Method Article

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

DOI:

10.3791/55652

⸱

May 25th, 2017

 , 
1Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anatomy, Brain Research Institute, Yonsei University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naczynia krwionośne dostarczają tlen i składniki odżywcze do całego ciała, a tworzenie sieci naczyniowej jest pod ścisłą kontrolą rozwoju. Skuteczna wizualizacja naczyń krwionośnych in vivo i wiarygodna kwantyfikacja ich złożoności są kluczem do zrozumienia biologii i chorób sieci naczyniowej. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodę wizualizacji naczyń krwionośnych za pomocą dostępnego na rynku barwnika fluorescencyjnego, kompleksu lipoprotein DiI o niskiej gęstości acetylowanej z ludzkiego osocza (DiI-AcLDL) oraz ilościowego określenia ich złożoności w Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można znakować za pomocą prostego wstrzyknięcia DiI-AcLDL do bijącego serca zarodka, a naczynia krwionośne w całym zarodku można obrazować w żywych lub utrwalonych zarodkach. W połączeniu z zaburzeniami genów poprzez celowaną mikroiniekcję kwasów nukleinowych i/lub stosowanie odczynników farmakologicznych w kąpieli, rola genu lub szlaku sygnałowego w rozwoju naczyń krwionośnych może być zbadana w ciągu jednego tygodnia bez uciekania się do wyrafinowanych genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Ze względu na dobrze zdefiniowany układ żylny Xenopus i jego stereotypową angiogenezę, kiełkowanie wcześniej istniejących naczyń, złożoność naczyń można skutecznie określić ilościowo po eksperymentach perturbacyjnych. Ten stosunkowo prosty protokół powinien służyć jako łatwo dostępne narzędzie w różnych dziedzinach badań sercowo-naczyniowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Waskulogeneza, tworzenie nowych naczyń krwionośnych z nowo powstałych komórek śródbłonka, oraz angiogeneza, tworzenie nowych naczyń z wcześniej istniejących naczyń, to dwa odrębne procesy, które kształtują unaczynienie embrionalne1. Wszelkie rozregulowanie tych procesów skutkuje różnymi chorobami serca i nieprawidłowościami strukturalnymi naczyń. Ponadto wzrost guza wiąże się z niekontrolowanym wzrostem naczyń. W związku z tym mechanizmy molekularne leżące u podstaw waskulogenezy i angiogenezy są przedmiotem intensywnych badań2.

Xenopus i danio pręgowany są atrakcyjnymi modelami kręgowców do badań nad waskulogenezą i angiogenezą, z kilku powodów. Po pierwsze, ich zarodki są małe; W związku z tym stosunkowo łatwo jest zobrazować całe unaczynienie. Po drugie, rozwój embrionalny jest szybki; Potrzeba tylko kilku dni, aby rozwinęła się cała naczyniowość, w tym czasie można zobrazować rozwijające się naczynia krwionośne. Po trzecie, interwencje genetyczne i farmakologiczne przed i w trakcie tworzenia naczyń krwionośnych są łatwe do wykonania, na przykład poprzez mikrowstrzyknięcie antysensownych nukleotydów morfolinowych (MO) do rozwijającego się zarodka lub poprzez zastosowanie leków w kąpieli3,4,5.

Unikalną przewagą Xenopus nad danio pręgowanym jest to, że manipulacje embriologiczne mogą być wykonywane, ponieważ Xenopus podąża za stereotypowymi holoblastycznymi podziałami, a mapa losu embrionalnego jest dobrze zdefiniowana6. Na przykład, możliwe jest wygenerowanie zarodka, w którym tylko jedna boczna strona jest genetycznie manipulowana poprzez wstrzyknięcie antysensownego MO do jednej komórki w stadium dwukomórkowym. Możliwe jest również przeszczepienie zawiązka serca z jednego zarodka do drugiego w celu określenia, czy gen pełni swoją funkcję poprzez mechanizm wewnętrzny czy zewnętrzny komórki7. Chociaż techniki te zostały w większości opracowane w przypadku Xenopus laevis, który jest allotetraploidalny i dlatego nie jest idealny do badań genetycznych, można je bezpośrednio zastosować do Xenopus tropicalis, blisko spokrewnionego gatunku diploidalnego8.

Jednym ze sposobów wizualizacji unaczynienia u żywego zarodka Xenopus jest wstrzyknięcie barwnika fluorescencyjnego w celu oznaczenia naczyń krwionośnych. Acetylowana lipoproteina o niskiej gęstości (AcLDL) znakowana cząsteczką fluorescencyjną, taką jak DiI, jest bardzo przydatną sondą. W przeciwieństwie do nieacetylowanego LDL, AcLDL nie wiąże się z receptorem LDL9, ale jest endocytozowany przez makrofagi i komórki śródbłonka. Wstrzyknięcie DiI-AcLDL do serca żywego zwierzęcia powoduje specyficzne znakowanie fluorescencyjne komórek śródbłonka, a całe unaczynienie można zobrazować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w żywych lub utrwalonych zarodkach4.

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły wizualizacji i kwantyfikacji naczyń krwionośnych za pomocą DiI-AcLDL u Xenopus tropicalis (Rysunek 1). Przedstawiamy kluczowe punkty praktyczne, wraz z przykładami udanych i nieudanych eksperymentów. Ponadto udostępniamy prostą metodę ilościowej analizy złożoności naczyń krwionośnych, która może być przydatna w ocenie wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na kształtowanie sieci naczyniowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Yonsei University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committees.

1. Przygotowanie zarodków Xenopus tropicalis

UWAGA: Zarodki Xenopus tropicalis zostały wyprodukowane zgodnie z wcześniejszym opisem10, z niewielką modyfikacją. Zarodki Xenopus tropicalis zostały sklasyfikowane zgodnie z tabelami Nieuwkoopa i Faber11 .

  1. Indukcja owulacji
    1. Aby przygotować się do krycia, należy wstrzyknąć ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) do grzbietowego worka limfatycznego pary żab (jednego samca i jednej samicy) w dniu poprzedzającym dzień krycia. Wstrzyknąć 20 jednostek na samicę żaby i 10 jednostek na samca. Trzymaj samca i samicę w tym samym zbiorniku na noc (przez ponad 18 godzin).
      2. Aby przygotować szczepionkę
    2. , następnego dnia wstrzyknij 200 jednostek hCG wstępnie zaszczepionej samicy i 100 jednostek hCG wstępnie zaszczepionemu samcowi; zaszczepiona samica zacznie składać jaja w ciągu około 3 godzin i będzie to robić przez cały dzień. Trzymaj parę samca i samicy razem do naturalnego krycia lub w oddzielnych zbiornikach do zapłodnienia in vitro (krok 1.2).
  2. Zapłodnienie
    UWAGA: Jaja mogą być zapłodnione przez krycie naturalne lub zapłodnienie in vitro. W kryciu naturalnym jaja są zapładniane w miarę ich składania, a zatem nie można kontrolować czasu zapłodnienia. Alternatywnie, przygotowana samica żaby może być trzymana w osobnym zbiorniku, a niezapłodnione jaja mogą być zbierane do zapłodnienia in vitro, co generuje setki zarodków zapłodnionych w tym samym czasie. To ostatnie podejście jest przydatne, gdy mikroiniekcja ukierunkowana na blastomery zostanie wykonana przed znakowaniem naczyń. W tym podejściu jednak składa się w ofierze samca.
    1. Naturalne krycie
      1. Pozostaw zagruntowaną parę samic i samców w tym samym zbiorniku. Samiec ściska samicę, co prowadzi do natychmiastowego zapłodnienia złożonych jaj. Zbierz jajka szklaną lub plastikową pipetą i przenieś je na szalkę Petriego. Aby zapobiec przywieraniu jaj do pipety, należy pokryć wewnętrzną powierzchnię pipety 0,5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
    2. Zapłodnienie in vitro (IVF)
      1. Po zagruntowaniu oddziel zagruntowaną samicę od samca. Samica zacznie spontanicznie składać jaja po około 3 godzinach. Przenieś kilka złożonych jaj za pomocą pipety pokrytej BSA na szalkę Petriego i sprawdź ich jakość pod mikroskopem. Jeśli złożono zdrowe jaja (przezroczysty pigment, elastyczny w kształcie kuli), przygotuj się do wycięcia jąder z zaszczepionego samca.
      2. Przygotować 0,4% metanosulfonianu trikainy (MS222) do eutanazji i wstrzyknąć 300 μl do grzbietowego worka limfatycznego przygotowanego samca. Po około 10 minutach samiec straci zmysł równowagi i utrzyma się na powierzchni; Potwierdź, że samiec został poddany eutanazji, szczypiąc tylną nogę parą kleszczy i obserwując brak reakcji.
      3. Wyciąć dwa jądra, oczyścić je, szybko stukając nimi w niestrzępiący się papier, a następnie przenieść je do mikroprobówki zawierającej 1 ml 60% pożywki L-15 Leibovitz (60%) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS); szczegółowa procedura jest opisana w innym miejscu10.
      4. Delikatnie zmiel jądra tłuczkiem, aby wydobyć plemniki. Przy tym stężeniu (tj. 2 jądra w 1 ml 10% FBS w 60% L-15), kilka kropli roztworu jądra (0,1 ml) może zapłodnić około trzystu jaj. Pozostałe plemniki można przechowywać w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętej probówce i wykorzystać do zapłodnienia in vitro następnego dnia.
      5. Wyciśnij jaja z samicy na małą szalkę Petriego. Przytrzymaj górną część samicy do góry nogami na dłoni i włóż palec wskazujący między jej tylne nogi. Rozłóż tylne nogi palcem wskazującym, a drugą ręką, aby odsłonić kloakę. Przyłóż kloakę do szalki Petriego. Posmaruj szalkę Petriego 0,5% BSA, aby równomiernie rozprowadzić jaja jako monowarstwę podczas IVF.
      6. Dodaj kilka kropli (0,1 ml) pożywki L-15 zawierającej plemniki do komórek jajowych. W przypadku zapłodnienia synchronicznego delikatnie wymieszaj roztwór nasienia w poprzek naczynia. Po 4 minutach w temperaturze pokojowej napełnij szalkę Petriego 0,01x zmodyfikowanym roztworem soli fizjologicznej Bartha (MBS), inkubuj przez 10 minut i zastąp roztwór roztworem 0,1x MBS. Zapłodnione jaja zostaną poddane pierwszemu rozszczepieniu po około 1 godzinie w temperaturze pokojowej. 1x MBS to 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,5 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 1 mMMgSO4 i 0,7 mM CaCl2, pH 7,5.
  3. (Opcjonalnie) Wstrzyknięcie antysensownych oligonukleotydów morfolinooligonukleotydów (MO) i/lub mRNA
    1. Aby zbadać wpływ interesującego genu na tworzenie naczyń krwionośnych, należy wykonać mikroiniekcję antysensownego MO i/lub mRNA.
    2. W przypadku takich eksperymentów należy usunąć galaretę z jaj z 2% L-cysteiną w 1x MBS (pH 7,5-7,8). Zamień 0,1x MBS w naczyniu zawierającym zapłodnione zarodki z 2% L-cysteiną w 1x MBS. Delikatnie zakręć naczyniem, aby wymieszać roztwór.
      UWAGA: Zwykle potrzeba około 5 minut, aby zarodki zostały odgalaretowate. Na tym etapie należy często monitorować jaja, aby upewnić się, że nie są nadmiernie narażone na działanie roztworu. Jeśli jaja są nadmiernie naświetlone, stracą elastyczność i staną się spłaszczone, co spowoduje nieprawidłowy rozwój i śmiertelność.
    3. Umyj pozbawione galaretki jajka pięć razy za pomocą 0,1x MBS. Wykonać mikroiniekcję w 4% Ficollu rozpuszczonym w 0,1x MBS. Zazwyczaj wstrzykuje się 4 ng MO i 600 pg mRNA na blastomer na etapie dwukomórkowym. Wstrzyknąć do jednej komórki, aby manipulować ekspresją genów tylko po jednej stronie zarodka. Jako grupę kontrolną należy użyć niewstrzykniętej strony tego samego zarodka.
    4. Jako kolejną kontrolę specyficzności manipulacji genami, wstrzyknij taką samą ilość kontrolnego MO (CoMO) lub kontrolnego mRNA (np. mRNA beta-galaktozydazy). CoMO musi mieć taką samą masę cząsteczkową jak MO specyficzny dla genu i nie może być ukierunkowany na żaden gen w genomie Xenopus. Aby ułatwić wizualizację wstrzykniętej strony, użyj MO znakowanego fluoresceiną lub wstrzyknij jednocześnie znacznik (np. mRNA EGFP).
    5. Pozostawić wstrzyknięte zarodki w 4% Ficoll na 2 godziny, a następnie przenieść je na nową 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 0,1x MBS.
  4. Podnoszenie
    1. Hodować zarodki w temperaturze 23 °C. Chociaż tempo rozwoju można spowolnić lub przyspieszyć, stosując odpowiednio temperatury poniżej lub powyżej 23 °C (zakres: 16-26 °C), zaleca się ich zwiększenie do 23 °C.
  5. (Opcjonalnie) Leczenie odczynnikami farmakologicznymi
    1. W przypadku manipulacji farmakologicznych należy podawać leki rozwijającym się zarodkom poprzez kąpiel
      2. .

2. Przygotowanie iniekcji DiI-AcLDL

  1. Wykonaj stożkową szklaną pipetę za pomocą standardowego ściągacza do mikropipet. Umieść rurkę ze szkła borokrzemianowego w ściągaczu do mikropipet i użyj następujących ustawień: ciśnienie, 200; ciepło, 30; ciągnąć, 30; prędkość, 120; czas, 200.
  2. Roztwór podstawowy DiI-AcLDL przechowywać w temperaturze 4 °C. Pobrać górną przezroczystą część roztworu do wstrzykiwań, ale nie cząstki wytrącone na dnie probówki. Wszelkie zanieczyszczenia w szklanej pipecie będą zakłócać prawidłowe wylewanie roztworu.
  3. Przygotować szklaną pipetę napełnić odpowiednią ilością roztworu DiI-AcLDL (~5 μL) za pomocą mikroładowarki.
  4. Stopniowo odetnij końcówkę szklanej pipety za pomocą cienkich kleszczy (numer 55). Ustawić system iniekcji z kontrolowanym ciśnieniem w taki sposób, aby jednorazowo wyrzucane było około 5 nl roztworu; 50-60 nL roztworu DiI-AcLDL wystarcza do zabarwienia naczyń jednego zarodka.
  5. Nie pozostawiaj pipety z DiI-AcLDL w powietrzu przez dłuższy czas, aby uniknąć wysuszenia. Końcówkę pipety należy zanurzyć w roztworze 0,04% MS222 w 0,1 x MBS. Tuż przed wstrzyknięciem go do zarodka (krok 4.2.1) sprawdź, czy taka sama ilość barwnika wyrzuca się.

3. Konfiguracja iniekcji

  1. Pleśń Sylgard
    1. Aby przygotować małą foremkę Sylgard, wymieszaj bazę Sylgard i utwardzacz w stosunku wagowym 10 do 1. Napełnij około połowy małej szalki Petriego (szalka 35 mm lub 60 mm) tym zmieszanym roztworem, a następnie pozostaw ją do zestalenia się na około 48 godzin w temperaturze pokojowej.
  2. znieczulenie
    1. Użyj 0,04% MS222 w 1x MBS (pH 7,5-8,0) do znieczulenia. Gdy potrzebne jest długie znieczulenie (np. podczas obrazowania na żywo), użyj 0,04% MS222 w 0,1x MBS, aby zmniejszyć nierównowagę osmotyczną. Aby dostosować pH, dodaj kilka kropli NaOH (~20 μL) i sprawdź pH za pomocą papieru pH.
    2. Poczekaj, aż przeniesione zarodki przestaną się poruszać. Dotknij płetw grzbietowych zarodków i sprawdź, czy reagują, aby potwierdzić całkowite znieczulenie.
  3. Ustawianie zarodków do wstrzyknięcia
    1. Wciąć powierzchnię utwardzonej formy Sylgard cienkim i ostrym ostrzem. Wykonaj wklęsłe wgłębienie w kształcie litery V, w którym umieścisz zarodki (patrz rysunek 2D). Umieścić znieczulony zarodek, brzusznie do góry, w lekko skośny sposób (około 30°) (ryc. 2D).
    2. Napełnij formę roztworem MS222 i umieść zarodki w formie.

4. Iniekcja DiI-AcLDL

  1. Nacięcie skóry pokrywającej serce
    1. Przygotuj dwie szpilki (minuterii, 0,10 mm) do przecięcia skóry pokrywającej serce. Mocno przymocuj każdy kołek do uchwytu na kołek; serce powinno być łatwe do zidentyfikowania podczas pulsowania (ryc. 2A-2C, różowy).
    2. Nakłuć skórę zarodka jedną szpilką. Włóż szpilkę przez otwór w przestrzeni między sercem a skórą (Rysunek 2C, pełna strzałka). Nie nakłuwać serca. Umieść włożoną część tej szpilki w obszarze, w którym zostanie wykonane nacięcie.
    3. Wykonaj liniowe nacięcie, delikatnie pocierając drugą szpilkę trzymaną na zewnątrz skóry o włożoną szpilkę. Delikatnie poszerz to nacięcie za pomocą dwóch szpilek, odsłaniając serce (Rysunek 2B' i 2D', strzałka). Pipeta wypełniona DiI-AcLDL może teraz bezpośrednio zbliżać się do serca (ryc. 2D').
  2. zastrzyk
    1. Włóż końcówkę załadowanej szklanej pipety do serca i wstrzyknij 50-60 nl roztworu DiI-AcLDL w około 10 impulsach wyrzutowych. Nie należy wstrzykiwać nadmiernej ilości roztworu, ponieważ powoduje to pęknięcie serca. Sprawdź, czy po wstrzyknięciu serce nadal bije. Po każdym wstrzyknięciu należy sprawdzić, czy taka sama ilość DiI-AcLDL jest wyrzucana; W przeciwnym razie końcówka pipety może zostać zablokowana (patrz krok 2.5).
  3. Rekonwalescencja i badania przesiewowe wzroku
    1. Przenieś wstrzyknięte zarodki na nową szalkę Petriego wypełnioną 0,1x MBS w celu odzyskania sprawności. Po 5-10 minutach kijanki powinny odzyskać przytomność i zacząć się poruszać. W tym momencie można zobrazować oznakowane naczynia. Zaleca się wizualne badanie przesiewowe pomyślnie oznakowanych zarodków pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 3A i 3B). Jeśli do zarodka zostanie wstrzyknięta niewystarczająca ilość DiI-AcLDL, można go wstrzyknąć ponownie (ryc. 3C).
    2. Wyrzuć kijanki, które mają oznaczone inne narządy (ryc. 3D). Kontynuuj aż do uzyskania wymaganej liczby pomyślnie oznakowanych zarodków.
  4. (Opcjonalnie) Utrwalenie zarodków
    1. W celu dokładniejszego zobrazowania naczyń krwionośnych należy użyć mikroskopii konfokalnej; może być łatwiej ustalić oznakowane zarodki do mikroskopii konfokalnej. Najpierw znieczulić znakowane zarodki w 0,04% MS222 w 1x MBS (pH 7,5-8,0), a następnie utrwalić je w 4% paraformaldehydzie w 1X buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Utrwalone zarodki mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C; chronić wstrzykiwane próbki przed światłem, aby uniknąć fotowybielania DiI.

5. Obrazowanie DiI-AcLDL

  1. Obrazowanie stereoskopowe
    1. Wykonaj zdjęcia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (ryc. 3), aby ocenić ogólną morfologię układu krwionośnego.
    2. Rozpuść 1% agarozy w 1x PBS dla stałych zarodków lub w 1x MBS dla żywych zarodków. Wlej stopioną agarozę na szalkę Petriego i poczekaj, aż zastygnie. Wykonaj płytkie wgłębienie na powierzchni żelu agarozowego, które będzie pasować do zarodka, który ma być zobrazowany, gdy leży na jego bocznej stronie. Napełnij naczynie buforem (roztwór MS222 dla znieczulonych zarodków lub 1x PBS dla zarodków stałych).
  2. Mikroskopia fluorescencyjna (zestaw filtrów rodaminowych)
    1. Ponieważ DiI jest barwnikiem wzbudzonym na zielono i emitującym czerwień, obraz odbywa się przy użyciu standardowego zestawu filtrów dla rodaminy lub fluoroforów związanych ze spektralnie (maksymalne wzbudzenie przy 554 nm i emisja przy 571 nm). Umieść wstrzyknięte zarodki we wgłębieniach w formie agarozowej i zrób zdjęcia (ryc. 3).
  3. Mikroskopia konfokalna
    UWAGA: W celu dokładniejszej analizy architektury naczyniowej należy użyć mikroskopii konfokalnej.
    1. Jeśli używasz mikroskopu odwróconego, umieść zarodki na naczyniu ze szklanym dnem. Dodaj kilka kropli 1x PBS i unieruchamiaj je, umieszczając na wierzchu szkiełko nakrywkowe. Usuń nadmiar PBS. Jeśli mają być obrazowane żywe zarodki, należy użyć znieczulonych zarodków i użyć 0,015% MS222 w 0,1x MBS zamiast PBS.
    2. W przypadku obrazowania w małym powiększeniu użyj obiektywu 4X do 10X, aby znaleźć obszar zainteresowania; rostralna część tylnej żyły kardynalnej (PCV) jest przydatnym regionem do badania angiogenezy rozwojowej (ryc. 4, przerywane ramki).
      1. Użyj ustawienia akwizycji dla czerwonego fluoroforu emisyjnego (takiego jak rodamina).
      2. Twórz obrazy z ułożonymi w stos, obrazując boczną połowę zarodka. Najpierw ustaw ostrość na PCV po bocznej stronie w pobliżu obiektywu, a następnie ustaw dolną granicę ostrości w miejscu, w którym ustawione są naczynia znajdujące się najbliżej obiektywu. Ustaw górną granicę w miejscu, w którym można ustawić ostrość na przyśrodkowej części obrazowanego PCV. Wyobraź sobie całą boczną połowę zarodka. Używaj oprogramowania, które przechowuje metadane dotyczące ustawień akwizycji, takie jak skale x, y i z, ponieważ są one wymagane do obliczenia długości naczyń.
      3. W razie potrzeby użyj trybu skanowania kafelków, aby zobrazować całe unaczynienie zarodka. Empirycznie określ liczbę płytek poziomych i pionowych.
    3. W przypadku obrazowania w dużym powiększeniu postępuj zgodnie z powyższymi procedurami, aby zobrazować rostralną część PCV i 4 najbardziej rostralne żyły międzysomomityczne (ISV) (ryc. 4, ramka przerywana). Dostosuj odpowiednio liczbę stosów (z-stack) i kafelków (tile scan).

6. Kwantyfikacja naczyń oznaczonych znakiem DiI

UWAGA: Naczynia oznaczone znakiem DiI można śledzić ręcznie lub za pomocą oprogramowania. Używamy "Simple neuryte tracer", darmowej wtyczki ImageJ (NIH), która umożliwia półautomatyczne śledzenie struktur przypominających rurki, takich jak naczynia krwionośne i neuryty12. Za pomocą tego bezpłatnego oprogramowania można obliczyć następujące parametry. Szczegółowa procedura korzystania z tego oprogramowania jest opisana w innym miejscu (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer)12. Poniżej używamy przykładów unaczynienia zarodków, w których sygnalizacja Tie2 jest zahamowana lub wzmocniona (Rysunek 4A-4C)5. Zarodki wstrzyknięte antysensownie Tie2MO wykazują zmniejszenie angiogenezy i skraca ISV (Figura 4B), podczas gdy jednoczesne wstrzyknięcie konstytutywnie aktywnego zmutowanego mRNA Tie2 (caTie2 mRNA) nadmiernie ratuje ten fenotyp, powodując wybujałe gałęzie ISV (Figura 4C).

  1. Długości niezależnych dostawców oprogramowania
    1. Korzystając z prostego śledzenia neurytów, oblicz długość każdego śledzonego naczynia. Oblicz długości 4 najbardziej rostralnych niezależnych dostawców oprogramowania.
  2. Oddziały niezależnego dostawcy oprogramowania
    UWAGA: W zarodkach typu dzikiego tylko kilka krótkich gałęzi wyrasta z najbardziej rostralnych ISV w stadium 42.
    1. W Simple neuryt tracer śledź te małe naczynia po utworzeniu ISV, z którego pochodzą gałęzi podstawowej. Oblicz następujące parametry tych gałęzi pochodzących od niezależnych dostawców oprogramowania.
    2. Łączna liczba oddziałów
      1. Po wyśledzeniu wszystkich niezależnych dostawców oprogramowania i skojarzonych gałęzi oblicz łączną liczbę gałęzi (Rysunek 5B-5D).
    3. Kolejność oddziałów
      1. Ponieważ prosty znacznik neurytów rejestruje kolejność każdej gałęzi (rysunek 5A), oblicz liczbę gałęzi dla każdej gałęzi. Większość naczyń w zarodkach typu dzikiego powinna być gałęziami pierwszorzędowymi (tj. ISV).
    4. Wskaźnik złożoności żył (VCI)
      1. Ponieważ VCI jest użytecznym parametrem dla złożoności naczyń, który nadaje większą wagę gałęziom wyższego rzędu, oblicz VCI dla każdego zarodka, korzystając ze wzoru na rysunku 5A. Na przykład zarodki, którym wstrzyknięto Tie2MO, mają niższy VCI w porównaniu z kontrolą (Figura 5B i 5C), a zarodki wstrzyknięte mRNA caTie2 mają wyższe VCI (Figura 5D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oś czasu eksperymentów (Rysunki 1 i 2)

Krótko po zapłodnieniu można przeprowadzić celowaną mikroiniekcję w celu modulacji ekspresji genów. Na przykład antysensowny MO, który specyficznie wiąże się z kodonem inicjacyjnym endogennego mRNA Tie2, może zostać wstrzyknięty, hamując translację docelowego mRNA Tie2 przez przeszkodę steryczną. MO może być sprzężony z fluoresceiną w celu łatwego wizualnego badania przesiewowego pomyślnie wst...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół został po raz pierwszy opracowany przez Ali H. Brivanlou i współpracowników w celu zbadania zdarzeń rozwojowych podczas tworzenia naczyń krwionośnych u Xenopus laevis4, ale, jak pokazano w tym manuskrypcie, można go zastosować do innych małych zwierząt. Wstrzyknięcie barwnika do serca jest proste do wykonania, a całą sieć naczyniową można zobrazować pod mikroskopem fluorescencyjnym, a także mikroskopem konfokalnym. Jeśli barwnik zostanie wstrzyknięty do serca ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zainspirowane pracą Levine et al., która opisała tę eksperymentalną metodę i dostarczyła wyczerpującego opisu rozwoju naczyń krwionośnych u Xenopus laevis. Dziękujemy członkom naszego laboratorium za ich wkład. Badanie to było wspierane przez Inicjatywę Badawczą Uniwersytetu Yonsei z 2015 r. (2015-22-0095) oraz Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych Narodowej Fundacji Badawczej (NRF) finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (NRF-2013M3A9D5072551)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm szalka PetriegoSPL10035Rama formy Sylgard
60 mm szalka PetriegoSPL10060Taca do wychowywania zarodków
Szkło borokrzemianoweInstrument SutterB100-50-10Igła do wstrzykiwań
BSASigmaA3059-10GOdczynnik powlekający
CaCl2D.S.P.GROdczynnik0,1x MBS składnik
Szkiełko nakrywkoweSuperiorHSU-0111520Do obrazowania konfokalnego
DiI-AcLDLThermo Fisher ScientificL3484Roztwór do barwienia naczyń
FBSHycloneSH.30919.02Do przechowywania jądra
Oświetlacz światłowodowyWorld Precision InstrumentsZ-LITE-ZLight
FicollSigmaF4375Bufor do wstrzykiwań
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetInstrument SutterP-97Ściągacz igieł iniekcyjnych
KleszczFine Science Tool11255-20Do wylęgu zarodków i
cięcia końcówek igieł
Naczynie ze szklanym dnemSPL100350Do obrazowania konfokalnego
hCGMNS Korea Dogruntowania żab
HEPESSigmaH3375Środek buforujący
InkubatorLab. CompanionILP-02Do hodowli zarodków
KClDAEJUNG6566-4400MBS
składnik L15 mediumGibco11415-114Do przechowywania
jądra L-cysteinaSigma168149-100GOdczynnik do usuwania galaretki
MgSO4SigmaM7506składnik MBS
MikroprobówkaAxygenMCT-175-C-S Doprzechowywania jądra
MS222SigmaE10521Proszek znieczulający
NaClDAEJUNG7647-14-5Składnik MBS
NaOHSigmaS-0899Odczynnik regulujący pH
ParaformaldehydSigmaP6148Utrwalacze
PBSBIOSESANGP2007Bufor do obrazowania
papieru pHSigmaP4536-100EADo potwierdzania pH
WTRYSKIWACZ PICO-LITRInstrumenty WanerPLI-100ADo iniekcji
PinPinservice26002-10Do nacięcia
Uchwyt na pinyScitech Korea26016-12Do nacięcia
Precyzyjny mikroskop lornetkowy stereo zoomŚwiat Przyrządy precyzyjnePZMIIIdo badań przesiewowych
Standardowy mikromanipulator sterowany ręcznie Waner instrumentsW4 64-0056Do mikroiniekcji
SYLGARD 184 ZestawDow Corningdo iniekcji DiI
Pipeta transferowaKorea Ace Scientific Co.Ym. B78-400Do pobierania jaj i
zarodków

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541(2013).
  8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
  9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
  10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293(2009).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
  12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379(2012).
  15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
  16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
  17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus tropicalisBlood Vessel VisualizationDiI AcLDL InjectionFluorescent Dye LabelingVascular Network AnalysisEmbryonic AngiogenesisConfocal MicroscopyVein Complexity IndexGene PerturbationPharmacological Application

Related Articles