Artykuł metodologiczny

Wypreparowanie trzustki myszy w celu analizy histologicznej i profilowania metabolicznego

39.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55647

⸱

19 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł wideo zawiera szczegółową demonstrację procedur wymaganych do skutecznego usunięcia trzustki myszy poprzez sekcję do analizy histologicznej i profilowania metabolicznego.

Streszczenie

Badaliśmy specyficzny dla trzustki czynnik transkrypcyjny, 1a cre-rekombinazę; lox-stop-lox- mięsak szczura Kristen, glicyna do kwasu asparaginowego w kodonie 12 (Ptf1acre/+; Szczep myszy LSL-KrasG12D/+) jako model ludzkiego raka trzustki. Celem naszych obecnych badań jest identyfikacja nowych biomarkerów metabolicznych progresji raka trzustki. Przeprowadziliśmy profilowanie metaboliczne moczu, kału, krwi i ekstraktów z tkanek trzustki, a także analizy histologiczne trzustki w celu określenia stopnia zaawansowania nowotworu. Trzustka myszy nie jest dobrze zdefiniowanym narządem stałym, jak u ludzi, ale raczej jest rozproszoną tkanką miękką, która nie jest łatwa do zidentyfikowania przez osoby niezaznajomione z anatomią wewnętrzną myszy lub przez osoby, które mają niewielkie lub żadne doświadczenie w wykonywaniu sekcji narządów myszy. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowej demonstracji wizualnej, która poprowadzi nowicjuszy w usuwaniu trzustki myszy przez sekcję. Ten artykuł powinien być szczególnie cenny dla studentów i badaczy początkujących w badaniach, które wymagają pobrania trzustki myszy przez sekcję w celu profilowania metabolicznego lub analiz histologicznych.

Wprowadzenie

Mysz stała się ważnym zwierzęcym modelem ludzkiego raka trzustki1,2. W Ptf1acre/+; Model mysi LSL-KrasG12D/+, onkogen mięsaka szczura Kristen (K-Ras) jest aktywowany wyłącznie w trzustce, co powoduje inicjację zmian przedrakowych w trzustce, znanych jako śródnabłonkowe neoplazje trzustki (PanINs), które postępują do gruczolakoraka przewodowego trzustki, powszechnie określanego jako PDACs3. Ten system modeli mysich zapewnia jeden z najlepszych dostępnych modeli zwierzęcych dla ludzkiego raka trzustki4,5, z dodatkową zaletą, że PanIN pojawiają się w ciągu pierwszych pięciu miesięcy życia i często przechodzą w PDAC w ciągu jednego roku4,5, podczas gdy rak trzustki najczęściej występuje u ludzi w wieku 60-70 lat.

Ekstrakcja trzustki przez wypreparowanie z Ptf1acre/+; Myszy LSL-KrasG12D/+ w różnym wieku pozwalają na szczegółowe podłużne badanie histologiczne rozwoju raka trzustki, począwszy od najwcześniejszych etapów PanIN, aż po progresję do PDAC3,4,5. Pobieranie trzustki w wieku od pięciu do piętnastu miesięcy może być również wykorzystane do przygotowania ekstraktów tkankowych w celu scharakteryzowania globalnych zmian w metabolizmie trzustki4, które zachodzą podczas przejścia od zdrowej do chorej tkanki6,7.

Ten artykuł przedstawia kompletny wizualny przewodnik po krokach wymaganych do przeprowadzenia ekstrakcji trzustki myszy oraz dostarcza wskazówek dotyczących przechowywania trzustki do dalszej analizy. Przewodnik ten będzie równie cenny dla osób prowadzących badania nad innymi chorobami trzustki, w tym cukrzycą typu I, i powinien być szczególnie przydatny dla studentów i badaczy początkujących w badaniach obejmujących pobieranie trzustki myszy za pomocą sekcji w celu profilowania metabolicznego lub analiz histologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury przeprowadzone w filmie i opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Miami.

1. Test przygotowawczy i stymulacyjny

  1. Ustal dwa odrębne obszary dla zabiegu chirurgicznego, stół operacyjny i stół pooperacyjny. Przygotuj oba obszary ze wszystkimi niezbędnymi materiałami i przyborami.
    1. Ustaw stół operacyjny pod wentylowaną maską. Stół ze sprzętem należy ułożyć w sposób umożliwiający ciągłe i niezakłócone wykonywanie zabiegu.
    2. Ustal stół pooperacyjny w tym samym pomieszczeniu i w pobliżu głównego stołu operacyjnego. Utrzymuj oba stoły jako sterylne środowisko przez cały czas trwania procedury.
  2. Na stole operacyjnym umieść następujące materiały: jeden szklany słoik z pokrywką, jedną tubkę 15 ml, jedną parę nożyczek chirurgicznych, jedną butelkę do wyciskania 70% etanolu, dwie płyty piankowe, dwie kleszcze, dwie strzykawki 1 ml 21 G, dwie probówki 50 ml, jedną probówkę wirówkową, jedną fiolkę kriogeniczną, cztery podkładki chirurgiczne, dziesięć szpilek, dozownik chusteczek sterylizujących, i pojemnik na ostre przedmioty.
  3. Na stole pooperacyjnym umieść następujące zapasy: jedną wagę analityczną, jedną 4 l dewara ciekłego azotu, płytką rurkę Dewara z szerokimi otworami, pływający stojak na mikroprobówki, jedną parę nożyczek chirurgicznych, dwa kleszcze, cztery fiolki kriogeniczne i dozownik sterylnych chusteczek.
  4. Napełnij jedną probówkę o pojemności 50 ml i jedną probówkę o pojemności 15 ml do 75% objętości formaliną.
  5. Za pomocą szpilki w każdym rogu przymocuj jedną podkładkę chirurgiczną do płyty piankowej o wymiarach około 30 cm x 30 cm, która będzie służyć jako deska do sekcji. Użyj pozostałych czterech kołków podczas operacji. Przygotuj mniejszą tablicę piankową z podkładką chirurgiczną, aby przenieść narządy na stół pooperacyjny.
    UWAGA: Izofluran (99,9%) jest toksyczną substancją chemiczną i powinien być stosowany w okapie wentylacyjnym, aby zapewnić maksymalny poziom bezpieczeństwa przed wydostaniem się odpadowego gazu znieczulającego8. Dodatkowe informacje na temat zagrożeń dla badaczy związanych ze stosowaniem metody open-drop z użyciem izofluranu można znaleźć w artykule Taylora i Mook8.
  6. Umieść jedną podkładkę chirurgiczną w szklanym słoiku i nasącz kilkoma kroplami izofluranu (99,9%), a na wierzchu połóż ręcznik papierowy, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z izofluranem. Podobnie, użyj podkładki chirurgicznej, aby wyłożyć pozostałą rurkę i nasącz kilkoma kroplami izofluranu i umieść dodatkową podkładkę na górze, aby zapobiec bezpośredniemu kontaktowi myszy z izofluranem.
  7. Wlej ciekły azot do płytkiego dewara z szerokim otworem, aż do osiągnięcia linii maksymalnego napełnienia.
  8. Mysz wybraną do sekcji umieszczamy w komorze anestezjologicznej, czyli szklanym słoju z podkładką nasączoną kilkoma kroplami izofluranu (99,9%) przykrytą pokrywką, na ~1 min.
    UWAGA: Ten czas różni się w zależności od myszy. Gdy mysz straci przytomność, wyjmij ją z komory i umieść na tablicy operacyjnej.
  9. Ustaw mysz tak, aby leżała brzusznie do góry i z głową skierowaną w stronę przeciwną do naukowca. Umieść głowę w rurce wyłożonej podkładką chirurgiczną nasączoną kilkoma kroplami izofluranu (99,9%) i wykonaj test bodźca przez uszczypnięcie stopy, aby upewnić się, że mysz nie reaguje na bodźce.
    1. Jeśli ten test zakończy się niepowodzeniem, a mysz zareaguje na test szczypania stopy, powtórz krok 1.8.

2. Pierwsze nacięcie, nakłucie serca i eutanazja

  1. Przypnij kończyny myszy do deski z pianki chirurgicznej i zwilż brzuszną stronę myszy 70% etanolem.
  2. Ściśnij futro/skórę w pobliżu ujścia cewki moczowej kleszczami i pociągnij lekko do góry. Wykonaj nacięcie nożyczkami chirurgicznymi przez jamę brzuszną, zaczynając od ujścia cewki moczowej, w górę linii środkowej, a kończąc na brodzie.
    1. W pobliżu punktu początkowego nacięcia chwyć kleszczami jedną stronę futra/skóry i wykonaj kolejne nacięcie nożyczkami w dół i ukośnie w kierunku tylnej łapy.
    2. Powtórz to w ten sam sposób po przeciwnej stronie.
      UWAGA: Futro/skórę można przypiąć, aby utworzyć szerszy otwór, ale nie jest to konieczne.
  3. Zlokalizuj serce i usuń osierdzie, który jest workiem wokół serca, aby uniknąć zatkania igły strzykawki.
    1. Chwyć osierdzie kleszczami i przetnij je nożyczkami. Wykonać nakłucie serca, ostrożnie wkładając igłę strzykawki do bijącego serca i powoli zacząć cofać tłok.
    2. W celu optymalnego pobrania krwi należy użyć tłoka igły, aby naśladować pompowanie serca i unikać zbyt szybkiego pobierania.
      UWAGA: Zazwyczaj można pobrać około 1 ml krwi.
    3. Po zakończeniu pobierania krwi rozprowadzić krew do probówki wirówkowej i wyrzucić strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty.
    4. Po wykonaniu nakłucia serca należy przeprowadzić eutanazję, usuwając nasadki łączące serce.
      UWAGA: Heparyna, antykoagulant, nie została dodana do strzykawki w tej procedurze przed punkcją serca, aby umożliwić koagulację krwi w celu pobrania surowicy w tym konkretnym badaniu. Jeśli jednak badacz chciałby zapobiec krzepnięciu krwi w celu pobrania osocza, heparynę można dodać do strzykawki przed punkcją serca.
  4. Jeśli badanie obejmuje genotypowanie myszy, odetnij nożyczkami część ucha i umieść w probówce wirówkowej w celu weryfikacji genotypu.

3. Ekstrakcja trzustki

  1. Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy. Rozpocznij delikatnie (aby uniknąć rozerwania) oddzielać trzustkę od żołądka i dwunastnicy za pomocą dwóch kleszczy.
    UWAGA: Podczas odłączania trzustki od żołądka i jelit bardzo ważne jest, aby kleszcze były delikatnie używane do odprowadzania tkanki trzustki z dala od narządów i nie miażdżenia ani nie rozrywania trzustki kleszczami.
    1. Kontynuuj oddzielanie trzustki od odcinków jelita cienkiego jelita czczego i jelita krętego, a na końcu od kątnicy jelita grubego.
  2. W kątnicy zmień położenie kleszczy i kontynuuj oddzielanie trzustki wzdłuż pozostałej okrężnicy w kierunku odbytnicy.
    UWAGA: W tym momencie wygodnie jest przeciąć i usunąć część z żołądka do obszaru okrężnicy bezpośrednio poprzedzającego odbytnicę.
  3. Zlokalizuj trzustkę i przyczepioną śledzionę. Przesuń trzustkę w kierunku prawej strony myszy. Oddziel pozostałe połączenia między trzustką a klatką piersiową za pomocą kleszczy, aby całkowicie odłączyć trzustkę i przylegającą śledzionę.
  4. Wyjmij trzustkę i rozłóż ją do badania. Pozostaw śledzionę przyczepioną do trzustki w celu identyfikacji.
    1. Usuń całą tkankę łączną, tłuszcz i tkankę krezkową z trzustki.
      UWAGA: Ta tkanka ma bielszy kolor, dzięki czemu można ją łatwo odróżnić od tkanki trzustki, która ma bardziej różowy kolor. Jest to szczególnie ważne, jeśli konieczne jest usunięcie całej trzustki. Na przykład, jeśli trzustka musi zostać zważona i porównana z masą ciała lub między grupami zwierząt. W Ptf1acre/+; Model myszy LSL-KrasG12D/+, szczególnie w starszych miesiącach, może być obecna twarda włóknista tkanka trzustki. W takim przypadku należy przeprowadzić ostrożne usunięcie trzustki, ponieważ jelita mogą być przeplatane w tkance nowotworowej. W zaawansowanych przypadkach mogą również występować nieprawidłowe tkanki śledziony i wątroby.
  5. W razie potrzeby usuń w tym momencie inne narządy.

4. Gromadzenie i przechowywanie danych

  1. Po ekstrakcji narządów należy przenieść próbki do obszaru pooperacyjnego w celu konserwacji.
  2. Zważ każdy narząd i umieść go w odpowiedniej fiolce kriogenicznej.
    UWAGA: Wraz z masą każdej próbki należy odnotować wszelkie nieprawidłowości do wykorzystania w przyszłości.
  3. Po zważeniu narządów umieść je w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia.
  4. Po zatrzaskowym zamrożeniu narządy należy przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  5. Próbki przechowywane w formalinie należy umieszczać na noc na blacie stołu, a następnego ranka zmienić ich roztwór z formaliny na 70% etanolu.
    UWAGA: Próbki te należy przechowywać w temperaturze 4 °C w celu długotrwałego przechowywania.
  6. W przypadku długotrwałego przechowywania należy zamrozić krew i dziurkacz w uchu w temperaturze -80 °C. W celu pobrania surowicy z krwi, pozwól krwi krzepnąć przez 30 minut, a następnie odwiruj ją. Usunąć porcję surowicy za pomocą pipety, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.

5. Sprzątanie

  1. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia do preparowania chusteczkami sterylizującymi. Zakryj rurkę wyłożoną podkładką chirurgiczną nasączoną izofluranem. Wymień podkładkę chirurgiczną na płycie piankowej na nową podkładkę chirurgiczną. Pozbądź się części myszy, które nie zostały zebrane zgodnie z polityką zakładu dotyczącą utylizacji zwierząt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia ogólny widok obszaru operacyjnego, a Rysunek 2 przedstawia obszar pooperacyjny. Choć ta konfiguracja zapewnia minimalną ilość sprzętu i przygotowania, osoby przeprowadzające procedurę mogą ją zmodyfikować, aby jak najlepiej dostosować ją do indywidualnych potrzeb. Protokół należy zoptymalizować zgodnie z konkretnymi wymaganiami eksperymentu. Procedura ta jest przeprowadzana w sposób kończący życie myszy, co ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod
Chociaż istnieją inne nieformalne filmy przedstawiające sekcje myszy, ten artykuł wideo stanowi pierwszą profesjonalną, recenzowaną, wizualną demonstrację wszystkich szczegółowych kroków wymaganych do ekstrakcji i pobrania trzustki myszy przez sekcję10. Ponieważ trzustka jest głównym narządem odpowiedzialnym za aktywność metaboliczną i produkcję insuliny, rozwarstwienie i pobranie trzustki pozwala na zachowanie cech fizjologicznyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

MAK dziękuje za wsparcie dla tej pracy od National Institutes of Health / National Cancer Institute grant numer - 1R15CA152985-01A1. Projekt ten był również wspierany przez Miami University Undergraduate Research Award Program, Miami University Doctorate-Undergraduate Opportunities for Scholarship Program oraz Miami University Summer Scholars Program.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklany słoik Corning3140-150Szklany słoik użyty w filmie został wycofany z produkcji. To jest jego zamiennik.
Pokrywka szklanegosłoika Corning9985-150Szklana pokrywka słoika używana w filmie została wycofana.  To jest jego zamiennik.
15 ml Falcon TubesFisher Scientific339650
Fisher Scientific9201
Butelka do wyciskania Fisher Scientific03-409-10DD
100% etanolFisher Scientific22-032-103
FormalinaFisher Scientific245-684
Deski piankowe Kleszcze562908Therapak
Fisher Scientific200205SHN
1 mL 21G StrzykawkiBD Biosciences309624
50 ml probówki FalconFisher Scientific339652
2,0 ml Probówki do mikrowirówek Fisher Scientific02-681-258
Podkładki chirurgiczneFisher ScientificS67011
Szpilki teowe Długość:  2" Produkty ze sklepuAdvance X32T-05
Chusteczki sterylizująceProfessional Disposables International Inc.Q85084
Pojemnik na ostre przedmiotyFisher Scientific14-827-122
Waga analitycznaMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Płytkie szerokie usta DewarFisher ScientificF3087-V
Pływający stojak na mikroprobówkiVWR60986-100
Fiolka kriogeniczna 1,2 ml, sterylnaFisher Scientific10-500-25
Isothesia (Isoflurane) Henry Schein Zdrowie zwierząt050033
ciekły azotBracia WrightNIT-60-XX
Szczep myszy KrasJackson LaboratoryOO8179
Szczep myszy CreMMRRCOOO435-UNC
Nożyczki chirurgiczne

Bibliografia

  1. Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
  2. Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
  3. Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
  4. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
  5. Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
  6. LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
  7. Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
  8. Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
  9. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  10. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  11. Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
  12. Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
  13. Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
  14. Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
  15. Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
  16. Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja trzustki myszyterminalne pobieranie krwiprocedura nak ucia sercaizolacja organ wprzechowywanie w prob wkach kriogenicznychb yskawiczne mro enie w ciek ym azociemocowanie szpilkami do chirurgicznej p yty piankowejdezynfekcja chusteczkami sterylizuj cymi

Powiązane artykuły