Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55676

⸱

16 maja 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2The Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Streszczenie

Transport nukleocytoplazmatyczny odnosi się do importu i eksportu dużych cząsteczek z jądra komórkowego. Ostatnio wiele badań wykazało związek między stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) a upośledzeniem szlaku nukleocytoplazmatycznego. ALS jest chorobą neurodegeneracyjną atakującą neurony ruchowe i prowadzącą do paraliżu, a ostatecznie do śmierci, średnio w ciągu 2-5 lat. Większość przypadków ALS jest sporadyczna, bez widocznych powiązań genetycznych, ale 10% jest dziedziczonych w sposób dominujący. Ostatnio ekspansje powtórzeń heksanukleotydowych (HRE) w genie chromosomu 9 z otwartą ramką odczytu 72 (C9orf72) zostały zidentyfikowane jako genetyczna przyczyna ALS i otępienia czołowo-skroniowego (FTD). Co ważne, różne grupy zasugerowały ostatnio, że te mutanty wpływają na transport nukleocytoplazmatyczny. Badania te w większości wykazały ostateczny wynik i objawy wywołane przez HRE w transporcie nukleocytoplazmatycznym, ale nie wykazały dysfunkcji transportu jądrowego w czasie rzeczywistym. W rezultacie można określić tylko poważny niedobór transportu nukleocytoplazmatycznego, głównie z powodu wysokiej nadekspresji lub insercji białek egzogennych.

Ten protokół opisuje nowy i bardzo czuły test do oceny i ilościowego określenia dysfunkcji transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. Szybkość importu białka NLS-NES-GFP (SHUTTLE-GFP) MOŻNA OKREŚLIĆ ILOŚCIOWO W CZASIE RZECZYWISTYM ZA POMOCĄ MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ. Odbywa się to za pomocą inhibitora eksportu, dzięki czemu czółenka GFP może dostać się tylko do jądra. Aby zweryfikować test, wykorzystano translowane powtórzenia dipeptydowe C9orf72 HRE poly(GR) i poly(PR), które, jak wykazano wcześniej, zakłócają transport nukleocytoplazmatyczny. Przy użyciu opisanego testu zaobserwowano 50% spadek wskaźnika importu jądrowego w porównaniu z kontrolą. Za pomocą tego systemu można badać drobne zmiany w transporcie nukleocytoplazmatycznym i określać zdolność różnych czynników do ratowania (nawet częściowo) defektu transportu nukleocytoplazmatycznego.

Wprowadzenie

Kompleks porów jądrowych (NPC) kontroluje import i eksport dużych cząsteczek do i z jądra komórkowego. W przeciwieństwie do małych cząsteczek, które mogą dostać się do jądra bez regulacji1, transport większych cząsteczek jest silnie kontrolowany przez NPC. Te duże cząsteczki, takie jak białka i RNA, wiążą się z czynnikami transportowymi, w tym importynami i eksportynami, które mają być importowane i eksportowane z jądra2. Aby białka mogły zostać zaimportowane, muszą zawierać mały motyw peptydowy, ogólnie nazywany sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS), który jest związany przez importyny2. Te sekwencje aminokwasów działają jak znacznik i są zróżnicowane pod względem składu3,4. Białka mogą być eksportowane z jądra do cytoplazmy ze względu na ich związek z eksportynami, które wiążą sekwencję sygnałową, ogólnie nazywaną jądrowym sygnałem eksportowym (NES)2. Zarówno importy, jak i eksporterzy są w stanie transportować swoje ładunki dzięki regulacji małej GTPazy białka jądrowego związanego z Ras (Ran)2. Wykazano, że ran występuje w różnych stanach konformacyjnych w zależności od tego, czy jest związany z GTP czy GDP. Po powiązaniu z GTP, Ran może wiązać się z importinami lub exportinami. Po związaniu się z RanGTP, importy zwalniają swój ładunek, podczas gdy eksporty muszą związać RanGTP, aby utworzyć kompleks ze swoim ładunkiem eksportowym. Dominujący stan wiązania nukleotydów Ran zależy od jego lokalizacji w jądrze (RanGTP) lub cytoplazmie (RanGDP).

Ostatnio, wiele badań wykazało związek między upośledzeniem szlaku nukleocytoplazmatycznego a zarówno stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS), jak i otępieniem czołowo-skroniowym (FTD)5,6,7,8,9,10,11,12. ALS jest postępującą i śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną atakującą zarówno górne, jak i dolne neurony ruchowe (MNs)13 i prowadzącą do paraliżu, a ostatecznie do śmierci, średnio w ciągu 2-5 lat. Większość przypadków ALS jest klasyfikowana jako sporadyczne (SALS), bez widocznych powiązań genetycznych, ale 10% jest dziedziczonych w sposób dominujący (rodzinne ALS; FAŁSZE). Ostatnio zidentyfikowano ekspansje powtórzeń heksanukleotydowych (HRE) w genie chromosomu 9 z otwartą ramką odczytu 72 (C9orf72) 14,15 jako genetyczna przyczyna ALS i FTD. Mutanty te stanowią 30-40% przypadków FALS16, a różne badania wykazały, że powodują one toksyczność, wpływając na transport nukleocytoplazmatyczny5,6,7,8,9,10,11,12.

Te badania w większości wykazały końcowe wyniki i objawy HRE w transporcie nukleocytoplazmatycznym, ale nie wykazały zakłócenia nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. W rezultacie oceniono tylko poważny niedobór transportu nukleocytoplazmatycznego11,17,18.

Ten protokół opisuje nowy i bardzo czuły test do oceny i ilościowego określenia dysfunkcji transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym. Szybkość importu białka NLS-NES-GFP (SHUTTLE-GFP) MOŻNA OKREŚLIĆ ILOŚCIOWO W CZASIE RZECZYWISTYM ZA POMOCĄ MIKROSKOPII FLUORESCENCYJNEJ. Odbywa się to za pomocą inhibitora eksportu, jak opisano wcześniej18, co pozwala wahadłowcowi GFP wejść tylko do jądra. Korzystając z mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania zdolnego do ilościowego określania zmian fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym, możliwe jest ilościowe określenie stopniowych zmian intensywności fluorescencji wahadłowca GFP, znajdującego się w jądrze. W rezultacie, można wyznaczyć podobną do Michaelisa-Mentena krzywą nasycenia osi fluorescencja-czas, reprezentującą ilość promu jądrowego-GFP w danym momencie. Wykorzystując początkową szybkość liniową krzywych, możliwe jest wygenerowanie nachylenia, które reprezentuje szybkość wchodzenia do jądra przed nasyceniem fluorescencyjnym.

Aby potwierdzić test, użyto translowanych powtórzeń dipeptydowych C9orf72, poly(GR) i poly(PR), które wcześniej zgłaszano, że zakłócają transport nukleocytoplazmatyczny5,7,8,10,12. Stosując ten test, zaobserwowano 50% spadek wskaźnika importu jądrowego w porównaniu z kontrolą. Za pomocą tego systemu można badać drobne zmiany w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Ponadto można określić zdolność różnych czynników do ratowania defektu transportu nukleocytoplazmatycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie linii komórkowej

  1. Rozmrozić około 1 000 000 mysich komórek nerwiaka zarodkowego rdzenia kręgowego (komórki NSC-34), które były przechowywane w pojemniku z ciekłym azotem. Użyj inkubatora wodnego o temperaturze 37 °C, aż komórki całkowicie się rozmrozą.
  2. Dodaj świeżą, ciepłą pożywkę (pożywkę DMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% L-glutaminy i 1% antybiotyków pen-strep).
  3. Odwirować rozmrożone komórki (SL16R) w ilości 500 x g przez 5 minut, tworząc osad komórkowy. Odrzucić pożywkę i dodać 1 ml nowej pożywki do ponownego wytworzenia komórek.
  4. Umieścić zawieszone komórki w kolbie o pojemności 15 ml i dodać dodatkowe 5 ml pożywki. Inkubować komórki przez noc w sterylnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  5. Równolegle umieść 8 niepowlekanych szkiełek nakrywkowych (szkło nakrywkowe: 12 mm, grubość 0,13-0,17 mm) w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i sterylizuj przy użyciu 70% etanolu i ekspozycji na 30 minut światła UV, aż wyschnie. Dodaj podłoże do każdego naczynia i wylej, aby zmyć resztki etanolu.
  6. Dodaj bufor trypsyny (2,5 g trypsyny i 0,2 g EDTA w 1 litrze zbilansowanego roztworu soli Hanksa) do komórek po osiągnięciu około 90% konfluencji (około 6 milionów komórek na kolbę), aby umożliwić przylegającym komórkom dysocjację.
    UWAGA: Komórki NSC-34 są wrażliwe i wymagają tylko 15 s inkubacji bufora trypsyny i 1 dodatkowej minuty inkubacji bez trypsyny przed dysocjacją przy użyciu pożywki.
  7. Umieść komórki na 60-milimetrowych szalkach hodowlanych zawierających szkiełka nakrywkowe z 3 ml pożywki, około 350 000 na szalkę. Pozostaw je w inkubatorze na 24 godziny, aby umożliwić przyczepienie komórek do szkiełek nakrywkowych.

2. Transfekcja komórek

UWAGA: Po około 24 godzinach, komórki NSC-34 osiągną 40% konfluencji (około 800 000 komórek) i będą gotowe do transfekcji.

  1. Przygotować czystą pożywkę DMEM (300 μl pożywki DMEM na każde 60 mm naczynie hodowlane) w sterylnych probówkach do mikrowirówek.
  2. Dodać 2 μg każdego plazmidu wymaganego do transfekcji do każdej probówki mikrowirówkowej zawierającej DMEM.
    UWAGA: Plazmid shuttle-GFP jest obowiązkowy we wszystkich transfekcjach komórkowych.
  3. Dodać odczynnik do transfekcji do wszystkich probówek do mikrowirówek, które zawierają wymagane plazmidy. Tutaj dodaj 4 μl komercyjnego odczynnika do transfekcji na każde 2 μg DNA.
  4. Wirować probówki do mikrowirówek zawierające DMEM, plazmidy i odczynnik do transfekcji i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
  5. Dodaj każdą probówkę do mikrowirówki do naczynia hodowlanego i delikatnie wymieszaj naczynie, aby uzyskać jednorodny roztwór. Umieść naczynie z powrotem w inkubatorze na 48 godz.
    UWAGA: Ponieważ shuttle-GFP powinien być wyrażany we wszystkich komórkach, skuteczność transfekcji shuttle-GFP można częściowo zbadać i wstępnie przetestować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po nocnej transfekcji. Pełne badanie białek nieulegających ekspresji fluorescencyjnej można przeprowadzić za pomocą analizy immunoblot.

3. Mikroskopia

  1. Umieścić szkiełka nakrywkowe zawierające transfekowane komórki NSC-34 do uchwytu na szkiełko nakrywkowe i delikatnie przemyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia oderwanych martwych komórek.
  2. Zidentyfikuj odpowiednią łatkę komórkową za pomocą zielonego filtra fluorescencyjnego z odwróconym mikroskopem.
    UWAGA: Odpowiedni plaster komórkowy definiuje się jako pole widzenia mikroskopu pokazujące dużą liczbę komórek (20-30 komórek w polu) i w którym jądra są wyraźnie zdefiniowane w komórkach. Jądra komórkowe w obrębie łaty komórkowej są najpierw identyfikowane wzrokowo i ręcznie oznaczane przez oprogramowanie do obrazowania.
  3. Dodać 200 μl buforu inhibitora eksportu-1 leptomycyny B (LMB) zawierającego 10 ng/ml LMB w PBS do szkiełek nakrywkowych, wlewając bufor na szkiełka nakrywkowe pod mikroskopem.
    UWAGA: Ten punkt w czasie jest ustawiony jako interwał zerowy.
  4. Określ ilościowo intensywność fluorescencji oznaczonych jąder w odstępach 3 s przez około 400-500 s.
  5. Zbadać od 3 do 5 szkiełek nakrywkowych dla każdej grupy transfekcji w każdym indywidualnym doświadczeniu.

4. Analiza

UWAGA: Ponieważ różne komórki wyrażają różne poziomy fluorescencyjnego GFP, ważne jest, aby znormalizować intensywność fluorescencji jądrowej każdej komórki do jej początkowej intensywności fluorescencji.

  1. Znormalizuj intensywność fluorescencji oznaczonych jąder, dzieląc 3-sekundowy interwał fluorescencyjny każdego jądra przez średnią z początkowych sześciu interwałów tego jądra.
  2. Po normalizacji każdego jądra należy wytworzyć krzywą intensywności fluorescencji reprezentującą zmianę fluorescencji jąder w funkcji czasu dla każdej łaty komórki. Aby to zrobić, oblicz średnią wszystkich komórek w każdej łatce komórkowej (składającej się z około 20-30 komórek w każdym łacie).
    UWAGA: Krzywa intensywności fluorescencji jąder przypomina krzywą nasycenia Michaelisa-Mentena, którą lepiej zaobserwować w dłuższych okresach czasu. Wynika to ze zmniejszania się cytozolowych ilości czółenka-GFP z czasem w związku z transportem jądrowym. Spadek ten statystycznie obniża prawdopodobieństwo transportu wahadłowca-GFP do jądra, osiągając w ten sposób nasycenie fluorescencją jądrową. Nachylenie wyprowadzone z liniowej szybkości początkowej krzywej daje Vmaksymalną szybkość wchodzenia do jądra.
  3. Przeanalizujnachylenia V max każdej łatki komórkowej, pochodzące z trzech do pięciu niezależnych eksperymentów, używając oprogramowania do tworzenia wykresów, aby uzyskać jedno nachylenie reprezentujące każdą grupę eksperymentalną. Wykonaj kwantyfikację przy użyciu jednoczynnikowej analizy statystycznej ANOVA.

5. Walidacja ekspresji białka

  1. Umieścić na lodzie 60-milimetrowe szalki hodowlane zawierające resztki komórek (niewykorzystane w powyższym doświadczeniu).
  2. Wyrzucić pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS w celu rozcieńczenia i umycia pozostałej pożywki.
  3. Potraktuj komórki 200-400 μl buforu do lizy zawierającego PBS, 0,5% Triton i tabletkę koktajlową inhibitora proteazy (PI). Zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek.
  4. Zebrać komórki w buforze do lizy w probówce mikrowirówki i homogenizować z homogenizatorem przy 4,000 obr./min przez 1 minutę pod lodem.
  5. Odwirować homogenizowane komórki w temperaturze 2 500 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant, określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu Bradforda i przechowywać do momentu użycia w temperaturze -20 °C.
  6. Zebrać od 30 do 70 μg białka ogółem (w zależności od białka) i załadować je do żelu SDS-PAGE w celu zbadania ekspresji białka za pomocą testu immunoblot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, komórki NSC-34 przypominające neurony ruchowe zostały transfekowane białkiem NLS-NES-GFP (shuttle-GFP). Białko to, posiadające sekwencje sygnałowe NLS i NES (Rycina 1), może przemieszczać się między jądrem a cytoplazmą. Generyczne GFP w przypadku braku jakiegokolwiek sygnału lokalizacji może wnikać do jądra lub z niego opuszczać jedynie drogą dyfuzji, w związku z czym jest równomiernie rozłożone pomiędzy jądrem a cytoplazmą (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten demonstruje wysoce czuły i ilościowy nowy test do oceny drobnych zmian w transporcie nukleocytoplazmatycznym. Za pomocą tego systemu możliwa jest obserwacja i pomiar transportu nukleocytoplazmatycznego i jego dysfunkcji w czasie rzeczywistym, a nie tylko dużych defektów, które skutkują dramatycznymi zmianami w dystrybucji białek. Test ten ma nie tylko przewagę w zakresie czułości, ale także wymaga niewielkiego przygotowania, jest niedrogi i jest bardzo łatwym i mało angażującym testem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium AI za ich pomocne komentarze i sugestie. Serdecznie dziękujemy prof. Markowi Hippowi (Instytut Biochemii im. Maxa Plancka) za udostępnienie nam wektora wahadłowca GFP. Prace te były wspierane przez granty Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF #124/14), Binational Science Foundation (BSF #2013325), Grantu na Integrację Kariery Marie Curie 7PR (CIG # 333794) oraz Narodowego Instytutu Psychobiologii w Izraelu (NIPI #b133-14/15).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mysia hybrydowa linia komórkowa podobna do neuronów ruchowych (NSC-34)tebu-bioCLU140-A
DMEM 4,5 g / L L-glukozyPrzemysł biologiczny01-055-1A
FBS Przemysłbiologiczny04-007-1A
Wirówka SL 16RThermo Scientific75004030
Thermo Forma Series ii Płaszcz wodny CO2 InkubatorThermo Scientific3111
Szkło nakrywkowe o średnicy 12 mm, grubości 0,13-0,17 mmBar Naor LTD
Odczynnik do transfekcji TurboFectThermo ScientificR0531
Mikroskop odwrócony Axiovert 100Zeiss
Imaging Workbench 2Axon Instruments
Leptomycyna BSigmaL2913
PBSBiological Industries02-023-1A
Silnik homogenizatora/sterowanie/uchwyt/zacisk 90 stopniGlas-Col099C K5424CE
MicroCL 17R Wirówka, chłodzonaThermo Scientific75002455
klasy europejskiej

Bibliografia

  1. Alberts, B. Molecular biology of the cell. , 4th edn, Garland Science. (2002).
  2. Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
  3. Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
  4. la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
  5. Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877(2016).
  6. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
  7. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
  8. Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
  9. Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
  10. Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
  11. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
  12. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
  13. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
  14. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
  15. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
  16. Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
  17. Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
  18. Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
  19. Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
  20. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komórki neuronów ruchowychtest w czasie rzeczywistymmikroskopia fluorescencyjnaszybkość importu jądrowegoinhibitor eksportynyC9orf72 HREbiałka powtórzeń dipeptydowychtransfekcja białek
Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.