Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55688

⸱

30 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beykoz Institute of Life Sciences and Biotechnology, Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey, 2School of Public Health and Tropical Medicine, Department of Tropical Medicine, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Streszczenie

Ostatnie postępy w genetyce i technologiach biologii systemowej przyczyniły się do lepszego zrozumienia biologii pasożytów malarii na poziomie molekularnym. Jednak skuteczne cele dla pasożytów malarii w celu opracowania szczepionek i chemioterapii są nadal ograniczone. Wynika to w dużej mierze z niedostępności odpowiednich i praktycznych modeli zakażeń in vivo dla ludzkich gatunków Plasmodium, w szczególności dla P. falciparum i P. vivax. W związku z tym gatunki malarii gryzoni są szeroko stosowane jako praktyczne alternatywne modele in vivo dla szczepionek przeciwko malarii, celowania w leki, odpowiedzi immunologicznej i badań charakterystyki funkcjonalnej konserwatywnych genów Plasmodiumspp. Rzeczywiście, modele malarii u gryzoni okazały się nieocenione, zwłaszcza w badaniu transmisji komarów i biologii wątroby, a także były niezbędne w badaniach immunologicznych. Istnieją jednak rozbieżności w metodach stosowanych do oceny fenotypów transgenicznych i dzikich pasożytów bezpłciowych i płciowych we krwi typu dzikiego. Przykładami tych rozbieżności są wybór zakażenia dożylnego vs. dootrzewnowego u gryzoni z pasożytami we krwi oraz ocena biczowania gamet u samców. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy znormalizowane metody eksperymentalne do oceny fenotypów bezpłciowych i płciowych stadiów krwi u transgenicznych pasożytów eksprymujących gen reporterowy lub gatunki pasożytów malarii gryzoni typu dzikiego. Szczegółowo opisujemy również metody oceny fenotypów stadiów pasożyta malarii (gamety, ookinety, oocysty i sporozoity) wewnątrz wektorów komarów Anopheles. Metody te są tutaj szczegółowo opisane i uproszczone dla śmiertelnych i nieśmiertelnych szczepów P. berghei i P. yoelii, ale mogą być również stosowane z pewnymi dostosowaniami do gatunków malarii gryzoni P. chabaudi i P. vinckei.

Wprowadzenie

Pasożyty malarii powodują setki milionów zakażeń malarią u ludzi na całym świecie, powodując ponad 600 000 zgonów rocznie1. Zakażenia u ludzi są wywoływane przez pięć gatunków pasożytów malarii, a mianowicie P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae i P. knowlesi. Większość klinicznych zgonów z powodu malarii jest spowodowana przez P. falciparum w Afryce Subsaharyjskiej1. Innym ludzkim gatunkiem pasożyta malarii, który powoduje rozległe zachorowalności na całym świecie poza Afryką Subsaharyjską, jest P. vivax2. Pozostałe trzy gatunki są bardziej ograniczone geograficznie i powodują łagodne infekcje malarią, z wyjątkiem śmiertelnego P. knowlesi3. Niedostępność odpowiednich i praktycznych modeli zakażeń in vivo innych niż ludzkie zawsze była i nadal jest przeszkodą w opracowywaniu szczepionek i leków przeciwko malarii. Wcześniejsze badania nad lekami na malarię i badania metaboliczne opierały się w dużej mierze na modelach malarii ptaków, takich jak P. gallinaceum i P. lophurae, infekujących odpowiednio kurczaki i kaczki4. Następnie gatunki malarii gryzoni były stopniowo wprowadzane do różnych szczepionek i badań ukierunkowanych na leki jako modele in vivo. Z biegiem lat zgromadzono dowody na podobieństwa w biologii i interakcjach gospodarz-pasożyt między etapami cyklu życiowego modeli malarii gryzoni a ludzkimi gatunkami malarii.

W szczególności, modele malarii gryzoni były niezwykle ważne dla zbadania i scharakteryzowania biologii komarów i stadiów pre-erytrocytarnych5. Istnieją jednak cztery gatunki malarii gryzoni (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi i P. vinckei), które mają różne cechy biologiczne, z których najbardziej godne uwagi są we krwi6. Gatunki malarii gryzoni różnią się synchronizacją stadiów krwi, gdzie stadia krwi szczepów P. chabaudi i P. vinckei są w większości synchroniczne, podczas gdy stadia krwi P. berghei i P. yoelii nie są6,7. Inną zauważalną różnicą jest samooczyszczanie się etapów krwi, które występuje w niektórych szczepach (np. P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 i P. vinckei lentum), podczas gdy zakażenie krwi innymi szczepami tego samego gatunku może być śmiertelne, jeśli nie jest leczone (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA i P. chabaudi AS). Co więcej, szczep P. yoelii 17X-NL i szczep P. berghei ANKA preferencyjnie atakują retikulocyty8,9,10,11, chociaż te cechy szczepów P. yoelii i P. berghei nie są ścisłym wymogiem wzrostu12,13,14. Dlatego myszy są leczone fenylohydrazyną przed zakażeniem stadiami krwi tych pasożytów w celu zwiększenia parazytemii i gametocytemii potrzebnych do zakażenia komarem dla szczepu P. berghei ANKA i dla P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.

Różnice w rozwoju komarów istnieją również między różnymi gatunkami malarii gryzoni, z których najbardziej zauważalne to temperatura i czas potrzebny do optymalnego rozwoju komarów oraz długość sporozoitu5,6,20. W stadiach preerytrocytarnych malarii u gryzoni różnice obejmują gatunki i szczepy gryzoni, które są najbardziej podatne na zakaźne zaszczepienie sporozoitu, liczbę sporozoitów potrzebnych do inokulacji w podatnym szczepie gryzoni, typy komórek ssaków potrzebne do testów rozwoju wątroby in vitro oraz czas do zakończenia rozwoju stadium wątroby5,21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30.

Pomimo tych różnic, pasożyty malarii u gryzoni były na początku korzystnymi modelami do zastosowania odwrotnych metod genetycznych, ponieważ były mniej czasochłonne i zasobożerne, z wysokim prawdopodobieństwem sukcesu31. W rzeczywistości modele malarii gryzoni były najlepszymi modelami, a w wielu przypadkach jedynymi modelami, dostępnymi przez wiele lat, aby funkcjonalnie scharakteryzować geny ulegające ekspresji w stadiach komara

, wątroby.

W świetle popularności i możliwości stosowania metod genetyki odwrotnej w modelach malarii u gryzoni, do analizy fenotypów etapów cyklu życia pasożytów transgenicznych, zwłaszcza etapów krwi, zastosowano szereg różnych metodologii. Niektóre z tych metod są jednak niespójne; na przykład, porównując zakażenia pasożytami we krwi po wstrzyknięciu IP (które mogą być odprowadzane do węzłów chłonnych otrzewnej, a stamtąd mogą dostać się do krwiobiegu; dlatego wstrzyknięte pasożyty nie trafiają równomiernie do krwiobiegu), porównując przenoszenie klonów przez komary z inną liczbą seryjnych transferów we krwi lub liczbą G (co może wpływać na gametocytogenezę32, 33), lub porównując transgeniczne pasożyty bezpośrednio z naiwnymi pasożytami typu dzikiego (WT), które nigdy nie zostały poddane elektroporacji i pozytywnej selekcji leków oraz różnym niestandaryzowanym ocenom biczowania męskich gamet. Dlatego tak ważne jest ujednolicenie protokołów, które są łatwe do naśladowania w analizie fenotypowej wszelkiego rodzaju transgenicznych lub WT gryzoni pasożytów malarii we krwi i u komarów, aby dostosować się do biologicznej zmienności gatunków pasożytów malarii gryzoni.

Niniejszym przedstawiamy ustandaryzowany, szczegółowy protokół eksperymentalny do analizy fenotypowej etapów cyklu życia krwi i komarów transgenicznych lub dzikich pasożytów P. yoelii i P. berghei. Protokoły te mają również zastosowanie do pasożytów P. chabaudi i P. vinckei.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tulane oraz Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Bezmialem Vakif. Wszystkie inne protokoły eksperymentalne i zastosowanie rekombinowanego DNA przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) Uniwersytetu Tulane.

1. Zakażenie myszy pasożytami we krwi do analizy parazytemii i testów infekcji komarami

  1. Dzień -3: opcjonalne wstrzyknięcie fenylohydrazyny myszom biorcom
    1. Wstrzyknąć myszom biorcom SW lub CD1 (myszy, które będą używane do testów na zakażenie komarami i zakażenie komarami) dootrzewnowo (IP) ze 100 μl fenylohydrazyny (50 mg fenylohydrazyny w 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)) za pomocą strzykawki igłowej 26 G.
      nuta: W przypadku silnych infekcji komarów P. berghei i P. yoelii, fenylohydrazyna jest stosowana do indukowania retikulocytozy u myszy biorców, co zwiększa parazytemię, a następnie odsetek gametocytów i znacznie zwiększa wizstrzykość męskich gamet (Rysunek 5), co doprowadzi do lepszego stadium infekcji komara zarówno dla szczepów P. berghei, jak i P. yoelii15,16,17,18.
  2. Dzień -2: wstrzyknięcie zamrożonych zapasów pasożytów myszom-dawcom
    1. Szybko rozmrozić zamrożone wywary kriokonserwowane i natychmiast wstrzyknąć każdej myszy dawcy (zwykle dwóm myszom na genotyp) IP ~200 μL bulionu za pomocą strzykawki igłowej 26 G.
      nuta: Nie więcej niż pięć myszy jest trzymanych w jednej klatce w kontrolowanych warunkach wiwarium.
    2. Rozpocznij sprawdzanie parazytemii pod 100-krotnym obiektywem mikroskopu na cienkim rozmazie krwi podbarwionym Giemsą po 24 godzinach od zakażenia. Postępuj zgodnie z sekcją 2.1 protokołu dotyczącego cienkich rozmazów krwi podbarwionych metodą Giemsa.
      nuta: Ze względu na niemożność precyzyjnego policzenia ocalałych żywotnych stadiów krwi po szybkim rozmrożeniu i wstrzyknięciu kriokonserwowanej zakażonej krwi, myszy dawcy otrzymują najpierw kriokonserwowaną krew. Zainfekowane erytrocyty myszy dawcy można precyzyjnie określić ilościowo, a następnie wykorzystać.
  3. Dzień 0: krwawienie myszy dawcy
    1. Myszy dawcy należy wykrwawić (patrz punkt 3.1), gdy ich parazytemia wynosi od 0,1% do 1%, co zwykle uzyskuje się 2-3 dni po zakażeniu zamrożonym bulionem w przypadku szczepów P. yoelii 17X-NL i P. berghei ANKA.
    2. Użyj nakłucia żyły twarzowej (aby uzyskać od 200 do 500 μl) lub nieuleczalnie wykrwawij zwierzęta przez nakłucie serca (aby uzyskać od 600 μl do 1,2 ml) zakażonej krwi. Końcowe wykrwawienie myszy przez nakłucie serca, jak opisano szczegółowo w punkcie 3.1.
      nuta: Krwawienie z żył twarzowych nie jest rutynową metodą pozyskiwania krwi, ponieważ jest znacznie trudniejsze do zastosowania i jest bardzo uciążliwe dla myszy w porównaniu z krwawieniem końcowym. Optymalna parazytemia dla krwawienia myszy dawców wynosi od 0,1% do 1%, ponieważ w tym zakresie parazytemii jest bardzo mało gametocytów (które nie mogą się replikować w celu wytworzenia bezpłciowych stadiów krwi) i jest mniej podwójnie lub potrójnie zakażonych erytrocytów (co sprawia, że kwantyfikacja jest mniej dokładna).
  4. Dzień 0: oznaczanie ilościowe zakażonej krwi w celu przygotowania dawek zakażonych erytrocytów przez seryjne rozcieńczenia
    1. Przygotować seryjne rozcieńczenia krwi dawcy, dodając 100 μl krwi do probówki mikrowirówkowej (probówka do rozcieńczania 1). Dodać 900 μl pożywki RPMI do probówki 1 i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół tą samą końcówką pipety, tworząc rozcieńczenie 1:10.
    2. Pobrać 100 μl rozcieńczonej krwi z probówki 1 i dodać ją do nowej probówki do mikrowirówki (probówka do rozcieńczania 2). Dodać 900 μl pożywki RPMI do probówki 2 i dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół tą samą końcówką pipety, tworząc rozcieńczenie 1:100.
    3. Powtórzyć kroki 1.4.1 i 1.4.2, aby wykonać dwa kolejne seryjne rozcieńczenia, tworząc rozcieńczenia 1:1 000 (probówka rozcieńczająca 3) i 1:10 000 (probówka rozcieńczająca 4).
    4. Dodać 12 μl rozcieńczonej krwi z probówki 3 i 12 μl rozcieńczonej krwi z probówki 4 na różne strony hemocytometru i określić średnią liczbę erytrocytów po każdej stronie hemocytometru. Pomnóż te liczby przez 10. Pomnóż te liczby przez współczynnik rozcieńczenia, odpowiednio 1 000 lub 10 000, aby określić liczbę erytrocytów w 1 μl każdego rozcieńczenia.
    5. Podzielić żądaną liczbę zakażonych erytrocytów do wstrzyknięcia przez liczbę erytrocytów w 1 μl każdego rozcieńczenia, aby określić objętość rozcieńczonej krwi dawcy niezbędną do wstrzyknięcia. Wybrać rozcieńczenie o najbardziej odpowiedniej objętości do wstrzyknięcia, dodać objętość do nowej probówki do mikrowirówki i uzupełnić do 120 μl pożywką RPMI.
  5. Dzień 0: wstrzyknięcie dożylne myszom biorcy
    1. Umieść myszy biorcy pod gorącą czerwoną lampą, aby rozszerzyć ich żyły do wstrzyknięcia. Załaduj dawki pasożyta do strzykawki insulinowej 27 G i umieść mysz biorcy w ograniczniku.
    2. Wstrzyknąć dożylnie 1 milion lub 10 000 zakażonych erytrocytów (IV) za pomocą strzykawki insulinowej 27 G każdej myszy biorcy w celu przeprowadzenia testów infekcji komarami lub odpowiednio do testów wzrostu krwi bezpłciowej i płciowej. Kontynuuj konserwację myszy w standardowych warunkach mieszkaniowych.
      nuta: Wstrzyknięcie IP jest pośrednią metodą wprowadzania pasożytów do krwiobiegu, ponieważ spasożytowane erytrocyty muszą przejść przez drenujące węzły chłonne jamy otrzewnej, aby dotrzeć do krwi. To sprawia, że wstrzyknięcie IP jest pośrednią drogą dostarczania do wstrzykiwania precyzyjnej liczby pasożytów do krwiobiegu. W związku z tym preferowana jest droga dożylna, ponieważ dostarcza ona dokładne dawki pasożytów bezpośrednio do krwiobiegu, jak pokazano na Rysunek 3 i opisano w Reprezentatywnych Wynikach.

2. Określanie obciążenia pasożytami we krwi dla stadiów seksualnych i bezpłciowych

UWAGA: W tej sekcji wymienione są standardowe metody oceny fenotypowej stadiów krwi pasożyta malarii. Metody te są przydatne w ocenie nowych kandydatów na leki przeciwmalaryczne lub szczepionki, a nawet nokaut genów na etapy rozwoju płciowego i bezpłciowego u tych samych myszy eksperymentalnych. Warto zauważyć, że P. chabaudi i P. vinckei są również bardzo racjonalnymi i ważnymi alternatywnymi opcjami dla tego typu testów, zwłaszcza w badaniach przesiewowych leków.

  1. Oznaczanie parazytemii w stadiach bezpłciowych i gametocytach męskich i żeńskich za pomocą cienkich rozmazów krwi barwionych Giemsą do testów wzrostu pasożytów
    1. Za pomocą igły o sile 26 G lub 27 G nakłuj ogon myszy i zbierz kroplę krwi na szkiełku mikroskopowym. Użyj krótszej krawędzi innego szkiełka mikroskopowego, aby szybko rozmazać krew na szkiełku.
    2. Zamocuj szkiełko 100% metanolem na co najmniej 1 minutę, dopiero po całkowitym wyschnięciu krwi na szkiełku. Bejcować w 10% Giemsa przez 10-15 min. Umyj szkiełko wodą jedno- lub podwójnie destylowaną i pozostaw do wyschnięcia.
    3. Przeczytaj slajd za pomocą 100-krotnego obiektywu i zanurzenia w oleju pod mikroskopem świetlnym. Aby uzyskać dokładny pomiar parazytemii, sprawdź co najmniej łącznie 6 000 erytrocytów, które można uzyskać, licząc co najmniej 30 lub 40 mikroskopijnych siatek o średniej liczbie odpowiednio 200 lub 150 erytrocytów (RBC) na siatkę. Policz całkowitą liczbę krwinek czerwonych w pierwszej i ostatniej siatce, aby określić średnią liczbę czerwonych krwinek dla wszystkich siatek.
    4. Policz całkowitą liczbę zakażonych erytrocytów na siatkę. Gametocyty męskie i żeńskie mogą być liczone oddzielnie w celu określenia gametocytemii, ale powinny być również uwzględnione w całkowitej liczbie parazytemii.
    5. Określ całkowity procent parazytemii, dzieląc całkowitą liczbę spasożytowanych erytrocytów przez całkowitą liczbę zaobserwowanych erytrocytów. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić procent parazytemii.
    6. Określ gametocytemię, dzieląc całkowitą liczbę zliczonych gametocytów przez całkowitą liczbę zaobserwowanych krwinek czerwonych. Pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić procent gametocytemii na mysz.
      nuta: Jedyną wiarygodną metodą różnicowania różnych stadiów krwi bezpłciowej i płciowej jest użycie mikroskopu do oceny cienkich rozmazów krwi zabarwionych Giemsą, ponieważ każdy z etapów ma inną morfologię, z wyjątkiem niedojrzałych gametocytów, które są w większości nie do odróżnienia od bezpłciowych stadiów krwi.
  2. Oznaczanie parazytemii w stadium krwi za pomocą cytometrii przepływowej dla fluorescencyjnych szczepów pasożytów podobnych do WT wykazujących ekspresję białka reporterowego
    1. Oznaczyć dwie probówki do mikrowirówek dla każdej próbki myszy, oznaczając jedną probówkę do rozcieńczenia 1:1,000, a drugą do rozcieńczenia 1:2,000. Dodać 1,5 μl 1x heparyny do probówki do rozcieńczania w stosunku 1:1 000.
    2. Za pomocą igły o sile 26 G lub 27 G nakłuć ogon myszy i przenieść 1,5 μl krwi do probówki zawierającej 1,5 μl 1x heparyny (probówka do rozcieńczania 1:1 000). Delikatnie wymieszaj krew i 1x heparynę, pipetując w górę iw dół.
    3. Dodaj 1 497 μl pożywki RPMI do probówki mikrowirówki i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby dobrze wymieszać.
    4. Przenieść 500 μl mieszaniny z probówki do probówki do probówki do 1:2000. Dodaj 500 μl pożywki RPMI do probówki w proporcji 1:2 000 i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
    5. Postępuj zgodnie z odpowiednim protokołem rozruchu producenta cytometru przepływowego. Uruchom próbki z wolnym natężeniem przepływu i ustaw wykrywanie dla co najmniej 20 000 zdarzeń.
      nuta: Istnieje alternatywny praktyczny test do pomiaru parazytemii za pomocą trójkolorowego sortowania FACS, niezależnie od tego, czy pasożyty wyrażają markery fluorescencyjne, czy nie34. Jednak opisany tutaj test oferuje dokładny pomiar parazytemii u żywych pasożytów bez dodawania jakichkolwiek barwników wiążących DNA i stosowania sortowania FACS.
  3. Oznaczanie szybkości wiczowania męskich gamet na mikrolitr zakażonej krwi myszy
    1. Przygotować probówkę wirówkową do mikrowirówek o rozcieńczeniu 1:10 z 40 μl niekompletnego podłoża ookinte (RPMI + wodorowęglan sodu + hipoksantyna + kwas ksanturonowy) i 5 μl 1x heparyny.
    2. Za pomocą igły o sile 26 G lub 27 G nakłuć ogon myszy i szybko przenieść 5 μl krwi (za pomocą mikropipety) do probówki zawierającej niekompletną pożywkę ookinte + heparynę. Delikatnie wymieszać i załadować 12 μl probówki do rozcieńczania krwi w stosunku 1:10 na hemocytometr i pozostawić w temperaturze pokojowej (20-24 °C).
    3. Liczenie wykwitów należy rozpocząć po 9-10 minutach od przygotowania rozcieńczenia w stosunku 1:10. Użyj mikroskopu światła z kontrastem fazowym i 40-krotnym powiększeniem.
    4. Pomnóż średnią liczbę przypadków wykwitania policzonych przez 10, a następnie pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia (10), aby określić średnią liczbę wykwitów na mikrolitr zakażonej krwi.
      nuta: Test ten mierzy liczbę przypadków wistructwa męskich gamet w objętości krwi o objętości 1 μl, którą można określić ilościowo za pomocą hemocytometru. Niekompletne podłoże ookinete 18 miesza się z krwią, aby dokładnie naśladować warunki, podczas których biczowanie występuje w jelicie środkowym komara krótko po posiłku z krwi.

3. Izolacja i przetwarzanie pasożytów krwi z zakażonych erytrocytów i przygotowanie mrożonego bulionu

  1. Końcowe krwawienie zakażonych gryzoni przez nakłucie serca
    1. Przygotować strzykawkę igłową 26 G, która zawiera około ≤20 μl 1x heparyny (200 jednostek/ml) w celu pobrania krwi myszy dawcy przez nakłucie serca.
    2. Użyj powolnego przepływu CO2 do eutanazji myszy przed krwawieniem. Alternatywnie, znieczulij mysz izofluranem (który musi być utrzymywany przed i w trakcie nacięcia skóry, aby odsłonić serce).
    3. Połóż mysz na plecach i przypnij jej kończyny. Wykonaj małe nacięcie w skórze w pobliżu podstawy mostka, podciągając skórę kleszczami i przecinając ją nożyczkami. Rozsuń skórę w miejscu nacięcia, aby odsłonić przeponę i górną część jamy brzusznej.
    4. Przytrzymaj podstawę klatki piersiowej kleszczami i przetnij przeponę, aby dostać się do klatki piersiowej; uważaj, aby nie uszkodzić serca lub płuc. Przypnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
    5. Delikatnie nakłuć serce i powoli pociągnąć do góry tłok strzykawki, aby zebrać ~1 ml krwi i przenieść ją do probówki do mikrowirówki.
  2. Przygotowanie zamrożonych wywarów z zakażonej krwi
    1. U myszy należy wykrwawić (patrz punkt 3.1) z pasożytami krwi w zakresie od około 2% do 5%, ze znaczną liczbą stadiów pierścieniowych i mniejszą liczbą gametocytów.
    2. Wymieszać żądaną porcję krwi z roztworem zamrażającym (10% glicerolu w roztworze Alsevera) w stosunku 1:2 i przechowywać w fiolkach kriogenicznych. Zamrażać w ciekłym azocie.
  3. Izolacja i oczyszczanie pasożytów we krwi w celu ekstrakcji DNA, RNA i białek
    1. Myszy z krwawieniem (patrz punkt 3.1) z pasożytami krwi większymi niż 0,5%.
    2. Przygotuj strzykawkę o pojemności 10 ml, wyjmując tłok i wkładając mały bawełniany wacik. Spakuj bawełnę na dno strzykawki. Napełnij go celulozą, aż poziom celulozy osiągnie oznaczenie 3 ml, ale nie przekroczy oznaczenia 4 ml na strzykawce.
    3. Umieścić strzykawkę w klipsie na stojaku pierścieniowym i umieścić pod nim rurkę do zbierania odpadów. Dodać 5 ml PBS do strzykawki i pozwolić mu przepłynąć do rurki odpływowej.
    4. W razie potrzeby przygotuj zamrożone wywary, używając tylko 100-300 μl krwi. Dodaj resztę zakażonej krwi (400-700 μl) do kolumny. Zbieraj przepływ za pomocą rurki odpływowej, aż kropelki zaczną zmieniać kolor na czerwony. Gdy kropelki zaczną zmieniać kolor na czerwony, umieść nową probówkę o pojemności 14 ml pod strzykawką, aby zebrać przepływ.
    5. Gdy przepływ zacznie zwalniać, dodaj PBS do strzykawki i zbieraj przepływ w probówce o pojemności 15 ml, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 14 ml. Zebrać pozostały przepływ za pomocą rurki odpływowej.
    6. Odwirować probówkę o pojemności 14 ml z mieszaniną krew/PBS przez 8 minut przy 250 x g bez hamulców. Usunąć supernatant i dodać 14 ml schłodzonej saponiny (50 mg saponiny w 50 ml PBS). Aby usunąć osad, należy kilkakrotnie odwrócić rurkę i w razie potrzeby
      7. przekręcić wir.
    7. Wirować probówkę przez 8 minut przy stężeniu 1,217 x g bez hamulców. Usunąć supernatant, pozostawiając około 0,5 ml roztworu nad osadem.
    8. Zawiesić osad w roztworze za pomocą mikropipety i przenieść go do probówki do mikrowirówki. Dodaj 500 μl PBS do probówki o pojemności 14 ml, aby zmyć wszelkie pozostałości pasożytów, które pozostały w probówce. Dodaj to do tej samej probówki do mikrowirówki.
    9. Odwirować probówkę przez 2 minuty przy 6,010 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić 1 ml PBS. Wirować przez 2 minuty przy 9 391 x g.
    10. Przystąp do ekstrakcji genomowego DNA, całkowitego RNA i białka.
      1. W celu ekstrakcji genomowego DNA należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS, a następnie postępować zgodnie z dowolnym odpowiednim protokołem ekstrakcji gDNA.
      2. W celu ekstrakcji całkowitego RNA należy usunąć supernatant, ponownie zawiesić i zawirować osad w 1 ml dowolnego roztworu na bazie izotiocyjanianu fenolu i guanidyny lub innego odpowiedniego odczynnika, a następnie postępować zgodnie z dowolnym odpowiednim protokołem ekstrakcji całkowitego RNA.
      3. W celu ekstrakcji całkowitego białka należy usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości 6-krotnego barwnika ładującego dodecylosiarczan sodu (SDS) lub innego odpowiedniego odczynnika, a następnie postępować zgodnie z odpowiednim protokołem przetwarzania białka całkowitego.

4. Testy na infekcje komarami

UWAGA: Komar jest głównym żywicielem pasożytów malarii, gdzie odbywa się rozmnażanie płciowe. Zakażenie myszy w celu przeniesienia pasożytów malarii na komary przeprowadza się przez wstrzyknięcie dożylne co najmniej 1 miliona etapów krwi, a następnie karmienie zakażonej myszy (z każdego genotypu, który wykazuje najwyższy wskaźnik wykwitu męskich gamet) komarom Anopheles w klatce w 3 dniu po zakażeniu myszy. Wstrzyknięcie dożylne z 1 milionem pasożytów we krwi u myszy leczonych fenylohydrazyną zapewni szybszy i szybszy rozwój męskich i żeńskich gametocytów. Komary zakażone P. yoelii i P. berghei są inkubowane odpowiednio w temperaturze 24 °C i 20-21 °C, aby umożliwić jak najlepszy rozwój komarów6.

  1. Karmienie komarów i oznaczanie liczby ookinetsów na komara
    1. Dorosłe samice komarów Anopheles stephensi lub A. gambiae (w wieku 4-7 dni) należy głodzić przez 8-12 godzin przed karmieniem. Pozwolić dorosłym komarom żerować przez co najmniej 15 minut na zakażonych znieczulonych myszach (wstrzykniętych odpowiednią dawką ketaminy/ksylazyny) o najwyższym wskaźniku biczowania (mierzonym w sekcji 2.3).
      nuta: Roztwór roboczy ketamina/ksylazyna jest przygotowywany przez rozcieńczenie roztworu podstawowego w stosunku 1:5 w roztworze soli fizjologicznej i wstrzyknięcie IP: 100 μl na mysz. W przypadku 10 ml roztworu podstawowego 1 ml ksylazyny (100 mg/ml) dodaje się do 9 ml ketaminy (100 mg/ml).
    2. Usuń niekarmione samice komarów i samce komarów za pomocą aspiratora do ust.
    3. Po 18-20 godzinach od karmienia zbierz 20-30 komarów i umieść je w zamrażarce na nie mniej niż 10 minut, aby zapewnić śmierć. Używając lornetki do dyssekcji, wyciąć 20-30 wypełnionych krwią jelit środkowych za pomocą dwóch igieł 26 G lub 27 G lub igły i kleszczy w pożywce preparacyjnej RPMI lub PBS i przenieść jelita środkowe do probówki mikrowirówkowej zawierającej 200 μl RPMI lub PBS (metoda preparacji znajduje się w sekcji 4.3).
    4. Odwirować probówkę zbiorczą przez 1 minutę przy 700 x g. Zmiel granulowane jelita środkowe za pomocą tłuczka. Powtórz ten krok.
    5. Przenieść 50 μl z probówki ze zmielonym jelitem środkowym do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać 200 μl RPMI lub PBS, aby uzyskać rozcieńczenie 1:5.
    6. Przenieść 12 μl do hemocytometru i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby zawartość opadła.
    7. Określ średnią liczbę ookinetów za pomocą mikroskopu świetlnego z kontrastem fazowym i 40-krotnym powiększeniem.
    8. Pomnóż średnią liczbę dojrzałych ookinetów przez 10, a następnie przez współczynnik rozcieńczenia 5, aby określić średnią całkowitą liczbę ookintesów.
    9. Podziel średnią liczbę ookinety przez liczbę wyciętych komarów karmionych krwią, aby określić liczbę ookinetsów na komara karmionego krwią.
  2. Oznaczanie liczby wczesnych oocyst dla fluorescencyjnych szczepów pasożytów przypominających WT wykazujących ekspresję białka reporterowego
    nuta: Celem tego testu jest określenie liczby żywych pasożytów eksprymujących białko zielonej fluorescencji (GFP), które doprowadziły do pełnej infekcji jelita środkowego komara i utworzyły wczesne kuliste oocysty. Test ten określa, czy ookinety (ich rozwój oszacowany w poprzednim teście) zakończyły swoje funkcje poprzez przejście przez komórki nabłonka jelita środkowego komara i transformację do wczesnych oocyst po stronie blaszki podstawnej nabłonka jelita środkowego, czy nie. Jest to kolejny test, który w dużym stopniu wykorzystuje pasożyty wyrażające GFP, ponieważ liczenie wczesnych oocyst na tym etapie będzie prawie niemożliwe bez żmudnego barwienia immunologicznego.
    1. Wypreparować jelita środkowe (patrz punkt 4.1) 20-30 komarów karmionych krwią, w 3. lub 4. dniu po karmieniu komarów (pmf) w przypadku P. yoelii 17X-NL i w dniu 6 lub 7 pmf w przypadku P. berghei ANKA, za pomocą dwóch igieł 26 G lub 27 G lub igły i kleszczy w pożywce preparacyjnej RPMI lub PBS (metoda preparacji znajduje się w sekcji 4.3).
    2. Rozprowadzić 40-50 μl pożywki preparacyjnej na poziomej linii środkowej dłuższej krawędzi szkiełka podstawowego. Przenieś jelita środkowe do tej linii, pojedynczo, podczas sekcji i w razie potrzeby dodaj więcej pożywki do jelita środkowego, aby uniknąć wysuszenia.
    3. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na rozcięte jelito środkowe i uszczelnij je lakierem do paznokci.
    4. Używając obiektywu 10x lub 20x mikroskopu fluorescencyjnego z zielonym filtrem fluorescencyjnym, policz liczbę wczesnych oocyst na każdym jelicie środkowym, w co najmniej 20 jelitach środkowych.
  3. Oznaczanie liczby sporozoitów oocyst na komara
    1. Wypreparuj jelita środkowe co najmniej 20-30 komarów za pomocą dwóch igieł 26-G lub 27-G lub igły i kleszczy w pożywce preparacyjnej RPMI lub PBS i zbierz wypreparowane jelita środkowe w 200 μl RPMI.
    2. Przytrzymaj dolne segmenty brzucha mocno na miejscu za pomocą jednej igły (lub kleszczy) i lekko popchnij klatkę piersiową w górę drugą igłą na styku klatki piersiowej i brzucha. Wykonuj ostrożne, krótkie pchnięcia, aż klatka piersiowa oddzieli się od brzucha. Gdy tylko rozpocznie się separacja, białe jelito środkowe będzie wyglądało na rozciągnięte, a następnie jelito środkowe zostanie przecięte od końca przełyku za pomocą tej samej igły, która została użyta do oddzielenia klatki piersiowej. Jeśli nadal jest przymocowany do brzucha, ta sama igła może być użyta do odciągnięcia jelita środkowego od brzucha. Przenieś jelita środkowe wszystkich komarów do probówki zbiorczej, zbierając je z pożywki za pomocą igły, pojedynczo.
    3. Odwiruj probówkę zbiorczą przez 1 minutę przy 700 g, aby osadzić jelita środkowe na dnie probówki i zmielić je tłuczkiem. Powtórz ten krok.
    4. Przenieść 12 μl do hemocytometru i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby jego zawartość mogła się uspokoić.
    5. Policz sporozoity oocyst za pomocą obiektywu 40X mikroskopu świetlnego. Stosować rozcieńczenia w stosunku 1:5 i/lub 1:10, jeśli szczątki komarów uniemożliwiają dokładne policzenie sporozoitów lub jeśli liczba sporozoitów jest zbyt duża, aby można było je dokładnie policzyć.
    6. Obliczyć średnią całkowitą liczbę sporozoitów oocyst, mnożąc średnią liczbę sporozoitów przez 10, a następnie mnożąc tę liczbę przez współczynnik rozcieńczenia, jeśli istnieje, i przez całkowitą objętość (200 μl).
    7. Podziel średnią całkowitą liczbę sporozoitów przez liczbę wyciętych komarów, aby obliczyć średnią liczbę oocyst sporozoitów na komara.
      nuta: Częstym błędem w mierzeniu sukcesu lub produktywności infekcji w stadiach komarów jest liczenie oocyst na późniejszych etapach rozwoju oocysty. Wynika to z faktu, że niektóre oocysty są wakuolizowane w późniejszych punktach rozwoju oocysty, a inne nie rozwijają sporozoitów, nawet na tym samym jelicie środkowym. Najlepszą i najbardziej wiarygodną metodą określania produktywności infekcji stadiami komara jest liczenie średniej liczby sporozoitów oocyst w jelicie środkowym w dniach 10-12 po zakażeniu komarem w przypadku P. yoelii i w dniach 12-14 po zakażeniu komarem w przypadku P. berghei.
  4. Oznaczanie liczby sporozoitów gruczołów ślinowych na komara
    nuta: Ostateczna ocena pełnego zakończenia rozwoju komarów jest dokonywana poprzez oszacowanie liczby sporozoitów, które zaatakowały gruczoły ślinowe, które są stadiami zakaźnymi i zakaźnymi dla kręgowców. Inwazja gruczołu ślinowego następuje po zakończeniu rozwoju sporozoitu oocyst, wydostaniu się do hemolimfy, przyczepieniu się do blaszki podstawnej komórek groniastych gruczołów ślinowych i przejściu komórek groniastych w celu dotarcia do przewodów gruczołów ślinowych5. Dlatego ten test jest również oceną powodzenia wszystkich tych procesów, czy nie. Niemniej jednak oszacowanie liczby sporozoitów w hemolimfie pozwoliłoby na rozróżnienie między defektami w wychodzeniu z oocyst a defektami inwazji gruczołów ślinowych35. Oczyszczanie sporozoitów gruczołów ślinowych pozwala na przeprowadzenie wielu funkcjonalnych testów ruchliwości sporozoitów i fenotypów inwazji. Sporozoity gruczołów ślinowych mogą być również stosowane do infekcji in vivo myszy oraz w badaniach nad szczepieniami36,37. Co więcej, najbardziej powtarzalnymi etapami dostępnymi do ustalenia inwazji in vitro wątroby lub testu rozwoju jest użycie sporozoitów gruczołów ślinowych.
    1. Wypreparować gruczoły ślinowe 50-100 samic komarów, w dniach 14-16 pmf dla P. yoelii i w dniach 17-20 pmf dla P. berghei, najlepiej za pomocą dwóch igieł 26 G lub 27 G, w pożywce RPMI lub DMEM trzymanej na lodzie i uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub/lub albuminą surowicy bydlęcej (BSA) dla sporozoitów P. yoelii lub 3% FBS/BSA dla P. berghei sporozoity. Jeśli sporozoity mają być użyte w testach wątrobiaka in vitro, należy dodać 1% penicyliny/streptomycyny do podłoża preparacyjnego. Zasadniczo istnieją dwie metody rozwarstwiania gruczołów ślinowych. Pierwsza metoda jest czasochłonna, ale prowadzi do rozwarstwienia gruczołów ślinowych z bardzo małą ilością lub bez tkanek zanieczyszczających. Druga metoda jest mniej czasochłonna, ale prowadzi do pobrania znacznej ilości zanieczyszczających tkanek. Pierwsza metoda jest szczegółowo opisana tutaj.
    2. Przytrzymaj segmenty górnej części brzucha na miejscu za pomocą skośnej strony jednej igły i ostrożnie bardzo lekko popchnij głowę (w bardzo krótkich pchnięciach) na styku głowy i klatki piersiowej w kierunku do góry, aż głowa zostanie ostrożnie oddzielona od klatki piersiowej bez rozrywania szklistych gruczołów ślinowych, odsłonięte gruczoły ślinowe są następnie oddzielane od głowy tą samą igłą, która pchnęła głowę do góry.
    3. Wypreparowany gruczoł ślinowy zostanie podniesiony z pożywki preparacyjnej za pomocą krótkiej szklanej pipety Pasteura.
    4. Kiedy wszystkie gruczoły ślinowe zostaną wypreparowane i pobrane, talent umieści probówkę zawierającą jelito środkowe w wirówce (1 min, 700 x g).
    5. Policz sporozoity za pomocą hemocytometru pod mikroskopem świetlnym ustawionym na kontrast fazy 2 i 40-krotne powiększenie. Jeśli liczba wyciętych komarów ≥40, rozcieńczyć gruczoły ślinowe do 1:5 lub 1:10, w zależności od oczekiwanej wydajności zakaźności (określonej we wcześniejszych testach).
    6. Pomnóż średnią liczbę sporozoitów przez 10 i współczynnik rozcieńczenia (jeśli występuje). Pomnóż przez całkowitą objętość, aby określić średnią liczbę sporozoitów gruczołów ślinowych. Podziel przez liczbę wypreparowanych samic komarów, aby określić średnią sporozoity gruczołów ślinowych na komara.
      nuta: Problem z rozwarstwieniem gruczołów ślinowych polega na ich niewielkich rozmiarach i szklistym, przezroczystym wyglądzie. W związku z tym bardzo trudno jest wyizolować gruczoły ślinowe i dlatego zwykle są one wycinane jednorazowo wraz z innymi tkankami z przedniej części klatki piersiowej, co jest również ważne dla ochrony gruczołów ślinowych przed pęknięciem podczas pobierania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sukces w zastosowaniu narzędzi i technik genetyki odwrotnej w badaniach nad pasożytami malarii zrewolucjonizował tę dziedzinę, umożliwiając dodawanie, usuwanie lub modyfikowanie specyficznych segmentów genomowych u kilku gatunków Plasmodium39. Co istotne, zidentyfikowano i z sukcesem wykorzystano zbędne loci genomowe do wprowadzenia markerów białek fluorescencyjnych u pasożytów malarii gryzoni i ludzi poprzez podwójną rekombinację homologiczną, aby zapewni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo podobieństwa w ogólnej biologii ich cykli życiowych do ludzkiej populacji pasożytów malarii, mysie modele malarii mają również wiele różnic w stosunku do ludzkich gatunków Plasmodium , które ograniczałyby ich zastosowanie jako wiarygodnych modeli in vivo . Na przykład, z wyjątkiem żywych atenuowanych pasożytów jako szczepionek, wszystkie badania nad szczepionkami z podjednostkami i DNA oraz innymi szczepionkami dały doskonałe wyniki w modelu mysim, ale u ludzi żyjących na obszarach endemicznych w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ahmed Aly jest wspierany przez finansowanie dla Uniwersytetu Bezmialem Vakif z grantu tureckiego Ministerstwa Rozwoju 2015BSV036, oraz przez finansowanie przez Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, oraz przez finansowanie z NIH-NIAID dla R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HeparynaSigma375095-100KU
Kwas ksanturenowySigmaD120804-5G
HipoksantynaSigmaH9377-25G
Roztwór AlseveraSigmaA3551-500ML
Wodorowęglan soduSigmaS5761-500G
FenylohydrazynaSigmaP26252-5G
GlycerolSigmaG5516-500ML
GiemsaSigmaGS1L-1L
26 G x 3/8 Precyzyjna igła ślizgowa, Becton Dickinson305110
1 ml strzykawka TB, 26 G x 3/8Becton Dickinson309625
1 cc Strzykawka insulinowa, U-100 27 GBecton Dickinson329412
Isoflurane, USBPiramal2667-46-7
PBS, pH 7,4Gibco10010049
RPMIGibco22400105
DMEMGibco11995065
Pencillin/StreptomycinGibco10378016
Surowica bydlęca płoduGibco10082147
Wełna z włókna szklanegoCorning3950

Bibliografia

  1. Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
  2. Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071(2014).
  3. Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
  4. Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
  5. Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
  6. Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
  7. Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
  8. Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
  9. Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
  10. Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600(2015).
  11. Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
  12. Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
  13. Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
  14. Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882(2015).
  15. Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518(2016).
  16. Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
  17. Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665(2014).
  18. Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
  19. Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260(2017).
  20. Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
  21. Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
  22. Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
  23. Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
  24. House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
  25. Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
  26. Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
  27. Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
  28. Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
  29. Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
  30. Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
  31. Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
  32. Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
  33. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
  34. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118(2011).
  35. Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
  36. Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
  37. Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
  38. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
  39. de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
  40. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
  41. Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289(2011).
  42. Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

pasożyty w stadium krwibarwienie metodą Giemsycytometria przepływowazakażenie domięśniowezakażenie dożylnekomar Anophelesilościowe oznaczanie sporozoitów
Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.