Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Summary

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Abstract

Filopodia to dynamiczne, przypominające palce wypukłości komórkowe związane z migracją i komunikacją między komórkami. Aby lepiej zrozumieć złożone mechanizmy sygnalizacyjne leżące u podstaw inicjacji, wydłużenia i późniejszej stabilizacji lub wycofania filopodiów, kluczowe jest określenie czasoprzestrzennej aktywności białek w tych dynamicznych strukturach. Aby przeanalizować funkcję białek w filopodiach, opracowaliśmy niedawno półautomatyczny algorytm śledzenia, który dostosowuje się do zmian kształtu filopodiów, umożliwiając w ten sposób równoległą analizę dynamiki wypukłości i względnego stężenia białka na całej długości filopodiów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku do zoptymalizowanej obsługi komórek, akwizycji obrazu i analizy oprogramowania. Ponadto udostępniamy instrukcje dotyczące korzystania z opcjonalnych funkcji podczas analizy obrazu i reprezentacji danych, a także wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów ze wszystkimi krytycznymi krokami po drodze. Na koniec zamieszczamy również porównanie opisywanego oprogramowania do analizy obrazu z innymi dostępnymi programami do kwantyfikacji filopodiów. Łącznie przedstawiony protokół stanowi podstawę do dokładnej analizy dynamiki białek w wypukłościach filopodialnych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

Introduction

Czasoprzestrzenna kontrola białek regulatorowych aktyny jest związana z dynamiką filopodium ^1,2. Śledzenie przestrzennie rozdzielonego stężenia białka na całej długości filopodium w czasie ma zatem kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw inicjacji, wydłużenia, stabilizacji lub zapadania się tych dynamicznych struktur ^3,4. W przeciwieństwie do analizy białek w cytozolu, gdzie wiele zmian kształtu komórki zachodzi na większą skalę, filopodia są dynamicznymi mikrostrukturami, które stale wyginają się ⁵ i wyginają się, uniemożliwiając w ten sposób analizę przy użyciu prostego podejścia, takiego jak skanowanie linii.

Dostępne są różne rozwiązania programowe do śledzenia kształtu filopodialnego ^6,7,8^,9. Podobnie, opracowano oprogramowanie do ratiometrycznego śledzenia dynamiki białek w ciele komórki: ^10,11. Aby połączyć automatyczne śledzenie kształtu filopodiów i czasoprzestrzenną analizę białek, opracowaliśmy niedawno oprogramowanie do analizy obrazu oparte na algorytmie wypukłego kadłuba ¹². Ta nowatorska metoda analizy, która jest obsługiwana za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (GUI), po raz pierwszy łączy względne stężenie białka wzdłuż długości filopodium i prędkość wzrostu, umożliwiając w ten sposób dokładny pomiar czasoprzestrzennego rozkładu białek niezależnie od ruchu tych dynamicznych struktur ¹².

Idea oprogramowania (kod źródłowy jest dostępny za darmo, patrz poniżej) polega na tym, że jeden z wierzchołków wypukłej powłoki pokrywa się z czubkiem filopodium (Rysunek 1A). Szukając w kolejnej klatce najbliższego wierzchołka wypukłego kadłuba, ruchoma końcówka może być śledzona przez cały film. Po wykryciu końcówki w każdej klatce, jej położenie jest wykorzystywane do narysowania osi poprzez połączenie końcówki z punktem odniesienia u podstawy filopodium (Rysunek 1B). Wreszcie, używając równoodległych punktów węzłowych, których położenie jest określane przez medianę piksela z maksymalną intensywnością wzdłuż linii prostopadłej do osi, stosuje się do wyznaczenia szkieletu, który podąża za kształtem filopodium. Wykorzystując ten adaptacyjny szkielet, generowany jest kimograf do śledzenia wzrostu filopodialnego i stężenia białka dla maksymalnie trzech kanałów wzdłuż długości filopodialnej (Rysunek 1C).

Rysunek 1: Zasada działania oprogramowania do analizy obrazu. (A) Algorytm stojący za oprogramowaniem. W kroku 1 użytkownik określa odniesienie (podstawę) i wierzchołek (wierzchołek) filopodium. W kroku 2-1 szkielet filopodium uzyskuje się za pomocą mediany piksela o maksymalnej wartości intensywności. W kroku 3 szkielet jest używany do przestrzennego profilu intensywności białka. W kroku 2-2 oprogramowanie automatycznie śledzi końcówkę w kolejnej klatce. Cała procedura jest powtarzana. (B) Migawka algorytmu z prawdziwym filopodium wprowadzającym ważne elementy, takie jak wypukła powłoka, która jest używana do śledzenia. (C) Przegląd parametrów, które można zmierzyć za pomocą algorytmu. Ten rysunek został zmodyfikowany z odwołania ¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oprogramowanie do analizy obrazów jest obsługiwane w Matlabie (określane jako oprogramowanie do programowania) za pomocą graficznego interfejsu użytkownika. Aby zmaksymalizować elastyczność i solidność dla konkretnego ustawienia eksperymentalnego, użytkownik może dostosować szereg parametrów śledzenia (np. dozwolony kąt gięcia i ruch międzyklatkowy), a także wprowadzić pewne poprawki do filmów (np. kadrowanie, obracanie, usuwanie niechcianych obiektów) (Rysunek 2A i Tabela 1)".

. .

interfejs graficzny	Nie.	obowiązkowy	Opis					Nazwa (w graficznym interfejsie użytkownika)
Numer katalogowy #1	ust. 1a	Y	Wczytywanie pliku z .tiff w stosie reprezentującego ciało komórki (z zaznaczonym polem) lub tworzenie nałożonej treści komórki z kanałów					Ciało komórki
Numer katalogowy #1	1b	Y	Wczytywanie pliku z obrazem w stosie odpowiadającego białku 1					Białko 1
Numer katalogowy #1	1c	Y	Wczytywanie pliku z obrazem stosu odpowiadającego białku 2					Białko 2
Numer katalogowy #1	1d	Y	Wczytywanie pliku z obrazem stosu odpowiadającego białku 3					Białko 3
Numer katalogowy #1	1e	N	Resetuje wszystko do wstępnie załadowanych plików graficznych w stosie					resetować
Numer katalogowy #1	2a	Y	Pasek przewijania, aby określić początkową ramkę do analizy w oknie GUI #2					nie
Numer katalogowy #1	2b	Y	Pasek przewijania, aby określić końcową klatkę do analizy w oknie GUI #2					nie
Numer katalogowy #1	2c	Y	Pasek przewijania reprezentujący bieżącą klatkę					nie
Numer katalogowy #1	2d	N	Szara wartość pikseli, poniżej której wszystkie piksele zostaną ustawione na zero					nie
Numer katalogowy #1	2e	N	Szara wartość pikseli, powyżej której wszystkie piksele zostaną ustawione na maksymalne wartości					nie
Numer katalogowy #1	2f	N	Ustaw wartości intensywności pikseli określone przez <2e> & <2f>					zbiór
Numer katalogowy #1	2 gramów	N	Odtwórz film o dostosowanej intensywności					grać
Numer katalogowy #1	2h	N	Przytnij obraz					wole
Numer katalogowy #1	2i	N	Obróć obraz					obracać
Numer katalogowy #1	2j	N	Usuń regiony z całego stosu					Usuwanie regionów
Numer katalogowy #1	3a	Y	Kliknij aby otworzyć 'Okno Analizy' (okno GUI #2)					Okno śledzenia
Numer katalogowy #1	3b	Y	Wprowadź rozmiar piksela w mikronach					Wprowadź rozmiar w pikselach
#2	4	Y	Kliknij, aby wygenerować obraz granicy/krawędzi nałożonej bryły komórki					granica
#2	5	Y	Kliknij, aby wybrać podstawę i czubek filopodiów					Referencje
#2	6a	Y	Wprowadź liczbę segmentów lub węzłów					Liczba segmentów
#2	6b	Y	Wprowadź długość skanowania (prostopadle do osi)					Szerokość skanowania
#2	6c	Y	Wprowadź długość, powyżej której filopodia zaczynają się zginać					Dokładne pomiary po
#2	6d	Y	Wprowadź promień okręgu wykrywania końcówki (tj. obszar, w którym wierzchołek może być zlokalizowany w następnej klatce)					Promień wykrywania końcówki
#2	6e	Y	Wprowadź maksymalny kąt, pod jakim filopodium może wygiąć się od osi pionowej					Próg kątowy
#2	6f	N	Dodaj punkty odniesienia dla podstawy i końcówki dla tej konkretnej ramki					Wybierz odniesienie
#2	6gr	N	Wprowadź długość, powyżej której filopodia zaczynają się zginać dla tej konkretnej klatki					Dokładne pomiary po
#2	6 godz.	N	Wprowadź promień okręgu wykrywania dla tej konkretnej ramki					Promień wykrywania końcówki
#2	6i	N	Po wprowadzeniu wszystkich parametrów dla konkretnej ramki kliknij, aby zapisać wartości w pamięci i pliku do dalszego wykorzystania					dodawać
#2	6j	N	Kliknij, aby usunąć ręcznie ustawione parametry dla tej ramki					usunąć
#2	6 tys.	N	Kliknij, aby usunąć wszystkie parametry przechowywane ręcznie za pomocą panelu 'opcjonalne funkcje' dla wszystkich ramek					resetować
#2	6l	N	Zamelduj się przed śledzeniem, aby zapisać wszystkie wyniki śledzenia w pamięci do wykorzystania w przyszłości					Ślad historii
#2	7	Y	Kliknij, aby rozpocząć śledzenie					Śledzenie i analizowanie
#2	8a	N	Kliknij, aby rozpocząć śledzenie intensywności kanału białkowego					Analizuj intensywność białka
#2	8b	N	Sprawdź, aby śledzić intensywność kanału białkowego wzdłuż długości filopodialnej.					Całe filopodia
#2	8c	N	Zamelduj się, aby śledzić białko referencyjne lub białko A					Białko A
#2	8d	N	Zamelduj się, aby śledzić białko B					BiałkoB
#2	art. 8e	N	Zamelduj się, aby śledzić białko C					BiałkoC
#2	8f	N	Zamelduj się, aby śledzić średnią intensywność białka w końcówce					Wskazówka wiodąca
#2	8gr	N	Wprowadź długość końcówki					Długość końcówki
#2	8 godz.	N	Wprowadź minimalną odległość od podstawy, powyżej której końcówka zaczyna się formować					próg
#2	8i	N	Kliknij, aby zapisać wyniki analizy końcówki wiodącej do pliku					Przycisk
#2	9a	N	Kliknij, aby rozpocząć ratiometryczną analizę białek					porównywać
#2	9b	N	Zamelduj się, aby porównać białko B w odniesieniu do A					log10(B/A)
#2	9c	N	Zamelduj się, aby porównać białko C w odniesieniu do A					log10(C/A)
#2	9d	N	Zamelduj się, aby porównać białko B w odniesieniu do A na końcówce					log10(B/A)
#2	9e	N	Zamelduj się, aby porównać białko C w odniesieniu do A na końcówce					log10(C/A)
#2	art. 10a	N	Wybierz inną mapę kolorów (domyślnie: Jetplot)					Mapa kolorów
#2	10 mld	N	Edytuj mapę kolorów					Edycja mapy kolorów

Tabela 1: Przegląd wszystkich funkcji dostępnych w GUI Windows #1 i #2.

Gdy to zostanie wykonane, program tworzy wypukłą powłokę i automatycznie śledzi końcówkę przez cały film. Parametry wyodrębnione z filmu, takie jak kimograf ratiometryczny, prędkość wzrostu i długość filopodiów, są wyświetlane i przechowywane w folderze roboczym jako obrazy i pliki danych. Inne parametry, takie jak czas życia filopodiów, szybkość wzrostu i szybkość retrakcji, można następnie wyodrębnić i dalej analizować z przechowywanych plików danych ( Rysunek 2B).

Rysunek 2: Graficzny interfejs użytkownika do korzystania z oprogramowania do analizy obrazu. (A) Okno GUI #1 służy do ładowania i przetwarzania obrazów. Program może załadować do 3 kanałów białkowych, przy czym 2 kanały są porównywane parami. Okno jest wyposażone w obowiązkowe (niebieskie) i opcjonalne funkcje (zielone) do wstępnego przetwarzania obrazów przed śledzeniem (B) Okno GUI #2 służy do śledzenia filopodium, a także do czasoprzestrzennej i ratiometrycznej analizy białek. Również w tym przypadku funkcje opcjonalne są zaznaczone na zielono. Ten rysunek został zmodyfikowany z odwołania ¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przygotowania próbek i obsługi oprogramowania. Zaczynamy od szczegółowych instrukcji dotyczących hodowli komórek i pozyskiwania filmów zoptymalizowanych pod kątem analizy obrazu. Po tej części dotyczącej pozyskiwania danych znajduje się szczegółowy opis obsługi oprogramowania do analizy obrazu. W całym protokole wprowadzamy krytyczne kroki i opcjonalne funkcje, które należy wziąć pod uwagę podczas gromadzenia i przetwarzania danych. Na koniec analizujemy filopodia z różnych systemów modelowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, a na koniec porównujemy opisane oprogramowanie do analizy obrazu z innymi programami dostępnymi do kwantyfikacji filopodialnej oraz omawiamy ograniczenia i przyszły kierunek.

Protocol

1. Hodowla komórkowa

1. Hodowla komórek HeLa lub COS w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 4,5 g/l D-glukozy, dipeptyd L-alaniny-L-glutaminy, pirogronian, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 10 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny. Neurony hodowlane w pożywkach hodowlanych bez L-glutaminy, kwasu glutaminowego lub kwasu asparaginowego, uzupełnione 0,5 mM dipeptydu L-alaniny-L-glutaminy, suplementów neuronalnych bez surowicy i 10 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny.
2. Po osiągnięciu 40% konfluencji należy przetransfekować komórki z wybranymi konstruktami za pomocą odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać transfekowane komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 15-18 godzin.
3. W celu zmniejszenia zmian pH i osmolarności (spowodowanych parowaniem) podczas akwizycji obrazu, należy napełnić komory hodowli komórkowych (przed obrazowaniem) do 90 % wstępnie podgrzaną pożywką o temperaturze 37 °C zawierającą 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). Aby uszczelnić pokrywkę, nałóż cienką warstwę tłuszczu próżniowego na wewnętrzną stronę pokrywki i delikatnie dociśnij ją do komory hodowlanej zawierającej transfekowane komórki.

2. Akwizycja obrazu

UWAGA: Długość filopodiów waha się od 2 do 10 μm ¹³. Filopodia rosną ze średnią prędkością 0,05-0,1 μm/s ^13,14.

1. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu z obiektywem 60X lub 100X i bez łączenia pikseli (w tym przypadku mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem). Użyj szybkości akwizycji większej niż 1 Hz do śledzenia dynamiki filopodialnej. Aby zminimalizować artefakty nieostre, należy obrazować filopodia blisko błony podstawnej (tj. powierzchni podłoża).
2. Aby zapewnić płynne śledzenie, dostosuj czas ekspozycji kamery i intensywność lasera tak, aby stosunek sygnału do szumu (SNR) był większy niż 4. Należy unikać nasycenia poszczególnych kanałów (np. wartości pikseli 255 dla obrazów 8-bitowych i 65 535 dla obrazów 16-bitowych), ponieważ uniemożliwi to późniejszą analizę obrazu.
3. Aby uniknąć przesączania, należy używać wyłącznie znaczników fluorescencyjnych kompatybilnych z liniami laserowymi i filtrami mikroskopu (szczegółowe informacje można znaleźć w odnośniku ¹⁵).

3. Wstępne przetwarzanie obrazu

UWAGA: Użyj ImageJ lub innego dostępnego oprogramowania do wstępnego przetwarzania obrazów ^16,17.

1. Jeżeli próbka jest w ruchu, przed analizą należy skorygować dryft poprzeczny za pomocą dostępnego oprogramowania (np. https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Wyklucz filmy z dryftem osiowym (tj. ruchem w kierunku z).
2. Prawidłowe tło (tj. szare wartości obszarów na zewnątrz komórki), wybielanie (tj. ciągła utrata intensywności fluorescencji z powodu uszkodzenia białek fluorescencyjnych) i ewentualna dolina krwawienia (tj. sygnał z jednej sondy fluorescencyjnej w obu kanałach) za pomocą dostępnego oprogramowania (np. http://imagej.net/Category:Plugins i ^16,17).
   Uwaga: Intensywność fluorescencji poszczególnych kanałów nie jest zmieniana przez oprogramowanie.
3. Aby zapewnić późniejszą analizę obrazu, zapisz filmy odpowiadające poszczególnym kanałom białkowym w skali szarości jako ".tiff" format pliku stosowego w folderze roboczym.
   UWAGA: Wymiary (tj. rozmiar, długość) stosów muszą być takie same dla wszystkich kanałów.

4. Analiza obrazu – Krok 1: Załaduj obrazy

UWAGA: Opisane tutaj oprogramowanie zostało napisane w Matlabie (określane jako oprogramowanie do programowania) i będzie działać tylko z tym programem.

1. Pobierz spakowany folder zawierający wszystkie pliki wymagane do analizy obrazu z następującej witryny: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/software/. Rozpakuj i skopiuj pliki do folderu roboczego.
2. Po zainstalowaniu otwórz oprogramowanie do programowania i uruchom plik 'filopodiaAnalysisM3.fig'. Otworzy się okno GUI #1, jak pokazano na Rysunek 2A.
3. Załaduj zapisane pliki ".tiff" odpowiadające konkretnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania w oknie GUI #1 za pomocą przycisków <1b> dla białka A, <1c> dla białka B, <1d> dla białka C. Zobacz Rysunek 2 i Tabela 1, aby uzyskać szczegółowe informacje.
   UWAGA: Białko A pokazane w oknie GUI #1 działa jako kanał referencyjny dla końcowej analizy ratiometrycznej.
4. Utwórz nałożony obraz komórki z kanałów białkowych, klikając <1a>.
5. Kliknij <2a> aby przypisać pierwszą klatkę i <2b> aby przypisać ostatnią klatkę używaną do analizy.
6. Opcjonalnie przytnij obszar zainteresowania (ROI) zawierający filopodium za pomocą przycisku <2h>, obróć obraz za pomocą przycisku <2i> lub usuń niechciane obszary za pomocą narzędzia do rysowania odręcznego <2j>.
   UWAGA: Aby usprawnić analizę obrazu, zaleca się odizolowanie ROI (tj. przycinanie, obracanie, usuwanie) wraz z innymi etapami przetwarzania wstępnego (odejmowanie tła, korekty wybielania itp.) za pomocą ImageJ.
7. Przesuń suwak <2c> dla każdej klatki, aby sprawdzić jakość i sprawdzić, czy filopodium pozostaje dobrze widoczne przez cały film.

5. Analiza obrazu – Krok 2: Generuj ślad

1. Kliknij na przycisk <3a> w oknie GUI #1 aby otworzyć GUI Window #2 (patrz Rysunek 2B).
2. Kliknij na przycisk <4> w oknie GUI #2 aby wygenerować maskę nałożonej bryły komórki (wygenerowaną w oknie GUI #1 po kliknięciu <1a>). Program generuje również granicę maski, w której zaimplementowana jest wypukła powłoka w celu uzyskania punktów wierzchołkowych.
3. Kliknij przycisk <5> pojawi się kursor. Użyj kursora, aby wybrać podstawę (od której mierzona jest odległość końcówki filopodiów), a następnie końcówkę filopodiów w ramce, w której pojawia się po raz pierwszy. Aby to zrobić, przesuń suwak w oknie #2).
   UWAGA: Aby zminimalizować błędy w wyprowadzaniu danych, umieść punkt bazowy pionowo poniżej końcówki filopodialnej wzdłuż osi. Umieszczenie punktu bazowego w innych miejscach (np. przesuniętych na boki) może wprowadzić odchylenie kierunkowe wartości fluorescencji w ciele komórki.
4. Wybierz długość progu (powyżej którego filopodia się ugną) za pomocą <6c>.
   Uwaga: Długość ta jest definiowana jako odległość między punktem bazowym (wybranym za pomocą <5>) a granicą ciała komórki (tj. obszarem, z którego filopodia zaczynają rosnąć). Odległość jest mierzona w pikselach.
5. W polu <6a>.
   podać liczbę segmentów użytych do przybliżonego określenia kształtu filopodiów. UWAGA: Minimalna liczba segmentów zależy od maksymalnej długości osiąganej przez filopodium, ale także od tego, jak filopodium się wygina. Nie wybieraj liczby segmentów większej niż liczba pikseli między podstawą a końcówką (tj. długość progu). Wybranie większej liczby segmentów niż długość progu zdefiniowana w kroku 5.4. (tj. liczba pikseli między podstawą a końcówką) spowoduje przeszacowanie długości filopodium.
6. Określ szerokość skanowania, która działa jak skaner poziomy do umieszczania węzłów, w <6b>.
   UWAGA: Węzły te są używane przez program do dopasowania linii łączącej podstawę i końcówkę z korpusem filopodium (tj. do stworzenia kręgosłupa). Jako punkt wyjścia wpisz wartość w pikselach równą maksymalnej długości pomnożonej przez współczynnik .
7. Określ promień skanowania (w pikselach) w polu <6d>. Użyj wartości, która jest o około 50% większa niż obserwowane przemieszczenie końcówki między ramkami.
   UWAGA: Użycie bardzo dużego promienia skanowania może spowodować uchwycenie niechcianych punktów wypukłego kadłuba w ramkach, w których nie ma prawdziwej końcówki filopodialnej (np. ruch poza płaszczyzną lub niski SNR).
8. Określ kąt gięcia w polu <6e>.
   UWAGA: Próg kąta jest określany przez maksymalny kąt, pod jakim filopodium wygina się podczas całej analizy. Określenie progu kąta pomaga oprogramowaniu wykluczyć śledzenie niepożądanych struktur rosnących od strony filopodiów, gdy filopodia wyginają się w kierunku ciała komórki. Program działa niezawodnie w przypadku filopodiów o kącie nachylenia mniejszym niż 45 stopni od osi pionowej.
9. Aby rozpocząć śledzenie, kliknij przycisk <Śledź i analizuj> w oknie GUI #2. Kliknij pole "Śledzenie historii" w oknie GUI #2, aby zapisać cały protokół śledzenia do wykorzystania w przyszłości.
   UWAGA: Po zakończeniu procedury śledzenia, długość filopodium w każdej klatce jest przechowywana w arkuszu o nazwie "length_vel" z "dynamics.xlsx" do wykorzystania w przyszłości. Podobnie wszystkie inne parametry śledzenia są przechowywane w arkuszu o nazwie "parametry" z "dynamics.xlsx".
10. Opcjonalnie, jeśli filopodia nie zostaną automatycznie wykryte we wszystkich klatkach, wykonaj następujące czynności, aby ręcznie je skorygować.
    1. Odwiedź odpowiednią ramkę za pomocą suwaka w oknie #2 i ręcznie wybierz końcówkę filopodium.
       Uwaga: Ramki, w których nie wykryto wypukłych punktów kadłuba, będą reprezentowane przez niebieski region w oknie śledzenia w oknie GUI #2. Obowiązkowe jest zaznaczenie przycisku "Śledzenie historii" przed uruchomieniem programu śledzącego w celu uzyskania dostępu do współrzędnych węzłowych w tej ramce.
    2. Wybierz punkty odniesienia (podstawa, a następnie końcówka) za pomocą <6f> w oknie GUI #2. Określ inne parametry, takie jak "długość skanowania", "Dokładny pomiar po" i "maksymalny kąt gięcia" dla tej ramy, zgodnie z opisem w krokach 5.4-5.8.
    3. Kliknij przycisk <6i> aby zapisać nowe parametry (specyficzne dla tej jednej klatki). Kroki należy powtórzyć dla wszystkich klatek oznaczonych niebieskim obszarem.
    4. Po zakończeniu ponownie zainicjuj procedurę śledzenia za pomocą <7>.
       UWAGA: Ta poprawka może być również użyta, jeśli program nagle przełączy się z jednego filopodialnego pliku na drugi w filmie. Alternatywnie rozważ przycinanie filmów, które zawierają wiele filopodiów.

6. Analiza obrazu – Krok 3: Czasoprzestrzenna analiza białek

1. W przypadku analizy czasoprzestrzennej należy zaznaczyć pole oznaczone symbolem <8b> a następnie kanałem białkowym będącym przedmiotem zainteresowania (<8c> i/lub <8d> i/lub <8e>).
   Uwaga: Obowiązkowy jest wybór białka A przed analizą ratiometryczną (<9a>, <9b> i/lub <9c>), ponieważ jako odniesienie stosuje się białko A.
2. Kliknij na <8a> aby rozpocząć śledzenie białka wzdłuż długości filopodiów za pomocą śladu wygenerowanego w kroku 5.9.

7. Analiza obrazu – Krok 4: Analiza białkowa w metrykach ratiometrycznych

1. Zaznacz pole <9b> lub <9c> i kliknij przycisk <9a> aby uzyskać przestrzenno-czasowy wykres ratiometryczny.
   UWAGA: Aby uniknąć błędnego przedstawienia względnego stężenia białka, obraz ratiometryczny nie jest wykreślany jako X/Y, ale jako log(X/Y). Do wykorzystania w przyszłości wykres ratiometryczny jest eksportowany do plików w formatach ".png" i ".fig", a surowe dane wykresu są przechowywane w pliku "dynamics.xlsx".

8. Analiza obrazu – Krok 5: Analiza końcówki filopodialnej

1. Zaznacz pole <8f> i określ długość końcówki oraz długość progu od podstawy za pomocą <8g> i <8h>. Kliknij aby zapisać dane do pliku "dynamics.xlsx". Kliknij aby wygenerować ślad intensywności białka w końcówce filopodialnej i zapisać do analizy ratiometrycznej.
   UWAGA: Długość końcówki określa liczbę pikseli na końcówce używanej do analizy. Oprogramowanie zwróci średnią wartość intensywności pikseli na końcówce w każdej klatce. Długość progu określa minimalną odległość od podstawy do końcówki, powyżej której filopodium (końcówka filopodialna) zaczyna rosnąć (i kiedy program zaczyna śledzić wartość intensywności końcówki). Dlatego długość końcówki musi być mniejsza niż długość progu.
2. Kliknij żądany współczynnik, który chcesz przeanalizować za pomocą <9d> lub <9e>.
3. Kliknij przycisk porównania <9a> aby wygenerować dane ratiometryczne.

Results

Używając komórek COS transfekowanych markerem nitkowatej aktyny (f-tractin¹⁸, czerwony) i cytozolowym odniesieniem (zielony), znaleźliśmy bogate w aktynę wypukłości filopodialne (Rysunek 3A, górny panel). Szeregi czasowe pokazały, że filopodia szybko się wysuwają i chowają (Rysunek 3A, środkowy panel). Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, prześledziliśmy poszczególne filopodia. Porównanie długości filopodialnej mie...

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół śledzenia dynamiki wzrostu filopodialnego i analizy względnych stężeń białek w tych dynamicznych strukturach za pomocą algorytmu wypukłego kadłuba. Za pomocą oprogramowania można porównać parami do 3 kanałów w jednym przebiegu, przy czym względne stężenia dwóch kanałów (tj. białek) są określane w całym cyklu wysuwania/wycofywania i przechowywane jako pliki obrazów i danych w oddzielnych folderach. Oprócz rutynowych operacji, oprogramowanie zapewnia również szereg ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Płodowa surowica bydlęca	Biochrom AG	L11-044
Lipofektamina 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicylina/streptomycyna	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (roztwór podstawowy 1M)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Instytut Heli	Leibniz DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Instytut DSMZ	ACC-60
Ogniwa 3T3	Instytut Leibniza DSMZ	ACC-59
Mikroskop	Nicon Eclipse
Kamera	Andor	DU888 Ultra
jednostka konfokalna	Yokagawa	CSU-X1
Pirogronian	Gibco	31966-021