Artykuł metodologiczny

Porównanie wpływu oparów papierosów elektronicznych i dymu papierosowego w nowatorskim systemie ekspozycji in vivo

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55672

⸱

24 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jobst Vascular Research Laboratory, University of Michigan Medical School, 2Department of Engineering, Purdue University, 3Department of Surgery, Section of Vascular Surgery, University of Michigan Health System

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę wystawiania gryzoni na działanie oparów papierosów elektronicznych (E-vapor) i dymu papierosowego. Komory ekspozycyjne są konstruowane poprzez modyfikację komór anestezjologicznych za pomocą zautomatyzowanego systemu pompowania, który dostarcza gryzoniom parę E lub dym papierosowy. System ten można łatwo zmodyfikować, aby uwzględnić wiele eksperymentalnych punktów końcowych.

Streszczenie

Elektroniczne papierosy (E-cigarettes) są szeroko stosowane i zyskują na popularności. Szacuje się, że regularnie korzysta z nich ponad 9 milionów dorosłych. Potencjalne niekorzystne skutki zdrowotne narażenia na opary papierosów elektronicznych (E-vapor) są słabo zdefiniowane. Podczas gdy opracowano kilka modeli zwierzęcych E-steam exposure zostało opracowanych, niewiele modeli wystawia gryzonie na klinicznie istotne ilości nikotyny i dokonuje bezpośrednich porównań do dymu papierosowego w tym samym systemie ekspozycji. W tym miejscu przedstawiamy metodę konstruowania i obsługi E-komora parowa i komora dymu papierosowego. Komory są zbudowane poprzez wyposażenie komór anestezjologicznych w sterowany komputerowo system pompowania, który dostarcza gryzoniom stałe ilości E-para lub dym papierosowy dla gryzoni. Narażenie na nikotynę mierzy się pośrednio poprzez ilościowe określenie poziomu kotyniny w surowicy przed i po ekspozycji. Ten system ekspozycji może być modyfikowany tak, aby uwzględniał różne typy E-papierosów i papierosów tytoniowych, i może być używany do porównywania efektów E-vapor i dym papierosowy in vivo.

Wprowadzenie

Od momentu wejścia na rynek amerykański w 2004 roku, elektroniczne papierosy (e-papierosy) rozrosły się do wartego miliardy dolarów przemysłu i szacuje się, że prawie 9 milionów dorosłych używa ich regularnie1. W 2014 i 2015 roku więcej uczniów szkół średnich używało e-papierosów niż tradycyjnych papierosów2. Rosnąca liczba użytkowników e-papierosów zrodziła wysiłki badawcze mające na celu ocenę ich potencjalnych negatywnych skutków zdrowotnych.

E-papierosy wytwarzają parę (nazwaną "E-vapor") poprzez podgrzanie lepkiego roztworu, który zazwyczaj zawiera mieszaninę wody, glikolu polietylenowego lub gliceryny roślinnej, nikotyny i aromatów3,4. Wykazano, że para elektroniczna zawiera kilka szkodliwych związków, w tym reaktywne formy tlenu (ROS), nikotynę, różne aldehydy i wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne5,6. Wiele z tych związków powstaje podczas procesu waporyzacji E-liquidu przed inhalacją7. Warto zauważyć, że kilka z tych szkodliwych związków jest również obecnych w dymie papierosowym, co budzi obawy, że używanie e-papierosów może mieć podobne negatywne konsekwencje zdrowotne7.

Nie ma zgody co do wpływu e-papierosów na zdrowie. Aby rozwiązać ten problem, opracowano kilka zwierzęcych modeli ekspozycji na opary E (Tabela 1). Modele te wykorzystują różne metody, takie jak naświetlanie całego ciała na e-parę i wentylacja mechaniczna. Podczas gdy obecne modele dostarczyły wnikliwych danych, niewiele z nich dokonuje bezpośrednich porównań z dymem papierosowym w ramach tego samego systemu ekspozycji (Tabela 1). Ponadto, podczas gdy kilka badań na ludziach wykazało, że użytkownicy e-papierosów i palacze papierosów mają poziom kotyniny w surowicy między 30-200 ng / ml, wiele modeli ekspozycji na dym papierosowy i parę elektroniczną wykracza poza ten zakres8,9,10,11,12.

Tutaj prezentujemy metodę porównywania efektów ekspozycji na dym papierosowy i opary E-in vivo, która daje poziom kotyniny w surowicy podobny do badań na ludziach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół został wykonany pod nadzorem i za zgodą Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Michigan.

1. Montaż komory z oparami e-papierosa

UWAGA: Podczas użytkowania całą komorę należy umieścić w dygestorium. Komora użyta w tym przypadku znajdowała się w środowisku laboratoryjnym z filtrowanym powietrzem i kontrolowaną temperaturą. Badacze mogą zdecydować się na monitorowanie tych aspektów systemu, aby zapewnić spójność jakości powietrza w pomieszczeniu. Opcjonalnie, osłonięcie monitorów metalową klatką może zapobiec ingerencji gryzoni, umożliwiając jednocześnie monitorom próbkowanie środowiska wewnątrz komory.

  1. Należy pozyskać komorę do znieczulania z hermetyczną, zdejmowaną pokrywą o objętości 20 L.
  2. Używając wyrzynarki z brzeszczotem odpowiednim do cięcia danego materiału, należy wyciąć w pokrywie komory otwór o średnicy 10,2 cm, w odległości około 7,6 cm od tylnej krawędzi komory.
  3. Należy włożyć regulowany otwór wentylacyjny w otwór i zamocować go za pomocą dowolnego uszczelniacza klejącego.
    UWAGA: Należy upewnić się, że uszczelniacz klejący nie jest dostępny dla gryzoni w komorze, ponieważ mogą one go przegryźć. Aby zapobiec temu problemowi, uszczelniacz należy nałożyć na zewnętrzną ściankę komory w celu zamocowania wentylacji.
  4. Należy pociąć rurkę silikonową na dwa odcinki o długości 15 cm i przymocować ich końce do obu stron złącza T.
    UWAGA: Rurki silikonowe mogą reagować z niektórymi składnikami e-papierosów lub dymu tytoniowego. W związku z tym badacze mogą rozważyć zastosowanie rurek niereaktywnych.
  5. Obie rurki silikonowe należy przełożyć przez fabryczne otwory znajdujące się w pobliżu przodu pokrywy komory w taki sposób, aby złącze T znalazło się wewnątrz komory. Należy upewnić się, że rurki są przymocowane do pokrywy za pomocą uszczelniacza klejącego lub taśmy izolacyjnej.
  6. Wolne końce rurek silikonowych należy podłączyć do końcówek wylotowych dwóch mikropomp powietrznych. Pompy powinny być zamontowane do pokrywy komory za pomocą dwustronnej taśmy klejącej lub uszczelniacza.
    UWAGA: Długość rurki podłączonej do wylotu pompy powinna być krótka, aby ograniczyć ilość pary skraplającej się na wewnętrznej powierzchni rurki podczas użytkowania.
  7. Używając nowej rurki silikonowej, należy przymocować jeden jej koniec do wlotu jednej z pomp powietrznych (Pompa A na Rysunku 1) i przyciąć tę rurkę do długości około 4 cm. Jest to miejsce, w którym podczas korzystania z komory zostanie umieszczony e-papieros. Należy upewnić się, że średnica rurki zapewnia szczelne dopasowanie do końcówki e-papierosa.
  8. Używając nowej rurki silikonowej, należy przymocować jeden jej koniec do wlotu drugiej pompy powietrznej (Pompa B na Rysunku 1). Pompa ta będzie wprowadzać powietrze z pomieszczenia do komory. W związku z tym koniec rurki musi znajdować się poza dygestorium. Długość tej rurki nie jest krytyczna, ale powinna być jak najkrótsza, aby ograniczyć opory przepływu powietrza.
  9. Wewnątrz komory należy przymocować za pomocą dwustronnej taśmy dwa małe haczyki do utrzymania monitorów gazu tlenu i tlenku węgla.

Schemat mieszaniny powietrza z e-papierosa z pompami, otworem wylotowym oraz monitorami gazu CO/O2 do analizy emisji.
Rysunek 1. Schemat komory do generowania aerozolu z e-papierosa.
Komora znajduje się w dygestorium (nie pokazano). Pompa powietrza pokojowego (Pompa B) stale wprowadza powietrze z otoczenia dygestorium do komory z przepływem 2 L/min. Pompa e-papierosa (Pompa A) generuje zaciągnięcia 133 mL aerozolu z e-papierosa w czasie 4 s, z 30 s przerwą. Aerozol i powietrze pokojowe mieszają się przed wpompowaniem do komory. Monitory gazu stale mierzą stężenia tlenku węgla (CO) i tlenu (O2) wewnątrz komory. Aerozol jest usuwany pasywnie przez otwór wylotowy do dygestorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Montaż komory z dymem papierosowym

UWAGA: Z systemem tym można stosować praktycznie każdą markę papierosów, jednak standaryzowane papierosy badawcze, takie jak University of Kentucky 1R6F Research Cigarette, są ekonomiczne, niezawodne i najlepiej nadają się do tej aplikacji.

  1. Należy wykonać kroki 1.1 - 1.6 oraz krok 1.9.
  2. Za pomocą nowej rurki silikonowej należy połączyć jeden koniec z urządzeniem do zapalania papierosów, a drugi koniec ze stroną wlotową pompy powietrznej (Pompa A na Ryc. 2). Urządzenie do zapalania papierosów powinno znajdować się wewnątrz dygestorium, ale na zewnątrz komory podczas użytkowania.
    Uwaga: Konstrukcja urządzenia do zapalania papierosów wymaga wiedzy z zakresu obróbki metali i inżynierii elektrycznej. Chociaż w niniejszym dokumencie nie przedstawiono szczegółowej instrukcji budowy, plany znajdują się w materiałach uzupełniających.
  3. Za pomocą nowej rurki silikonowej należy podłączyć jeden koniec do drugiej pompy powietrznej (Pompa B na Ryc. 2). Pompa ta będzie wprowadzać powietrze pokojowe do komory, dlatego koniec rurki musi znajdować się poza dygestorium.
  4. W przedniej ścianie komory należy wyciąć kilka pionowych szczelin o szerokości 5 mm, a następnie zamontować wentylator komputerowy na zewnątrz komory w taki sposób, aby zakrywał on ten otwór. Należy upewnić się, że przód wentylatora jest skierowany w stronę komory, tak aby wpompowywał on powietrze do jej wnętrza przez wspomniany otwór.

Schemat układu analizy dymu papierosowego z monitorami gazu do detekcji CO i O2, zawierający pompy powietrza.
Rysunek 2. Schemat komory dymu papierosowego.
Pompa powietrza pokojowego (Pompa B) w sposób ciągły wprowadza powietrze z pomieszczenia spoza dygestorium do komory z przepływem 2 L/min. Pompa A zasysa dym z zapalonego papierosa przez 40 s z przepływem 2 L/min, a 20 s później wentylator komputerowy opróżnia komorę w ciągu 3 min. Dym i powietrze pokojowe mieszają się przed wpompowaniem do komory. Monitory gazu w sposób ciągły mierzą stężenia tlenku węgla (CO) i tlenu (O2) w komorze. Dym jest usuwany przez otwór wentylacyjny do dygestorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Montaż mikrokontrolera i oprogramowanie

  1. Steruj systemem pompowania komory oparów e-papierosa oraz komory dymu papierosowego za pomocą oddzielnych mikrokontrolerów. Pobierz oprogramowanie do mikrokontrolera i wgraj kody operacyjne zawarte w Materiałach Uzupełniających. Kod dla oparów e-papierosa będzie uruchamiać pompę powietrza pokojowego w sposób ciągły i aktywować pompę e-papierosa na 4 s co 30 s. Kod dla dymu papierosowego będzie uruchamiać pompę powietrza pokojowego w sposób ciągły, aktywować pompę papierosową na 40 s, a następnie aktywować wentylator komputerowy 20 s po zatrzymaniu pompy papierosowej. Wentylator wyłączy się po 3 min pracy.
    Uwaga: Czas pracy pomp i wentylatora można dostosować w razie potrzeby. W kwestii wgrywania odpowiednich kodów do mikrokontrolera należy zapoznać się z instrukcjami producenta.
  2. Aby złożyć mikrokontroler, podłącz przewody, diody, rezystory i kondensatory do płytki stykowej zgodnie z Rysunkiem 3, a następnie podepnij przewody z klipsami krokodylkami do odpowiednich pomp powietrza (oraz do wentylatora komputerowego w przypadku komory dymu papierosowego). Jeśli to możliwe, umieść mikrokontroler poza dygestorium.

Schemat równowagi statycznej oparty na Arduino z komponentami obwodu; konfiguracja powietrza pokojowego i pompy e-papierosa.
Rycina 3. Schemat mikrokontrolera.
Schemat mikrokontrolera i płytki stykowej służącej do sterowania czasem pracy pomp powietrza i wentylatora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Zwierzęta

  1. Należy wykorzystać dorosłe szczury o masie od 450 do 520 g.
  2. Szczury należy podzielić na grupy w zależności od rodzaju ekspozycji (np. papieros elektroniczny, dym tytoniowy, powietrze pokojowe pompowane do komory).
  3. Przed ekspozycją należy pobrać 500 µL krwi z żyły ogonowej do probówek z EDTA za pomocą strzykawki, aby zmierzyć bazowe stężenie kotyniny w surowicy.
  4. Próbki krwi należy wirować przy 20,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 ˚C, a następnie zebrać surowicę. Należy upewnić się, że próbki przez cały ten proces są schłodzone na lodzie.
  5. Zgodnie z protokołem producenta należy oznaczyć poziom kotyniny w zebranych próbkach surowicy. Próbki można również przechowywać w temperaturze -80 ˚C do późniejszego użycia.

5. Obsługa komory e-papierosa

  1. Wnętrze komory należy oczyścić 70% etanolem, a następnie wodą dejonizowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu aż do całkowitego wyschnięcia (około 30 min).
  2. Należy skalibrować monitory gazów i zamocować cały zestaw monitorujący na ścianie wewnątrz komory.
  3. Umieść szczury wewnątrz komory. Należy pamiętać, że jednocześnie można poddać ekspozycji do trzech zwierząt.
  4. Upewnij się, że e-papieros jest w pełni naładowany i zawiera odpowiednią ilość e-liquidu, a następnie włóż e-papieros do rurki doprowadzającej. Kluczowe jest zapewnienie, aby poziom naładowania baterii e-papierosa oraz poziom e-liquidu były wystarczające przez cały czas trwania 90-minutowej ekspozycji.
  5. Włącz pompy powietrza i uruchom stoper.
  6. Podczas ekspozycji obserwuj monitory gazów, aby upewnić się, że w komorze znajduje się >20% O2 oraz 0 ppm CO.
    Uwaga: Jeśli poziom tlenu spadnie, może to oznaczać niewystarczającą wentylację komory lub nieprawidłową kalibrację monitora tlenu.
  7. Po osiągnięciu 90 min czasu ekspozycji wyjmij e-papieros i kontynuuj pracę pomp gazowych, aby usunąć pozostałe opary. Dodatkowo można podnieść górną część komory, aby przyspieszyć wentylację.
  8. Po całkowitym usunięciu oparów wyjmij szczury i oczyść komorę.
  9. Z pobierz 500 µL krwi z żyły ogonowej każdego szczura około 1 h po ekspozycji, po zakończeniu protokołu eksperymentalnego.
  10. Postępuj zgodnie z krokami 4.4 – 4.5 w celu wyizolowania surowicy i oznaczenia poziomu kotyniny.

6. Obsługa komory do papierosów tytoniowych

  1. Należy wykonać kroki 5.1 – 5.3.
  2. Włożyć papierosa do urządzenia do zapalania papierosów, tak aby koniec papierosa opierał się o elementy grzejne.
  3. Włączyć urządzenie do zapalania papierosów, aż filtr papierosa zacznie się tlić (około 5 s).
  4. Po zapaleniu papierosa włączyć system pompowania, uruchomić stoper i obserwować spalanie papierosa do końca (około 40 s).
  5. Po wypaleniu papierosa ostrożnie usunąć niedopałek z urządzenia do zapalania za pomocą pincety.
  6. Upewnić się, że poziom CO nie przekroczy 1000 ppm, a poziom O2 nie spadnie poniżej 20%. Prawidłowy czas i czas trwania pracy wentylatora komputerowego są kluczowe dla zapobiegania kumulacji tlenku węgla.
  7. Po 4 min wyłączyć system pompowania i powrócić do kroku 6.2, aż szczury zostaną poddane działaniu dymu tytoniowego przez 90 min (lub około 23 papierosy).
    UWAGA: Poziom tlenku węgla 4 min po spaleniu papierosa powinien spaść poniżej 400 ppm, w przeciwnym razie tlenek węgla może zacząć kumulować się w komorze.
  8. Po zakończeniu ekspozycji pozostawić włączony system pompowania w celu usunięcia pozostałego dymu. Gdy poziom tlenku węgla spadnie poniżej 100 ppm, wyjąć szczury z komory. Powinno to zająć od 5 do 10 min.
  9. Wyjąć szczury i wyczyścić komorę.
  10. Pobrać 500 µL krwi z żyły ogonowej około 1 h po ekspozycji, pod koniec protokołu eksperymentalnego, analogicznie jak w przypadku e-papierosów.
  11. Należy wykonać kroki 4.4 – 4.5 w celu wyizolowania surowicy i przeprowadzenia analizy zawartości kotyniny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Monitorowanie tlenku węgla i tlenu

Stężenia tlenu nie spadły poniżej 20% podczas ekspozycji na e-papieros, a stężenia CO pozostały niewykrywalne przez cały czas trwania ekspozycji. Monitory gazów podczas ekspozycji na dym papierosowy wykazały, że stężenie tlenu utrzymało się powyżej 20%. Stężenia tlenku węgla nie przekroczyły 1,000 ppm (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisano metodę konstruowania komór, które w kontrolowany sposób wystawiają gryzonie na działanie oparów E i dymu papierosowego (ryc. 6). Budowa komory na e-papierosy jest stosunkowo prosta i niedroga w porównaniu z komercyjnymi systemami ekspozycji 14,15,16. Części i narzędzia potrzebne do budowy komory są łatwo dostępne u komercyjnych dostawców online. Podobnie, zbudowanie komory dymu papierosoweg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były możliwe dzięki grantowi badawczemu Aortic Research Grant (University of Michigan) dla dr Eliasona. Autorzy pragną również podziękować Nickowi Scottowi z Wydziału Znaków i Grafiki Operacji Zakładowych Uniwersytetu Michigan za pomoc w projektowaniu i montażu urządzenia do zapalania papierosów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw akumulatorów blu PLUSblu eCigsN/A
1R6F Referencyjne centrum papierosówdla Tob Ref  Prod UKN/A
Lexan Komora anestezjologiczna 20 LJorgensen LaboratoriesJOR265
Arduino UNOArduino2877
Prostownik diodowy - 1 A; 50 VSpark FunCOM-08589
Rezystor 10 KOhm 1/6 W PTH - 20 sztukSpark FunCOM-11508
Kondensatory odsprzęgające elektrolityczne - 100 uF/25 VSpark FunCOM-00096
Płytka stykowa bez Systemy prototypowe BusBoardBB400
Przewody z zaciskiem krokodylkowymSystemy prototypowe BusBoardCA-M-20
ZipWireBusBoardZW-MM-10
Wentylator standardowy 80 ST2Cooler MasterR4-S8R-20AK-GP
Regulowany odpowietrznik ARIC 4"BestlouverN/A
ToxiPro  Monitor tlenku węgla (CO)Honeywell Analytics54-00-10316
ToxiPro Oxygen (O2) MonitorHoneywell Analytics54-45-90-VD
Stacja dokująca ToxiPro IQ ExpressHoneywell/Sperian Biosystems 54-46-9100
Hak ścienny Command Mały drut 6-pak3MN/A
Micro pompa wodna/powietrznaXiamen Conjoin ElectronicsCJWP40-A12A1
1/4 "Rurka silikonowaNewAge2801470-100
T ZłączeBel-Art SciencewareF196060000
Plastikowa probówka z krwią pełną z natryskiwanym natryskiem K2EDTABecton, Dickinson and Company367841
zestaw COTYNINE ELISACalbiotechCO096D
Systemy prototypowe

Bibliografia

  1. Schoenborn, C. A., Gindi, R. M. Electronic Cigarette Use Among Adults: United States, 2014 Key findings. NCHS. , (2014).
  2. Singh, T. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011-2015. MMWR. 65 (14), 361-367 (2016).
  3. Flora, J. W. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regul. Toxicol. Pharmacol: RTP. 74, 1-11 (2016).
  4. Tierney, P. A., Karpinski, C. D., Brown, J. E., Luo, W., Pankow, J. F. Flavour chemicals in electronic cigarette fluids. Tob. Control. , (2015).
  5. Sleiman, M. Emissions from Electronic Cigarettes: Key Parameters Affecting the Release of Harmful Chemicals. Environ. Sci. Technol. 50 (17), 9644-9651 (2016).
  6. Hwang, J. H. Electronic cigarette inhalation alters innate immunity and airway cytokines while increasing the virulence of colonizing bacteria. Int J Mol Med (Berlin, Germany). 94 (6), 667-679 (2016).
  7. Cheng, T. Chemical evaluation of electronic cigarettes. Tob Control. 23, 11-18 (2014).
  8. Etter, J. -F. A longitudinal study of cotinine in long-term daily users of e-cigarettes. Drug Alcohol Depend. 160, 218-221 (2016).
  9. Etter, J. -F. Levels of saliva cotinine in electronic cigarette users. Addiction. 109 (5), 825-829 (2014).
  10. Marsot, A., Simon, N. Nicotine and Cotinine Levels With Electronic Cigarette: A Review. Int. J. Toxicol. 35 (2), 179-185 (2016).
  11. Flouris, A. D. Acute impact of active and passive electronic cigarette smoking on serum cotinine and lung function. Inhal. Toxicol. 25 (2), 91-101 (2013).
  12. Bot, M. Plasma cotinine levels in cigarette smokers: impact of mental health and other correlates. Eur Addict Res. 20 (4), 183-191 (2014).
  13. Zhu, S. -H. Four hundred and sixty brands of e-cigarettes and counting: implications for product regulation. Tob. Control. 23, Suppl 3. 3-9 (2014).
  14. CH TECHNOLOGIES. Single Cigarette Smoking Machine SCSM-STEP. , Available from: http://chtechusa.com/products_tag_smoke_single-cigarette-CSM-SCSM.php (2016).
  15. SCIREQ. inExpose. , Available from: http://www.scireq.com/inexpose (2016).
  16. TSE Systems. Cigarette Smoke Generators. , Available from: http://www.tse-systems.com/products/inhalation/aerosol-vapor-generation/cigarette-smoke.htm (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modele chor b u gryzoniekspozycja na nikotynkotynina w surowicychoroby p ucchoroby uk adu sercowo naczyniowegokomora dymu papierosowegokomora e papieros w

Powiązane artykuły