Method Article

Metoda badania wpływu sygnałów środowiskowych na zachowania godowe u Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazujemy test do analizy środowiskowych i genetycznych wskazówek, które wpływają na zachowania godowe muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na popęd seksualny jednostki wpływa genotyp, doświadczenie i warunki środowiskowe. Sposób, w jaki te czynniki oddziałują na siebie, modulując zachowania seksualne, pozostaje słabo poznany. U Drosophila melanogaster sygnały środowiskowe, takie jak dostępność pożywienia, wpływają na aktywność godową, oferując elastyczny system do badania mechanizmów modulujących zachowania seksualne. U D. melanogaster sygnały środowiskowe są często wyczuwane przez chemosensoryczny układ smakowy i węchowy. W tym miejscu przedstawiamy metodę testowania wpływu środowiskowych sygnałów chemicznych na zachowania godowe. Test składa się z małej areny godowej zawierającej pożywkę pokarmową i parę kryjącą. Częstotliwość krycia dla każdej pary jest stale monitorowana przez 24 godziny. W tym miejscu przedstawiamy możliwość zastosowania tego testu do badania związków środowiskowych ze źródła zewnętrznego za pomocą systemu sprężonego powietrza, a także do manipulacji składnikami środowiska bezpośrednio na arenie łączenia. Zastosowanie systemu sprężonego powietrza jest szczególnie przydatne do testowania wpływu bardzo lotnych związków, podczas gdy manipulowanie komponentami bezpośrednio na arenie łączącej może być przydatne w celu ustalenia obecności związku. Test ten można zaadaptować, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu sygnałów genetycznych i środowiskowych na zachowania godowe i płodność, a także inne zachowania reprodukcyjne samców i samic.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowania reprodukcyjne zazwyczaj wiążą się z wysokimi kosztami energii, szczególnie dla samic, które produkują większe gamety niż samce i muszą starannie wybierać warunki do wychowania swojego rozwijającego się potomstwa. Ze względu na koszt energii nie jest zaskakujące, że reprodukcja jest związana z warunkami odżywiania. Dotyczy to większości, jeśli nie wszystkich, zwierząt, w tym ssaków, których dojrzewanie może być opóźnione przez niedożywienie i których popęd seksualny może być negatywnie dotknięty przez ograniczenie żywności1.

Na rozmnażanie modelu genetycznego Drosophila melanogaster wpływają również warunki żywieniowe. Samce są bardziej wrażliwe seksualnie na wyższy poziom w obecności substancji lotnych w pokarmie2, a samice są bardziej wrażliwe seksualnie w obecności drożdży, głównego składnika odżywczego dla produkcji jaj i przetrwania potomstwa3,4,5. Ta ewolucyjnie zachowana reakcja reprodukcyjna na żywność daje możliwość zbadania mechanizmów, które łączą środowiskową dostępność żywności z rozmnażaniem płciowym w genetycznie podatnym i wydajnym czasowo organizmie. Rzeczywiście, badania nad D. melanogaster wskazują na szlak insulinowy jako ważny regulator związku między jedzeniem a zachowaniami godowymi6. Wykazano również, że sam akt krycia zmienia preferencje żywieniowe samic, a także związane z nimi neurony chemosensoryczne7,8,9.

Jest jasne, że wskazówki dotyczące jedzenia wpływają na zachowania reprodukcyjne u D. melanogaster. Wydaje się, że efekty te dotyczą głównie samic, szczególnie tych, które już pokryły5. Jednak, aby przetestować te ostre skutki warunków środowiskowych, test klasycznie stosowany do zachowań godowych samic może nie być zbyt odpowiedni ze względu na długie przerwy między epizodami godowymi. W klasycznym teście recytacyjnym dziewicza samica najpierw kojarzy się z samcem i jest natychmiast izolowana i prezentowana z nowym samcem 24 do 48 godzin później. Ten klasyczny test został wykorzystany z dużym powodzeniem do identyfikacji składników męskiego ejakulatu, które modyfikują zachowanie samicy i reakcję samicy12,13,14,15,16,17,18. Pokazany tutaj test ciągłego krycia jest zatem dodatkiem do klasycznych testów godowych, które można wykorzystać do badania ostrego wpływu warunków środowiskowych na zachowania reprodukcyjne.

Korzystając z opisanego tutaj ciągłego testu zachowań godowych, wcześniej pokazaliśmy, że para much wystawionych na działanie drożdży będzie się ponownie kojarzyć kilka razy w ciągu 24-godzinnego okresu obserwacji5,19,20,21, podczas gdy muchy nienarażone na kontakt z jedzeniem będą ponownie kojarzyć tylko raz5. Odkrycie to może być zastanawiające w świetle dużej części literatury dotyczącej D. melanogaster wskazującej, że samice nie łączą się w pary przez kilka dni po pierwszym kryciu (przejrzane w źródłach10,11). Jednak tę rozbieżność można łatwo wytłumaczyć warunkami testu, w których samica jest izolowana przez jeden do kilku dni, zanim zostanie zapewniona nowa okazja do krycia. Jeśli para nie kojarzy się w tym godzinnym okresie obserwacji, samica jest charakteryzowana jako nieotwarta. Co więcej, wysoka częstotliwość krycia nie powinna dziwić, biorąc pod uwagę, że dane dotyczące dziko żyjących much pokazują, że samice zawierają plemniki od 4 do 6 samców w swoich narządach spichrzowych; Wskazując w ten sposób, że samice naturalnie łączą się w pary kilka razy22,23.

Tutaj demonstrujemy użycie tego ciągłego testu godowego do rozwikłania, w jaki sposób muchy zbierają i łączą informacje o warunkach środowiskowych w celu modulowania częstotliwości krycia. Test ten pozwala na przetestowanie stosunkowo dużej liczby par godowych do badań genetycznych oraz na przetestowanie wpływu lotnych i nielotnych sygnałów środowiskowych. Test trwa zazwyczaj 24 godziny, ale można go przedłużyć do 48 godzin, co pozwala na testowanie cyklicznych sygnałów środowiskowych, takich jak cykl jasny-ciemny (LD). Demonstrujemy ten test, testując wpływ lotnych sygnałów z kultury drożdży w systemie sprężonego powietrza w połączeniu z dostępnością nielotnych składników odżywczych drożdży w podłożu spożywczym.

System sprężonego powietrza nieustannie pompuje lotne sygnały do areny godowej, która zawiera substrat pokarmowy i parę testową (której zachowanie godowe jest monitorowane). Aby dokładniej określić specyfikę, poprzez którą drożdże wpływają na kojarzenie, testujemy główny lotny związek drożdży, a mianowicie kwas octowy24, w połączeniu z zawartością aminokwasów odpowiadającą zawartości drożdży w podłożu spożywczym, w postaci peptonu (aminokwasy pochodzące z enzymatycznego trawienia białek zwierzęcych). Razem eksperymenty te pokazują, w jaki sposób wpływ sygnałów środowiskowych na zachowanie godowe D. melanogaster można przetestować za pomocą tego testu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Skrzynka godowa kontrolowana przez środowisko

  1. Aby zapewnić kontrolowany i łatwy do czyszczenia obszar testowy, ustaw szafkę kuchenną ze stali nierdzewnej o wymiarach 120 cm x 64 cm x 85 cm, jak pokazano na rysunku 1A.
    1. Wywierć jeden otwór z tyłu szafki tuż pod sufitem i cztery zestawy czterech otworów po bokach, każdy o średnicy 2 cm. Wywierć pierwsze dwa zestawy po cztery otwory, po każdej stronie pudełka na wysokości 7 cm od dna pudełka i z 12,5 cm między otworami. Wywierć pozostałe dwa zestawy z każdej strony pudełka na wysokości 35 cm od dołu.
      UWAGA: Cztery zestawy po cztery otwory służą do zasilających kamerę i przewodów pompy powietrza do wchodzenia i wychodzenia z szafy. Otwór z tyłu służy do podłączenia zasilających tablicy świetlnej.
    2. Zbuduj tablicę świetlną z 18 rzędami 40 naprzemiennie białych i czerwonych diod elektroluminescencyjnych (LED) z odstępem 2,5 cm między każdym światłem. Zamontuj białą i czerwoną diodę LED w obwodzie z zasilaniem. Podłącz każdą diodę LED szeregowo z rezystorem o Ω 560, 0,25 W i tolerancji 5%.
      UWAGA: Długości fal emisyjnych światła czerwonego wahały się od 590 do 661 nm z ostrym szczytem przy 627 nm. Wynikowe natężenie światła na obszarze eksperymentalnym wynosi około 900 luksów przy włączonych obu światłach i 90 luksów przy włączonych tylko światłach czerwonych; Zostało to zmierzone za pomocą aplikacji światłomierza na smartfona.
    3. Przymocuj tablicę świetlną do górnej części obudowy ze stali nierdzewnej i przeprowadź zasilające przez otwór z tyłu.
    4. Podłącz adapter białych diod LED do timera sterowania mocą, aby umożliwić wyłączenie białej diody LED podczas ciemnej fazy eksperymentu. Podłącz adapter czerwonego światła, które muchy są ślepe na25, do zwykłego źródła zasilania, aby były włączone przez cały czas trwania eksperymentu.
    5. Przymocuj jeden metalowy wspornik o długości 110 cm i dwa metalowe wsporniki o długości 54 cm, każdy o szerokości 0,5 cm, do wewnętrznych boków pudełka na wysokości 50 cm od dna pudełka. Umieść płytę dyfuzyjną z matowego szkła (wymiary 119.0 cm x 54.5 cm x 0.5 cm) na tych wspornikach.
    6. Dodać trzy warstwy bibuły filtracyjnej (120 cm x 50 cm) między płytą świetlną a płytą szklaną, aby rozproszyć światło i ograniczyć odblaski na powierzchni aren łączących się (opisanych w sekcji 4). Zepnij ze sobą dwa arkusze bibuły filtracyjnej na ich długiej krawędzi na drewnianych prętach o długości 120 cm za pomocą magnesów (z boku), aby przykleić je do wnętrza metalowej szafki; Wykonaj tę czynność 3 razy.
    7. Zamocuj cztery wentylatory po bokach skrzynki, aby wytworzyć strumień powietrza, który w sposób ciągły odprowadza pasującą skrzynkę. Zamocuj pierwszy zestaw wentylatorów o średnicy 8 cm między tablicą świetlną a szklaną płytą, tak aby wlot powietrza znajdował się po lewej stronie, a wylot po prawej stronie skrzynki, aby zminimalizować gromadzenie się ciepła wytwarzanego przez tablicę świetlną.
    8. Podłącz drugi zestaw wentylatorów 12 cm 25 cm nad dnem szafy, aby wytworzyć przepływ powietrza na zewnątrz, który wentyluje wnętrze szafy i chłodzi ją do stabilnej temperatury 26 °C. Podłącz wentylatory po stronie wywiewu do węża ssącego i wyprowadź strumień powietrza z pomieszczenia, aby zapobiec ponownemu recyklingowi powietrza w szafie.
  2. Ustaw dwa stojaki (o wysokości około 48 cm) zamontowane za pomocą dwóch zacisków, jeden w odległości 28 cm, a drugi w odległości 30 cm od podstawy stojaka. Zamocuj kamerę internetową na każdym z zacisków. Podłącz 4 kamery do komputera, na którym działa oprogramowanie monitorujące.
  3. Umieść arkusze A4 pod każdą kamerą internetową. Użyj niezadrukowanych białych arkuszy lub arkuszy z wstępnie ponumerowaną siatką kwadratów 7 na 5 z osiami 4 cm, aby pomieścić areny do krycia (opisane w sekcji 4).
    UWAGA: Kamera internetowa HD z szerokokątnym kątem widzenia 78° i rozdzielczością 5 milionów pikseli może pokryć obszar o wymiarach 21 cm x 30 cm, co odpowiada arkuszowi A4 i monitorować od 20 do 35 aren godowych.

2. Hodowla i zbieranie much

  1. Umieścić 20 samców i 20 samic much Canton-S typu dzikiego w butelkach do hodowli much zawierających 45 ml bogatej pożywki dla much (patrz sekcja 3) na trzy do czterech dni. Przenieś te same dorosłe osoby trzy razy, najpierw stukając je w dół, a następnie do świeżych butelek.
    1. Umieścić butelki w inkubatorze w temperaturze 25 °C i 12 godzin: 12 godzin cyklu jasno-ciemnego z włączonym światłem o godzinie 09:00 (czasu Zeitgebera (ZT) 0). Nowe pokolenie pojawi się około 10 dni później.
  2. Znieczulenie powstałych nowo zamkniętych much na podkładkach z dwutlenkiem węgla nie dłużej niż 5 minut i zebranie ich do fiolek z pokarmem dla much za pomocą pędzla.
    1. Zebrać dziewicze (nowo zamknięte) samice i dziewicze samce z butelek bulionowych Canton-S typu dzikiego do fiolek do hodowli much o wymiarach 2,5 cm x 9,5 cm z 6,5 ml bogatej pożywki dla much.
  3. Starzenie much w grupach tej samej płci po 20 much każda w fiolkach do hodowli much przez 5 do 8 dni w temperaturze 25 °C i 12 godzin: 12 godzin cyklu jasno-ciemnego i światła włączone o 09:00 (ZT 0).
  4. Przenieść muchy do fiolek do hodowli świeżych much w dniu poprzedzającym eksperyment.

3. Przygotowanie podłoża spożywczego

  1. Przygotuj 1 l bogatego podłoża muchowego w następujący sposób.
    1. Wlej 1 l wody z kranu do szklanej zlewki o pojemności 2 l z mieszadłem magnetycznym i umieść zlewkę na magnetycznej płycie grzejnej. Nie mieszaj i zwiększ temperaturę grzania do 300 °C, aż do osiągnięcia temperatury wrzenia.
      UWAGA: Podczas długiego czasu gotowania w kolejnych krokach część wody wyparuje, ale wraz z dodanymi składnikami protokół ten daje 1 l bogatej pożywki muchowej przygotowanej w temperaturze pokojowej około 22 °C.
    2. Włącz mieszanie do 500 obrotów na minutę (rpm) i dodaj następujące składniki do wrzącej wody: 10 g agaru, 30 g glukozy, 15 g sacharozy, 15 g mąki kukurydzianej, 10 g kiełków pszenicy, 10 g mąki sojowej, 30 g melasy, 35 g aktywnych suchych drożdży. Poczekaj, aż drożdże energicznie się spienią, a następnie zmniejsz temperaturę płyty grzejnej do 120 °C.
    3. Po 10 minutach zmniejsz temperaturę płyty grzejnej do 30 °C i pozwól mieszaninie mieszać się, aż ostygnie do 48 °C. Monitoruj temperaturę, wkładając termometr bezpośrednio do żywności.
    4. Rozpuścić 2 g estru metylowego kwasu p-hydroksybenzoesowego (tegosept,100%) w 10 ml 96% etanolu. Dodaj to i 5 ml 1 M kwasu propionowego do mieszaniny. Mieszaj przez 3 minuty.
    5. Wlej pożywkę z pokarmem dla much do aren (opisaną w sekcji 4), aby utworzyć warstwę o grubości 0,3 cm na dnie areny.
      1. Do nalewania użyj szklanej zlewki o pojemności 200 ml. Gdy ważne są dokładne ilości, użyj pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  2. Przygotować pożywkę dla much bez drożdży dokładnie tak, jak opisano w kroku 3.1.1 do 3.1.5, ale pominąć drożdże w kroku 3.1.2.
  3. Przygotować podłoże z agarem z peptonem lub bez, mieszając 10 g agaru i 35 g peptonu w 1 l wrzącej wody i wykonać czynności 3.1.4-3.1.5.

4. Przygotowanie areny godowej

  1. Przebić otwór o średnicy około 0,3 cm na górnej stronie plastikowej szalki Petriego o wymiarach 3,5 cm x 1,0 cm za pomocą podgrzanej igły do przygotowania (podgrzanej do zaczerwienienia w palniku Bunsena). Alternatywnie użyj lutownicy.
  2. Przygotowując pożywkę spożywczą ze związkami zapachowymi, najpierw odpipetuj 30 μL (1% końcowego podłoża spożywczego, np. Kwas octowy lodowaty 100%) pożądanego związku do naczynia dla połowy eksperymentalnych szalek. Drugą połowę naczyń pozostaw puste dla porównania.
    UWAGA: Przy opisanej tutaj konfiguracji można przetestować maksymalnie 140 aren jednocześnie.
  3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml wlej 3 ml pożywki spożywczej na dno naczynia na wierzch żądanego związku. Przykryj go gazą serową, aby zapobiec zanieczyszczeniu, i pozostaw podłoże do zestalenia się na około 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść pokrywkę na naczyniach i zaklej je taśmą z dwóch stron. Przygotuj małe zatyczki z folii parafinowej do zakrycia otworów naczyń, zwijając kawałki folii parafinowej w rolki o grubości 0,2 cm, a następnie pokrój je na segmenty o grubości 0,5 cm.

5. Kultura drożdży dla zapachu

  1. Hoduj suche aktywne drożdże na agarze z dekstrozą peptonową (YPD) z ekstraktem drożdżowym na szalce Petriego o wymiarach 14,0 cm x 2,06 cm. Na tym etapie należy nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    1. Przygotować płytki agarowe YPD, dodając 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 22 g glukozy (0(+)-glukozy jednowodnej) i 15 g agaru (czystego) do 1 l wrzącej ultraczystej wody. Po rozpuszczeniu wszystkiego ułóż warstwę na dnie szalki Petriego i przechowuj do góry nogami w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.
    2. Posyp kilka ziaren suszonych drożdży na pożywce YPD, pozwól im się rozpuść. Następnie przetrzyj pożywkę za pomocą sterylnej pętli. Przechowywać płytkę w inkubatorze o temperaturze 30 °C przez noc. Następnie przechowuj kulturę w lodówce nie dłużej niż 1 tydzień.
  2. Przygotuj płynną pożywkę YPD w butelkach o pojemności 1 l, dodając 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu, 22 g glukozy (0(+)-glukozy jednowodnej) i mieszadło do 1 l ultraczystej wody.
    1. Autoklaw przez 25 minut w temperaturze 120 °C i ciśnieniu 1 bar. Następnie należy przechowywać butelki w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy, aż do użycia.
  3. Do otwartych nakrętek (4,5 cm) należy dopasować silikonową przegrodę o grubości 0,32 cm.
    1. Wytnij dwa małe otwory w przegrodzie, aby dobrze dopasować kolczaste łączniki grodziowe. Przymocuj małą rurkę z polichlorku winylu (PVC) (średnica: zewnętrzna 0.8 cm i wewnętrzna 0.5 cm) do obu wylotów wychodzących z butelki i tylko do jednego z wlotów wchodzących do butelki. Zobacz rysunek 1B dla ilustracji.
    2. Owinąć dopasowane nakrętki i rurki folią aluminiową i sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 120 °C i ciśnieniu 1 bar.
  4. Na tym etapie należy nosić rękawice chroniące przed zanieczyszczeniem. Zanurzyć sterylną końcówkę pipety o pojemności 100 μl w jednej z kolonii drożdży z płytki agarowej YPD (opisanej w ppkt 5.1) i wrzucić ją do autoklawowanej butelki z płynnym podłożem YPD.
    1. Zakręć tę zaszczepioną drożdżami butelkę z płynnym podłożem YPD, a także butelkę kontrolną pożywki YPD (drożdże nie dodawane) z autoklawowanymi nakrętkami zamontowanymi z wlotem i wylotem (opisano w kroku 5.3). Umieść obie butelki na osobnych płytkach magnetycznych i mieszaj z prędkością 100 obr./min w temperaturze pokojowej przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić wzrost kultury drożdży.
    2. Podłącz wloty obu butelek do oddzielnych pomp akwariowych, aby dostarczyć powietrze do kultury drożdży. Upewnij się, że wylot eksperymentalnej butelki z drożdżami jest podłączony do rurki odprowadzającej zapach drożdży z pomieszczenia eksperymentalnego, aby zapobiec zakłóceniom eksperymentu.

6. Konfiguracja pompy powietrza

  1. Podłącz dużą rurkę PVC (średnica: zewnętrzna 1,2 cm i wewnętrzna 0,9 cm) do źródła sprężonego powietrza i przeprowadź ją przez dwie szklane kolby Erlenmeyera o pojemności 1 litra wypełnione węglem aktywnym do linii 800 ml w celu oczyszczenia powietrza. Użyj sprężonego powietrza zwykle dostarczanego w laboratoriach jako źródła powietrza lub podłącz rurki do pompy powietrza (tutaj użyto sprężonego powietrza).
    UWAGA: Materiał rurki powinien być wybrany na podstawie właściwości chemicznych substancji lotnej i przetestowany, aby zapobiec przywieraniu substancji lotnych do wyściółki rurki (np. politetrafluoroetylen, nylon lub stal nierdzewna).
  2. Wykonaj dwa rozdzielacze powietrza z probówek o pojemności 15 ml i trzech końcówek do pipet o pojemności 1 000 μl każdy.
    1. Wykonaj trzy otwory o średnicy ~1 cm. Najpierw wypal dwa otwory, używając podgrzanej igły do preparatu (podgrzewanej na czerwono w palniku Bunsena), przylegających do siebie tuż pod pokrywką probówki o pojemności 15 ml. Następnie wykonaj trzeci otwór, usuwając spód rurki.
    2. Przyklej końcówki pipet o pojemności 1 000 μl do otworów wąskim końcem skierowanym na zewnątrz. Odetnij końcówkę końcówek pipet, aby umożliwić większy przepływ powietrza.
  3. Podłącz dużą rurkę PVC od wylotu kolby Erlenmeyera wypełnionej węglem drzewnym do końcówki pipety na dnie probówki o pojemności 15 ml. Dodaj małe wyloty rurki z PVC do dwóch poziomych końcówek pipet i poprowadź je w kierunku butelki kontrolnej i eksperymentalnej.
  4. Aby zapobiec zanieczyszczeniu podłoża YPD mikroorganizmami, należy przymocować małą rurkę do sterylnego filtra strzykawkowego (wielkość porów 0,45 μm) z plastikowym łącznikiem rurki grodziowej skierowanym w stronę filtra i przykręcanym plastikowym łącznikiem grodziowym wychodzącym z filtra. Następnie podłącz rurkę do wlotu butelki z kulturą YPD (patrz rysunek 1B).
  5. Aby zapobiec przedostawaniu się drożdży unoszących się w powietrzu z kolby hodowlanej na arenę doświadczalną, przymocuj szklaną rurkę (o długości 6,5 cm, średnicy zewnętrznej = 0,5 cm i średnicy wewnętrznej = 0,3 cm) do wylotu każdej butelki z kulturą YPD za pomocą małych rurek. Przymocuj rurkę PVC po drugiej stronie szklanej rurki i poprowadź ją w kierunku dolnych otworów (wywierconych z każdej strony) w pudełku do eksperymentów.
    1. Napełnij probówkę włóknem szklanym i autoklaw przed użyciem.
  6. Dodać kolejny rozdzielacz probówek o pojemności 15 ml (opisany w sekcji 6.2) do małego rurki z PVC, po każdej stronie pudełka doświadczalnego, aby uzyskać dwie rurki biegnące do pudełka zarówno po stronie doświadczalnej (najbliżej wylotu strumienia powietrza wentylatora, po prawej), jak i po stronie kontrolnej (najbliżej wlotu strumienia powietrza wentylatora, po lewej).
  7. Przygotuj 8 pipet serologicznych o pojemności 25 ml, każda z 10 wylotami, aby przetestować 80 par łączących się w tym samym czasie, tj. 40 dla każdego stanu powietrza.
    1. Wypal w pipecie 10 otworów o średnicy ~0,8 cm, w odległości 2 cm od siebie.
    2. Pokrój zewnętrzną część strzykawki o pojemności 1 ml na jeden mały (2,5 cm) i jeden duży (5 cm) wylot.
    3. Przyklej te wyloty do otworów za pomocą gorącego kleju.
    4. Owiń mały pasek plastikowej folii parafinowej wokół końca wylotów i przymocuj końcówkę do pipety o pojemności 1 000 μl. Średnica otworu końcówki wynosi 0,1 cm. Używaj przejrzystych wskazówek dla każdego eksperymentu.
  8. Podłącz dwie pipety serologiczne za pomocą rozdzielacza T o średnicy zewnętrznej ≥0,5 cm i krótkich kawałków małej rurki z PVC, do każdego z dwóch wylotów po obu stronach. Przyklej pipety płasko do białego arkusza papieru (pod kamerami w stalowym pudełku).
  9. Za pomocą monitora przepływu powietrza ustaw przepływ powietrza tak, aby prędkość powietrza na wylocie końcówki pipety o pojemności 1000 μl wynosiła 0,5 m/s. Odpowiada to przepływowi powietrza wynoszącemu 0,0017 l/s na końcówkę.

7. Monitorowanie zachowań godowych

  1. Użyj pipety doustnej (zgodnie z opisem w reference26), aby umieścić jedną eksperymentalną samicę na małej szalce Petriego (opisanej w sekcji 4) o godzinie 15:00 (ZT 6) i daj jej 1 godzinę na aklimatyzację na arenie godowej.
  2. Ustawić skrzynkę doświadczalną (opisaną w sekcji 1) w następujący sposób:
    1. Włącz światła, tj. diody LED z białym światłem w cyklu 12h :12 h światło-ciemność podłączone do timera, który włącza światło o godzinie 09:00 (ZT0) oraz ciągłe diody LED światła czerwonego, aby umożliwić monitorowanie much podczas ciemnej fazy eksperymentu. Włącz wentylatory, aby ograniczyć nagrzewanie się szafy przez źródło światła i zapewnić odprowadzanie nadmiaru zapachów poza obszar testowy.
    2. Podłącz kamery kamery internetowe do komputera i uruchom je za pomocą oprogramowania monitorującego do monitorowania obrazu.
    3. Dla każdej kamery ustaw ostrość, jasność i powiększenie w oprogramowaniu monitorującym.
      1. Kliknij prawym przyciskiem myszy ekran aparatu, otwórz "właściwości aparatu" i odznacz "automatyczne ustawianie ostrości". Dostosuj "ostrość", aby wyjaśnić siatkę lub dowolne słowa napisane na arkuszu papieru. W razie potrzeby zmień "jasność" i "powiększenie".
    4. Ustaw program oprogramowania monitorującego tak, aby robił 1 zdjęcie co 2 minuty. Kliknij prawym przyciskiem myszy na ekranie każdej kamery i wybierz "edytuj kamerę", a następnie opcję "Akcje". Kliknij, aby rozpocząć akcje "W regularnych odstępach czasu" i zmień czas na "2 minuty". Wybierz "Zrób zdjęcie", aby wybrać czynności do wykonania i na koniec kliknij "ok".
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy każdy ekran kamery i wybierz "rozpocznij monitorowanie".
  3. Po 1 godzinie (przy 7 ZT) przenieś samca typu dzikiego na szalkę Petriego za pomocą pipety doustnej, umieść naczynie na arkuszach papieru A4 pod kamerami kamery internetowej i kliknij "rozpocznij monitorowanie" na 24 godziny. W przypadku eksperymentu z pompą powietrza umieść naczynie w taki sposób, aby wylot pipety był podłączony do otworu wejściowego areny łączącej.
  4. Aby przeanalizować zachowanie godowe pary, wykonaj następujące czynności.
    1. Wybierz i otwórz wszystkie zdjęcia w oprogramowaniu do przeglądania obrazów i przeglądaj je w porządku chronologicznym.
    2. Zapisz datę, numer eksperymentu, numer dania i godzinę rozpoczęcia w arkuszu kalkulacyjnym w tym samym wierszu. Weź czas rozpoczęcia każdej areny od momentu, gdy zostanie ona umieszczona pod kamerą internetową. Zapisz znacznik czasu ze zdjęć.
    3. Zaznacz czas rozpoczęcia każdej kopulacji w tym samym wierszu w arkuszu kalkulacyjnym. Krycie należy traktować jako incydent, gdy samiec dosiada samicy, a para pozostaje umiarkowanie nieruchoma i w tej samej pozycji przez co najmniej pięć kolejnych klatek (10 min).
      UWAGA: Kryterium to opiera się na zgłoszonej długości kopulacji, wynoszącej od 12 do 27 minut u D. melanogaster, oraz obserwacji, że kopulacje trwające 10 minut i więcej są płodne27,28.
    4. Policz liczbę kopulacji dla każdego wiersza w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić częstotliwość krycia. Alternatywnie, odejmij czas rozpoczęcia eksperymentu od czasu pierwszego krycia dla każdego rzędu jako miarę opóźnienia krycia lub odejmij czas pierwszego krycia od czasu drugiego krycia jako miarę opóźnienia ponownego krycia.
      1. Aby obliczyć opóźnienie ponownego wiązania, upewnij się, że daty pierwszego i drugiego krycia zostały zdefiniowane jako kolejne dni w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego.
    5. Przeanalizuj dane za pomocą modeli efektów mieszanych, zakładając normalny rozkład danych i uwzględniając datę eksperymentu jako czynnik losowy, używając oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów) w celu określenia istotności statystycznej zmiennych niezależnych - pożywki żywnościowej, rodzaju powietrza i interakcji - zgodnie z wcześniejszym opisem5.
    6. Wybierz najlepiej wyjaśniający model, wykonując wsteczną eliminację nieistotnych zmiennych niezależnych przy użyciu testów logarytmiczno-ilorazu prawdopodobieństwa i powiązanych informacji Akaike. Po uruchomieniu modelu sprawdź wizualnie resztki danych, aby potwierdzić normalność. Potwierdź jednorodność wariancji za pomocą testu Levene'a. W przypadku nierównej jednorodności pierwiastki kwadratowe przekształcają dane.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego ciągłego testu, można określić zachowanie godowe, a w szczególności częstotliwość krycia, w eksperymentalnych warunkach środowiskowych. Aby kontrolować warunki środowiskowe, przekształciliśmy szafkę kuchenną ze stali nierdzewnej w obszar testowy, z własnym źródłem światła i dyfuzją, co zapewnia dużą ilość światła i minimalną ilość olśnienia z górnej części aren godowych (rysunek 1A). Wewnętrzny obszar testowy jest całkowicie pokryty stalą nierdzewną i s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje test mający na celu przetestowanie zachowania godowego przez 24 godziny przy ciągłym kontrolowaniu wskazówek środowiskowych, które para godowa ma rzekomo wykorzystać do określenia częstotliwości krycia. Możliwe jest zwiększenie częstotliwości krycia w odpowiedzi na powietrze drożdży dostarczane przez system sprężonego powietrza, gdy pożywka zawiera również drożdże (ryc. 2B). Dodatkowo, podobną reakcję w częstotliwości krycia można zaobserwować w przypadku uproszczonej pożywki spożywc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Bloomington Drosophila Stock Center za zasoby much; C. Gahr, J. T. Alkema i S. van Hasselt za ich wczesną próbę opracowania testu na sprężone powietrze; Jasper Bosman za porady dotyczące uprawy drożdży; oraz Rezza Azanchi i Joelowi Levine'owi za pierwotne opracowanie poklatkowego monitorowania zachowań godowych Drosophila. J.A. Gorter otrzymał wsparcie w ramach grantu Neuroscience Research School BCN/NWO Graduate Program. Prace te były częściowo wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) (numer referencyjny: 821.02.020) dla J.C. Billetera.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szafka
Szafka kuchenna ze stali nierdzewnejHorecaworld7412.0105
Białe diody LEDLucky Lightll-583WC2C-001Zimna biel, 20 mAmp i 2 V
Czerwone diody LEDLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daDługość fali od 625 nm, 20 mAmp do 6 V
RezystorRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 omów, 0,25 W, 250 V i tolerancja 5 %
Aplikacja miernika światła na smartfonyPatrick GiudicelliMiernik światła/luksów BEZPŁATNY, wersja 1.1.1
Zegar mocyAlectoTS-121
Wsporniki metaloweKąt ostry 5 na 5 mm,  2 x 5450 i 1 x 1100 mm długości
szkła matowego1190 x 545 x 5 mm
Bibuła filtracyjna arkuszeFiltry LEE220Biały szron
Mały wentylatorNanoxia Deep silence426028529282880 mm Ultra-cichy wentylator PC, 1200 obr./min
Duży wentylatorNanoxia Deep silence4260285292910120 mm Ultracichy wentylator PC, 650-1500 obr./min
Kamera internetowaLogitech950270B910 HD OEM, Kąt: 78 stopni, rozdzielczość: 5 milionów pikseli   
Oprogramowanie kameryDeskShareSecurity monitor pro
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Fly rearing
Fly chów butelkiFlystuff32-1306oz Kolba Drosophila butelka
FlypadFlystuff59-114
Muchy dzikieCanton-S
Fiolki do hodowli muchDominique Dutscher789008Rurki Drosophila wąskie 25x95 mm
InkubatorSanyoMIR-154
Magnetyczna płyta grzejnaHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Składniki B.V.010001.26.0
GlukozaGezond& wel1019155Dekstroza/Druivensuiker
SacharozaVan GilseCukier granulowany
Mąka kukurydzianaMuchy62-100
Kiełki pszenicyGezond& wel1017683
Mąka sojowaFlystuff62-115
MelasaFlystuff62-117
Aktywne suche drożdżeRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Pepton (bakto)BD211677
Kwas octowyMerck1000631000Glacial, 100%
Mały petridishGreiner bio-one62710235 x 10 mm z otworami wentylacyjnymi
Folia parafinowaBemis NAParafilm
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Drożdże i sprężone powietrze
Big petridishGosselinBP140-01140 x 20,6 mm
Ultraczysta wodaMillipore corporationMiliQ
Ekstrakt drożdżowyBD212750
Agar (czysty)BD214530bacto
Glukoza (0(+)-glukoza jednowodna) Merck18270000004
Czapki z daszkiemSchott29 240 28 Zobacz materiał GL45
Przegroda silikonowaVWR548-0662
Złączki grodziowe z zadzioramiNalgene6149-0002
rurki: zewnętrzna 1,2 cm i wewnętrzna 0,9 cm
rurekPVC: zewnętrzna 0,8 cm i wewnętrzna 0,5 cm
rurka 15 mlFalcon
Pompa akwariowaSera precyzjaSera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W i ciśnienie >100 mbar
Węgiel aktywnySuperfishA8040400Norit z węglem aktywnym
Jednorazowy filtrWhatman10462100
Pipety serologiczneVWR612-1600
StrzykawkaBD Plastipak300013
Gorący klejPattex
Filtr strzykawkowyWhatmanFP 30/wielkość porów 0,45 mm CA-S
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Analysis
Statistics softwarePakiet Rlme4
Płyta zeDuża średnica PVCMałe średnice

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Mating BehaviorEnvironmental CuesReproductive BehaviorsBehavioral AssayFood Medium PreparationChemosensory SystemsMating FrequencyPressurized Air SystemVolatile CompoundsFemale Receptivity

Related Articles