Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ostatnie postępy w genetyce i technologiach biologii systemowej przyczyniły się do lepszego zrozumienia biologii pasożytów malarii na poziomie molekularnym. Jednak skuteczne cele dla pasożytów malarii w celu opracowania szczepionek i chemioterapii są nadal ograniczone. Wynika to w dużej mierze z niedostępności odpowiednich i praktycznych modeli zakażeń in vivo dla ludzkich gatunków Plasmodium, w szczególności dla P. falciparum i P. vivax. W związku z tym gatunki malarii gryzoni są szeroko stosowane jako praktyczne alternatywne modele in vivo dla szczepionek przeciwko malarii, celowania w leki, odpowiedzi immunologicznej i badań charakterystyki funkcjonalnej konserwatywnych genów Plasmodiumspp. Rzeczywiście, modele malarii u gryzoni okazały się nieocenione, zwłaszcza w badaniu transmisji komarów i biologii wątroby, a także były niezbędne w badaniach immunologicznych. Istnieją jednak rozbieżności w metodach stosowanych do oceny fenotypów transgenicznych i dzikich pasożytów bezpłciowych i płciowych we krwi typu dzikiego. Przykładami tych rozbieżności są wybór zakażenia dożylnego vs. dootrzewnowego u gryzoni z pasożytami we krwi oraz ocena biczowania gamet u samców. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy znormalizowane metody eksperymentalne do oceny fenotypów bezpłciowych i płciowych stadiów krwi u transgenicznych pasożytów eksprymujących gen reporterowy lub gatunki pasożytów malarii gryzoni typu dzikiego. Szczegółowo opisujemy również metody oceny fenotypów stadiów pasożyta malarii (gamety, ookinety, oocysty i sporozoity) wewnątrz wektorów komarów Anopheles. Metody te są tutaj szczegółowo opisane i uproszczone dla śmiertelnych i nieśmiertelnych szczepów P. berghei i P. yoelii, ale mogą być również stosowane z pewnymi dostosowaniami do gatunków malarii gryzoni P. chabaudi i P. vinckei.
Wprowadzenie
Pasożyty malarii powodują setki milionów zakażeń malarią u ludzi na całym świecie, powodując ponad 600 000 zgonów rocznie1. Zakażenia u ludzi są wywoływane przez pięć gatunków pasożytów malarii, a mianowicie P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae i P. knowlesi. Większość klinicznych zgonów z powodu malarii jest spowodowana przez P. falciparum w Afryce Subsaharyjskiej1. Innym ludzkim gatunkiem pasożyta malarii, który powoduje rozległe zachorowalności na całym świecie poza Afryką Subsaharyjską, jest P. vivax2. Pozostałe trzy gatunki są bardziej ograniczone....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Tulane oraz Komitetu Etyki Zwierząt Uniwersytetu Bezmialem Vakif. Wszystkie inne protokoły eksperymentalne i zastosowanie rekombinowanego DNA przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (IBC) Uniwersytetu Tulane.
1. Zakażenie myszy pasożytami we krwi do analizy parazytemii i testów infekcji komarami
- Dzień -3: opcjonalne wstrzyknięcie fenylohydrazyny myszom biorcom....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Sukces w zastosowaniu narzędzi i technik genetyki odwrotnej w badaniach nad pasożytami malarii zrewolucjonizował tę dziedzinę, umożliwiając dodawanie, usuwanie lub modyfikowanie specyficznych segmentów genomowych u kilku gatunków Plasmodium39. Co istotne, zidentyfikowano i z sukcesem wykorzystano zbędne loci genomowe do wprowadzenia markerów białek fluorescencyjnych u pasożytów malarii gryzoni i ludzi poprzez podwójną rekombinację homologiczną, aby zapewni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomimo podobieństwa w ogólnej biologii ich cykli życiowych do ludzkiej populacji pasożytów malarii, mysie modele malarii mają również wiele różnic w stosunku do ludzkich gatunków Plasmodium , które ograniczałyby ich zastosowanie jako wiarygodnych modeli in vivo . Na przykład, z wyjątkiem żywych atenuowanych pasożytów jako szczepionek, wszystkie badania nad szczepionkami z podjednostkami i DNA oraz innymi szczepionkami dały doskonałe wyniki w modelu mysim, ale u ludzi żyjących na obszarach endemicznych w.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ahmed Aly jest wspierany przez finansowanie dla Uniwersytetu Bezmialem Vakif z grantu tureckiego Ministerstwa Rozwoju 2015BSV036, oraz przez finansowanie przez Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, oraz przez finansowanie z NIH-NIAID dla R21Grant 1R21AI111058-01A1.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Heparyna | Sigma | 375095-100KU | |
| Kwas ksanturenowy | Sigma | D120804-5G | |
| Hipoksantyna | Sigma | H9377-25G | |
| Roztwór Alsevera | Sigma | A3551-500ML | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma | S5761-500G | |
| Fenylohydrazyna | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precyzyjna igła ślizgowa, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 ml strzykawka TB, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Strzykawka insulinowa, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667-46-7 | |
| PBS, pH 7,4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Surowica bydlęca płodu | Gibco | 10082147 | |
| Wełna z włókna szklanego | Corning | 3950 |
Bibliografia
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
