Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55653

⸱

11 lipca 2017

 ,  , 
1DFG Cluster of Excellence 'Cells in Motion', (EXC 1003), Institute of Medical Physics and Biophysics, University of Muenster

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Streszczenie

Filopodia to dynamiczne, przypominające palce wypukłości komórkowe związane z migracją i komunikacją między komórkami. Aby lepiej zrozumieć złożone mechanizmy sygnalizacyjne leżące u podstaw inicjacji, wydłużenia i późniejszej stabilizacji lub wycofania filopodiów, kluczowe jest określenie czasoprzestrzennej aktywności białek w tych dynamicznych strukturach. Aby przeanalizować funkcję białek w filopodiach, opracowaliśmy niedawno półautomatyczny algorytm śledzenia, który dostosowuje się do zmian kształtu filopodiów, umożliwiając w ten sposób równoległą analizę dynamiki wypukłości i względnego stężenia białka na całej długości filopodiów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku do zoptymalizowanej obsługi komórek, akwizycji obrazu i analizy oprogramowania. Ponadto udostępniamy instrukcje dotyczące korzystania z opcjonalnych funkcji podczas analizy obrazu i reprezentacji danych, a także wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów ze wszystkimi krytycznymi krokami po drodze. Na koniec zamieszczamy również porównanie opisywanego oprogramowania do analizy obrazu z innymi dostępnymi programami do kwantyfikacji filopodiów. Łącznie przedstawiony protokół stanowi podstawę do dokładnej analizy dynamiki białek w wypukłościach filopodialnych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

Wprowadzenie

Przestrzenno-czasowa kontrola białek regulacyjnych aktyny wiąże się z dynamiką filopodniów 1,2. Śledzenie w czasie rozdzielczo przestrzennego stężenia białek wzdłuż całej długości filopodnium jest zatem kluczowe dla pogłębienia rozumienia mechanizmów leżących u podstaw inicjacji, elongacji, stabilizacji lub kolapsu tych dynamicznych struktur 3,4. W przeciwieństwie do analizy białek w cytosolu, gdzie wiele zmian kształtu komórki zachodzi w większej skali, filopodnia są dynamicznymi mikrostrukturami, które nieustannie ulegają wyboczeniu 5 i zgięciom, co wyklucza analizę z wykorzystaniem prostych metod, takich jak skanowanie liniowe.

Dostępne są różne rozwiązania programowe do śledzenia kształtu filopodii 6,7,8,9Podobnie opracowano oprogramowanie do ratiometrycznego śledzenia dynamiki białek w obrębie ciała komórki 10,11Aby połączyć zautomatyzowane śledzenie kształtu filopodiów z czasowo-przestrzenną analizą białek, opracowaliśmy niedawno oprogramowanie do analizy obrazów oparte na algorytmie otoczki wypukłej (convex-hull) 12Ta nowatorska metoda analizy, obsługiwana poprzez graficzny interfejs użytkownika (GUI), który po raz pierwszy łączy względne stężenie białka wzdłuż długości filopodium z prędkością wzrostu, umożliwiając tym samym dokładny pomiar czasoprzestrzennego rozkładu białek niezależnie od ruchu tych dynamicznych struktur 12.

Koncepcja stojąca za tym oprogramowaniem (kod źródłowy jest ogólnodostępny, patrz poniżej) zakłada, że jeden z wierzchołków otoczki wypukłej będzie pokrywał się z końcówką filopodium (Rycina 1A). Poprzez poszukiwanie w kolejnej klatce najbliższego wierzchołka otoczki wypukłej, można śledzić poruszającą się końcówkę przez cały czas trwania filmu. Po wykryciu końcówki w każdej klatce, jej pozycja służy do wyznaczenia osi poprzez połączenie końcówki z punktem odniesienia u podstawy filopodium (Rycina 1B). Wreszcie, z wykorzystaniem równoodległych punktów węzłowych, których pozycje są określone przez piksel o maksymalnej intensywności znajdujący się w połowie linii prostopadłej do osi, wyznaczany jest szkielet odwzorowujący kształt filopodium. Wykorzystując ten adaptacyjny szkielet, generowany jest kymograf w celu prześledzenia wzrostu filopodium oraz stężeń białek dla maksymalnie trzech kanałów wzdłuż długości filopodium (Rycina 1C).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Zasada działania oprogramowania do analizy obrazu. (A) Algorytm stojący za oprogramowaniem. W kroku 1 użytkownik określa punkt odniesienia (podstawę) oraz wierzchołek (koniec) filopodium. W kroku 2-1 szkielet filopodium jest wyznaczany przy użyciu mediany pikseli o maksymalnej wartości intensywności. W kroku 3 szkielet służy do sporządzenia przestrzennego profilu intensywności białka. W kroku 2-2 oprogramowanie automatycznie śledzi wierzchołek w następnej klatce. Cała procedura jest iterowana. (B) Zrzut ekranu algorytmu z rzeczywistym filopodium, wprowadzający istotne elementy, takie jak otoczka wypukła używana do śledzenia. (C) Przegląd parametrów, które można zmierzyć za pomocą algorytmu. Rysunek zmodyfikowano na podstawie referencji 12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Oprogramowanie do analizy obrazów jest uruchamiane w środowisku Matlab (określanym jako oprogramowanie programistyczne) za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Aby zapewnić maksymalną elastyczność i stabilność dla konkretnych ustawień eksperymentalnych, użytkownik może dostosować szereg parametrów śledzenia (np. dozwolony kąt zgięcia i ruch między klatkami), a także wprowadzić pewne korekty w nagraniach (np. przycinanie, rotację, usuwanie niepożądanych obiektów) (Rysunek 2A i Tabela 1).

GUINrObowiązkoweOpisNazwa (w GUI)
#11aTWczytywanie stosu plików .tiff reprezentującego ciało komórki (z zaznaczonym polem wyboru) lub tworzenie nałożonego ciała komórki z kanałówCellBody
#11bTWczytywanie stosu plików obrazów odpowiadających białku 1Protein 1
#11cTWczytywanie stosu plików obrazów odpowiadających białku 2Protein 2
#11dTWczytywanie stosu plików obrazów odpowiadających białku 3Protein 3
#11eNResetuje wszystkie ustawienia do wczytanych stosów plików obrazówReset
#12aTPasek przewijania służący do określenia klatki początkowej analizy w oknie GUI nr 2NA
#12bTPasek przewijania służący do określenia klatki końcowej analizy w oknie GUI nr 2NA
#12cTPasek przewijania reprezentujący bieżącą klatkęNA
#12dNWartość szarości pikseli, poniżej której wszystkie piksele zostaną ustawione na zeroNA
#12eNWartość szarości pikseli, powyżej której wszystkie piksele zostaną ustawione na wartości maksymalneNA
#12fNUstawienie wartości intensywności pikseli określonych przez <2e> & <2f>Set
#12gNOdtwarzanie filmu z dostosowaną intensywnościąPlay
#12hNPrzycinanie obrazuCrop
#12iNObracanie obrazuRotate
#12jNUsuwanie obszarów w całym stosieDelete regions
#13aTKliknij, aby otworzyć „Okno analizy” (okno GUI nr 2)Tracking Window
#13bTWprowadź rozmiar piksela w mikronachEnter Pixel size
#24TKliknij, aby wygenerować obraz granicy/krawędzi nałożonego ciała komórkiBoundary
#25TKliknij, aby wybrać podstawę i wierzchołek filopodiiReferernce
#26aTWprowadź liczbę segmentów lub węzłówNo of segments
#26bTWprowadź długość skanowania (prostopadle do osi)Scan Width
#26cTWprowadź długość, powyżej której filopodia zaczyna się wyginaćAccurate Meas after
#26dTWprowadź promień okręgu detekcji wierzchołka (tj. obszaru, w którym wierzchołek może zostać zlokalizowany w następnej klatce)Radius of tip detection
#26eTWprowadź maksymalny kąt, pod którym filopodium może wygiąć się od osi pionowejAngle Threshold
#26fNDodawanie punktów referencyjnych dla podstawy i wierzchołka dla tej konkretnej klatkiSelect reference
#26gNWprowadź długość, powyżej której filopodia zaczyna się wyginać dla tej konkretnej klatkiAccurate Meas after
#26hNWprowadź promień okręgu detekcji dla tej konkretnej klatkiRadius of tip detection
#26iNPo wprowadzeniu wszystkich parametrów dla konkretnej klatki kliknij, aby zapisać wartości w pamięci i pliku do dalszych odniesieńAdd
#26jNKliknij, aby usunąć ręcznie ustawione parametry dla tej klatkiDelete
#26kNKliknij, aby usunąć wszystkie parametry zapisane ręcznie za pomocą „panelu funkcji opcjonalnych” dla wszystkich klatekReset
#26lNZaznacz przed śledzeniem, aby zapisać wszystkie wyniki śledzenia w pamięci do późniejszego wykorzystaniaHistory trace
#27TKliknij, aby rozpocząć śledzenieTrack&Analyze
#28aNKliknij, aby rozpocząć śledzenie intensywności kanału białkowegoAnalyze Protein Intensities
#28bNZaznacz, aby śledzić intensywność kanału białkowego wzdłuż długości filopodiiWhole filopodia
#28cNZaznacz, aby śledzić białko referencyjne lub białko AProteinA
#28dNZaznacz, aby śledzić białko BProteinB
#28eNZaznacz, aby śledzić białko CProteinC
#28fNZaznacz, aby śledzić średnią intensywność białka w wierzchołkuLeading tip
#28gNWprowadź długość wierzchołkaTip Length
#28hNWprowadź minimalną odległość od podstawy, powyżej której zaczyna formować się wierzchołekthreshold
#28iNKliknij, aby zapisać wyniki analizy wierzchołka prowadzącego do plikuPush Button
#29aNKliknij, aby zainicjować ratiometryczną analizę białekCompare
#29bNZaznacz, aby porównać białko B w stosunku do Alog10(B/A)
#29cNZaznacz, aby porównać białko C w stosunku do Alog10(C/A)
#29dNZaznacz, aby porównać białko B w stosunku do A w wierzchołkulog10(B/A)
#29eNZaznacz, aby porównać białko C w stosunku do A w wierzchołkulog10(C/A)
#210aNWybierz inną mapę kolorów (domyślna: Jetplot)Color Map
#210bNEdytuj mapę kolorówEdit colormap

Tabela 1: Przegląd wszystkich funkcji dostępnych w oknach interfejsu graficznego użytkownika (GUI) nr 1 i 2.

Po wykonaniu tej operacji program tworzy otoczkę wypukłą i automatycznie śledzi wierzchołek przez cały czas trwania filmu. Parametry wyekstrahowane z filmu, takie jak ratiometryczny kymograf, prędkość wzrostu i długość filopodium, są wyświetlane oraz zapisywane w folderze roboczym jako obrazy i pliki danych. Inne parametry, takie jak czas życia filopodium, szybkość wzrostu i szybkość retrakcji, mogą następnie zostać wyekstrahowane i poddane dalszej analizie na podstawie zapisanych plików danych (Rycina 2B).

figure-introduction-2
Rycina 2: Graficzny interfejs użytkownika oprogramowania do analizy obrazów. (A) Okno GUI nr 1 służy do ładowania i przetwarzania obrazów. Program może wczytać do 3 kanałów białkowych, przy czym 2 kanały są porównywane parami. Okno zawiera funkcje obowiązkowe (niebieskie) oraz opcjonalne (zielone) do wstępnego przetwarzania obrazów przed śledzeniem (B) Okno GUI nr 2 służy do śledzenia filopodium, a także do czasowo-przestrzennej i ratiometrycznej analizy białek. Ponownie funkcje opcjonalne zaznaczono na zielono. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła 12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania próbek oraz obsługi oprogramowania. Rozpoczynamy od szczegółowych instrukcji dotyczących hodowli komórek oraz rejestrowania filmów zoptymalizowanych pod kątem analizy obrazu. Po sekcji poświęconej akwizycji danych następuje szczegółowy opis obsługi oprogramowania do analizy obrazu. W całym protokole wskazujemy krytyczne kroki oraz opcjonalne funkcje, które należy wziąć pod uwagę podczas gromadzenia i przetwarzania danych. Na koniec przeprowadzamy analizę filopodiów z różnych systemów modelowych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, a następnie kończymy porównaniem opisanego oprogramowania z innymi programami dostępnymi do kwantyfikacji filopodiów oraz dyskusją na temat ograniczeń i przyszłych kierunków rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórek

  1. Hodowlę komórek HeLa lub COS prowadzić w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zawierającej 4,5 g/L D-glukozy, didektyd L-alaniny-L-glutaminy, pirogronian, 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 10 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny. Neurony hodować w pożywce bez L-glutaminy, kwasu glutaminowego lub kwasu asparaginowego, uzupełnionej o 0,5 mM didektydu L-alaniny-L-glutaminy, bezsurowicze suplementy neuronalne oraz 10 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny.
  2. Po osiągnięciu 40% konfluencji przeprowadzić transfekcję komórek wybranymi konstruktami, stosując odczynnik do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Transfekowane komórki inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 15-18 h.
  3. Aby zminimalizować zmiany pH i osmolarności (wynikające z parowania) podczas akwizycji obrazów, wypełnić komory hodowli komórkowej (przed obrazowaniem) w 90% uprzednio ogrzaną do 37 °C pożywką zawierającą 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). W celu uszczelnienia pokrywki nanieść cienką warstwę smaru próżniowego na wewnętrzną stronę pokrywki i delikatnie docisnąć ją do komory hodowlanej z transfekowanymi komórkami.

2. Akwizycja obrazów

UWAGA: Długość filopodiów waha się od 2-10 µm 13. Filopodia rosną ze średnią prędkością 0,05-0,1 µm/s 13,14.

  1. Należy pozyskać obrazy za pomocą mikroskopu z obiektywem 60X lub 100X bez binningu pikseli (w tym przypadku użyto konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym). Aby śledzić dynamikę filopodni, należy zastosować częstotliwość akwizycji powyżej 1 Hertza (Hz). W celu zminimalizowania artefaktów poza ogniskową, należy obrazować filopodnia znajdujące się blisko błony podstawnej (tj. powierzchni podłoża).
  2. Aby zapewnić płynność śledzenia, należy dostosować czas ekspozycji kamery oraz intensywność lasera w taki sposób, aby stosunek sygnału do szumu (SNR) był większy niż 4. Należy unikać nasycenia poszczególnych kanałów (tj. wartości pikseli wynoszących 255 dla obrazów 8-bitowych i 65 535 dla obrazów 16-bitowych), ponieważ uniemożliwi to późniejszą analizę obrazu.
  3. Aby uniknąć przenikania sygnału (bleed-through), należy używać wyłącznie znaczników fluorescencyjnych kompatybilnych z liniami laserowymi i filtrami mikroskopu (szczegóły znajdują się w referencji 15).

3. Wstępne przetwarzanie obrazów

UWAGA: Do wstępnego przetwarzania obrazów należy użyć programu ImageJ lub innego dostępnego oprogramowania 16,17.

  1. Jeśli próbka się porusza, przed przystąpieniem do analizy należy skorygować dryf boczny przy użyciu dostępnego oprogramowania (np. https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Należy wykluczyć filmy z dryfem osiowym (tj. ruchem w kierunku z).
  2. Skorygować tło (tj. wartości szarości obszarów poza komórką), blaknięcie (tj. ciągłą utratę intensywności fluorescencji z powodu uszkodzenia białek fluorescencyjnych) oraz ewentualny prześwit (tj. sygnał z jednej sondy fluorescencyjnej w obu kanałach) przy użyciu dostępnego oprogramowania (np. http://imagej.net/Category:Plugins oraz 16,17).
    Uwaga: Intensywności fluorescencji poszczególnych kanałów nie są zmieniane przez oprogramowanie.
  3. Aby umożliwić późniejszą analizę obrazu, należy zapisać filmy odpowiadające konkretnym kanałom białek w skali szarości w formacie plików stosu '.tiff' w folderze roboczym.
    UWAGA: Wymiary (tj. rozmiar, długość) stosów muszą być takie same dla wszystkich kanałów.

4. Analiza obrazu – Krok 1: Wczytywanie obrazów

UWAGA: Opisane tutaj oprogramowanie zostało napisane w środowisku Matlab (określanym jako oprogramowanie programistyczne) i będzie działać wyłącznie z tym programem.

  1. Pobierz z następującej strony skompresowany folder zawierający wszystkie pliki niezbędne do analizy obrazu: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/software/. Rozpakuj i skopiuj pliki do folderu roboczego.
  2. Po instalacji należy uruchomić oprogramowanie programistyczne i otworzyć plik „filopodiaAnalysisM3.fig”. Wyświetli się okno GUI nr 1, zgodnie z przedstawionym na Rycina 2A.
  3. Za pomocą przycisków w oknie GUI nr 1 załaduj zapisane stosy plików „.tiff” odpowiadające konkretnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania <1b> dla białka A, <1c> dla białka B, <1d> dla białka C. Patrz Rysunek 2 i Tabela 1 po szczegóły.
    UWAGA: Białko A przedstawione w oknie interfejsu graficznego (GUI) nr 1 służy jako kanał referencyjny dla końcowej analizy ratiometrycznej.
  4. Kliknij, aby utworzyć obraz nałożony komórki z kanałami białkowymi <1a>.
  5. Kliknij w <2a> aby przypisać pierwszą klatkę i <2b> dla ostatniej klatki wykorzystanej do analizy.
  6. Opcjonalnie można wyciąć obszar zainteresowania (ROI) zawierający wybrany filopod za pomocą przycisku <2 h>obróć obraz za pomocą przycisku <2i>lub usuń niepożądane obszary za pomocą narzędzia do rysowania ręcznego <2j>.
    UWAGA: W celu usprawnienia analizy obrazu zaleca się wyizolowanie ROI (obszaru zainteresowania)t.j. (kadrowanie, obracanie, usuwanie) wraz z pozostałymi krokami wstępnego przetwarzania (odejmowanie tła, korekcja blaknięcia itp.) przy użyciu programu ImageJ.
  7. Przesuń suwak <2c> dla każdej klatki w celu kontroli jakości oraz sprawdzenia, czy filopodium pozostaje wyraźnie widoczne przez cały czas trwania filmu.

5. Analiza obrazu – Krok 2: Generowanie śladu

  1. Kliknij przycisk <3a> w oknie GUI nr 1, aby otworzyć okno GUI nr 2 (patrz Rycina 2B).
  2. Kliknij przycisk <4> w oknie GUI nr 2, aby wygenerować maskę nałożonego ciała komórki (wygenerowaną w oknie GUI nr 1 po kliknięciu <1a>). Program generuje również obrys maski, w którym zaimplementowano otoczkę wypukłą (convex hull) w celu uzyskania punktów wierzchołkowych.
  3. Kliknij przycisk <5>, wówczas pojawi się kursor. Użyj kursora, aby zaznaczyć podstawę (od której mierzona jest odległość do czubka filopodia), a następnie czubek filopodia w klatce, w której pojawia się on po raz pierwszy. Aby to zrobić, przesuń suwak w oknie nr 2.
    UWAGA: Aby zminimalizować błędy w wynikach danych, umieść punkt podstawy pionowo pod czubkiem filopodia wzdłuż osi. Umieszczenie punktu podstawy w innych miejscach (np. z przesunięciem bocznym) może wprowadzić błąd kierunkowy w wartościach fluorescencji w obrębie ciała komórki.
  4. Wybierz długość progową (powyżej której filopodia ulegną zgięciu), używając <6c>.
    Uwaga: Długość ta jest definiowana jako odległość między punktem podstawy (wybranym za pomocą <5>) a obrysem ciała komórki (t.j. obszarem, z którego filopodia zaczynają rosnąć). Odległość mierzona jest w pikselach.
  5. Określ liczbę segmentów użytych do przybliżenia kształtu filopodia w polu <6a>.
    UWAGA: Minimalna liczba segmentów zależy od maksymalnej długości osiągniętej przez filopodium, ale także od tego, jak filopodium się zgina. Nie wybieraj liczby segmentów większej niż liczba pikseli między podstawą a czubkiem (t.j. długość progowa). Wybranie większej liczby segmentów niż długość progowa określona w kroku 5.4. (t.j. liczba pikseli między podstawą a czubkiem) spowoduje przeszacowanie długości filopodia.
  6. Określ szerokość skanowania, która działa jako poziomy skaner do rozmieszczania węzłów, w polu <6b>.
    UWAGA: Węzły te są wykorzystywane przez program do dopasowania linii łączącej podstawę z czubkiem do korpusu filopodia (t.j. do stworzenia szkieletu). Jako wartość początkową wprowadź wartość w pikselach równą długości maksymalnej pomnożonej przez współczynnik figure-protocol-1.
  7. Określ promień skanowania (w pikselach) w polu <6d>. Użyj wartości, która jest o około 50% większa niż zaobserwowane przemieszczenie czubka między klatkami.
    UWAGA: Użycie bardzo dużego promienia skanowania może spowodować uchwycenie niepożądanych punktów otoczki wypukłej w klatkach, w których nie występuje rzeczywisty czubek filopodia (np. ruch poza płaszczyzną lub niski stosunek sygnału do szumu SNR).
  8. Określ kąt zgięcia w polu <6e>.
    UWAGA: Próg kąta jest określany przez maksymalny kąt, pod którym filopodium zgina się podczas całej analizy. Określenie progu kąta pomaga oprogramowaniu wykluczyć śledzenie niepożądanych struktur rosnących z boku filopodia, gdy filopodium zgina się w stronę ciała komórki. Program działa niezawodnie dla filopodiów z kątami nachylenia mniejszymi niż 45 stopni od osi pionowej.
  9. Aby rozpocząć śledzenie, kliknij przycisk <Track&Analyze> w oknie GUI nr 2. Zaznacz pole 'History trace' w oknie GUI nr 2, aby zapisać cały protokół śledzenia do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Po zakończeniu procedury śledzenia długość filopodia w każdej klatce jest zapisywana w arkuszu o nazwie 'length_vel' w pliku 'dynamics.xlsx' do późniejszego wykorzystania. Podobnie wszystkie pozostałe parametry śledzenia są przechowywane w arkuszu o nazwie 'parameters' w pliku 'dynamics.xlsx'.
  10. Opcjonalnie, jeśli filopodia nie zostaną automatycznie wykryte we wszystkich klatkach, wykonaj następujące kroki, aby skorygować to ręcznie.
    1. Przejdź do odpowiedniej klatki za pomocą suwaka w oknie nr 2 i ręcznie zaznacz czubek filopodia.
      Uwaga: Klatki, w których nie wykryto punktów otoczki wypukłej, będą reprezentowane przez niebieski obszar w oknie śledzenia w oknie GUI nr 2. Przed uruchomieniem programu śledzenia konieczne jest zaznaczenie przycisku 'History trace', aby uzyskać dostęp do współrzędnych węzłów w danej klatce.
    2. Wybierz punkty referencyjne (najpierw podstawę, potem czubek) za pomocą <6f> w oknie GUI nr 2. Określ pozostałe parametry, takie jak 'scan length', 'Accurate Measurement after' oraz 'maximum bending angle' dla tej klatki, zgodnie z opisem w krokach 5.4-5.8.
    3. Kliknij przycisk <6i>, aby zapisać nowe parametry (specyficzne dla tej jednej klatki). Kroki te należy powtórzyć dla wszystkich klatek wskazanych przez niebieski obszar.
    4. Po zakończeniu ponownie zainicjuj procedurę śledzenia za pomocą <7>.
      UWAGA: Korekcja ta może być również zastosowana, jeśli program nagle przełączy się z jednego filopodia na inne w obrębie filmu. Alternatywnie można rozważyć przycięcie filmów zawierających wiele filopodiów.

6. Analiza obrazu – Krok 3: Przestrzennie-czasowa analiza białek

  1. Do analizy czasowo-przestrzennej wybierz pole oznaczone jako <8b>, a następnie interesujący kanał białkowy (<8c> i/lub <8d> i/lub <8e>).
    Uwaga: Przed przeprowadzeniem analizy ratiometrycznej (<9a>, <9b> i/lub <9c>) konieczne jest wybranie Białka A, ponieważ służy ono jako referencja.
  2. Kliknij <8a>, aby rozpocząć śledzenie białka wzdłuż długości filopodii przy użyciu śladu wygenerowanego w kroku 5.9.

7. Analiza obrazu – Krok 4: Ratiometryczna analiza białek

  1. Zaznacz pole <9b> lub <9c> i kliknij przycisk <9a>, aby uzyskać czasowo-przestrzenny wykres ratiometryczny.
    UWAGA: Aby uniknąć błędnej reprezentacji względnego stężenia białka, obraz ratiometryczny nie jest przedstawiany jako X/Y, lecz jako log(X/Y). Do późniejszego wykorzystania wykres ratiometryczny jest eksportowany do plików w formacie '.png' i '.fig', a surowe dane z wykresu są zapisywane w pliku 'dynamics.xlsx'.

8. Analiza obrazu – Krok 5: Analiza końców filopodiów

  1. Zaznacz pole wyboru <8f> i określ długość końcówki oraz długość progową od podstawy, korzystając z <8g> i <8h>. Kliknij <przycisk>>, aby zapisać dane w pliku 'dynamics.xlsx'. Kliknij <Analyze Protein Intensities>>, aby wygenerować wykres intensywności białek w końcówce filopodia i zapisać go do analizy ratiometrycznej.
    UWAGA: Długość końcówki określa liczbę pikseli na końcówce wykorzystywanych do analizy. Oprogramowanie zwróci średnią wartość intensywności pikseli na końcówce dla każdej klatki. Długość progowa określa minimalną odległość od podstawy do końcówki, powyżej której filopodium (końcówka filopodialna) zaczyna rosnąć (i w którym momencie program rozpoczyna śledzenie wartości intensywności końcówki). Zatem długość końcówki musi być mniejsza niż długość progowa.
  2. Wybierz analizowany stosunek, korzystając z <9d> lub <9e>.
  3. Kliknij przycisk porównania <9a>>, aby wygenerować dane ratiometryczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując komórki COS przetransfekowane markerem aktyny filamentowej (f-tractin18, kolor czerwony) oraz referencją cytozolową (kolor zielony), zaobserwowano bogate w aktynę wypustki filopodialne (Rysunek 3A, górny panel). Serie czasowe wykazały, że filopodia szybko się wysuwają i wciągają (Rysunek 3A, środkowy panel). Następnie, przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, prześledzono pojedyncze filo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół śledzenia dynamiki wzrostu filopodialnego i analizy względnych stężeń białek w tych dynamicznych strukturach za pomocą algorytmu wypukłego kadłuba. Za pomocą oprogramowania można porównać parami do 3 kanałów w jednym przebiegu, przy czym względne stężenia dwóch kanałów (tj. białek) są określane w całym cyklu wysuwania/wycofywania i przechowywane jako pliki obrazów i danych w oddzielnych folderach. Oprócz rutynowych operacji, oprogramowanie zapewnia również szereg ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy potwierdzają finansowanie z DFG (EXC-1003 dla MG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMLife Technologies31966-021
10% Płodowa surowica bydlęcaBiochrom AGL11-044
Lipofektamina 2000Life Technologies11668-027
1% penicylina/streptomycynaBiochrom AG12212
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049
B27Life Technologies17504-044
HEPES (roztwór podstawowy 1M)Life Technologies15630
Citrine-N1Addgene54593
LabtechThermo155411
Glutamax-IThermo35050-061
Instytut HeliLeibniz DSMZACC-57
COS 7Leibniz Instytut DSMZACC-60
Ogniwa 3T3Instytut Leibniza DSMZACC-59
MikroskopNicon Eclipse
KameraAndorDU888 Ultra
jednostka konfokalnaYokagawaCSU-X1
PirogronianGibco31966-021

Bibliografia

  1. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
  2. Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses. Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).
  3. Galic, M., et al. Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons. Elife. 3, e03116(2014).
  4. Hotulainen, P., et al. Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis. J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).
  5. Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Helical buckling of actin inside filopodia generates traction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).
  6. Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization. BMC Syst Biol. 4, 33(2010).
  8. Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models. Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).
  9. Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).
  10. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
  11. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).
  12. Saha, T., et al. Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking. Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).
  13. Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. A quantitative study of growth cone filopodial extension. J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).
  14. Mogilner, A., Rubinstein, B. The physics of filopodial protrusion. Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).
  15. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  16. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  17. Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells. PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).
  18. Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus. J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).
  19. Korobova, F., Svitkina, T. Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis. Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).
  20. Cheadle, L., Biederer, T. The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization. J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).
  21. Tarnok, K., et al. A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility. Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).
  22. Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons. J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).
  23. Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images. Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).
  24. Costantino, S., et al. Semi-automated quantification of filopodial dynamics. J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).
  25. Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images. BMC Syst Biol. 7, 66(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ledzenie filopodi woprogramowanie do analizy obrazudynamika wypustekanaliza czasowo przestrzennalokalizacja bia ekmigracja kom rekfilamenty aktynoweratiometryczna analiza bia ek
Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.