Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55658

⸱

10 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Center Utrecht, 2Department of Pharmaceutics, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Streszczenie

Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w hemostazie, tworzeniu skrzeplin w celu uszczelnienia naczyń krwionośnych. Są również zaangażowane w zakrzepicę, tworzenie skrzeplin, które zamykają naczynia krwionośne i uszkadzają narządy, co ma zagrażające życiu konsekwencje. Motywuje to do prowadzenia badań naukowych nad funkcją płytek krwi i opracowywania metod śledzenia procesów biologicznych zachodzących w warunkach przepływu.

Dostępne są różne modele przepływu do badania adhezji i agregacji płytek krwi, dwóch kluczowych zjawisk w biologii płytek krwi. W pracy opisano metodę badania degranulacji płytek krwi w czasie rzeczywistym pod wpływem przepływu podczas aktywacji. Metoda wykorzystuje komorę przepływową sprzężoną z konfiguracją strzykawka-pompa, która jest umieszczona pod szerokokątnym, odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym opartym na diodach LED. Opisana tutaj konfiguracja pozwala na jednoczesne wzbudzenie wielu fluoroforów, które są dostarczane przez fluorescencyjnie znakowane przeciwciała lub barwniki fluorescencyjne. Po eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek, szkła nakrywkowe mogą być dalej przetwarzane i analizowane za pomocą mikroskopii statycznej (tj. mikroskopii konfokalnej lub skaningowej mikroskopii elektronowej).

Wprowadzenie

Płytki krwi to komórki bezjądrzające, które krążą w krwiobiegu. Ich główną funkcją jest uszczelnianie naczyń krwionośnych w miejscach urazu i zapobieganie utracie krwi. W tych miejscach uszkodzenia podśródbłonkowe włókna kolagenowe zostają odsłonięte, a następnie pokryte białkiem multimerycznym, czynnikiem von Willebranda (VWF). VWF oddziałuje z płytkami krwi w krążeniu w mechanizmie, który zależy od kompleksu glikoproteiny Ibα-IX-V na powierzchni komórki1, spowalniając prędkość płytek krwi. Jest to szczególnie ważne przy dużych prędkościach ścinania. Płytki krwi następnie ulegają zmianom morfologicznym, otrzymując impulsy aktywujące z kolagenu. Prowadzi to do nieodwracalnego rozprzestrzeniania się i ostatecznie do agregacji płytek krwi. Oba procesy zależą od wydzielania granulek w celu ułatwienia przesłuchu płytkowo-płytkowego. Granulki α płytek krwi zawierają między innymi fibrynogen i VWF, które wspomagają adhezję płytek krwi i łączą płytki krwi w sposób zależny od integryny. Granulki o dużej gęstości płytek krwi zawierają związki nieorganiczne2, w tym wapń i difosforan adenozyny (ADP), które pomagają wzmocnić aktywację płytek krwi. Ponadto płytki krwi zawierają mediatory (alergicznego) stanu zapalnego3, białka kontrolujące dopełniacz4 oraz czynniki angiogenezy5,6, co rodzi pytania, czy i w jaki sposób te treści są różnie uwalniane w różnych warunkach.

Od 1980 roku, badanie funkcji płytek krwi w modelach przepływu było cenne dla badania mechanizmów zakrzepowych7. Od tego czasu poczyniono znaczne postępy techniczne, a modele przepływu, które obejmują tworzenie fibryny, są obecnie opracowywane w celu zbadania potencjału hemostatycznego terapeutycznych koncentratów płytek krwi ex vivo8 lub zbadania wpływu zaburzeń szybkości ścinania na morfologię skrzepliny9. Różnice w mechanizmach molekularnych i komórkowo-biologicznych, które napędzają stabilną adhezję i fizjologiczne tworzenie skrzepliny (hemostaza) w porównaniu z patologicznym tworzeniem skrzepliny (zakrzepicy) mogą być bardzo subtelne i motywować do opracowania modeli przepływu, które pozwalają na wizualizację tych procesów subkomórkowych w czasie rzeczywistym.

Przykładem procesu, dla którego taka konfiguracja byłaby wartościowa, jest (re)dystrybucja wewnątrzkomórkowego polifosforanu i rekrutacja czynników krzepnięcia, aby odkryć zależny od czasu wpływ, jaki ma to na ultrastrukturę fibryny10. Badania często ograniczają się do analiz punktów końcowych. Głównym celem opisanej metody jest umożliwienie wizualnego badania w czasie rzeczywistym dynamicznych procesów subkomórkowych, które zachodzą podczas aktywacji płytek krwi pod wpływem przepływu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Lokalna Komisja Etyki Medycznej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie zatwierdziła pobieranie krwi do celów badawczych ex vivo, w tym do celów tego badania.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować bufor Tyrode kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), rozpuszczając 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mMMgSO4 i 5,55 mM D-glukozy w wodzie destylowanej.
    1. Wykonaj dwa warianty buforu: ustaw poziom pH odpowiednio na 6,5 i 7,4. Zrób nowy bufor na każdy dzień eksperymentów. Uzupełnij 10 ng/ml prostacykliny tam, gdzie jest to wskazane.
  2. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną TRIS (TBS), rozpuszczając 50 mM Tris i 150 mM NaCl w wodzie destylowanej i dostosować pH do 9,0.
  3. Przygotować kwaśną dekstrozę cytrynianu (ACD), rozpuszczając 85 mM cytrynianu trisodu, 71 mM kwasu cytrynowego i 111 mM D-glukozy w wodzie destylowanej.
  4. Przygotować roztwór utrwalający, dodając 2% (v/v) paraformaldehydu (PFA) do buforu HEPES Tyrode, pH 7,4. Podgrzać do rozpuszczenia (50 - 70 °C) i ustawić pH na 7,4. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić w temperaturze 37 °C.
  5. Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 1% (m/v) albuminę surowicy ludzkiej (HSA) w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4
  6. Przygotuj roztwór alkoholu poliwinylowego, dodając 4,8 g alkoholu poliwinylowego do 12 g glicerolu i dobrze wymieszaj. Dodaj 12 ml wody destylowanej i pozostaw na noc na rotatorze w temperaturze pokojowej.
    1. Dodać 24 ml 0,2 M Tris-HCL o pH 8,5. Podgrzać do 50 °C, mieszając przez 30 min. Dodać 1,25 g 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) i dobrze wymieszać. Wirować przy 1 500 x g przez 5 min. Porcję supernatantu należy podać na porcję (1 ml wystarcza na 15-20 szkiełek) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć podwielokrotności raz.

2. Przygotowanie szkła nakrywkowego

  1. Odtłuścić szkła nakrywkowe (25 x 50mm2) przez inkubację przez noc w nierozcieńczonym kwasie chromosiarkowym. Opłucz kieliszki nakrywkowe wodą destylowaną i wysusz je przez noc w temperaturze 60 °C w piekarniku.
  2. Przyklej pasek folii parafinowej (10 x 15 cm2) na stole laboratoryjnym z kroplą wody i usuń powietrze, wygładzając folię parafinową. Odpipetować 80 μl kropli 10 μg/ml VWF lub 100 μg/ml fibrynogenu na folię parafinową. Umieść okulary na kroplach; Roztwór białka rozprzestrzeni się między dwiema powierzchniami, pokrywając całą tylną stronę szkła. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Usunąć folię parafinową i zablokować okulary nakrywkowe, umieszczając je powlekaną stroną do góry na płytce 4-dołkowej z buforem blokującym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Jako kontrolę należy zablokować szkło nakrywkowe, które nie zostało pokryte VWF lub fibrynogenem.

3. Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP)

  1. Pobrać cytrynian krwi pełnej (końcowe stężenie: 0,32% cytrynian sodu (M/V)) przez nakłucie dożylne.
  2. Odwirowywać krew przez 15 minut przy 160 x g i RT bez hamulca. Zebrać supernatant (tj. PRP) za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
    UWAGA: Po odwirowaniu można zaobserwować trzy warstwy (od góry do dołu): PRP, białe krwinki i czerwone krwinki. Upewnij się, że nie uwzględniasz białych i czerwonych komórek. Zazwyczaj 3 ml PRP można zebrać po odwirowaniu 9 ml probówki z krwią.
  3. Przejdź do sekcji 4, jeśli doświadczenie będzie przeprowadzone z przemytymi płytkami krwi. Jeśli pożądane jest PRP, przejdź do następnego kroku.
  4. Po pobraniu PRP należy ponownie odwirować pozostałą część krwi (zawierającą osad z krwinek czerwonych) przez 10 minut przy 2 000 x g bez przerwy. Zebrać supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi (PPP).
    UWAGA: Zazwyczaj po tym drugim etapie wirowania można zebrać 2 ml.
  5. Policz liczbę płytek krwi w PRP na analizatorze komórkowym i rozcieńcz go za pomocą PPP (krok 3.4) do stężenia 150 000 płytek krwi/μL.
    UWAGA: Całkowita objętość rozcieńczonego PRP zależy od liczby płytek krwi dawcy. Liczba płytek krwi różni się znacznie u różnych dawców, a rozcieńczenie PRP wymaga indywidualnej oceny. Liczba płytek krwi jest uważana za normalną, gdy mieści się w zakresie od 150 000 do 450 000 płytek krwi/μl.
  6. Przejdź do sekcji 5.

4. Przygotowanie umytych płytek

krwi
  1. Określić średnią objętość płytek krwi (MPV) w PRP za pomocą analizatora komórek.
    UWAGA: Jest to wskaźnik wstępnej aktywacji płytek krwi11. Normalny MPV dla spoczynkowych płytek krwi wynosi 7,5-11,5 fL11. MPV nie powinno wzrosnąć o więcej niż 1,5 fL podczas procedury płukania płytek krwi.
  2. Dodać 1/10 objętości ACD do PRP, aby zapobiec wstępnej aktywacji płytek krwi i wirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze HEPES Tyrode, pH 6,5, do pierwotnej objętości PRP.
  3. Rozmrozić porcję prostacykliny, dodając TBS do stężenia 10 μg/ml; przechowywać ją na lodzie.
  4. Aby zapobiec aktywacji płytek krwi, dodać prostacyklinę w końcowym stężeniu 10 ng/ml do ponownie zawieszonych płytek krwi i natychmiast odwirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca. Usunąć sklarowany osad i ostrożnie zawiesić osad w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4.
  5. Policz liczbę płytek krwi (krok 3.5) i określ zmianę MPV (krok 4.1) (MPV nie powinno zmienić się o więcej niż 1,5 fL).
  6. Dostosuj liczbę płytek krwi za pomocą buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do stężenia 150 000 płytek krwi/μl. Pozostaw płytki krwi do regeneracji na 30 minut w temperaturze pokojowej przed eksperymentami. Umyte płytki krwi należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 4 godzin po izolacji.

5. Zespół komory przepływowej

UWAGA: Te eksperymenty wykorzystują opracowany przez nas komorę przepływową12. Można stosować różne komory przepływowe produkowane komercyjnie, o ile mogą one pomieścić szkło nakrywkowe, które preferencyjnie można zdjąć w celu dalszych analiz. Komora przepływowa używana do opisywanych eksperymentów jest wykonana z poli(metakrylanu metylu), aby precyzyjnie pasowała do stolika mikroskopowego. Zawiera wlot i wylot (Rysunek 1A-C; 1, 2), a także przyłącze próżniowe (Rysunek 1A i C; 3). Na górze umieszcza się niestandardowy arkusz silikonowy (Rysunek 1A i D; 4). Dwa wycięcia tworzą kanały próżniowe (Rysunek 1A i D; 5) do szczelnego przymocowania szkła nakrywkowego (Rysunek 1A; 6) szczelnie przylegającego do komory. Centralne wycięcie tworzy kanał przepływowy (Rysunek 1A i D; 7; 2,0 mm szerokości i 0,125 mm wysokości). Wlot i wylot są podłączone do kanału przepływowego, a podciśnienie jest podłączone do kanału próżniowego.

  1. Przykryj górną część komory przepływowej wodą destylowaną i umieść na wodzie niestandardowy arkusz silikonowy gładką stroną do dołu skierowaną w dół. Umieść arkusz na miejscu, usuwając nadmiar wody, jednocześnie utrzymując arkusz na miejscu.
    UWAGA: Ten arkusz silikonowy nadaje się do wielokrotnego użytku (silikon jest znany ze swoich właściwości obojętnych); Ogólnie rzecz biorąc, nie zaobserwowano, aby płytki krwi przyczepiały się do niego. Arkusze można czyścić detergentem i używać ponownie, aż do uszkodzenia materiału (tj. rozdarcia, szczególnie w obszarze między kanałami). Ogólnie rzecz biorąc, arkusz może być używany przez 20 dni z wieloma eksperymentami dziennie.
  2. Inkubować komorę przepływową przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C w celu odparowania pozostałej wody i mocno przylgnąć arkusz silikonowy do komory przepływowej.
  3. Za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj kroplę buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do kanału przepływowego. Umieść szkło nakrywkowe (patrz rozdział 2) powlekaną stroną do dołu, na kanale przepływowym. Podłącz pompę próżniową do przyłącza podciśnienia (rysunki 1A i C; 3). Zastosować ciśnienie ~10 kPa.

6. Wstępne barwienie płytek krwi i przygotowanie przeciwciał

  1. Barwienie płytek krwi
    1. Inkubować umyte płytki krwi z 10 μg/ml DAPI przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Aby zmyć niezwiązaną DAPI i zapobiec aktywacji płytek krwi, dodać prostacyklinę w końcowym stężeniu 10 ng/ml i natychmiast odwirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca.
    2. Rozpuścić osad płytek krwi w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4, do stężenia płytek krwi 150 000 płytek krwi/μl.
  2. Przygotowanie przeciwciał
    1. Wymieszaj przeciwciało znakowane biotyną ze streptawidyną znakowaną Alexą w stosunku molowym 1:1. Przed użyciem inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej (krok 7.6).
      UWAGA: Skuteczność etykietowania biotyny może się różnić w zależności od partii. W przypadku problemów z wizualizacją cząsteczek docelowych należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne w celu potwierdzenia udanej biotynylacji, a także właściwości wiązania celu przez specyficzne przeciwciało biotynylowane.

7. Perfuzja

  1. Uruchom mikroskop fluorescencyjny, a także oprogramowanie mikroskopu. Użyj ustawień mikroskopu podanych w tabeli 1.
    UWAGA: Zainicjuj ustawienia mikroskopu i rejestracji w celu wizualizacji żywych komórek i zapisu płytek krwi oraz wybranych fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i/lub barwników, ładując odpowiedni eksperyment do oprogramowania mikroskopu. Wykonuj eksperymenty przepływu w RT.
  2. Zablokuj rurkę wlotową, podłączając strzykawkę o pojemności 10 ml do rurki i zasysając 1% bufor blokujący HSA do rurki wlotowej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać rurkę dolotową, zasysając bufor HEPES Tyrode o pH 7,4 do rurki wlotowej.
  3. Podłącz zablokowaną rurkę wlotową i nieobrobioną rurkę wylotową, obie o średnicy 1,02 mm i długości ~20-30 cm, do wlotu i wylotu komory. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml (lub mniejszą objętość dla większej dokładności) do rurki wylotowej. Włączyć pompę strzykawkową.
    UWAGA: Średnica strzykawki w połączeniu z natężeniem przepływu ustawionym na pompie określa objętościowe natężenie przepływu. Wraz z powierzchnią kanału przepływowego szybkość ścinania można obliczyć zgodnie ze wzorem13 poniżej. W związku z tym możliwe jest manipulowanie szybkością ścinania poprzez zmianę natężenia przepływu pompy strzykawkowej lub zmianę wymiarów kanału przepływowego. Szybkość ścinania 800-1,600 s-1 zazwyczaj modeluje przepływ krwi tętniczej, podczas gdy modele 25-100s-1 dotyczy przepływu krwi żylnej. W przypadku tej konfiguracji natężenie przepływu 7,5 μl/min daje szybkość ścinania 25 s-1,
    Szybkość ścinania = 6Q / h2w w s-1
    W czym: Q = objętościowe natężenie przepływu (ml/s), h = kanał wysokości (cm) (0,0125 cm; jest to grubość arkusza silikonu), w = kanał szerokości (cm) (0,2 cm w tej komorze).
  4. Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie 100X (całkowite wzmocnienie 1,000X) i zamontuj komorę na mikroskopie szklaną powierzchnią do dołu.
  5. Umieścić rurkę doprowadzającą w rurce zawierającej bufor HEPES Tyrode, pH 7.4. Ręcznie pociągnąć za tłok strzykawki podłączonej do rurki wylotowej i przeciągnąć roztwór przez komorę, aby usunąć powietrze z systemu. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej (Rysunek 1B i C; 8) i krótko uruchomić pompę, aby dokręcić tłok i zapewnić stabilny przepływ.
  6. Dodać przeciwciała i/lub barwniki do zawiesiny płytek krwi lub PRP, ostrożnie wymieszać plastikową pipetą i przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Do typowej 30-minutowej perfuzji z szybkością ścinania 25s-1 (7,5 μL/min) potrzebne jest co najmniej 225 μL zawiesiny płytek krwi. Przeciwciała użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników przedstawiono w tabeli 2.
  7. Przesunąć rurkę wlotową, podczas ściskania, z buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej PRP lub przemyte płytki krwi oraz przeciwciała i/lub barwniki (Rysunek 1B i C; 9).
    UWAGA: Ważne jest, aby podczas przenoszenia rurki rurka była ściskana (wyciskanie powietrza), aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do rurki. Możliwe jest traktowanie przylegających płytek krwi różnymi odczynnikami w kolejnym etapie, przesuwając rurkę wlotową do innej rurki w podobny sposób. Wykaz potencjalnie użytecznych odczynników znajduje się w tabeli 3.
  8. Wybierz opcję "wizualizacja na żywo" w oprogramowaniu, ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni powlekanego szkła nakrywkowego i uruchom pompę z szybkością ścinania 1 600s-1 (484 μl/min), aż płytki krwi dotrą do komory przepływowej. W tym momencie zmniejsz szybkość ścinania z powrotem do 25s-1, zmieniając ustawienia pompy strzykawkowej na natężenie przepływu 7,5 μL/min.
  9. Monitoruj powierzchnię powlekanej strony szkła nakrywkowego, poczekaj, aż pierwsza płytka krwi zacznie przylegać, skoncentruj mikroskop na tej płytce i rozpocznij nagrywanie, rozpoczynając eksperyment w oprogramowaniu. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z używanymi tutaj ustawieniami nagrywania.
  10. Śledź wizualnie nagranie na żywo. Po 30 minutach zatrzymać pompę strzykawkową.
    UWAGA: Upewnij się, że płytki krwi pozostają ostre w trakcie eksperymentu. Zazwyczaj 20-30 płytek krwi przyczepia się w polu widzenia przy powiększeniu 1,000x; Jest to około 2 000-3 000 płytek krwi w całym kanale przepływowym.
  11. Mocowanie za pomocą komory przepływowej (opcjonalnie).
    1. Po zatrzymaniu przepływu po zatrzymaniu pompy strzykawkowej przenieść rurkę wlotową (bez powietrza) do roztworu utrwalającego. Uruchom ponownie pompę i przepuść bufor utrwalający przez kanał przez co najmniej 10 minut przy tym samym natężeniu przepływu, jak wspomniano w kroku 7.8.
  12. Wyjmij komorę z mikroskopu, oczyść olejek immersyjny ze szkła, odłącz odkurzacz i ostrożnie wyjmij szkło nakrywkowe z komory za pomocą igły 18 G.
    UWAGA: Zapobiegaj pękaniu szkła nakrywkowego i uszkodzeniu arkusza silikonowego.
  13. Umieść szkiełko przykrywające (z komórkami skierowanymi do góry) w 4-dołkowej płytce na chusteczce, wstępnie zwilżonej wodą destylowaną.
    UWAGA: Zapobiega to przywieraniu szkła nakrywkowego do powierzchni studzienki i zapobiega wysychaniu.
  14. Odpipetować 750 μl roztworu utrwalającego na wierzchu szkła nakrywkowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku, gdy próbki nie mogą być analizowane bezpośrednio, należy je przechowywać w 0,5% PFA (rozcieńczonym buforem HEPES Tyrode, pH 7,4) w temperaturze 4 °C, aby zapewnić stabilne utrwalenie. Przejdź do sekcji 8, aby przetworzyć szkło nakrywkowe do obrazowania.
  15. Po użyciu wypłucz komorę, rurkę i blachę wodą destylowaną i inkubuj przez noc w roztworze detergentu. Przed ponownym użyciem komory i innych elementów należy spłukać wodą destylowaną.
  16. Zapisz pliki surowych danych mikroskopu zawierające wszystkie metadane. W razie potrzeby wyeksportuj filmy do folderu . MOV, h.264 lub .AVI nieskompresowany. Zapisuj osobne klatki jako pliki JPEG lub TIF.

8. Przygotowanie próbki do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Przenieść szkła nakrywkowe na nowe płytki 4-dołkowe i spłukać 5 razy 3 ml buforu HEPES Tyrode, pH 7,4. Dodać 3 ml/studzienkę buforu blokującego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Usunąć bufor blokujący, dodać 3 ml / studzienkę 0,15% glicyny (M/V) do buforu HEPES Tyrode, pH 7,4 i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć roztwór glicyny i przemyć 5 razy w 3 ml / studzienkę buforu blokującego. Opcjonalnie dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem rozcieńczone w buforze blokującym w celu dodatkowego barwienia. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Przemyć 5 razy buforem blokującym i 2 razy wodą destylowaną. Osusz szkło, usuwając nadmiar płynu chusteczką (od krawędzi do wewnątrz), nie dotykając komórek.
  5. Odpipetować 60 μl roztworu alkoholu poliwinylowego na szkiełko mikroskopowe. Umieść szkło nakrywkowe komórkami w dół na wierzchu kropli i pozwól, aby alkohol poliwinylowy rozprzestrzenił się między dwiema powierzchniami. Inkubować przez noc w RT w ciemności.
  6. Przeanalizuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej14.
  7. Zapisz nieprzetworzone pliki danych zarejestrowanych danych stosu zawierające wszystkie metadane. W razie potrzeby przetwórz pliki danych pierwotnych na pliki MOV, skompresowane h.264 lub .AVI nieskompresowane. Zapisuj osobne stosy jako pliki JPEG lub TIF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia obrazy komory przepływowej i układu eksperymentalnego, położenie i wymiary arkusza krzemowego oraz połączenia rurek. Rysunek 2 zawiera szczegółowe informacje o wymiarach komory przepływowej. Rysunek 3 oraz Film 1 przedstawiają serię obrazów czasowych adhezji i rozprzestrzeniania się płytek krwi na unieruchomionym VWF. CD63 jest białkiem transbłonowym wbudowanym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Na całym świecie zakrzepica jest główną przyczyną zgonów i zachorowalności, a płytki krwi odgrywają kluczową rolę w jej rozwoju. W pracy opisano metodę obrazowania żywych komórek degranulacji płytek krwi pod przepływem. Powszechnie przyjmuje się, że gdy płytki krwi ulegają aktywacji, cała ziarnista zawartość jest bezpośrednio uwalniana do roztworu. Przedstawione wyniki sugerują, że niekoniecznie tak jest. Podczas adhezji i degranulacji płytki krwi zatrzymują znaczną ilość polifosforanu (ryc. 4). Dodatkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

CM dziękuje za wsparcie finansowe od Międzynarodowej Organizacji Pacjentów z Niedoborami Inhibitora C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht oraz Fundacji Landsteinera na rzecz Badań nad Transfuzją Krwi (LSBR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) VWR441476L
Na2HPO4SigmaS-0876
NaClSigma31434
KClSigma31248
MgSO4Merck KGaA1.05886
D-glukozaMerck KGaA1.04074
Prostacyklina Cayman Chemical18220
Cytrynian trisodowyMerck KGaA1.06448
Kwas cytrynowy Merck KGaA1.00244
Okulary nakrywkoweMenzel-Glä serBBAD02400500#A24 x 50 mm, Nr 1 = 0,13 - 0,16 mm grubości.
Kwas chromosiarkowy (2% CrO3)Riedel de Haen07404CAS [65272-70-0].
Czynnik von Willebranda (VWF)we własnym zakresie oczyszczone
laboratoria badawcze enzymówfibrynogenuFIB3L
4-dołkowa, niepoddawana działaniuThermo Scientific267061
Frakcja albuminy ludzkiej surowicy VHaem Technologies Inc.
Probówki do pobierania krwi, 9 mL, 9NC Koagulacja Cytrynian sodu 3,2%Greiner Bio-One455322
Analizator komórek Analizatorhematologiczny Abbott Diagnostics CELL-DYN
Sigma30525-89-4 
Pompa strzykawkowaAparat Harvard, Holliston, MAAparat Harvard 22
Strzykawka 10 ml o średnicy 14,5 mmBD biosciences305959Strzykawka Luer-Lok
Anty-CD63-biotyna Biblioteka 
Anty-CD62P-biotyna R& D SystemsDy137
Dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI)Polysciences Inc. 9224
Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488Thermo ScientificS11223 
Olejek immersyjnyZeiss444963-0000-000
Roztwór detergentuUnilever, Biotex
GlycineSigma56-40-6 
Alkohol poliwinylowySigma9002-89-5Mowiol 40-88.
Chlorowodorek trisSigma1185-53-1 
1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO)Sigma280-57-9
Owca anty-hVWF pAbAbcam AB9378
Alexa fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
GlicerolSigma-Aldrich15523-1L-R
Folia parafińskaBemisPM-9964 cale x 125 stóp Rolka.
Arkusz silikonowy niezbrojonyNagorNA 500-1200 mm x 150 mm x 0,125 mm.
Indywidualnie cięty arkusz silikonowy z kanałami perfuzyjnymi i próżniowymiwykonanymiWykonany z arkusza silikonowego niewzmocnionego (Nagor, NA 500-1)
Probówki 1,5 mlEppendorf AGT9661-1000AE
Mikroskop fluorescencyjnyZeiss Observer Z1 Wyposażony w światła wzbudzenia LED.
Oprogramowanie mikroskopoweZeiss ZEN 2blue edition
Igła 18 G (18 G x 1 1/2")BD biosciences305196
NaClRiedel de Haen31248375
TrisRoche10708976
Plastikowa pipeta PasteuraVWR612-1681  7 ml niesterylny, z podziałką do 3 ml.
Rurka silikonowaVWR228-0656Średnica wewnętrzna. x Średnica zewnętrzna x Grubość ścianki = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
Szkiełka mikroskopoweThermo ScientificABAA000001##12E76 x 26 x 1 mm, szlifowane krawędzie 45 & stopni, matowy koniec.
823022 Paraformaldehyd AB134331 we własnym zakresie

Bibliografia

  1. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  2. Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).
  3. May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
  4. Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
  5. Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
  6. Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
  7. Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
  8. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
  9. Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  10. Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
  11. Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
  12. Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
  13. Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
  14. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
  15. Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
  16. Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
  17. Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
  18. Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
  19. Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komora przep ywowaizolacja p ytek krwimikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnaaktywacja p ytek krwiczynnik von Willebrandamobilizacja P selektynyekspresja powierzchniowa CD63
Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.