Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Podsumowanie

Interakcje DNA-białko są niezbędne dla wielu procesów biologicznych. Podczas oceny funkcji komórkowych analiza interakcji DNA-białko jest niezbędna do zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do analizy takich interakcji in vivo.

Streszczenie

Wiele procesów komórkowych, w tym replikacja i naprawa DNA, rekombinacja DNA i ekspresja genów, wymagają interakcji między białkami a DNA. Dlatego interakcje DNA-białko regulują wiele funkcji fizjologicznych, patofizjologicznych i biologicznych, takich jak różnicowanie komórek, proliferacja komórek, kontrola cyklu komórkowego, stabilność chromosomów, epigenetyczna regulacja genów i transformacja komórek. W komórkach eukariotycznych DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest skondensowane do chromatyny. Do analizy interakcji DNA-białko można wykorzystać kilka narzędzi technicznych, takich jak test elektroforezy (żelu) Mobility Shift Assay (EMSA) i ślad DNazy I. Jednak techniki te analizują interakcję białko-DNA in vitro, a nie w kontekście komórkowym. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to technika, która wychwytuje białka w ich określonych miejscach wiązania DNA, umożliwiając w ten sposób identyfikację interakcji DNA-białko w kontekście chromatyny. Odbywa się to poprzez utrwalenie interakcji DNA-białko, a następnie immunoprecypitację interesującego białka. Następnie scharakteryzowano miejsce genomowe, z którym białko było związane. W tym miejscu opisujemy i omawiamy ChIP oraz wykazujemy jego wartość analityczną dla identyfikacji indukowanego przez transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) wiązania czynnika transkrypcyjnego SMAD2 z elementami wiążącymi SMAD (SBE) w regionie promotorowym liganda receptora kinazy tyrozynowo-białkowej Kit (c-KIT) i czynnika komórek macierzystych (SCF).

Wprowadzenie

W jądrze eukariontów DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest kondensowane do chromatyny. W kontekście fizjologicznym, patofizjologicznym i biologicznym komórki funkcje komórkowe są przestrzennie i tymczasowo kontrolowane przez skoordynowaną ekspresję genów chromatyny. Interakcje DNA-białko odgrywają zasadniczą rolę w regulacji procesów komórkowych, takich jak replikacja, rekombinacja i naprawa DNA, a także ekspresja białek. Dlatego analiza oddziaływań DNA-białko jest niezbędnym narzędziem w ocenie ekspresji genów i funkcji komórki.

Istnieje kilka technik oceny interakcji DNA-białko in vitro, takich jak test EM....

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Do każdego eksperymentu przygotuj świeże roztwory poniższych.
   1. Do roztworu utrwalającego przygotuj 37% formaldehydu i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć go w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,42%.
      UWAGA: Formaldehyd jest klasyfikowany jako drażniący,, mutagenny, teratogenny i rakotwórczy. Nie spożywać. Nie wdychać gazu/oparów/pary/rozpylonej cieczy. W przypadku niewystarczającej wentylacji należy nosić odpowiedni sprzęt do oddychania. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Przechowywać z dala od niezgodnych substancji, tak....

Wyniki

Wiązanie ligandu TGF-β1 z jego pokrewnym kompleksem receptorowym prowadzi do fosforylacji serynowej czynników transkrypcyjnych SMAD2/3, a następnie do ich asocjacji ze wspólnym mediatorem, SMAD4. Kompleks SMAD przemieszcza się do jądra komórkowego. TGF-β może regulować transkrypcję genów bezpośrednio, poprzez wiązanie SMAD do SBE w regionach regulatorowych genów docelowych, lub pośrednio, poprzez regulowaną przez SMAD ekspresję aktywatorów lub represorów transkrypcyjnych, które następnie .......

Dyskusja

W tym raporcie pokazujemy indukowane przez TGF-a1 wiązanie SMAD2 z SBE w promotorze liganda c-KIT oraz indukowane przez TGF-a1 wiązanie STAT3 z jego sekwencją rozpoznawczą w genie liganda TGF-a1. Wykazujemy indukowane cytokinami wiązanie obu czynników transkrypcyjnych za pomocą immunoprecypitacji chromatyny.

Immunoprecypitacja chromatyny jest potężnym narzędziem do wykazania bezpośredniego wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania z DNA, do scharakteryzowania bodźców, które indukują.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki HepG2	ATCC	HB-8065
Komórki Hep3B	ATCC	HB-8064
TGF-β 1	R& D Systems	101-B1	Stosowany w stężeniu 10 ng / ml
Przeciwciało anty-SMAD2	Technologia sygnalizacji komórkowej	5339	Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g
Przeciwciało anty-STAT3	Technologia sygnalizacji komórkowej	4904	Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g
Białko ChIP-IT G Koraliki magnetyczne	Aktywny motyw	53033
Inhibitor proteazy Koktajl	Aktywny motyw	37490
Technologia sygnalizacji komórek	nukleazy mikrokokkowej	10011
Starter do przodu PCR: PAI-1			Sekwencja: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Odwrócony starter PCR: PAI-1			Sekwencja: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Starter do przodu PCR: SCF			Sekwencja: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
Starter odwrócony PCR: Sekwencja SCF			: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Starter do PCR do przodu: TGF-β 1 (STB-1)			Sekwencja: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'
Starter odwrócony do PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sekwencja: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCCCC-3'
Starter do PCR do przodu: TGF-β 1 (STB-2)			Sekwencja: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
Starter odwrócony do PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sekwencja: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'