego wspornika PDMS. Następnie szczegółowo opisano rozsiewanie i analizę profili pływackich. Kantyl jest funkcjonalizowany białkiem adhezyjnym komórkowym, takim jak fibronektyna, i jest wysiewany zlewająco z kardiomiocytami. Gdy komórki osadzone na urządzeniu kurczą się, powodują wyginanie wspornika, a tym samym działanie jako siłownik. Z biegiem czasu, w miarę dojrzewania komórek, śledzimy zmiany naprężeń powierzchniowych na urządzeniu, analizując filmy z wygięcia wspornika. Opracowany w ten sposób aktywator biologiczny może być wykorzystany do określenia właściwości kurczliwych dowolnego typu komórek, takich jak fibroblasty lub indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, w miarę ich różnicowania.
Wiele wcześniejszych badań nad biorobotami skupiało się na rozwoju biologicznych siłowników, podczas gdy optymalizacja architektury biorobota i możliwości funkcjonalnych była w dużej mierze zaniedbywana. Ostatnio kilka badań wykazało implementację trybów pływania w biorobotach, które są inspirowane naturą. Na przykład zmodyfikowano pływające bioroboty z ruchem opartym na wiciach6, jellyfish propulsion9 i bio-hybrid rays4. W przeciwieństwie do innych prac w literaturze, tutaj skupiamy się na różnicowaniu właściwości mechanicznego szkieletu, aby stworzyć samostabilizującą się strukturę. Biorobot opracowany w tym badaniu jest w stanie utrzymać stałe nachylenie, przechylenie i głębokość zanurzenia podczas pływania. Parametry te można modyfikować poprzez zmianę grubości każdego kompozytu bazowego. Etapy produkcji związane z opracowaniem siłownika PDMS, zanurzalnego biorobota i funkcjonalizacji urządzenia są szczegółowo opisane w części 1 tego dwuczęściowego artykułu, a także w naszej ostatniej pracy7. Opracowana w ten sposób technika może utorować drogę do opracowania nowatorskich, wysoce wydajnych biorobotów do różnych zastosowań, takich jak dostarczanie ładunków.
Proces izolacji zastosowany w tym badaniu jest podobny do procesu opisanego we wcześniejszym worku10, jak również w ostatnio opublikowanym worku7. Metody mikrowytwarzania stosowane do wytwarzania siłowników PDMS i urządzeń biorobotów są szczegółowo opisane w części 1 tego dwuczęściowego manuskryptu. Sekcja protokołu tego manuskryptu opisuje etapy związane z umieszczaniem kardiomiocytów na wyprodukowanym siłowniku PDMS i biorobocie po ich funkcjonalizacji za pomocą białek adhezyjnych komórek.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj procedury zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem oraz regulacjami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Notre Dame.
1. Wysiew i hodowla komórek
- Przed rozpoczęciem przygotować niezbędne elementy: mały lejek, pipety oraz podgrzaną pożywkę DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku penicyliny (pełna pożywka DMEM).
- Przygotować kolby T-25 zawierające funkcjonalizowane urządzenie (aktuator biologiczny lub biorobota). Szczegóły dotyczące przygotowania, funkcjonalizacji i przechowywania urządzenia przed wysianiem komórek znajdują się w sekcji 4 części 1 niniejszego dwuczęściowego opracowania.
- Przygotować lejek, który można wykonać, zwijając mały, kwadratowy arkusz plastiku. Umieścić go nad aktuatorem biologicznym lub biorobotem wewnątrz kolby T-25. Dostosować średnicę szerszego końca tak, aby obejmował całe urządzenie, a wysokość tak, aby lejek przylegał ściśle po dokręceniu górnej części kolby.
- W przypadku biorobotów użyć magnesu, aby utrzymać urządzenie na dnie kolby przez cały proces wysiewania.
Uwaga: W tym przypadku użyto pojedynczego neodymowego magnesu dyskowego (średnica 1,26"), jednak do unieruchomienia biorobota z magnetyczną podstawą z kompozytu nikiel-PDMS można użyć dowolnego magnesu o podobnej wielkości i sile. - Arkusz plastiku należy wysterylizować promieniowaniem UV przez co najmniej 30 min przed użyciem.
- W przypadku biorobotów użyć magnesu, aby utrzymać urządzenie na dnie kolby przez cały proces wysiewania.
- Upewnić się, że między podstawą lejka a kolbą nie ma dużej szczeliny.
- Kardiomiocyty resuspendować w pełnej pożywce DMEM do gęstości 1,6 x 107 komórek/mL, a następnie powoli nanieść 400 µL zawiesiny na urządzenie przez lejek. Do oznaczenia liczby uzyskanych komórek użyć hemocytometru lub innego licznika komórek.
- Powoli przenieść układ z powrotem do inkubatora, nie naruszając urządzenia i znajdującego się wewnątrz lejka. Inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C.
- Po okresie inkubacji powoli usunąć lejek, delikatnie przemyć próbkę buforem PBS i uzupełnić kolbę 10 mL świeżej pełnej pożywki DMEM.
Uwaga: W przypadku biorobotów usunąć magnes, aby urządzenie mogło swobodnie pływać.
2. Charakterystyka biochemiczna
- Analiza przepływu jonów wapnia
Uwaga: Analizę przepływu jonów wapnia przeprowadza się w celu oceny łączności międzykomórkowej. Procedura obciążania komórek fluorescencyjnym barwnikiem specyficznym dla jonów wapnia jest zgodna z procesem opisanym w wcześniej ustalonym protokole11.- Najpierw należy przygotować wymagane materiały: ester acetometylowy (AM) kalcjum fluo-4, niejonowy surfaktant poliolowy (patrz: Tabela materiałów) oraz roztwór soli Tyrode'a.
- Za pomocą długiej pęsety należy ostrożnie przenieść urządzenie z kolby hodowlanej do 35-milimetrowej szalki Petriego zawierającej 2 mL roztworu soli Tyrode'a.
- W oddzielnej probówce do wirowania należy pobrać 1 mL ciepłego roztworu Tyrode'a (podgrzanego do 37 °C), dodać 3-5 µL roztworu zapasowego barwnika kalcjum fluo-4 AM (stężenie robocze: 3-5 µM) oraz równą ilość niejonowego surfaktantu poliolowego (stężenie robocze: 0,2 %). Należy zastąpić roztwór próbki ciepłym roztworem Tyrode'a uzupełnionym o barwnik wskaźnikowy wapnia fluo-4 oraz 0,2% niejonowy surfaktant. Inkubować przez 25-30 min w temperaturze 37 °C.
- Należy usunąć roztwór barwnika i ostrożnie wypłukać próbkę świeżym roztworem Tyrode'a. Przed obrazowaniem próbkę należy ponownie inkubować w 2 mL świeżej pożywki DMEM complete przez kolejne 30 min w temperaturze 37 °C.
Uwaga: Wyniki tej analizy oraz powiązane nagranie wideo zostały przedstawione w wcześniej opublikowanej pracy7.
- Immunofluorescencja
Uwaga: Podwójne barwienie immunocytochemiczne wszystkich próbek wykonano zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem12.- Najpierw należy przygotować 10% surowicę kozią (GS) w roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) w diH2O, 0,1% detergentu do lizy komórek (patrz: Tabela materiałów) w PBS, przeciwciała pierwszorzędowe (monoklonalne przeciwciało przeciw mysiej troponinie I serca oraz monoklonalne przeciwciało przeciw króliczym koneksynom-43), przeciwciała wtórnie (sprzężone z Alexa 594 oraz kozie przeciwciało przeciw mysiemu IgG (H+L) sprzężone z Alexa 488) oraz DAPI.
Ostrzeżenie: Paraformaldehyd jest rakotwórczy. - Należy wyjąć odpowiednią próbkę z kolby i ostrożnie dwukrotnie wypłukać ją roztworem PBS. Szczegóły dotyczące przygotowania i funkcjonalizacji próbki znajdują się w sekcji 4 w części 1 tego dwuczęściowego manuskryptu.
- Na małą lamellkę (średnica: 12 mm lub 15 mm) należy nanieść kroplę PBS. Trzymając delikatnie podstawę urządzenia pęsetą, należy nożyczkami odciąć cienkie ramiona PDMS (belka wspornikowa, Rysunek 1) od strony ich połączenia z górną częścią podstawy. Ramiona wspornikowe należy przenieść na kroplę, tak aby strona z przytwierdzonymi komórkami była skierowana do góry. Kropla PBS zapobiegnie wysychaniu komórek.
- Próbki należy utrwalić 4% PFA i przeprowadzić podwójne barwienie immunocytochemiczne, zgodnie z wcześniejszym opisem12.
- Po barwieniu immunocytochemicznym próbki należy zamontować na czystym szkiełku przedmiotowym przy użyciu odczynnika montującego zapobiegającego blaknięciu i pozostawić w ciemności, niezakłócone, na 24 h.
- Procedurę należy powtórzyć dla wszystkich próbek.
Uwaga: Wyniki tej analizy oraz powiązane obrazy są szczegółowo omówione w wcześniej opublikowanej pracy7.
- Najpierw należy przygotować 10% surowicę kozią (GS) w roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS), 4% paraformaldehyd (PFA) w diH2O, 0,1% detergentu do lizy komórek (patrz: Tabela materiałów) w PBS, przeciwciała pierwszorzędowe (monoklonalne przeciwciało przeciw mysiej troponinie I serca oraz monoklonalne przeciwciało przeciw króliczym koneksynom-43), przeciwciała wtórnie (sprzężone z Alexa 594 oraz kozie przeciwciało przeciw mysiemu IgG (H+L) sprzężone z Alexa 488) oraz DAPI.
3. Obrazowanie
- Umieść kolbę T-25 pionowo w inkubatorze CO2 i przygotuj system obrazowania wewnątrz inkubatora. Rejestruj urządzenie za pomocą kamery (patrz: Tabela materiałów) z obiektywem zoom (patrz: Tabela materiałów). Jako źródło światła zastosuj taśmę LED.
Uwaga: W tym przypadku użyto taśmy białych diod LED, jednak sprawdzą się tutaj również zwykłe diody LED. - Podłącz kamerę do systemu operacyjnego i otwórz oprogramowanie dedykowane dla danej kamery (patrz: Tabela materiałów). Kliknij obraz z kamery pod zakładką „File” w górnym panelu, aby otworzyć wszystkie opcje kamery, a następnie wybierz odpowiednią kamerę.
- Z listy zakładek w górnym panelu oprogramowania wybierz opcję „live”.
- Ręcznie ustaw ostrość obrazu, regulując pierścień obiektywu. Z górnego panelu wybierz opcję „Crop to region of interest (ROI)”. Następnie ręcznie narysuj w klatce wideo prostokąt obejmujący biologiczny siłownik oraz ramiona wspornikowe, aby wyznaczyć obszar ROI.
Uwaga: Wybór odpowiedniego obszaru ROI pozwala zminimalizować rozmiar plików obrazu.- W przypadku biorobotów przechwyć cały ekran, aby zarejestrować ruch pływający urządzenia.
UWAGA: W przypadku biorobotów nie ma potrzeby wyznaczania obszaru ROI
- W przypadku biorobotów przechwyć cały ekran, aby zarejestrować ruch pływający urządzenia.
- Przed rozpoczęciem nagrywania wybierz „Camera Settings” z jednej z zakładek w górnym panelu na ekranie. Ustaw częstotliwość klatek, regulując czas ekspozycji i stosunek pikseli obrazu na żywo poprzez przesuwanie suwaków lub ręczne wpisanie wartości. Ustaw częstotliwość klatek na około 30 ± 2 fps.
Uwaga: Zmiana ekspozycji i stosunku pikseli wpływa na jasność i kontrast obrazu na żywo. - Kliknij przycisk „Record” w górnym panelu oprogramowania, aby rozpocząć nagrywanie filmów z siłownikami w rozdzielczości 1,000 x 1,000 pikseli przez dokładnie 30 s. Powtórz ten proces dla wszystkich próbek.
4. Analiza obrazu aktuatorów biologicznych na podstawie stacjonarnej
- Przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania programistycznego (np. Matlab) uruchamiającego dedykowany skrypt. Szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów oraz w Pliku uzupełniającym.
Uwaga: Skrypt wyświetla każdą klatkę zarejestrowanych filmów, przyjmuje dane z myszy użytkownika w celu zapisania współrzędnych punktów wspornika na obrazach, oblicza średnicę i środek okręgu przechodzącego przez wprowadzone punkty za pomocą metody najmniejszych kwadratów, a następnie eksportuje wszystkie wprowadzone i obliczone dane do dalszego wykorzystania.- Otwórz oprogramowanie programistyczne, klikając ikonę. Z paska menu na górze wybierz „File” -> „Open” i zaznacz plik skryptu .m do analizy obrazu. Upewnij się, że zarejestrowane obrazy TIFF znajdują się w tym samym folderze co plik .m. Kliknij „Run”, aby uruchomić skrypt.
Uwaga: Pojawi się interaktywne okno do wprowadzania zmian. - Naciśnij „play”, aby uruchomić właściwy program. Kliknij przycisk „open” i zlokalizuj plik TIFF, który ma zostać poddany analizie.
- Kliknij przycisk „base”, a następnie kliknij punkt, w którym wspornik łączy się z podstawą u góry; naciśnij enter. Spowoduje to umieszczenie kwadratowego znacznika na obrazie w każdej klatce, aby oznaczyć położenie podstawy wspornika.
- Kliknij przycisk „Scale”, a następnie ręcznie kliknij na jednej krawędzi szklanej kuleczki. Przesuń wskaźnik myszy na przeciwległą stronę szklanej kuleczki i naciśnij „Enter”.
Uwaga: Powinno to narysować linię mierzącą średnicę szklanej kuleczki. Ponieważ szklana kuleczka ma średnicę 3 mm, pozwoli to powiązać 3 mm z wyświetlanymi pikselami. - Kliknij przycisk „Analyze”. Kliknij wzdłuż wspornika w krótkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika.
- Kliknij przycisk „Analyze”. Następnie kliknij wzdłuż wspornika w krótkiej odległości od pierwszego kwadratowego znacznika reprezentującego podstawę wspornika. Kontynuuj klikanie wzdłuż wspornika, wliczając jego końcówkę, i naciśnij enter po zakończeniu. Spowoduje to umieszczenie znaku „x” w każdym punkcie klikniętym na wsporniku.
Uwaga: Na podstawie współrzędnych znacznika kwadratowego i znaczników x, środek i średnica okręgu zostaną obliczone przy użyciu funkcji dopasowania metodą najmniejszych kwadratów (skrypt znajduje się w załączonym pliku uzupełniającym). Okrąg przechodzący przez znaczniki x i znacznik kwadratowy zostanie automatycznie nałożony na obraz. - Sprawdź, czy nałożony okrąg prawidłowo odwzorowuje profil wspornika.
Uwaga: Gdy wspornik jest bardzo płaski, trudno ocenić, czy jego profil został prawidłowo odwzorowany. Patrz Rysunek 3. - Kliknij przycisk „next frame”. Spowoduje to przejście do następnej klatki w pliku TIFF. Podstawa i skala są już ustawione z poprzedniego kroku.
- Powtarzaj kroki od 4.1.5 do 4.1.7, aż wszystkie klatki w pliku TIFF zostaną przetworzone. Po przetworzeniu wszystkich klatek kliknij przycisk „Export”.
Uwaga: Stworzy to plik arkusza kalkulacyjnego z nazwą pliku TIFF dla wspornika, który został właśnie przeanalizowany. Zmień nazwę pliku, aby określić, która strona (lewa czy prawa) wspornika była analizowana.
- Otwórz oprogramowanie programistyczne, klikając ikonę. Z paska menu na górze wybierz „File” -> „Open” i zaznacz plik skryptu .m do analizy obrazu. Upewnij się, że zarejestrowane obrazy TIFF znajdują się w tym samym folderze co plik .m. Kliknij „Run”, aby uruchomić skrypt.
- Obliczanie naprężeń w arkuszu kalkulacyjnym.
- Oblicz naprężenie powierzchniowe „σ” na wsporniku, korzystając z następującego równania:
gdzie E, R, v i h to odpowiednio moduł Younga, promień krzywizny, współczynnik Poissona i grubość wspornika.
Uwaga: Grubość wspornika można zmienić w celu modyfikacji czułości. W niniejszym badaniu wartości wynosiły: E = 750 kPa, v = 0.49 i h = 25 µm13,14. - Oblicz naprężenie powierzchniowe za pomocą równania z kroku 4.2.1. Otwórz plik arkusza kalkulacyjnego .xls. Zauważ, że wynik zawiera wiele kolumn wyświetlających kolejno współrzędne x i y podstawy i okręgu, a następnie promień krzywizny. Na ich podstawie oblicz współrzędne x i y każdego klikniętego punktu.
Uwaga: Wykreślenie naprężeń w funkcji klatek obrazu time-lapse pokazuje zmiany siły wywieranej na wspornik w czasie. Dołki wskazują naprężenie na wsporniku podczas relaksacji kardiomiocytów lub naprężenie statyczne wywierane na wspornik przez siły trakcyjne komórek. Piki wskazują dynamiczne naprężenie na wsporniku, wywołane przez bicie kardiomiocytów. Wartość ta odpowiada maksymalnej sile generowanej przez skurcz kardiomiocytów.
- Oblicz naprężenie powierzchniowe „σ” na wsporniku, korzystając z następującego równania:
5. Analiza pływających biorobotów
- Zarejestruj pozycję biorobota za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
Uwaga: Listę oprogramowania użytego w tej sekcji znajduje się w spisie materiałów.- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu (np. ImageJ). Wybierz „File”, a następnie „Open” i zaznacz plik wideo z pływającym biorobotem. Kliknij „OK” i poczekaj, aż program załaduje plik. Otwórz oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych.
- W załadowanym filmie z biorobotem znajdź punkt odniesienia o znanych wymiarach (np. szklaną kuleczkę o średnicy 3 mm, która została osadzona w biologicznym aktuatorze).
Uwaga: Można wykorzystać dowolny obiekt o znanym wymiarze. Pozwoli to określić stosunek liczby pikseli do długości w każdym filmie. - Użyj narzędzia „Straight”, aby narysować linię przez szklaną kuleczkę. Kliknij „Analyze” i wybierz „Set scale”. W polu „Known distance” wpisz „3,000 µm” i kliknij „Ok”.
Uwaga: Spowoduje to ustawienie współrzędnych x i y w mikrometrach. - Wybierz punkt na urządzeniu, który nie drga między klatkami, aby służył jako marker.
Uwaga: Zaleca się wybrać narożnik podstawy. - Zaznacz wybrany w punkcie 5.1.4 punkt na pierwszej klatce. Zapisz współrzędne x i y w arkuszu kalkulacyjnym.
- Przejdź z powrotem do okna oprogramowania do analizy obrazu i naciśnij prawą strzałkę, aby przejść do następnej klatki. Ponownie zaznacz marker (z kroku 5.1.4) i zapisz współrzędne x i y w arkuszu kalkulacyjnym.
- Powtórz krok 5.1.6 dla wszystkich klatek.
- Oblicz parametry pływania biorobota, korzystając z arkusza współrzędnych7.
- Oblicz czas między klatkami na podstawie znanej liczby klatek na sekundę dla każdego filmu.
- Oblicz zmianę współrzędnych x i y między klatkami, aby wyznaczyć przebyty dystans, w tym dystans całkowity.
- Oblicz amplitudę skurczu na podstawie maksymalnej zmiany wzdłuż osi y. Wyznacz częstotliwość uderzeń dla każdego biorobota jako odwrotność okresu między dwoma skurczami.
- Oblicz prędkość pływania każdego urządzenia na podstawie całkowitego czasu i dystansu przebytego w kierunku x.
- Powtórz krok 5.2 dla każdego analizowanego filmu z biorobotem.
- Znormalizuj każdy zmierzony parametr.
Uwaga: Znormalizuj wszystkie wartości, aby lepiej zwizualizować różnice. Niniejszy protokół prezentuje normalizację względem biorobota w trybie poziomym z niskoczęstotliwościowymi skurczami (poziomowy LF) (Rycina 4)7.
6. Analiza ekspresji białek
Uwaga: Próbki zamontowane w krokach 2.2.4 i 2.2.5 obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Obrazy pozyskano przy powiększeniach 20X, 40X i 60X sekwencyjnie w trzech kanałach jednocześnie: 460 nm, 488 nm i 594 nm. Dla każdej próbki wykonano zestaw 5 obrazów przy powiększeniu 40X z różnych pozycji, a każdy kanał zapisano jako oddzielny plik .TIFF. Ustawienie ekspozycji zależało od powiększenia użytego obiektywu i pozostawało stałe dla wszystkich ujęć przy danym powiększeniu.
- Otwórz oprogramowanie do analizy obrazów i wybierz „File” -> „Open”, aby załadować obrazy.
- Narysuj prostokątny wielokąt na ramce obrazu, aby zaznaczyć ROI. Wybierz „Analyze” -> „Measure”, aby zmierzyć średnią intensywność fluorescencji.
- Powtórz krok 6.2, aby zebrać pomiary intensywności ze wszystkich próbek i obliczyć odpowiednią średnią intensywność dla każdego stanu.
Uwaga: W tym przypadku różny stan odnosi się do różnych punktów czasowych, tj. dnia 1., dnia 2. i tak aż do dnia 6. - Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego w celu przeprowadzenia dalszej analizy statystycznej oraz przygotowania wykresów danych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Biologiczny aktuator wykonany z cienkiego wspornika PDMS (o grubości 25 µm) oraz kardiomiocytów stanowi rdzeń pływającego biorobota, co przedstawiono na schemacie i zrzucie ekranu urządzeń na Rysunku 1. Komórki zaczynają wykazywać skurcze po 24 h hodowli, a wygięcie ramion wspornika zaobserwowano w 2. dniu. Profil boczny urządzenia rejestrowano codziennie, a naprężenie powierzchniowe ilościowo określano na podstawie wygięcia ramion wspornika za pomocą dostosowanego skrypt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj procedura opisuje skuteczną metodę wysiewu dla siłowników i biorobotów opartych na PDMS, która ułatwia przyłączanie kardiomiocytów. Ponadto opisano proces pozyskiwania obrazu i późniejszej analizy, który charakteryzuje zachowanie komórek i wydajność urządzeń.
Zaobserwowaliśmy spontaniczne kurczenie się komórek na ramionach wspornikowych po 24 godzinach; Intensywność skurczów stale rosła w czasie i osiągnęła maksimum w 6 dniu, po czym intensywność powoli spadała. Chociaż ramiona w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
M. T. Holley jest wspierany przez program Graduate Fellows Rady Regentów Luizjany, a C. Danielson jest wspierany przez Howard Hughes Medical Institute Professors Program. Badanie to jest wspierane przez grant NSF nr: 1530884.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Chemikalia i odczynniki | |||
| Kardiomiocyty (pierwotne komórki serca) | Charles River | NA | Wyizolowane z 2-dniowych noworodków Sprague Dawley szczurów |
| Dulbecco" s zmodyfikowany orzeł" s media (DMEM) | Hyclone Laboratories | 16750-074 | z 4500 mg/L glukozy, 4,0 mM L-glutaminy i 110 mg/L pirogronianu sodu |
| Płodu III surowica Hyclone industries | , GE | 16777-240 | Płodowa surowica bydlęca (FBS) |
| Dulbecco' s bufor fosforanowy (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408-100ML | |
| Sól sodowa penicyliny-G | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Surowica kozia | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| 4,6-diamidyno-2-fenyloindolowy dihydrocholride w proszku (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Fibronektyna z osocza bydlęcego | Roztwór Sigma-Aldrich | F1141 | (1 mg / ml) |
| Zestaw Calcein-AM i ethidium homodimer-1 (test na żywo/martwy) | Sondy molekularne | L3224 | |
| Calcium Fluo-4, AM | Sondy molekularne | F14217 | wskaźnika wapnia |
| Roztwór soli Tyrodes Roztwór buforowy | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| Sondy molekularne | Pluronic F-127 | P3000MP | niejonowy środek powierzchniowo czynny-20% roztwór w dimetylosiloksanie (DMSO) |
| 16% parafomaldehyd | Mikroskopia elektronowa | 15710 | Uwaga: Drażniący i palny |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X-100 100 ml | detergent do lizy komórek, (glikol 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo-fenylowy), t-oktylofenoksyetoksyetanol, eter tert-oktylofenylowy glikolu |
| polietylenowego) Odczynnik przeciwblaknięcia ProLong Gold | Sondy molekularne | P10144 | Środek montażowy |
| Sondy molekularne | falloidyny Alexa Fluor 594 | A12381 | Marker filamentu aktynowego |
| Przeciwciało wtórne koziego przeciwciała anty-króliczego IgG (H + L), sprzężone | sondy molekularne | A-11012 | |
| Sondy molekularne | pha | A-11001 | |
| Przeciwciało anty-koneksynowe 43 | Abcam | ab11370 | Marker połączenia szczelinowego |
| Troponina przeciwsercowa I przeciwciało | Abcam | ab10231 | Białko kurczliwe |
| 16% roztwór paraformaldehydu klasy EM | Mikroskopia elektronowa | 100503-916 | |
| Polidimetylosiloksan (PDMS) | Elsevier | Sylgard 184 | |
| Materiały i wyposażenie | |||
| Camera | Thor Labs | DCC1545M | |
| światło LED taśma | NA | NA | Dowolna biała dioda LED bez emisji widma |
| Mikroskop konfokalny | Nikkon C2 | NA | Mikroskop konfokalny z zestawem trzech filtrów. |
| Obiektyw zmiennoogniskowy | Infinity | Model# 252120 | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks | NA | Używany w sekcji 4) do analizy siłownika biologicznego. |
| Image J | National Institute of Health | NA | Oprogramowanie do przetwarzania obrazów oparte na języku Java. Używany w sekcji 5) do analizy biorobotów. Darmowe oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów w języku java. (https://imagej.nih.gov/ij/) |
| Thor Cam | Thor Labs | NA | Camera oprogramowanie operacyjne |
Bibliografia
- Feinberg, A. W. Biological Soft Robotics. Annu. Rev. Biomed. Eng. 17, 243-265 (2015).
- Akiyama, Y., et al. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PLOS ONE. 7, 38274(2012).
- Herr, H., Dennis, R. G. A swimming robot actuated by living muscle tissue. J. NeuroEng Rehabil. 1, 6(2004).
- Park, S., et al. Phototactic guidance of a tissue-engineered soft-robotic ray. Science. 353 (6295), 158-162 (2016).
- Cvetkovic, C., et al. Three-dimensionally printed biological machines powered by skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 10125-10130 (2014).
- Williams, B. J., Anand, S. V., Rajagopalan, J., Saif, M. T. A. A self-propelled biohybrid swimmer at low Reynolds number. Nat. Commun. 5, (2014).
- Holley, M. T., Nagarajan, N., Danielson, C., Zorlutuna, P., Park, K. Development and characterization of muscle-based actuators for self-stabilizing swimming biorobots. Lab. Chip. 16, 3473-3484 (2016).
- Hopkins, P. M. Skeletal muscle physiology. Contin Educ Anaesth Crit Care Pain. 6, 1-6 (2006).
- Nawroth, J., et al. A tissue-engineered jellyfish with biomimetic propulsion. Nat Biotechnol. 30 (8), 729-797 (2012).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. JoVE. (79), e50154(2013).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circ. Res. 87, 275-281 (2000).
- Shin, S. R., et al. Carbon-Nanotube-Embedded Hydrogel Sheets for Engineering Cardiac Constructs and Biological actuators. ACS Nano. 7, 2369-2380 (2013).
- Park, J., et al. Real-Time Measurement of the Contractile Forces of Self-Organized Cardiomyocytes on Hybrid Biopolymer Microcantilevers. Anal. Chem. 77, 6571-6580 (2005).
- Tamayo, J., et al. Quantification of the surface stress in microcantilever biosensors: revisiting Stoney's equation. Nanotechnology. 23, 475702(2012).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat. Methods. 10, 781-787 (2013).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in Cardiomyocyte Isolation, Culture, and Gene Transfer. J. Mol. Cell. Cardiol. 51, 288-298 (2011).
- Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
- Sfakiotakis, M., Lane, D. M., Davies, J. B. C. Review of fish swimming modes for aquatic locomotion. IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
