Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Summary

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Abstract

Bezznacznikowe biosensory optyczne są potężnymi narzędziami do odkrywania leków do charakteryzowania oddziaływań biomolekularnych. W tym badaniu opisujemy zastosowanie czterech rutynowo używanych platform biosensorów w naszym laboratorium do oceny powinowactwa i kinetyki wiązania dziesięciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) o wysokim powinowactwie przeciwko ludzkiej konwertazie proproteinowej subtylizyny keksynie typu 9 (PCSK9). Podczas gdy zarówno Biacore T100, jak i ProteOn XPR36 wywodzą się z dobrze znanej technologii Surface Plasmon Resonance (SPR), pierwsza z nich ma cztery ogniwa przepływowe połączone konfiguracją przepływu szeregowego, podczas gdy druga przedstawia 36 punktów reakcji równolegle za pomocą improwizowanej konfiguracji kanałów mikroprzepływowych 6 x 6. IBIS MX96 działa również w oparciu o technologię czujników SPR, z dodatkową funkcją obrazowania, która zapewnia detekcję w orientacji przestrzennej. Ta technika detekcji w połączeniu z mikroskopem o ciągłym przepływie (CFM) znacznie zwiększa przepustowość, umożliwiając drukowanie matryc multipleksowych i wykrywanie 96 sportów reakcji jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, Octet RED384 opiera się na zasadzie optycznej interferometrii BioLayer (BLI), z sondami światłowodowymi działającymi jako bioczujnik do wykrywania zmian wzorca zakłóceń po interakcjach wiązania na powierzchni końcówki. W przeciwieństwie do platform opartych na SPR, system BLI nie opiera się na przepływie płynnym; Zamiast tego końcówki czujników zbierają odczyty, gdy są zanurzone w roztworach analitu 384-dołkowej mikropłytki podczas mieszania orbitalnego.

Każda z tych platform biosensorów ma swoje wady i zalety. Aby zapewnić bezpośrednie porównanie zdolności tych instrumentów do dostarczania wysokiej jakości danych kinetycznych, opisane protokoły ilustrują eksperymenty, które wykorzystują ten sam format testu i te same wysokiej jakości odczynniki do scharakteryzowania kinetyki przeciwciało-antygen, które pasują do prostego modelu interakcji molekularnej 1:1.

Introduction

Uzyskanie wiarygodnych parametrów kinetycznych do charakteryzowania interakcji przeciwciało-antygen jest niezbędnym elementem procesu odkrywania i rozwoju leków¹. Biosensory optycznego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), "złoty standard" do wykrywania tych interakcji w czasie rzeczywistym, są używane od około dwóch dekad, aby umożliwić wczesną selekcję kandydatów na przeciwciała terapeutyczne spełniające kryteria2^,3. Oprócz zapewnienia rankingu powinowactwa kandydatów na przeciwciała poprzez szybkie badanie przesiewowe wiązania surowych supernatantów⁴ oraz rygorystyczne oznaczanie stałych kinetycznych oczyszczonych preparatów⁵, biosensory mogą dalej różnicować aktywność funkcjonalną głównych kandydatów za pomocą badań grupowania epitopów^6,7.

Aby sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na produkty oparte na przeciwciałach dla różnych wskazań terapeutycznych⁸, w ostatnich latach opracowano szeroką gamę innowacyjnych instrumentów biosensorów, które zwiększają skuteczność identyfikacji i charakterystyki kandydatów^9,10. Przyrządy te różnią się konfiguracją kanałów mikroprzepływowych i/lub zasadami optycznymi związanymi z wykrywaniem oddziaływań biomolekularnych. W szczególności Octet RED384¹¹, ProteOn XPR36¹² i IBIS MX96⁷ zwiększyły liczbę interakcji mierzonych w jednym cyklu wiązania odpowiednio do 16, 36 i 96, co stanowi znaczną poprawę przepustowości w porównaniu z tradycyjną platformą Biacore. Chociaż wszystkie te różne platformy biosensorów dostarczają niezbędnych danych kinetycznych do scharakteryzowania interakcji przeciwciało-antygen, różnią się one konfiguracją eksperymentalną i procedurami operacyjnymi ze względu na różnice w konfiguracjach instrumentalnych. Na przykład na platformie macierzy obrazowania SPR IBIS MX96 etap immobilizacji liganda multipleksowego jest wykonywany w trybie off-line w zewnętrznym urządzeniu drukującym oddzielonym od detektora^7,13; W przeciwieństwie do tego, pozostałe trzy platformy biosensorów wykorzystują konfigurację "wszystko w jednym", w której dodanie komponentu do powierzchni czujnika, niezależnie od tego, czy jest to odczynnik aktywacyjny, ligand czy analit, jest rejestrowane w czasie rzeczywistym i za pomocą wstępnie zaprogramowanych poleceń w kolejności sekwencyjnej. W Octet RED384 unikalną cechą tej platformy opartej na interferometrii BioLayer (BLI) jest dostępność wstępnie powlekanych biosensorów światłowodowych do natychmiastowego użycia "zanurz i odczytuj" ¹⁴, eliminując potrzebę przygotowania powierzchni liganda i etapów inicjacji/kondycjonowania, które są często wymagane w przypadku chipów czujników w platformach opartych na SPR. Bezpłynowa konstrukcja tego urządzenia upraszcza również mechanikę i pozwala uniknąć problemów związanych z zatykaniem i zanieczyszczeniem podczas pracy z surowymi próbkami. Dzięki nowatorskiej konstrukcji płynów 6 x 6 krzyżujących się w ProteOn XPR36 można zastosować podejście kinetyki "one-shot", przełączając kanały przepływu między kierunkiem poziomym i pionowym, aby utworzyć 36 punktów interakcji¹⁵. Zamiast oceniać kinetykę wiązania po jednym stężeniu ligandu lub analitu na raz, jak ma to miejsce w tradycyjnej platformie Biacore T100 o przepływie szeregowym, podejście to oferuje możliwość jednoczesnego monitorowania do 36 różnych interakcji w jednym cyklu wiązania.

Pomimo różnic, te cztery platformy biosensorów są powszechnie używane przez wiele laboratoriów na całym świecie. Dla nowych użytkowników, którzy mają niewielkie doświadczenie w pracy z biosensorami, podjęcie decyzji, którego instrumentu użyć, może być trudnym zadaniem, biorąc pod uwagę różnice w konstrukcji instrumentów. Aby określić najbardziej odpowiedni instrument do celów badawczych, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak jakość danych, spójność wydajności, przepustowość, łatwość obsługi i zużycie materiałów. Podczas gdy w kilku badaniach porównawczych badano zmienność stałych szybkości kinetycznej uzyskanych z wielu laboratoriów i biosensorów^5,16, niedawno opublikowane bezpośrednie badanie porównawcze dalej dotyczy systematycznych czynników, które wpływają na wiarygodność danych z punktu widzenia wydajności instrumentalnej^17,18. Protokoły przedstawione w tym filmie koncentrują się szczegółowo na konfiguracji i procedurach eksperymentalnych i towarzyszą im artykuł badawczy zatytułowany "Porównanie platform biosensorów w ocenie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie"¹⁷. Protokoły te mają na celu nie tylko pomoc nowym użytkownikom biosensorów we wdrażaniu tych instrumentów do celów badawczych, ale także dostarczenie dodatkowych informacji obecnym użytkownikom biosensorów na temat wyzwań technicznych i rozważań w projektach eksperymentalnych do oceny interakcji przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie.

Protocol

1. Białka i przeciwciała

1. Wyprodukuj i oczyść ludzką konwertazę proproteiny subtylizynę kexin typu 9 (PCSK9) i dziesięć mysich przeciwciał anty-PCSK9 pochodzących z myszy, jak opisano wcześniej¹⁷.
2. Oceń czystość oczyszczonych produktów, sekwencyjnie wstrzykując 10 μg każdej próbki do kolumny wykluczającej wielkość analityczną (SEC) przy użyciu systemu UPLC¹⁹.

2. Pomiary kinetyczne w Biacore T100

1. Przygotowanie instrumentów i odczynników
   1. Utrzymuj równowagę układu czujnika CM5 w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. Rozmrozić dwie podwielokrotności 200 μl 200 mM chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i dwie 200 μl podwielokrotności 50 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotuj 1-litrową butelkę 1x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% v/v polisorbatu P20) biegnącego buforu, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy HBS-EP+ w wodzie.
   4. Przygotować 1 ml białka A/G w stężeniu 30 μg/ml w 10 mM octanu sodu (pH 4,5) i 500 μl każdej próbki mAb w stężeniu 0,063 μg/ml w buforze do pracy HBS-EP. Rozmrozić zamrożoną fiolkę PCSK9 u ludzi na lodzie.
   5. W oprogramowaniu sterującym kliknij "Narzędzia | Wysuń chip", umieść chip czujnika w osłonie i zamknij. Kliknij "Narzędzia | Ustaw temperaturę", wprowadź "25" °C jako temperaturę analizy i "10" °C jako temperaturę komory.
2. Unieruchomienie powierzchni
   1. W oprogramowaniu sterującym kliknij "Plik | Otwórz/Nowy szablon kreatora" i wybierz "Unieruchomienie" z listy w panelu po lewej stronie.
   2. Kliknij "Nowy", aby przejść do okna ustawień unieruchomienia. Wybierz "CM5" jako typ chipa i wybierz "1" komórkę przepływową na cykl.
   3. Zaznacz pole obok każdego "Unieruchomić komórkę przepływową 1/2/3/4", aby aktywować opcje. Wybierz "Celuj w poziom unieruchomiony" i "Amina" jako metodę dla wszystkich komórek przepływowych.
   4. Wprowadź "30 μg/mL ProA/G" jako ligand, upewnij się, że poziom docelowy jest ustawiony na "10000" jednostek odpowiedzi (RU) dla wszystkich komórek przepływowych.
   5. Zaznacz "Zalej przed uruchomieniem" i kliknij "Dalej". Wybierz "Stojak na odczynniki 2", określ lokalizację odczynników i odpowiednio pipetuj do poszczególnych fiolek z próbkami. Włóż stojak z powrotem do instrumentu, a następnie kliknij "Start" i wprowadź nazwę eksperymentu, która ma zostać zapisana, aby rozpocząć bieg.
3. Cykle wiązania i regeneracji analitu
   1. Kliknij "Plik | Otwórz/Nowa metoda", wybierz "20140812 hu anty-PCSK9 IgGs wiążące się z hu PCSK9" i otwórz metodę. Przejrzyj parametry w metodzie.
   2. W "Krokach testu" upewnij się, że jest 10 cykli, w których "hu PCSK9" jest nazwą z "Próbka" wybraną w "Przeznaczenie". Numer repliki jest ustawiony na "1".
   3. W polu "Typy cykli" ustaw czas kontaktu na "220" s dla przechwytywania 1 na ścieżce przepływu "2", "110" s dla przechwytywania 2 na ścieżce przepływu "3" i "55" s dla przechwytywania 3 na ścieżce przepływu "4". Natężenie przepływu wynosi "10" μl/min dla wszystkich cykli wychwytywania.
   4. Wybierz "Próbka 1", zaznacz "Przykładowe rozwiązanie" jako zmienną. Ustaw czas kontaktu na "600" s, a czas dysocjacji na "2700" s na ścieżce przepływu "1, 2, 3, 4". Natężenie przepływu jest ustawione na "30" μl/min.
   5. Wybierz "Regeneracja 1", wpisz "Glycine-HCl pH 1,5" w polu roztworu i ustaw czas kontaktu na "20" s na ścieżce przepływu "1, 2, 3, 4".
   6. W polu "Ustawienia zmienne" wprowadź 2-krotne stężenia miareczkowania "100 nM - 6,25 nM" dla cyklu 1-3, "50 nM - 3,12 nM" dla cyklu 4-8 i "5 nM - 0,323 nM" dla cyklu 9-10.
   7. W "Setup Run" wybierz ścieżkę przepływu wykrywania "2-1, 3-1, 4-1", kliknij "Dalej", zaznacz "Przygotuj przed uruchomieniem" i kliknij "Dalej".
   8. Wybierz opcję "Stojak na próbki i odczynniki 1", określ lokalizację odczynników i odpowiednio pipetuj do poszczególnych fiolek z próbkami. Włóż stojak do instrumentu, a następnie kliknij "Start" i wprowadź nazwę eksperymentu, która ma zostać zapisana, aby rozpocząć bieg.
4. Analiza danych za pomocą BiaEvaluation
   1. Kliknij "Kinetyka/Biegłość | Związany z powierzchnią", wybierz osobno Fc "2-1", "3-1" lub "4-1" i sprawdź wszystkie wyświetlane krzywe z różnych stężeń analitu, a także ślepą próbę stężenia "zerowego".
   2. Kliknij "Dalej", aby uzyskać puste odjęte krzywe bufora. Następnie kliknij "Kinetyka", wybierz model "Wiązanie 1:1" i kliknij "Dopasuj", aby uzyskać dopasowane parametry kinetyczne
   .
   3. Aby globalnie dopasować wiele powierzchni mAb, kliknij "Wiele R_max" u dołu i dodaj do listy krzywe wiązania z innych Fcs dla tego samego mAb
   .
   4. Kliknij "Dalej", aby uzyskać wszystkie odjęte krzywe wiązania puste bufora. Następnie kliknij "Kinetyka", wybierz model "Wiązanie 1:1" i wybierz "dopasuj lokalnie" dla każdego_maksimum R w parametrach, aby uzyskać globalnie dopasowane parametry kinetyczne
   .

3. Pomiary kinetyczne w ProteOn XPR36

1. Przygotowanie instrumentów i odczynników
   1. Zrównoważyć chip czujnika GLM i 2-litrową butelkę PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20 i 3 mM EDTA) w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. W oprogramowaniu sterującym kliknij "Wysuń", a następnie włóż chip GLM. Ustaw temperaturę chipa na "25" °C, a temperaturę automatycznego podajnika próbek na "10" °C. Kliknij "Inicjalizacja glicerolu" i postępuj zgodnie z wyświetlanymi instrukcjami, aby zainicjować chip.
   3. Kliknij "Plik | Otwórz" protokół kondycjonowania wstępnego z listy, przygotuj roztwory na płytce 96-dołkowej. Następnie kliknij "Uruchom", wybierz protokół i kliknij "Start".
   4. Rozmrozić jedną 1 ml podwielokrotność 400 mM EDC i jedną 1 ml podwielokrotność 100 ml N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS) w temperaturze pokojowej.
   5. Przygotować 2 ml białka A/G o stężeniu 60 μg/ml w 10 mM octanu sodu (pH 4,5) i 500 μl każdej próbki mAb w stężeniach 0,25 μg/ml, 0,125 μg/ml i 0,063 μg/ml w buforze PBS-T-EDTA. Rozmrozić zamrożoną fiolkę PCSK9 u ludzi na lodzie.
2. Unieruchomienie, wiązanie analitu i regeneracja
   1. Kliknij "Plik | Nowość | Nowy protokół". W polu "Konfiguracja" wprowadź nazwę eksperymentu, wybierz chip "GLM", wybierz "Mikropłytki" i wprowadź objętość "2,2" ml.
   2. Wybierz "Protokoły | Próbki", zdefiniować "EDC/sulfo-NHS" jako "Aktywator" w studzienkach H1-H6, "Białko A/G" jako "Ligand" w G1-G6, "Etanoloamina" jako "Dezaktywator" w F1-F6, "Glicyna" jako "Regenerator" w E1-E6, PBS-T-EDTA" jako "Ślepa próba" w D1-D6, "Próbka mAb X" jako "ligand" w C1-C6, i "ludzki PCSK9" jako "analit w studzienkach H1-H6 w drugiej 96-dołkowej płytce.
   3. Wybierz "Kroki", kliknij dwukrotnie "Immobilizacja" w "Edytorze protokołów", kroki obejmują trzy kolejne poziome wstrzyknięcia EDC/sulfo-NHS, białka A/G i 1 M etanoloaminy, każde przy natężeniu przepływu "30" μL/min i czasie kontaktu "300" s.
   4. Kliknij "Regeneruj", wstrzyknij trzy impulsy "18" s glicyny (pH 1,5) o prędkości "100" μL/min zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym, a następnie dwa impulsy "60"-s PBS-T-EDTA przy "25" μL/min również w obu kierunkach.
   5. Kliknij "Ligand", wstrzyknąć mAb 1 mAb 2 w kierunku pionowym, używając natężenia przepływu "25" μL/min i czasu kontaktu "160" s.
   6. Kliknij "Analit", wstrzyknij pięć stężeń ludzkiego PCSK9 (100 nM do 6,25 nM w 2-krotnych rozcieńczeniach seryjnych) i ślepy bufor przez 6 kanałów poziomych jednocześnie, przy "40" μl / min przez "600" s czasu asocjacji, a następnie "2700" s czasu dysocjacji.
   7. Kliknij "Regeneruj", wstrzyknij dwa impulsy "18" glicyny (pH 1,5) o prędkości "100" μl/min zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym.
   8. Powtórz powyższe kroki po każdym cyklu wiązania dla pozostałych mAbs.
      UWAGA: Oprócz serii stężeń PCSK9 dla ludzi 100 nM - 6,25 nM, stosuje się serie stężeń 25 nM - 1,56 nM i 5 nM - 0,313 nM.
   9. Przygotuj próbki i odczynniki na dwóch 96-dołkowych płytkach zgodnie z pozycjami odczynników zdefiniowanymi w kroku 3.2.2, a następnie kliknij zakładkę "Uruchom", wybierz protokół/eksperyment i kliknij "Start".
3. Analiza danych za pomocą ProteOn Manager
   1. Kliknij "Typ panelu" i wybierz "Analit". Następnie kliknij "Krok protokołu" i wybierz wszystkie krzywe wiązania z listy.
   2. Kliknij "Automatyczny proces" i kliknij "Proces | Odniesienie do kanału | Międzypunkt". Następnie kliknij "Proces | Podwójne odniesienie | Wiersz | Format A6".
   3. Kliknij "Utwórz zestaw danych", aby zapisać indywidualne zestawy danych dla każdego mAb na wszystkich trzech powierzchniach do analizy kinetycznej.
   4. Kliknij "Zestaw danych analizy", zaznacz każdy zestaw danych mAb i kliknij "Analiza | Kinetyczny". Wybierz model "Langmuir" i "Jednoczesne ka/kd" i kliknij "Dalej".
   5. Zaznacz zarówno zakres dopasowania asocjacji, jak i dysocjacji, wybierz "Lokalny" R_max i kliknij "Dalej", aby wykonać dopasowanie w celu uzyskania dopasowanych parametrów kinetycznych.
   6. Powtórz powyższy krok, ale wybierz "Zgrupowane" R_max dla złączki, aby uzyskać eksperymentalne wartości_{R max} do obliczenia aktywności powierzchni liganda.

4. Pomiary kinetyczne w oktecie RED384

1. Przygotowanie odczynnika i płytki z próbką
   1. Przygotuj 50 ml 1x KB (bufor kinetyczny zawierający PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% albuminy i 0,05% azydku sodu), rozcieńczając 10x roztwór podstawowy w PBS.
   2. Dozować 1x KB do 96-dołkowej płytki w ilości 200 μl na studzienkę. Uwodnić 48 końcówek biosensorów zapobiegających wychwytywaniu przez ludzi (AHC) w tych indywidualnych studzienkach przez co najmniej 10 minut.
   3. Przygotować każdą próbkę mAb w stężeniach 20 μg/mL, 10 μg/ml i 5 μg/ml w 1x KB, a także ludzki PCSK9 w 7 miareczkowanych stężeniach od 100 nM do 1,56 nM w 2-krotnych rozcieńczeniach seryjnych.
   4. Załaduj próbki mAb do 384-dołkowej mikropłytki z pochylonym dnem (zwanej płytką odczynnika), a ludzkie roztwory PCSK9 do innej 384-dołkowej mikropłytki (zwanej płytką próbki) w ilości 90 μl na studzienkę.
   5. Seria ładunków 1x KB i roztworów glicyny (pH 1,5) w studzienkach w obrębie płytki próbnej.
      UWAGA: Te studzienki 1x KB służą do wstępnego kondycjonowania chipów, stabilizacji linii podstawowej i dysocjacji analitu. Roztwór glicyny służy do regeneracji.
2. Konfiguracja metody eksperymentalnej
   1. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Eksperyment | Nowy kreator eksperymentów | Nowy eksperyment kinetyczny | Podstawowa kinetyka".
   2. W polu "Definicja płyty" wykonaj poniższe czynności, aby zdefiniować typy i pozycje próbek.
      1. Wybierz "16" kanałów i format "384-well".
      2. Zdefiniuj lokalizacje próbki i odczynnika na wyświetlaczu płytki, przytrzymując Shift podczas klikania lewym przyciskiem myszy na dołku, aby podświetlić 16 dołków jednocześnie.
      3. Kliknij prawym przyciskiem myszy studzienki zawierające próbki mAb i wybierz "Załaduj", aby oznaczyć krok, na którym mAb są ładowane (lub przechwytywane) do czujników AHC. Wprowadź nazwy mAb i stężenia w tabeli po prawej stronie.
      4. Kliknij prawym przyciskiem myszy studzienki zawierające ludzki PCSK9 i wybierz "Próbka", aby wskazać krok, na którym zanurzane są czujniki wychwycone przez mAb i mierzone są interakcje wiązania. Wprowadź odpowiednie stężenia molowe w tabeli po prawej stronie.
      5. Zdefiniuj studzienki zawierające 1x KB jako "Bufor" lub "Neutralizacja", a studzienki zawierające glicynę jako "Regeneracja".
   3. W sekcji "Definicja testu" wykonaj poniższe czynności, aby zdefiniować konfigurację eksperymentalną:
      1. Kliknij "Dodaj" i wybierz kroki "Linia bazowa", "Regeneracja", "Równoważenie", "Ładowanie", "Asocjacja" i "Dysocjacja" do listy z czasami "30" s, "30" s, "18" s, "200" s, "500" s i "1800" s, odpowiednio. Prędkość wstrząsania wynosi "1000" obr./min.
      2. Aby dodać kroki do "Listy kroków testu", najpierw kliknij krok, a następnie kliknij studzienki znajdujące się w próbce lub płytce odczynnika. Kroki są następujące:
         1. Równowaga-regeneracja: kondycjonuje czujniki AHC przez trzy cykle "15"-s zanurzeń glicyny (pH 1,5), naprzemiennie ze spadkami "15"-s w 1x KB.
         2. Ładowanie: przechwytywanie próbek mAb na czujnikach AHC przez "200" s.
         3. Linia bazowa: ustal sygnał BLI dla "60" s przed krokiem asocjacji.
         4. Asocjacja: zanurz czujniki w studzienkach zawierających różne stężenia ludzkiego PCSK9 na okres asocjacji "500"-s.
         5. Dysocjacja: zanurz czujniki związane z PCSK9 w nowych studzienkach o pojemności 1x KB na okres dysocjacji "1,800" s.
         6. Regeneracja: zanurz czujniki związane z mAb-PCSK9 w studzienkach glicyny (pH 1,5) z dwoma impulsami "18"-s między każdym cyklem wiązania.
   4. W sekcji "Przejrzyj eksperymenty" przejdź przez kolejne kroki i w razie potrzeby wprowadź zmiany, wracając do poprzednich kart.
   5. W polu "Uruchom eksperymenty" wprowadź czas opóźnienia "60" s i potrząśnij płytką próbki podczas oczekiwania. Ustaw temperaturę płyty na "25" °C i naciśnij "GO".
3. Analiza danych za pomocą oprogramowania do analizy danych ForteBio
   1. Kliknij "Wybór danych | Załadowane dane | Kinetyka | Przeciwciała PCSK9 wiążące się z PCSK9 7.23.14"
   2. W sekcji "Przetwarzanie" przetwarzaj dane w następujący sposób:
      1. W kroku 1: kliknij "Wybór czujnika", aby podświetlić czujniki w H1-H6, kliknij je prawym przyciskiem myszy i kliknij "Zmień typ czujnika | Czujnik odniesienia."
      2. W kroku 2 zaznacz "Odejmowanie" i wybierz "Średnie czujniki odniesienia", aby odjąć każdy aktywny czujnik próbki od średniej z 6 ślepych czujników buforowych.
      3. W kroku 3 kliknij "Wyrównaj oś Y" i wybierz "Linia bazowa", aby wyrównać wszystkie krzywe wiążące do kroku linii bazowej przed asocjacją.
      4. W kroku 5 zaznacz "Filtrowanie Savitsky'ego-Golaya", aby wygładzić krzywe wiązania poprzez zwiększenie stosunku sygnału do szumu, a następnie kliknij "Przetwarzaj dane!".
      5. W kroku 6 kliknij "Przetworzone wyniki", aby wyświetlić przetworzone krzywe wiążące.
      6. W kroku 7 przejrzyj cztery panele po prawej stronie, w których wyświetlane są krzywe powiązania po każdym kroku przetwarzania, a następnie kliknij "Zapisz przetworzone dane".
   3. W "Analizie" zaznacz "Asocjacja i dysocjacja" i wybierz model "1:1".
   4. Podświetl krzywe wiązania dla dopasowania "Globalny (pełny)" i pogrupuj je według "koloru". Użyj "R_max spred", aby wykonać dopasowanie grupowe na czujnikach pokrytych tym samym stężeniem mAb w celu uzyskania eksperymentalnych wartości R_max do obliczenia aktywności powierzchniowej liganda, oraz "R_max unlinked by sensor" (R max odłączone przez czujnik), aby wykonać globalne dopasowanie na czujnikach pokrytych wieloma stężeniami mAb.
   5. Kliknij "Dopasuj krzywe", aby uzyskać dopasowane parametry kinetyki. Wyniki należy zapisywać na końcu każdej analizy dopasowania.

5. Pomiary kinetyczne w IBIS MX96

1. Przygotowanie instrumentów i odczynników
   1. Równowaga chipa COOH-G w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   2. Przygotuj 1-litrową butelkę z buforem do pracy systemu (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) i buforem immobilizacyjnym (10 mM octan sodu [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
   3. Przygotować każdy mAb od 20 μg/ml do 0,16 μg/ml przez 2-krotne seryjne rozcieńczenia zarówno w buforze z uruchomionym układem, jak i w buforze immobilizacyjnym z octanu sodu (pH 5,0).
   4. Dozować próbki mAb do dwóch oddzielnych 96-dołkowych płytek, w których każda mAb zajmuje 8 pionowych dołków w stężeniach miareczkowania przy 200 μl na studzienkę.
   5. Rozmrozić podwielokrotności 400 mM EDC i 100 mM sulfo-NHS w temperaturze pokojowej.
   6. Przygotować 300 μl białka A/G w stężeniu 50 μg/ml w buforze do immobilizacji octanu sodu (pH 5,0) i odpipetować do fiolki.
   7. Przygotować 200 μl ludzkiego PCSK9 od 100 nM do 0,39 nM przez 2-krotne seryjne rozcieńczenia w buforze systemowym. Odpipetować je do oddzielnych fiolek.
2. Kinetyka wielocyklowa z układami przeciwciał sprzężonych aminami
   1. Wymieszać podwielokrotności EDC/sulfo-NHS (400 mM/100 mM) i dozować mieszaninę do górnych 48 dołków nowej 96-dołkowej płytki w temperaturze 200 μl na studzienkę.
   2. Umieść płytkę źródłową mAb (rozcieńczoną octanem sodu [pH 5,0]) w pozycji 2, a płytkę odczynnika EDC/sulfo-NHS w pozycji 1 wewnątrz drukarki.
   3. Zainstaluj chip czujnika w CFM. Otwórz oprogramowanie "CFM 2.0", a następnie kliknij "Załaduj ustawienia | 96 Para amin". Matrycę przeciwciał 10 x 8 tworzy się w następujący sposób:
      1. Dostarczyć EDC/sulfo-NHS w górnej połowie płytki odczynnika do czujnika za pomocą 48 mikrokanałów i przesuwać je po powierzchni czujnika przez "5" minut.
      2. Dostarczyć próbki mAb z górnej połowy płytki źródłowej do czujnika i cyklicznie przesuwać je po aktywowanych powierzchniach przez "10" minut.
      3. Dostarczyć bufor immobilizacyjny z 50 ml stożkowej probówki po powierzchni przeciwciała przez "5" min.
      4. Powtórzyć powyższe procedury dla pozostałych próbek mAb znajdujących się w dolnej połowie płytki źródłowej.
   4. Zadokuj wydrukowany chip czujnika w urządzeniu. W oprogramowaniu sterującym kliknij "Plik | Połącz się | Pomiar otwarty | Istniejący pomiar" i wybierz "2014-08-15".
   5. W "Ogólne" wybierz "G - System Prime" w sekcji "Pełny skrypt systemowy". Następnie wybierz "G - Quench", aby dezaktywować powierzchnie mAb poprzez wstrzyknięcie 150 μL 1 M etanoloaminy.
   6. Kliknij "Kamera", aby zobrazować tablice mAb i w razie potrzeby dostosować kontrast. Ustaw czerwone kwadratowe pola tak, aby otaczały plamki mAb, a następnie przenieś zielone kwadratowe pola do punktów pośrednich znajdujących się między aktywnymi plamkami mAb w celu odniesienia.
   7. W polu "Analysis Cycle" (Cykl analizy) wybierz opcję "A - AP Standard Run" w sekcji "IBIS Scripts". Ustaw 1,0 min dla linii bazowej, 10,0 min dla asocjacji i 90 kroków dla dysocjacji z prędkością 8 μl/s.
   8. Wewnątrz "cykli" wstrzykuje się ludzki PCSK9 po jednym stężeniu na raz po pięciu wstrzyknięciach buforu. Zregeneruj powierzchnie mAb za pomocą glicyny o pH 2,0 pomiędzy każdym cyklem wiązania.
3. Kinetyka jednego cyklu z matrycami przeciwciał wychwyconych przez Fc
   1. Zainstaluj nowy układ czujnika w CFM. Powtórzyć kroki 5.2.3-5.2.5 powyżej, zastępując próbki mAb białkiem A/G.
   2. Wyjmij chip czujnika z MX96 i włóż go z powrotem do drukarki CFM.
   3. Dostarczyć mAb w górnej połowie płytki do powierzchni czujnika białka A/G za pomocą 48 mikrokanałów i cyklicznie przesuwać je po powierzchni za pomocą przepływu dwukierunkowego przez 10 minut.
   4. Powtórz powyższy krok dla pozostałych próbek mAb w dolnej połowie płytki.
   5. Zadokuj wydrukowany układ czujnika w instrumencie MX96. W oprogramowaniu do akwizycji danych kliknij "Plik | Połącz się | Pomiar otwarty | Istniejący pomiar | Dalej" i wybierz "Kinetyczność wiązania białka A+G7.30.14".
   6. Kliknij "kamera", aby zobrazować tablice mAb i w razie potrzeby dostosować kontrast. Ustaw czerwone kwadratowe pola tak, aby otaczały plamki mAb, a następnie przenieś zielone kwadratowe pola do punktów pośrednich znajdujących się między aktywnymi plamkami mAb w celu odniesienia.
   7. W polu "Analysis Cycle" (Cykl analizy) wybierz opcję "A - AP Standard Run" w sekcji "IBIS Scripts". Ustaw "1.0 min" dla linii bazowej, "10.0 min" dla asocjacji i "10" kroków dla dysocjacji z prędkością "8 μL/s".
   8. Wewnątrz "cykli" wstrzykuje się ludzki PCSK9 po jednym stężeniu na raz po pięciu wstrzyknięciach buforu. Nie przeprowadza się regeneracji pomiędzy każdym wstrzyknięciem analitu.
4. Analiza danych za pomocą SPRint i Scrubber
   1. W oprogramowaniu SprintX kliknij "Plik | Otwórz plik trójkąta", wybierz wszystkie przykładowe wstrzyknięcia z listy i zaznacz "Zapisz plik SprintX", "Kalibracja" i "Oznaczanie RLL" przed kliknięciem "Analizuj"
      UWAGA: Wartości RLL odnoszą się do unieruchomionych/przechwyconych poziomów mAb na powierzchni czujnika.
   2. Zaznacz "Odniesienie" i wybierz "Lokalnie", aby użyć sąsiednich punktów odniesienia. Zaznacz również "Wyrównaj" przy pierwszym wstrzyknięciu, a następnie kliknij "Rozpocznij automatyzację".
   3. Na karcie Numer szeregowy wybierz opcję "Pokaż linijki na pasku narzędzi", dostosuj je, aby zaznaczyć mały obszar linii bazowej bezpośrednio przed pierwszym wstrzyknięciem próbki, a następnie wybierz opcję "Zero".
   4. Wygeneruj plik . IBMX do analizy w Scrubberze, wybierając opcję "Eksportuj do pliku ibmx", a następnie kliknij "Rozpocznij automatyzację".
   5. Uruchom Scrubber i załaduj plik . Plik IBMX. Wprowadź "100n" jako "Stężenie zapasów" i "2" jako "Współczynnik rozcieńczenia".
   6. Przytnij dane, usuń całą linię bazową przed rozpoczęciem iniekcji i wyrównaj krzywe wiązania na początku asocjacji.
      UWAGA: W przypadku eksperymentu z kinetyką jednego cyklu nie wyrównywać krzywych.
   7. Przejdź do zakładki "Kinetyka", wyreguluj linijkę na czas zakończenia wtrysku, wybierz "k_d" i dopasuj, a następnie "napraw k_d". Wybierz "k_{ak d}" i zamontuj go ponownie.
   8. Przesuń kolumnę k_d i dopasuj ponownie, aby jeszcze bardziej udoskonalić dopasowanie.
      UWAGA: Aby dopasować krzywe wiązania jednocyklowego, kliknij "Opts" i odznacz "Subtract", a następnie wybierz "Separate" i przesuń kolumnę "Begin Inj", aby dopasować profile asocjacji z powrotem do teoretycznego początku linii bazowej.
   9. Przejrzyj dopasowane parametry kinetyki na karcie Wyniki.

Results

Rysunek 1 pokazuje obraz matrycy przeciwciał z CFM i wykryte poziomy mAb za pomocą dwóch metod immobilizacji, a Rysunek 2 pokazuje odpowiednie sensorgramy wiązania wygenerowane w MX96 z wielocyklowych pomiarów kinetycznych i jednocyklowych pomiarów kinetycznych na tych tablicach mAb. Na rysunkach 3-6 przedstawiono krzywe wiązania w czasie rzeczywistym i kinetycznie dopasowane z wielu powierzchni pokrytych przeciwciałami wygenerowane w czterech platformach biosensorów. Rysunek 7 przedstawia porównanie końcowych szybkości kinetycznych i stałych wiązania równowagi uzyskanych z globalnej analizy tych krzywych wiązania. Indywidualne stałe wiązania asocjacji (k_a), dysocjacji (k_d) i równowagi (K_D) przedstawiono w tabeli 1. Aby zademonstrować zmienność zestawów danych generowanych w tym samym instrumencie, rysunek 8 przedstawia wykresy k_a, k_d i K_D przy różnych gęstościach powierzchni mAb, a rysunek 9 dalej porównuje obliczone aktywności wiązania powierzchni mAb na platformach biosensorów.

Rysunek 1. Multipleksowe macierze ligandów powierzchni przeciwciał sprzężonych z aminą (A) i Fc (B) z drukowania CFM w IBIS MX96. Obrazy wydrukowanych tablic są pokazane w lewych panelach, gdzie szare obszary otoczone czerwonymi kwadratami wskazują na obecność przeciwciał. Ciemniejsze plamki znajdujące się między plamkami aktywnego przeciwciała są używane do odejmowania referencyjnego. Każda kolumna zawiera przeciwciało wydrukowane w stężeniach miareczkowania określonych poniżej i po lewej stronie obrazu. Ilości wydrukowanych przeciwciał określone ilościowo poprzez obliczenie różnicy w przesunięciach masowych między lokalizacjami aktywnymi i referencyjnymi są pokazane w prawych panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Porównanie sensorgramów wiązania w czasie rzeczywistym z wielocyklowych (A) i jednocyklowych (B) eksperymentów kinetycznych w IBIS MX96. Sekwencyjne wstrzyknięcia ludzkiego PCSK9 w rosnących stężeniach w układach przeciwciał 10 x 8 są odnotowane powyżej każdego odpowiedniego segmentu sensorgramu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Wiążące sensorgramy wychwyconych przeciwciał oddziałujących z ludzkim modelem kinetycznym PCSK9 i 1:1 pasują do nakładek w Biacore T100. Interakcje są oceniane na powierzchniach o wysokiej gęstości (panele górne), średniej (panele środkowe) i niskiej (panele dolne). Nałożone na siebie gładkie czarne linie reprezentują kinetyczne dopasowanie sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach PCSK9 u ludzi (kolorowe linie) do modelu interakcji 1:1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Wiążące sensorgramy przechwyconych przeciwciał oddziałujących z ludzkim PCSK9 i modelem kinetycznym 1:1 pasują do nakładek w ProteOn XPR36. Interakcje są oceniane na powierzchniach o wysokiej gęstości (panele górne), średniej (panele środkowe) i niskiej (panele dolne). Nałożone na siebie gładkie czarne linie reprezentują kinetyczne dopasowanie sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach PCSK9 u ludzi (kolorowe linie) do modelu interakcji 1:1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Wiążące sensorgramy wychwyconych przeciwciał oddziałujących z ludzkim modelem kinetycznym PCSK9 i 1:1 pasują do nakładek w oktecie RED384. Interakcje są oceniane na powierzchniach o wysokiej gęstości (panele górne), średniej (panele środkowe) i niskiej (panele dolne). Nałożone na siebie czerwone linie reprezentują dopasowanie kinetyczne sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach PCSK9 u ludzi (kolorowe linie) do modelu interakcji 1:1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Wiążące sensorgramy przeciwciał sprzężonych z aminą (A) i wychwyconych Fc (B) oddziałujących z ludzkim PCSK9 i modelem kinetycznym 1:1 pasują do nakładek w IBIS MX96. Profile oprawy są zorganizowane jako panele 10 x 8, które są zgodne z mapą płyt tablicowych na rysunku 1. Czarne linie reprezentują zarejestrowane sygnały odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach PCSK9 u ludzi, a nałożone czerwone linie reprezentują dopasowane krzywe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Porównanie stałych wiązania K_A (A), dysocjacji k_d (B) i równowagi K_d (C) generowanych przez cztery platformy biosensorów. Parametry kinetyczne pochodzą z globalnej analizy krzywych wiązania na rysunkach 3 - 6. Instrumenty są reprezentowane w następujący sposób: Biacore T100 (niebieski), ProteOn XPR36 (zielony), Octet RED384 (czerwony), IBIS MX96, sprzężony aminowo (fioletowy) i IBIS MX96, przechwycony przez Fc (pomarańczowy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8. Porównanie spójności kinetycznych, stałych szybkości dla wielu gęstości powierzchni przeciwciał w Biacore T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, sprzężony aminami (D) i IBIS MX96, wychwycony przez Fc (E). Parametry kinetyczne k_a (górne podpanele), k_d (środkowe podpanele) i K_D (dolne podpanele) pochodzą z analizy grupowej przy indywidualnej gęstości powierzchni przeciwciała. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9. Aktywność wiązania powierzchni przeciwciał i ich odchylenia standardowe (słupki błędów) w czterech platformach biosensorów. Wartości są obliczane za pomocą równań opisanych w artykułach naukowych¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	ka	kd	KD
	(M-1 s-1)	(s-1)	(nM)
mAb 1	11,7 (7,8) x 105	4,89 (4,18) x 10-5	0,052 (0,05)
mAb 2	1,53 (0,28) x 105	1,30 (1,54) x 10-5	0,092 (0,12)
mAb 3	11,4 (8,3) x 105	27,6 (11,0) x 10-5	0,333 (0,20)
mAb 4	3,61 (1,6) x 105	20,1 (12,3) x 10-5	0,659 (0,54)
mAb 5	0,59 (0,21) x 105	3,46 (2,50) x 10-5	0,663 (0,46)
mAb 6	1,19 (0,78) x 105	7,21 (3,83) x 10-5	0,894 (0,64)
mAb 7	1,29 (0,53) x 105	16,4 (5,63) x 10-5	1,57 (1,02)
mAb 8	4,02 (2,23) x 105	22,8 (10,7) x 10-5	0,768 (0,68)
mAb 9	4,20 (2,13) x 105	6,67 (4,3) x 10-5	0,197 (0,16)
mAb 10	1,20 (0,49) x 105	12,5 (7,64) x 10-5	1,27 (0,80)

Tabela 1: Wskaźniki kinetyczne i stałe wiązania równowagi 10 mAb uzyskane przez globalne dopasowanie krzywych wiązania z czterech instrumentów biosensorowych do modelu interakcji 1:1.

Discussion

Nasze bezpośrednie badanie porównawcze pokazuje, że każda platforma biosensorów ma swoje mocne i słabe strony. Mimo że profile wiązania przeciwciał są podobne w porównaniu wizualnym (ryc. 3 - 6), a kolejność rang nabytych stałych szybkości kinetycznej jest wysoce spójna we wszystkich instrumentach (ryc. 7), nasze wyniki pokazują, że instrumenty oparte na SPR z płynnością o ciągłym przepływie) są lepsze w rozwiązywaniu interakcji o wysokim powinowactwie przy powolnych szybkościach dysocjacji. W zbiorach danych (np. mAb 2, mAb 5 i mAb 9 obserwuje się dryf w górę; Rysunek 5) generowane przez przyrząd BLI wolny od płynów. Odkrycie to można w dużej mierze przypisać parowaniu próbki w czasie w mikropłytce, co jest głównym ograniczeniem systemu. Z tym nieodłącznym ograniczeniem, czas eksperymentu jest również ograniczony do mniej niż 12 godzin; Eksperymenty zostały zatem zaprogramowane z krótszymi czasami (500 s asocjacji i 30 minut dysocjacji) w porównaniu z innymi platformami (10 minut asocjacji i 45 minut dysocjacji). Wydaje się jednak, że skrócenie czasu eksperymentu nie złagodziło wpływu parowania na jakość/spójność danych, ponieważ stałe szybkości generowane przez instrument oparty na BLI wykazują mniejszą liniowość w wyniku wahań niektórych wskaźników (Rysunek 8C). Oprócz odparowania próbki, różnice w użytych odczynnikach do wychwytywania mogły również przyczynić się do różnic w uzyskanych wynikach. Podczas gdy białko A/G zostało użyte we wszystkich trzech platformach SPR opartych na fluidyce, czujniki AHC zastosowano w niepłynnej platformie BLI. Ponieważ białko A / G prawdopodobnie ma słabsze powinowactwo do mAb niż AHC, powierzchnia biosensora oparta na przeciwciałach, odstępy kompleksu mAb-antygen z powierzchni białka A / G mogą sztucznie pojawiać się szybciej niż te uzyskane z powierzchni AHC. Za taką możliwością przemawiają dane eksperymentalne, z których wynika, że wartości odchyleń generowane przez platformę BLI były konsekwentnie niższe niż te uzyskane z innych instrumentów (Rysunek 7, czerwona linia). Niemniej jednak platforma BLI ma inne zalety w porównaniu z innymi platformami. Na przykład jest bardzo elastyczny pod względem wyboru czujnika i konfiguracji testu dzięki różnym wstępnie powlekanym czujnikom do natychmiastowego użycia. W naszych eksperymentach zastosowanie czujników AHC wyeliminowało potrzebę etapów unieruchomienia liganda, skracając czas przygotowania. Co więcej, platforma BLI wymaga znacznie mniej konserwacji w porównaniu z innymi platformami SPR Fluidics, które charakteryzują się skomplikowanymi konfiguracjami przewodów i przełączników wartości. Ta funkcja jest zaletą w przypadku eksperymentów z surowymi próbkami, które mogą powodować problemy z zatykaniem i zanieczyszczeniem.

Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na wydajną, szybką i dokładną identyfikację kandydatów terapeutycznych rośnie również zapotrzebowanie na przepustowość bioczujników. Spośród czterech platform biosensorów przepustowość z biosensora zdolnego do drukowania matrycy 96-ligandowej jest najwyższa, a następnie bioczujnik sprzężony z krzyżującym się formatem 36-ligandowym oraz bioczujnik oparty na BLI z 16-kanałowym równoczesnym odczytem, co ostatecznie zwiększa liczbę interakcji mierzonych w jednym cyklu wiązania do 96, 36 i 16, odpowiednio. Te możliwości przepustowości są znacznie wyższe niż w przypadku tradycyjnej platformy SPR, która jest ograniczona przez posiadanie tylko czterech komórek przepływowych połączonych jednym przepływem szeregowym. Ponieważ nasze eksperymenty obejmowały stosunkowo mały zestaw próbek 10 mAb ocenianych przy różnych gęstościach powierzchni z długimi czasami dysocjacji, przepustowości instrumentalne odegrały umiarkowaną rolę w określaniu efektywności eksperymentów. Nie stwierdzono istotnych różnic w czasie eksperymentów trzech wysokoprzepustowych platform i we wszystkich przypadkach eksperymenty zostały zakończone w ciągu jednego dnia. Z drugiej strony, tradycyjne eksperymenty SPR z przepływem szeregowym wymagały 3 dni na ukończenie, pomimo całkowitej automatyzacji pozyskiwania danych po konfiguracji. W innych badaniach, które obejmują dużą liczbę próbek (tj. w setkach lub tysiącach), do celów oceny poza oceną/badań kinetycznych lub kategoryzacji epitopów, przepustowość staje się czynnikiem krytycznym.

Chociaż przepustowość w IBIS MX96 jest o rzędy wielkości wyższa niż w przypadku innych biosensorów i dlatego jest optymalnym wyborem do tych celów, ma kilka wad. W szczególności drukowanie macierzy przez CFM wykazuje duże niespójności powierzchni (rysunek 1) i zmniejszoną odtwarzalność danych (rysunek 8D oraz 8E). W przypadku dokładnych pomiarów kinetycznych ilość ligandu na powierzchni biosensora jest krytycznym parametrem, który należy kontrolować, aby zapewnić, że reakcje wiązania nie zostaną zakłócone przez czynniki wtórne, takie jak transfer masy lub przeszkoda steryczna. W przypadku Biacore T100 i ProteOn XPR36 optymalne poziomy R_L zostały określone na podstawie standardowych obliczeń ustawionych wartości R_max , jak opisano w artykule^{badawczym 17}. Z drugiej strony, w przypadku platform Octet RED384 i IBIS MX96, poziomy wychwytu mAb osiągnięto empirycznie przy użyciu serii 2-krotnie seryjnie rozcieńczonych przeciwciał w stałych momentach. Brak wiedzy lub kontroli nad etapem wychwytywania skutkował powierzchnią o dużej gęstości i wysokimi sygnałami odpowiedzi wiązania (rysunek 2), co mogło zagrozić dokładności stałych szybkości kinetycznej. Co więcej, oddzielenie drukarki od detektora SPR stanowi również wyzwanie podczas przeprowadzania pomiarów wielu cykli wiązania obejmujących regeneracje. Jedynym sposobem na przeprowadzenie wielocyklowej konfiguracji kinetyki było bezpośrednie sprzężenie aminowe mAb, w przeciwieństwie do wychwytywania przez mAb Fc przez unieruchomioną powierzchnię białka A / G w pozostałych trzech platformach biosensorów. W związku z tym konieczny był dodatkowy eksperyment zwiadowczy w celu określenia optymalnych warunków regeneracji. Wynik tej konfiguracji był związany z ~90% niższą obserwowaną aktywnością powierzchniową w porównaniu z metodą wychwytywania Fc (Rysunek 9), a także z dłuższym czasem eksperymentu. Aby zastosować metodę wychwytywania Fc, przyjęto alternatywne podejście kinetyczne jednocyklowe. Podejście to polega na sekwencyjnym wstrzykiwaniu analitu w rosnących stężeniach bez regeneracji między każdym wstrzyknięciem (ryc. 2). To bardzo wygodne, ale rzadziej stosowane podejście nie tylko skróciło czas eksperymentu i zmniejszyło zużycie odczynników, ale także pozwoliło uzyskać kinetyczne stałe szybkości bardzo podobne do tych z innych biosensorów (rysunek 7). W związku z tym zastosowanie tego podejścia opartego na kinetyce pojedynczego cyklu pozwala przezwyciężyć nieodłączne ograniczenia konfiguracji instrumentu i stwarza możliwość uzyskania stałych szybkości kinetycznej o wysokiej rozdzielczości w sposób wysokoprzepustowy.

Pomimo tego, że przepustowość jest głównym ograniczeniem w Biacore T100, nasze wyniki pokazują, że wygenerował on najbardziej spójne dane o najwyższej jakości. Na drugim miejscu znalazł się ProteOn XPR36, który ma ~ 10-krotnie wyższą przepustowość. Ich zdolność do generowania wysokiej jakości danych staje się zaletą przy charakteryzowaniu interakcji przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie, które mogą być technicznie trudne po osiągnięciu limitów wykrywalności urządzeń. Podczas gdy systematyczne ograniczenia w oprzyrządowaniu Octet RED384 utrudniają dokładny pomiar stałych szybkości dysocjacji (tj. brak czułości pozwalającej na rozwiązanie wystarczającego zaniku sygnału dla spowolnienia), zarówno Biacore T100, jak i ProteOn XPR36 mogą zapewnić czułe i niezawodne wykrywanie różnicowania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System Biacore T100	GE Healthcare	28975001	System T100 został zaktualizowany do układu czujnika T200
CM5	BR100012		GE Healthcare
	GE Healthcare		wersja 4.1
Oprogramowanie sterujące Biacore T100	GE Healthcare		Oprogramowanie sterujące T100 zostało zaktualizowane do
zestawu sprzęgającego aminy	Healthcare	BR100050	Zawiera: 750 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC), 115 mg N-hydroksysukcynimidu (NHS), 10,5 ml 1,0 M etanoloamino-HCl pH 8,5
Bufor HBS-EP+ 10 razy;	GE Healthcare	BR100669	Skoncentrowany roztwór podstawowy
Fiolki plastikowe, średn. 7 mm	GE Healthcare	BR100212
Kapsle gumowe, typ 3	GE Healthcare	BR100502
Fiolki i nakrętki plastikowe, ø 11 mm	GE Healthcare	BR100214
System macierzy interakcji białkowych ProteOn XPR36	Bio-Rad	1760100
Oprogramowanie ProteOn Manager	Bio-Rad	1760200	Wersja 3.1.0.6
Układ czujnika GLM	Bio-Rad	1765012
Zestaw sprzęgający aminy	Bio-Rad	1762410	Obejmuje EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanoloaminę HCl
Zestaw do regeneracji i kondycjonowania oraz	Bio-Rad	1762210	Zawiera po 1 buforze glicyny (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) oraz NaOH, SDS, HCl, kwas fosforowy, NaCl; 50 ml każdego roztworu
2 l buforu PBS/Tween/EDTA	Bio-Rad	1762730	Zawiera sól fizjologiczną buforowaną hosphatem (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA
Oktet RED384 System	Forté
Oprogramowanie do analizy danych	biologicznych Forté		Bio Version 9.0.0.4
Zanurz i odczyt biosensorów anty-hIgG Fc Capture (AHC)	Forté Bio	18-5060	Jedna taca z 96 biosensorami
384-dołkowa płyta z pochylonym dnem	Forté Bio	18-5080
Dozownik Biosensora	Forté Bio	18-5016
Bufor kinetyczny 10x	Forté Bio	18-1092	10x stężenie. Zawiera ProClin 300.
IBIS MX96 SPRi System	Wasatch Microfluidics
Microfluidics Drukarka mikroskopu ciągłego przepływu (CFM)	Wasatch Microfluidics		wersja 2.0
Układ SensEye COOH-G	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
Oprogramowanie do analizy danych	Wasatch Microfluidics		Wersja 6.19.3.17
Oprogramowanie	do analizy danych SPRintWasatch Microfluidics		Wersja 6.15.2.1
Scrubber 2	Oprogramowanie		Wersja 2
Rekombinowane białko Pierce A/G	ThermoFisher Scientific	21186