Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Podsumowanie

Interakcje DNA-białko są niezbędne dla wielu procesów biologicznych. Podczas oceny funkcji komórkowych analiza interakcji DNA-białko jest niezbędna do zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do analizy takich interakcji in vivo.

Streszczenie

Wiele procesów komórkowych, w tym replikacja i naprawa DNA, rekombinacja DNA i ekspresja genów, wymagają interakcji między białkami a DNA. Dlatego interakcje DNA-białko regulują wiele funkcji fizjologicznych, patofizjologicznych i biologicznych, takich jak różnicowanie komórek, proliferacja komórek, kontrola cyklu komórkowego, stabilność chromosomów, epigenetyczna regulacja genów i transformacja komórek. W komórkach eukariotycznych DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest skondensowane do chromatyny. Do analizy interakcji DNA-białko można wykorzystać kilka narzędzi technicznych, takich jak test elektroforezy (żelu) Mobility Shift Assay (EMSA) i ślad DNazy I. Jednak techniki te analizują interakcję białko-DNA in vitro, a nie w kontekście komórkowym. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to technika, która wychwytuje białka w ich określonych miejscach wiązania DNA, umożliwiając w ten sposób identyfikację interakcji DNA-białko w kontekście chromatyny. Odbywa się to poprzez utrwalenie interakcji DNA-białko, a następnie immunoprecypitację interesującego białka. Następnie scharakteryzowano miejsce genomowe, z którym białko było związane. W tym miejscu opisujemy i omawiamy ChIP oraz wykazujemy jego wartość analityczną dla identyfikacji indukowanego przez transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) wiązania czynnika transkrypcyjnego SMAD2 z elementami wiążącymi SMAD (SBE) w regionie promotorowym liganda receptora kinazy tyrozynowo-białkowej Kit (c-KIT) i czynnika komórek macierzystych (SCF).

Wprowadzenie

W jądrze eukariontów DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest kondensowane do chromatyny. W kontekście fizjologicznym, patofizjologicznym i biologicznym komórki funkcje komórkowe są przestrzennie i tymczasowo kontrolowane przez skoordynowaną ekspresję genów chromatyny. Interakcje DNA-białko odgrywają zasadniczą rolę w regulacji procesów komórkowych, takich jak replikacja, rekombinacja i naprawa DNA, a także ekspresja białek. Dlatego analiza oddziaływań DNA-białko jest niezbędnym narzędziem w ocenie ekspresji genów i funkcji komórki.

Istnieje kilka technik oceny interakcji DNA-białko in vitro, takich jak test EMSA (Electroforeza (żel) Mobility Shift Assay i ślad DNase I^1,2. Jednak techniki te nie analizują interakcji białko-DNA w kontekście chromatyny i komórki. ChIP to technika, która wychwytuje białka związane z ich specyficznymi miejscami wiązania DNA, a tym samym ułatwia identyfikację interakcji DNA-białko w kontekście chromatyny. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Gimoura i Lisa do oceny wiązania polimerazy II RNA z określonymi genami w Escherichia coli i Drosophila melanogaster^3,4. Odbywa się to poprzez utrwalenie kompleksów DNA-białko, a następnie przeprowadzenie ekstrakcji chromatyny i ścinanie DNA na fragmenty ~ 200 par zasad (bp). Następnie białko związane z DNA, będące przedmiotem zainteresowania, jest izolowane przez immunoprecypitację. Po odwróceniu wiązania krzyżowego DNA-białko DNA jest oczyszczane i analizowane. Do analizy miejsc wiązania białek można zastosować kilka metod, które zależą od sekwencji kwasu nukleinowego miejsca wiązania białka w docelowym genie⁵. W przypadkach, gdy sekwencja DNA jest znana, można zastosować standardowe reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR), używając określonych par starterów flankujących znane miejsce wiązania. Można również użyć ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)⁶. W przypadkach, gdy sekwencja jest nieznana, ChIP można połączyć z mikromacierzami DNA (ChIP-on-chip), sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) lub technikami klonowania^7,8,9.

Szlak TGF-β ma silne funkcje tłumienia nowotworów i jest kluczowym szlakiem w różnicowaniu komórek. Jest aktywowany poprzez wiązanie liganda TGF-β1 z pokrewnym kompleksem receptorowym, co powoduje fosforylację seryny czynników transkrypcyjnych SMAD2/3. Po ich połączeniu ze wspólnym mediatorem, SMAD4, kompleks SMAD przemieszcza się do jądra i wiąże się z SBE w regionie promotorowym genów docelowych, gdzie reguluje geny kontrolujące cykl komórkowy, apoptozę i różnicowanie komórek. Odpowiedź transkrypcyjna na stymulację TGF-β jest specyficzna dla typu komórki i kontekstu¹⁰. Niedawno opisaliśmy pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego między TGF-β a ścieżką c-KIT¹¹. W tym modelu SMAD2 aktywowany TGF-β1 wiąże się z promotorem liganda c-KIT i indukuje jego ekspresję i wydzielanie. Następnie ligand c-KIT aktywuje receptor c-KIT w sposób auto- i parakrynny. Aktywacja receptora c-KIT powoduje fosforylację STAT3 Tyr⁷⁰⁵ przez JAK1/2. Po aktywacji STAT3 i translokacji jądrowej, STAT3 wiąże się z genem ligandu TGF-β1 i reguluje jego ekspresję.

Tutaj pokazujemy kluczową rolę analizy ChIP w identyfikacji wiązania SMAD2 z promotorem ligandu receptora c-KIT oraz w identyfikacji przetwornika sygnału (i) aktywatora (z) transkrypcji 3 (wiązanie STAT3 z genem TGF-β1).

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

1. Do każdego eksperymentu przygotuj świeże roztwory poniższych.
   1. Do roztworu utrwalającego przygotuj 37% formaldehydu i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć go w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,42%.
      UWAGA: Formaldehyd jest klasyfikowany jako drażniący,, mutagenny, teratogenny i rakotwórczy. Nie spożywać. Nie wdychać gazu/oparów/pary/rozpylonej cieczy. W przypadku niewystarczającej wentylacji należy nosić odpowiedni sprzęt do oddychania. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Przechowywać z dala od niezgodnych substancji, takich jak środki utleniające, redukujące, kwasy, zasady i wilgoć.
   2. Aby uzyskać roztwór stop-fix glicyny, należy przygotować 0,125 M glicyny w 1 roztworze PBS i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   3. Do roztworu do skrobania komórek przygotuj 1x roztwór PBS w dH₂O i przechowuj go na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitor proteinazy fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 0,5 mM.
      UWAGA: PMSF jest klasyfikowany jako i toksyczny; Nosić odzież ochronną i używać jej w przewiewnym miejscu.
   4. Bezpośrednio przed użyciem buforu do lizy komórek (20 mM Tris-HCl; pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% NP40), dodać 1X Koktajl Inhibitora Proteazy (; 100X roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku (DMSO): 104 mM chlorowodorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylu (AEBSF), 80 μM aprotynina, 4 mM bestatyna, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptyna i 1,5 mM pepstatyna A) i 0,5 mM PMSF.
   5. Bezpośrednio przed użyciem buforu do lizy jąder (50 mM Tris-Cl; pH 8,0, 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i 1% SDS) dodać 1X i 0,5 mM PMSF.

2. Utrwalanie i ścinanie komórek

1. Hoduj komórki do 70-80% zbieżności na 10 cm płytkach do hodowli tkankowych. Stymuluj komórki zgodnie z celami eksperymentalnymi.
2. Usunąć pożywkę do hodowli tkankowych, dodać 5 ml roztworu utrwalającego i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej.
3. Usuń roztwór utrwalający i przemyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego 1x PBS.
4. Usuń 1x PBS, dodaj 5 ml roztworu glicyny stop-fix i inkubuj komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej.
5. Usuń roztwór glicyny stop-fix i umyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego 1x PBS.
6. Usuń 1x PBS, dodaj 2 ml roztworu do skrobania komórek i zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś zebrane komórki do stożkowej rurki na lodzie.
7. Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 600 x g i temperaturze 4 °C.
8. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy komórek 1X i inkubować na lodzie przez 30 minut. Alternatywnie, zamrozić granulkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Gdy osad zostanie ponownie zawieszony w buforze do lizy komórek, przenieś zawiesinę komórkową do lodowatego homogenizatora z dounce i zanurzaj przez 10 uderzeń za pomocą tłuczka typu B do rozbijania komórek.
10. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej i odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 2 400 x g i temperaturze 4 °C.
11. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 350 μl buforu do wytrawiania jąder i inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
12. Dodać nukleazę mikrokokową (1 U/μL) i wymieszać przez wirowanie. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 5–20 minut; Mieszać próbki co 2 minuty metodą inwersji.
    UWAGA: Czas i stężenie enzymu różnią się w zależności od linii komórkowych i mogą wymagać optymalizacji w przypadku nieoptymalnego ścinania enzymatycznego.
13. Alternatywnie, osiągnij ścinanie chromatyny przez sonikację przy użyciu dostępnych na rynku sonikatorów.
    UWAGA: Warunki sonikacji będą wymagały optymalizacji. Poniżej przedstawiono przykładowy protokół optymalizacji wykorzystujący objętość próbki 300 μl i moc przetwarzania próbki 25%.
    1. Po kroku 2.10 wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 1,0 ml komercyjnego buforu ścinającego.
    2. Porcję 300 μl zawieszonego osadu jądrowego rozmieścić w trzech probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Umieść je na lodzie.
    3. Ścinanie 3 porcji ustalonej chromatyny przy 25% mocy przy użyciu 3 różnych warunków, aby określić optymalne warunki sonikacji:
       5 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem.
       10 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem.
       20 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem.
    4. Przejdź do kroku 2.15, jak opisano poniżej.
14. Po inkubacji z nukleazą mikrokokową dodać 7 μl lodowatego 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję.
15. Odwirować próbki ze ściętym DNA przez 10 minut w temperaturze 16 200 x g i temperaturze 4 °C.
16. Przenieść ścięty supernatant zawierający DNA do świeżej probówki do mikrowirówki. Podaniec 50 μl do oddzielnej probówki mikrowirówkowej w celu potwierdzenia pomyślnego ścinania DNA (sekcja 3). Pozostałą objętość należy natychmiast zużyć do immunoprecypitacji (punkt 4) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Potwierdzenie skuteczności ścinania

1. Dodać 150 μl wolnego od nukleaz_dH2O i 10 μl 5 M NaCl do 50 μl podwielokrotności ściętej chromatyny z kroku 2.16.
2. Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 4 godziny w celu odwrócenia powwiązań krzyżowych.
3. Dodać 2 μl RNazy A (10 μg/μl) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
4. Dodać 10 μl proteinazy K (0,5 μg/μl) i inkubować próbki w temperaturze 42 °C przez 90 minut.
5. W celu oczyszczenia DNA należy przeprowadzić ekstrakcję fenolem/chloroformem¹².
   1. Dodać wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 200 μl. Dodać 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do próbki i wirować przez 20 s.
   2. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 16 000 x g. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki. Należy pamiętać, aby nie przenosić fenolu podczas pipetowania.
   3. Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu (NH₄OAc) o pH 5,2 i wymieszać, kilkakrotnie przesuwając probówkę palcem. Dodaj 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu i mieszaj wirując przez 5 sekund. Inkubować próbkę O/N w temperaturze -20 °C lub przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C.
   4. Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C i 16 000 x g w celu osadzenia cDNA.
   5. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Dodaj 1 ml RT, 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę.
   6. Odwirować próbkę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i 16 000 x g. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.
   7. Suszyć osad przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 30 μL dH₂O.
6. Użyć 5 i 10 μl podwielokrotności oczyszczonego DNA do elektroforezy żelowej z 1% żelem agarozowym TAE.
   UWAGA: Udane ścinanie chromatyny skutkuje wzorem DNA o długości 200-1,500 pz. Jeśli ścinanie się nie powiedzie, określ optymalne warunki ścinania dla określonych komórek, modyfikując czas inkubacji etapu ścinania (krok 2.12) na 5, 10 i 15 minut.
7. Pozostałą próbkę należy wykorzystać do analizy stężenia DNA w próbce. Obliczyć wstecznie stężenie DNA w ściętej próbce chromatyny (krok 2.16); stosować te same ilości DNA dla każdej grupy poddanej działaniu substancji w celu immunoprecypitacji (punkt 4).

4. Immunoprecypitacja

1. Połącz 10-25 μg ściętej, usieciowanej chromatyny (krok 2.16) z 25 μl kulek magnetycznych białka G klasy ChIP, 10 μl buforu rozcieńczającego immunoprecypitację (roztwór podstawowy: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl; pH 8,0, 1,2 mM EDTA i 167 mM NaCl) i 1 μl.
2. Po 4 godzinach inkubacji dodać 1-10 μg przeciwciała (stężenie przeciwciała będzie się różnić w zależności od powinowactwa przeciwciała; początkowo należy je stosować zgodnie z zaleceniami producenta i w razie potrzeby zoptymalizować eksperymentalnie) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodać_dH2Odo końcowej objętości 100 μL.
   UWAGA: Zamiast opisanej powyżej metody immunoprecypitacji bezpośredniej, można zastosować metodę immunoprecypitacji pośredniej, najpierw łącząc chromatynę z przeciwciałami, a następnie dodając kulki magnetyczne białka G.
3. Próbki inkubować na rotatorze typu end-to-end przez 4–12 godzin w temperaturze 4 °C.

5. Elucja

1. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.
2. Przemyć kulki trzykrotnie 800 μl buforu do płukania 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl; pH 8 i 150 mM NaCl); wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć bufor do mycia, gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki.
3. Umyj kulki raz 800 μl buforu do płukania 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 i 500 mM NaCl); wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć bufor do mycia, gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki.
4. Zawiesić kulki w 50 μl buforu elucyjnego (1% SDS i 100 mM_NaHCO3) i inkubować próbki na rotatorze typu end-to-end przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umieść probówki na stojaku magnetycznym, a gdy kulki magnetyczne zbiorą się z boku probówki, przenieś supernatant do świeżej probówki.
6. Dodaj 6 μl 5 M NaCl, aby odwrócić sieciowanie, i 2 μl proteinazy K (0,5 μg/μL). Po wymieszaniu próbek inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.
7. W celu oczyszczenia DNA należy przeprowadzić ekstrakcję fenolem/chloroformem¹² (krok 3.5), a następnie ponownie zawiesić osad w 30 μL dH₂O.
   UWAGA: Próbki mogą być bezpośrednio analizowane pod kątem miejsc wiązania białek (sekcja 5) lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.

6. Analiza miejsca wiązania

1. Wykonaj analizę określonych miejsc wiązania w znanej sekwencji kwasu nukleinowego za pomocą PCR lub qRT-PCR. W przypadku projektowania starterów postępuj zgodnie z konwencjonalnymi protokołami PCR lub qRT-PCR. Zaprojektuj startery tak, aby zsyntetyzować amplikon o masie 150-400 pz, który mostkuje miejsce wiązania białka (Rysunek 1).
2. Ustaw PCR przy użyciu czterech różnych matryc DNA, aby zapewnić swoistość: i) DNA z ChIP immunoprecypitowanego badanym przeciwciałem, ii) DNA z ChIP immunoprecypitowanego niespecyficznym przeciwciałem IgG, iii) wejściowego DNA oraz iv) H₂O jako negatywnej kontroli dla PCR w celu wykluczenia zanieczyszczenia. W przypadku stymulacji szlaku należy wybrać piątą matrycę, używając innego zestawu starterów specyficznych dla znanego miejsca wiązania białka immunoprecypitowanego.
   UWAGA: W przypadku analizy promotora liganda c-KIT należy użyć konwencjonalnego PCR, aby wykazać wiązanie SMAD indukowane przez TGF-β w SBE w regionie promotora liganda c-KIT. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić PCR na inhibitorze aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1) jako znanym celu wiązania SMAD indukowanego przez TGF-β.

Wyniki

Wiązanie ligandu TGF-β1 z pokrewnym kompleksem receptorowym powoduje fosforylację seryny czynników transkrypcyjnych SMAD2/3, a następnie ich powiązanie z powszechnym mediatorem, SMAD4. Kompleks SMAD przemieszcza się do jądra. TGF-β może regulować transkrypcję genów, albo bezpośrednio poprzez wiązanie SMAD z SBE w regionach regulatorowych docelowych genów, albo pośrednio poprzez regulowaną przez SMAD ekspresję aktywatorów transkrypcyjnych lub represorów, które następnie regulują ekspresję ...

Dyskusja

W tym raporcie pokazujemy indukowane przez TGF-a1 wiązanie SMAD2 z SBE w promotorze liganda c-KIT oraz indukowane przez TGF-a1 wiązanie STAT3 z jego sekwencją rozpoznawczą w genie liganda TGF-a1. Wykazujemy indukowane cytokinami wiązanie obu czynników transkrypcyjnych za pomocą immunoprecypitacji chromatyny.

Immunoprecypitacja chromatyny jest potężnym narzędziem do wykazania bezpośredniego wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania z DNA, do scharakteryzowania bodźców, które indukują...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki HepG2	ATCC	HB-8065
Komórki Hep3B	ATCC	HB-8064
TGF-β 1	R& D Systems	101-B1	Stosowany w stężeniu 10 ng / ml
Przeciwciało anty-SMAD2	Technologia sygnalizacji komórkowej	5339	Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g
Przeciwciało anty-STAT3	Technologia sygnalizacji komórkowej	4904	Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g
Białko ChIP-IT G Koraliki magnetyczne	Aktywny motyw	53033
Inhibitor proteazy Koktajl	Aktywny motyw	37490
Technologia sygnalizacji komórek	nukleazy mikrokokkowej	10011
Starter do przodu PCR: PAI-1			Sekwencja: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Odwrócony starter PCR: PAI-1			Sekwencja: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
Starter do przodu PCR: SCF			Sekwencja: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
Starter odwrócony PCR: Sekwencja SCF			: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Starter do PCR do przodu: TGF-β 1 (STB-1)			Sekwencja: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'
Starter odwrócony do PCR: TGF-β 1 (STB-1)			Sekwencja: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCCCC-3'
Starter do PCR do przodu: TGF-β 1 (STB-2)			Sekwencja: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
Starter odwrócony do PCR: TGF-β 1 (STB-2)			Sekwencja: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'