Artykuł metodologiczny

Porównanie wpływu oparów papierosów elektronicznych i dymu papierosowego w nowatorskim systemie ekspozycji in vivo

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55672

⸱

24 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jobst Vascular Research Laboratory, University of Michigan Medical School, 2Department of Engineering, Purdue University, 3Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, University of Michigan Health System

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wystawiania gryzoni na działanie oparów papierosów elektronicznych (E-vapor) i dymu papierosowego. Komory ekspozycyjne są konstruowane poprzez modyfikację komór anestezjologicznych za pomocą zautomatyzowanego systemu pompowania, który dostarcza gryzoniom parę E lub dym papierosowy. System ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić wiele eksperymentalnych punktów końcowych.

Streszczenie

Elektroniczne papierosy (E-cigarettes) są szeroko stosowane i zyskują na popularności. Szacuje się, że regularnie korzysta z nich ponad 9 milionów dorosłych. Potencjalne niekorzystne skutki zdrowotne narażenia na opary papierosów elektronicznych (E-vapor) są słabo zdefiniowane. Podczas gdy opracowano kilka modeli zwierzęcych E-steam exposure zostało opracowanych, niewiele modeli wystawia gryzonie na klinicznie istotne ilości nikotyny i dokonuje bezpośrednich porównań do dymu papierosowego w tym samym systemie ekspozycji. W tym miejscu przedstawiamy metodę konstruowania i obsługi E-komora parowa i komora dymu papierosowego. Komory są zbudowane poprzez wyposażenie komór anestezjologicznych w sterowany komputerowo system pompowania, który dostarcza gryzoniom stałe ilości E-para lub dym papierosowy dla gryzoni. Narażenie na nikotynę mierzy się pośrednio poprzez ilościowe określenie poziomu kotyniny w surowicy przed i po ekspozycji. Ten system ekspozycji może być modyfikowany tak, aby uwzględniał różne typy E-papierosów i papierosów tytoniowych, i może być używany do porównywania efektów E-vapor i dym papierosowy in vivo.

Wprowadzenie

Od momentu wejścia na rynek amerykański w 2004 roku, elektroniczne papierosy (e-papierosy) rozrosły się do wartego miliardy dolarów przemysłu i szacuje się, że prawie 9 milionów dorosłych używa ich regularnie1. W 2014 i 2015 roku więcej uczniów szkół średnich używało e-papierosów niż tradycyjnych papierosów2. Rosnąca liczba użytkowników e-papierosów zrodziła wysiłki badawcze mające na celu ocenę ich potencjalnych negatywnych skutków zdrowotnych.

E-papierosy wytwarzają parę (nazwaną "E-vapor") poprzez podgrzanie lepkiego roztworu, który zazwyczaj zawiera mieszaninę wody, glikolu polietylenowego lub gliceryny roślinnej, nikotyny i aromatów3,4. Wykazano, że para elektroniczna zawiera kilka szkodliwych związków, w tym reaktywne formy tlenu (ROS), nikotynę, różne aldehydy i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne5,6. Wiele z tych związków powstaje podczas procesu waporyzacji E-liquidu przed inhalacją7. Warto zauważyć, że kilka z tych szkodliwych związków jest również obecnych w dymie papierosowym, co budzi obawy, że używanie e-papierosów może mieć podobne negatywne konsekwencje zdrowotne7.

Nie ma zgody co do wpływu e-papierosów na zdrowie. Aby rozwiązać ten problem, opracowano kilka zwierzęcych modeli ekspozycji na opary E (Tabela 1). Modele te wykorzystują różne metody, takie jak naświetlanie całego ciała na e-parę i wentylacja mechaniczna. Podczas gdy obecne modele dostarczyły wnikliwych danych, niewiele z nich dokonuje bezpośrednich porównań z dymem papierosowym w ramach tego samego systemu ekspozycji (Tabela 1). Ponadto, podczas gdy kilka badań na ludziach wykazało, że użytkownicy e-papierosów i palacze papierosów mają poziom kotyniny w surowicy między 30-200 ng / ml, wiele modeli ekspozycji na dym papierosowy i parę elektroniczną wykracza poza ten zakres8,9,10,11,12.

Tutaj prezentujemy metodę porównywania efektów ekspozycji na dym papierosowy i opary E-in vivo, która daje poziom kotyniny w surowicy podobny do badań na ludziach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół został wykonany pod nadzorem i za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Montaż komory do waporyzacji e-papierosów

UWAGA: Cała komora powinna być umieszczona w dygestorium podczas użytkowania. Komora opisana w niniejszej procedurze znajdowała się w środowisku laboratoryjnym z filtrowanym powietrzem i kontrolowaną temperaturą. Badacze mogą zdecydować się na monitorowanie tych aspektów systemu, aby zapewnić stałą jakość powietrza w pomieszczeniu. Opcjonalnie, osłonięcie monitorów metalową klatką może zapobiec ingerencji gryzoni, umożliwiając jednocześnie monitorom pobieranie próbek z wnętrza środowiska komory. 

  1. Przygotować komorę do znieczulenia o objętości 20 L z hermetyczną, zdejmowaną pokrywą.
  2. Używając wyrzynarki z brzeszczotem odpowiednim do cięcia danego materiału, wyciąć w pokrywie komory otwór o średnicy 10,2 cm, w odległości około 7,6 cm od tylnej krawędzi komory.
  3. Włożyć regulowany otwór wentylacyjny do otworu i zamocować go za pomocą dowolnego uszczelniacza typu caulk.
    UWAGA: Należy upewnić się, że uszczelniacz jest niedostępny dla gryzoni w komorze, ponieważ mogą one go przegryźć. Aby uniknąć tego problemu, uszczelniacz należy nałożyć na zewnętrzną ściankę komory podczas montażu wentylacji.
  4. Przeciąć rurkę silikonową na dwa odcinki o długości 15 cm i przytwierdzić końce do obu stron łącznika T.
    UWAGA: Rurki silikonowe mogą wchodzić w reakcję z niektórymi składnikami e-papierosów lub dymu papierosowego. Dlatego badacze mogą rozważyć zastosowanie rurek nieaktywnych.
  5. Przewlec obie rurki silikonowe przez gotowe otwory znajdujące się z przodu pokrywy komory w taki sposób, aby łącznik T znajdował się wewnątrz komory. Należy upewnić się, że rurki są przymocowane do pokrywy za pomocą uszczelniacza lub taśmy izolacyjnej.
  6. Wolne końce rurek silikonowych połączyć z wylotami dwóch mikropomp powietrznych. Pompy należy przymocować do pokrywy komory za pomocą dwustronnej taśmy klejącej lub uszczelniacza.
    UWAGA: Długość rurki podłączonej do wylotu pompy powinna być krótka, aby ograniczyć ilość pary skraplającej się na wewnętrznej powierzchni rurki podczas użytkowania.
  7. Używając nowej rurki silikonowej, przymocować jeden koniec do wlotu jednej z pomp powietrznych (Pompa A na Rysunku 1) i przyciąć tę rurkę do długości około 4 cm. W tym miejscu podczas pracy komory będzie umieszczany e-papieros. Należy upewnić się, że średnica rurki pozwala na ciasne dopasowanie do końcówki e-papierosa.
  8. Używając nowej rurki silikonowej, przymocować jeden koniec do wlotu drugiej pompy powietrznej (Pompa B na Rysunku 1). Pompa ta będzie wprowadzać powietrze z pomieszczenia do komory. W związku z tym koniec rurki musi znajdować się poza dygestorium. Długość tej rurki nie jest krytyczna, ale powinna być jak najkrótsza, aby ograniczyć opór przepływu powietrza.
  9. Wewnątrz komory przytwierdzić za pomocą dwustronnej taśmy klejącej dwa małe haczyki do utrzymania monitorów poziomu tlenu i tlenku węgla.

figure-protocol-1
Rycina 1. Schemat komory z oparami e-papierosów.
Komora znajduje się w dygestorze (nie pokazano). Pompa powietrza pokojowego (Pompa B) nieprzerwanie wprowadza powietrze z pomieszczenia spoza dygestora do komory z prędkością 2 L/min. Pompa e-papierosów (Pompa A) wprowadza 133 mL oparów e-papierosów w ciągu 4 s, z 30 s odstępem. Opary e-papierosów i powietrze pokojowe mieszają się przed wpompowaniem do komory. Monitory gazowe stale mierzą stężenia tlenku węgla (CO) i tlenu (O2) wewnątrz komory. Opary e-papierosów są pasywnie usuwane przez otwór wentylacyjny do dygestora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

2. Montaż komory z dymem papierosowym

UWAGA: Z systemem tym można stosować praktycznie każdą markę papierosów, jednak standaryzowane papierosy badawcze, takie jak University of Kentucky 1R6F Research Cigarette, są najbardziej opłacalne, niezawodne i najlepiej dostosowane do tej aplikacji.

  1. Wykonaj kroki 1.1 – 1.6, & krok 1.9.
  2. Za pomocą nowej rurki silikonowej podłącz jeden koniec do urządzenia do zapalania papierosów, a drugi koniec do strony wlotowej pompy powietrznej (Pompa A w Rysunek 2). Urządzenie do zapalania papierosów powinno być umieszczone wewnątrz dygestorium, poza komorą podczas użytkowania.
    Uwaga: Konstrukcja urządzenia do zapalania papierosów wymaga wiedzy z zakresu obróbki metali oraz inżynierii elektrycznej. Choć w niniejszym tekście nie przedstawiono szczegółowej instrukcji budowy, plany znajdują się w materiałach uzupełniających.
  3. Za pomocą nowej rurki silikonowej podłącz jeden koniec do drugiej pompy powietrznej (Pompa B w Rysunek 2). Pompa ta będzie wprowadzać powietrze pokojowe do komory, dlatego koniec rurki musi znajdować się poza dygestorium.
  4. Wyciąć kilka pionowych szczelin o szerokości 5 mm w przedniej ściance komory, a następnie zamocuj wentylator komputerowy na zewnątrz komory w taki sposób, aby zakrywał on ten otwór. Upewnij się, że przód wentylatora jest skierowany w stronę komory, tak aby wentylator tłoczył powietrze do wnętrza komory przez ten otwór.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Schemat komory dymu papierosowego.
Pompa powietrza pokojowego (Pompa B) w sposób ciągły wprowadza powietrze z zewnątrz dygestorium do komory z prędkością 2 L/min. Pompa A zasysa dym z zapalonego papierosa przez 40 s z prędkością 2 L/min, a po 20 s wentylator komputerowy usuwa zawartość komory w ciągu 3 min. Dym i powietrze pokojowe mieszają się przed wpompowaniem do komory. Monitory gazowe na bieżąco mierzą stężenia tlenku węgla (CO) i tlenu (O2) w komorze. Dym jest odprowadzany przez otwór wentylacyjny do dygestorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Montaż mikrokontrolera i oprogramowanie

  1. Steruj systemem pompowania komory z parą e-papierosa i komory z dymem papierosowym za pomocą oddzielnych mikrokontrolerów. Pobierz oprogramowanie mikrokontrolera i wgraj kody operacyjne zawarte w Materiałach uzupełniających. Kod dla pary e-papierosa będzie uruchamiać pompę powietrza pokojowego w sposób ciągły i aktywować pompę e-papierosa na 4 s co 30 s. Kod dla dymu papierosowego będzie uruchamiać pompę powietrza pokojowego w sposób ciągły, aktywować pompę papierosową na 40 s, a następnie uruchamiać wentylator komputerowy 20 s po zatrzymaniu pompy papierosowej. Wentylator wyłączy się po 3 min pracy.
    Uwaga: Czas pracy pomp i wentylatora można dostosować według potrzeb. W celu wgrania odpowiednich kodów do mikrokontrolera należy zapoznać się z instrukcjami producenta.
  2. Aby złożyć mikrokontroler, podłącz przewody typu zip, diody, rezystory i kondensatory do płytki stykowej zgodnie z Rysunkiem 3 i przymocuj przewody z klipsami krokodylkami do odpowiednich pomp powietrza (oraz do wentylatora komputerowego dla komory z dymem papierosowym). Jeśli to możliwe, umieść mikrokontroler poza dygestorium.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Schemat mikrokontrolera.
Schemat mikrokontrolera i płytki stykowej do sterowania czasem pracy pomp powietrza i wentylatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Zwierzęta

  1. Należy wykorzystać dorosłe szczury o masie 450 - 520 g.
  2. Szczury należy podzielić na grupy zgodnie z rodzajem ekspozycji (np. e-papieros, dym papierosowy, powietrze pokojowe wpompowywane do komory).
  3. Przed rozpoczęciem ekspozycji należy pobrać 500 µL krwi do probówek z EDTA z żyły ogonowej za pomocą strzykawki, aby zmierzyć bazowe stężenie kotyniny w surowicy.
  4. Próbki krwi należy wirować przy 20 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 ˚C, a następnie zebrać surowicę. Należy upewnić się, że próbki są przez cały czas schładzane na lodzie.
  5. Zgodnie z protokołem producenta należy oznaczyć poziom kotyniny w zebranych próbkach surowicy. Próbki można również przechowywać w temperaturze -80 ˚C do późniejszego wykorzystania.

5. Obsługa komory do papierosów elektronicznych

  1. Wyczyścić wnętrze komory 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, aż komora będzie całkowicie sucha (około 30 min).
  2. Zkalibrować monitory gazów i zamontować cały monitor na ścianie wewnątrz komory.
  3. Umieścić szczury wewnątrz komory. Należy pamiętać, że jednocześnie może być poddanych ekspozycji do trzech zwierząt.
  4. Upewnić się, że e-papieros jest w pełni naładowany i zawiera odpowiednią ilość e-liquidu, a następnie włożyć e-papieros  do rury doprowadzającej. Kluczowe jest zapewnienie, aby bateria e-papierosa oraz poziom e-liquidu były wystarczające przez cały czas trwania 90-minutowej ekspozycji.
  5. Włączyć pompy powietrzne i uruchomić stoper.
  6. Podczas ekspozycji monitorować wskaźniki gazów, aby upewnić się, że komora zawiera >20% O2 oraz 0 ppm CO.
    Uwaga: Jeśli poziom tlenu spadnie, może to oznaczać niewłaściwą wentylację komory lub nieprawidłową kalibrację monitora tlenu.
  7. Po upływie 90 min czasu ekspozycji wyjąć e-papieros i kontynuować pracę pomp gazowych w celu usunięcia pozostałej pary. Dodatkowo można podnieść górną część komory, aby przyspieszyć wentylację.
  8. Po ustąpieniu pary wyjąć szczury i wyczyścić komorę.
  9. Pobrać 500 µL krwi z żyły ogonowej każdego szczura około 1 h po ekspozycji, na zakończenie protokołu eksperymentalnego.
  10. Postępować zgodnie z krokami 4.4 - 4.5 w celu wyizolowania surowicy i przeprowadzenia analizy poziomu kotyniny.

6. Obsługa komory do papierosów tytoniowych

  1. Wykonaj kroki 5.1 - 5.3.
  2. Włóż papierosa do urządzenia do zapalania papierosów, tak aby koniec papierosa stykał się z elementami grzejnymi.
  3. Włącz urządzenie do zapalania papierosów, aż niedopałek papierosa zacznie tlić się (około 5 s).
  4. Po zapaleniu papierosa włącz system pompowania, uruchom stoper i obserwuj palenie się papierosa do całkowitego wypalenia (około 40 s).
  5. Po wypaleniu papierosa ostrożnie usuń zużytego papierosa z urządzenia do zapalania papierosów za pomocą pęsety.
  6. Upewnij się, że poziom CO nie przekroczy 1000 ppm, a poziom O2 nie spadnie poniżej 20%. Czas i czas trwania pracy wentylatora komputerowego są kluczowe dla zapobiegania gromadzeniu się tlenku węgla.
  7. Po 4 min wyłącz system pompowania i powtórz krok 6.2, aż szczury będą eksponowane na dym tytoniowy przez 90 min (lub około 23 papierosy).
    UWAGA: Poziom tlenku węgla 4 min po wypaleniu papierosa powinien spaść poniżej 400 ppm, w przeciwnym razie w komorze może zacząć gromadzić się tlenek węgla.
  8. Po zakończeniu ekspozycji pozostaw włączony system pompowania w celu usunięcia pozostałego dymu. Gdy poziom tlenku węgla spadnie poniżej 100 ppm, wyjmij szczury z komory. Powinno to zająć od 5 do 10 min.
  9. Wyjmij szczury i oczyść komorę.
  10. Około 1 h po ekspozycji, na zakończenie protokołu eksperymentalnego, pobierz 500 µL krwi z żyły ogonowej, analogicznie jak w przypadku e-papierosów.
  11. Wykonaj kroki 4.4 - 4.5, aby wyizolować surowicę i przeprowadzić analizę zawartości kotyniny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie tlenku węgla i tlenu

Stężenia tlenu nie spadły poniżej 20% podczas ekspozycji na e-papierozy, a stężenia CO pozostawały niewykrywalne przez cały czas trwania ekspozycji. Monitory gazowe podczas ekspozycji na dym papierosowy wykazały, że stężenie tlenu utrzymywało się powyżej 20%. Stężenia tlenku węgla nie przekroczały 1 000 ppm (Rycina 4).

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano metodę konstruowania komór, które w kontrolowany sposób wystawiają gryzonie na działanie oparów E i dymu papierosowego (ryc. 6). Budowa komory na e-papierosy jest stosunkowo prosta i niedroga w porównaniu z komercyjnymi systemami ekspozycji 14,15,16. Części i narzędzia potrzebne do budowy komory są łatwo dostępne u komercyjnych dostawców online. Podobnie, zbudowanie komory dymu papierosoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były możliwe dzięki grantowi badawczemu Aortic Research Grant (University of Michigan) dla dr Eliasona. Autorzy pragną również podziękować Nickowi Scottowi z Wydziału Znaków i Grafiki Operacji Zakładowych Uniwersytetu Michigan za pomoc w projektowaniu i montażu urządzenia do zapalania papierosów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw akumulatorów blu PLUSblu eCigsN/A
1R6F Referencyjne centrum papierosówdla Tob Ref  Prod UKN/A
Lexan Komora anestezjologiczna 20 LJorgensen LaboratoriesJOR265
Arduino UNOArduino2877
Prostownik diodowy - 1 A; 50 VSpark FunCOM-08589
Rezystor 10 KOhm 1/6 W PTH - 20 sztukSpark FunCOM-11508
Kondensatory odsprzęgające elektrolityczne - 100 uF/25 VSpark FunCOM-00096
Płytka stykowa bez Systemy prototypowe BusBoardBB400
Przewody z zaciskiem krokodylkowymSystemy prototypowe BusBoardCA-M-20
ZipWireBusBoardZW-MM-10
Wentylator standardowy 80 ST2Cooler MasterR4-S8R-20AK-GP
Regulowany odpowietrznik ARIC 4"BestlouverN/A
ToxiPro  Monitor tlenku węgla (CO)Honeywell Analytics54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) MonitorHoneywell Analytics54-45-90-VD
Stacja dokująca ToxiPro IQ ExpressHoneywell/Sperian Biosystems 54-46-9100
Hak ścienny Command Mały drut 6-pak3MN/A
Micro pompa wodna/powietrznaXiamen Conjoin ElectronicsCJWP40-A12A1
1/4 "Rurka silikonowaNewAge2801470-100
T ZłączeBel-Art SciencewareF196060000
Plastikowa probówka z krwią pełną z natryskiwanym natryskiem K2EDTABecton, Dickinson and Company367841
zestaw COTYNINE ELISACalbiotechCO096D
Systemy prototypowe

Bibliografia

  1. Schoenborn, C. A., Gindi, R. M. Electronic Cigarette Use Among Adults: United States, 2014 Key findings. NCHS. , (2014).
  2. Singh, T. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011-2015. MMWR. 65 (14), 361-367 (2016).
  3. Flora, J. W. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regul. Toxicol. Pharmacol: RTP. 74, 1-11 (2016).
  4. Tierney, P. A., Karpinski, C. D., Brown, J. E., Luo, W., Pankow, J. F. Flavour chemicals in electronic cigarette fluids. Tob. Control. , (2015).
  5. Sleiman, M. Emissions from Electronic Cigarettes: Key Parameters Affecting the Release of Harmful Chemicals. Environ. Sci. Technol. 50 (17), 9644-9651 (2016).
  6. Hwang, J. H. Electronic cigarette inhalation alters innate immunity and airway cytokines while increasing the virulence of colonizing bacteria. Int J Mol Med (Berlin, Germany). 94 (6), 667-679 (2016).
  7. Cheng, T. Chemical evaluation of electronic cigarettes. Tob Control. 23, 11-18 (2014).
  8. Etter, J. -F. A longitudinal study of cotinine in long-term daily users of e-cigarettes. Drug Alcohol Depend. 160, 218-221 (2016).
  9. Etter, J. -F. Levels of saliva cotinine in electronic cigarette users. Addiction. 109 (5), 825-829 (2014).
  10. Marsot, A., Simon, N. Nicotine and Cotinine Levels With Electronic Cigarette: A Review. Int. J. Toxicol. 35 (2), 179-185 (2016).
  11. Flouris, A. D. Acute impact of active and passive electronic cigarette smoking on serum cotinine and lung function. Inhal. Toxicol. 25 (2), 91-101 (2013).
  12. Bot, M. Plasma cotinine levels in cigarette smokers: impact of mental health and other correlates. Eur Addict Res. 20 (4), 183-191 (2014).
  13. Zhu, S. -H. Four hundred and sixty brands of e-cigarettes and counting: implications for product regulation. Tob. Control. 23, Suppl 3. 3-9 (2014).
  14. CH TECHNOLOGIES. Single Cigarette Smoking Machine SCSM-STEP. , Available from: http://chtechusa.com/products_tag_smoke_single-cigarette-CSM-SCSM.php (2016).
  15. SCIREQ. inExpose. , Available from: http://www.scireq.com/inexpose (2016).
  16. TSE Systems. Cigarette Smoke Generators. , Available from: http://www.tse-systems.com/products/inhalation/aerosol-vapor-generation/cigarette-smoke.htm (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele chor b u gryzoniekspozycja na nikotynkotynina w surowicychoroby p ucchoroby uk adu sercowo naczyniowegokomora dymu papierosowegokomora e papieros w

Powiązane artykuły