Artykuł metodologiczny

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

DOI:

10.3791/55696

⸱

22 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Pharmaceutical Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Neurobiology & Developmental Sciences, University of Arkansas for Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolce dendrytyczne to wypukłości z neuronalnych trzonów dendrytycznych, które zawierają synapsy pobudzające. Morfologiczne i rozgałęzione odmiany dendrytów neuronalnych w hipokampie są zaangażowane w poznanie i tworzenie pamięci. Istnieje kilka podejść do barwienia metodą Golgiego, z których wszystkie były przydatne do określania cech morfologicznych altan dendrytycznych i tworzenia wyraźnego tła. Obecna metoda Golgiego-Coxa (niewielka odmiana protokołu, która jest dostarczana z komercyjnym zestawem do barwienia Golgiego) została zaprojektowana w celu oceny, w jaki sposób stosunkowo niska dawka leku chemioterapeutycznego 5-flurouracylu (5-Fu) wpłynie na morfologię dendrytów, liczbę kolców i złożoność arboryzacji w obrębie hipokampa. 5-Fu znacząco modulował złożoność dendrytyczną i zmniejszał gęstość kręgosłupa w całym hipokampie w sposób specyficzny dla regionu. Przedstawione dane pokazują, że metoda barwienia Golgiego skutecznie wybarwiła dojrzałe neurony w CA1, CA3 i zakręcie zębatym (DG) hipokampa. Protokół ten informuje o szczegółach każdego kroku, dzięki czemu inni badacze mogą niezawodnie barwić tkanki w całym mózgu, uzyskując wysokiej jakości wyniki i minimalizując rozwiązywanie problemów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendryty to największa część neuronów, które odbierają i przetwarzają presynaptyczne dane wejściowe1. Ich wyrostki dendrytyczne mają złożoną geometrię, w której gałęzie proksymalne mają większą średnicę niż gałęzie dystalne. W miarę rozwoju dendrytów tworzą one kilka połączeń z innymi neuronami w procesie zwanym arboryzacją dendrytyczną. Zakres i wzorzec tego rozgałęzienia określa ilość wejść synaptycznych, które dendryt może odpowiednio przetworzyć2.

Arboryzacja dendrytyczna jest niezbędnym procesem dla plastyczności zależnej od aktywności i prawidłowego rozwoju obwodów neuronalnych. Wydłużanie, retrakcja, rozgałęzianie i synaptogeneza to skomplikowane procesy, które obejmują wewnętrzne programy genetyczne i wpływy czynników zewnętrznych. Morfologiczne i rozgałęzione odmiany dendrytów neuronalnych w hipokampie są zaangażowane w procesy poznawcze i tworzenie pamięci3,4. Zmiany w złożoności dendrytycznej są związane ze zmianami patofizjologicznymi i behawioralnymi5. Nieprawidłowości są związane z kilkoma stanami chorobowymi, w tym zespołem łamliwego chromosomu X i zespołem Downa6.

Kolce dendrytyczne to wyspecjalizowane subkomórkowe przedziały altan dendrytycznych, które otrzymują bodźce pobudzające w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Istnieją trzy klasy morfologiczne kolców dendrytycznych, których nazwa zależy od ich wielkości i kształtu: 1) kolce grzybowe, które mają złożone gęstości postsynaptyczne z większą liczbą receptorów glutaminianu niż inne kolce7; 2) przysadziste kolce, które nie mają łodygi; oraz 3) cienkie kolce, które składają się z wydłużonego, wąskiego trzonu i kulistej głowy8. Objętość grzbietu dendrytycznego jest częściowo używana do ich zdefiniowania, przy czym cienkie kolce są na ogół mniejsze (0,01 μm3) w porównaniu z kolcami grzybów (0,8 μm3)9,10. Kolce stabilizują się wraz z dojrzewaniem. Na przykład cienkie kolce albo chowają się po kilku dniach, albo przekształcają się w kolce grzybowe. Alternatywnie, kolce grzybów są stosunkowo stabilne i mogą przetrwać przez dłuższy czas. Uważa się, że siła połączeń neuronalnych zależy od liczby kolców i/lub ich objętości11,12,13.

Klasyczna metoda barwienia metodą Golgiego i jej bardziej nowoczesne odmiany były przydatne do badania morfologii i gęstości kolców dendrytycznych. Jednym z unikalnych aspektów barwienia Golgiego jest to, że losowo barwi około 5% wszystkich neuronów, co pozwala na śledzenie poszczególnych neuronów14,15. Chociaż dokładny mechanizm, w którym metoda Golgiego barwi poszczególne neurony, jest nadal nieznany, zasada metody opiera się na krystalizacji chromianu srebra (Ag2CrO4)16,17. Istnieją trzy główne typy metody Golgiego: szybki Golgi, Golgi-Cox i Golgi-Kopsch18,19. Wszystkie trzy metody rozpoczynają się od początkowej fazy inkubacji w solach chromu przez kilka dni do miesięcy, ale istnieją między nimi pewne kluczowe różnice. Szybki Golgi wykorzystuje w pierwszym etapie tetratlenek osmu, podczas gdy Golgi-Kopsch zawiera paraformaldehyd. Po barwieniu zarówno w rapid-Golgi, jak i Golgi-Kopsch następuje inkubacja w 1-2% roztworze azotanu srebra przez około 7 dni. Metoda Golgiego-Coxa wykorzystuje chlorek rtęci i dwuchromian potasu zamiast azotanu srebra, a czas impregnacji wynosi 2-4 tygodnie. Tkanki są następnie cięte na sekcje i szybko umieszczane w rozcieńczonym roztworze amoniaku, a następnie utrwalaczem fotograficznym w celu usunięcia soli. Spośród tych trzech typów, metoda Golgiego-Coxa jest uważana za najlepszą w barwieniu dendrytycznych altan bez dużej ingerencji tła, częściowo dlatego, że artefakty kryształowe nie występują na powierzchni tkanki (w przeciwieństwie do szybkiej metody Golgiego)17,20,21.

Obecna metoda jest niewielką odmianą protokołu dostarczanego z komercyjnym zestawem do barwienia Golgiego i została zaprojektowana, aby ocenić, jak stosunkowo niska dawka 5-Fu wpłynie na dendrytyczne cechy morfologiczne i gęstość kręgosłupa. Wszelkie uzyskane dane mogą dostarczyć dalszych informacji na temat tego, jak chemioterapia wpływa na obwody neuronalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UAMS.

1. Zwierzęta i paradygmat wstrzykiwania 5-Fu

  1. Kup 6-miesięcznych samców myszy typu dzikiego C57Bl6/J i trzymaj je w stałym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, aż osiągną wiek 1 roku.
  2. Rozcieńczyć 5-Fu w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Stosować 60 mg/kg mc. jako wymaganą dawkę na mysz.
  3. Podawaj zastrzyki dootrzewnowe 5-Fu (raz w tygodniu przez trzy tygodnie).
    1. Wstrzyknięcia dootrzewnowe należy wykonywać mniej więcej o tej samej porze każdego dnia. Na przykład między 0900-1200 h.
  4. Poddaj zwierzęta eutanazji i wyekstrahuj mózgi 30 dni po ostatnim wstrzyknięciu.

2. Procedura eutanazji i ekstrakcja mózgu

  1. Utrzymaj gryzonia i chwyć podstawę ogona. Drugą ręką połóż kciuk lub pierwszy palec u podstawy szyi gryzonia. Szybko naciskaj na szyję gryzonia i pchaj do przodu, podczas gdy druga ręka trzymająca ogon ciągnie do tyłu.
  2. Jedną ręką trzymaj gryzonia, a drugą duże nożyczki chirurgiczne. Umieść szyję gryzonia między dwoma ostrzami i szybko odetnij głowę.
  3. Weź odciętą głowę myszy i użyj cienkich nożyczek, aby przyciąć futro nad czaszką, aż do oczu. Następnie umieść końcówki nożyczek w każdym oczodole i zamknij nożyczki z niewielką siłą.
  4. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć czaszkę po lewej i prawej stronie móżdżku.
  5. Użyj kleszczy, aby podnieść część czaszki otaczającą móżdżek bezpośrednio do góry i ze zdejmij.
  6. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki.
  7. Użyj kleszczy, aby podnieść pozostałą część czaszki z mózgu.
  8. Użyj szpatułki i sondy, aby zgarnąć mózg do żądanego pojemnika. Za pomocą ostrza ze stali nierdzewnej przetnij każdy mózg wzdłuż płaszczyzny środkowej. Wykonaj następującą metodę Golgiego-Coxa na prawej półkuli.

3. Barwienie metodą Golgiego i preparacja tkanek

  1. Zanurz świeżo zebrane półmózgi w 5 ml roztworu na bazie chlorku rtęci (roztwór A z zestawu) w stożkowej probówce o pojemności 10 ml. Roztwór chlorku rtęci jest wrażliwy na światło; Przykryj tubę folią. Próbkę należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwór A znajduje się w zestawie wymienionym w tabeli materiałów. Ostrożność! Roztwór A (zwany również roztworem chlorku rtęci) zawiera toksyczne odczynniki, takie jak dwuchromian potasu, chlorek rtęci i chromian potasu. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
  2. Po 1 dniu powoli przelej roztwór do tymczasowego pojemnika (takiego jak duża łódka wagowa) i wyrzuć go do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Zanurz mózgi (nadal w oryginalnych stożkowych probówkach o pojemności 10 ml) w 5 ml roztworu chlorku rtęci i umieść próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej na kolejne 13 dni.
  3. Dodać 30 g buforu po impregnacji do 90 ml wody destylowanej lub dejonizowanej (dH2O). Napełnij każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 6,5 ml buforu po impregnacji, po jednym dołku na mózg
    UWAGA: Bufor po impregnacji znajduje się w zestawie, który jest wymieniony w tabeli materiałów.
    1. Po 14 dniach (łącznie) w roztworze chlorku rtęci przepłukać tkankędH2O, a następnie przenieść je na płytki 6-dołkowe z buforem po impregnacji. Przykryj talerze folią i przechowuj je w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Odpipetować bufor po impregnacji po 1 dniu zanurzenia i odnowić świeżym buforem po impregnacji; przechowywać przez 1 dzień w ciemności w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby przechowuj go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca22.

4. Podział na sekcje

  1. Oznacz 12-dołkowe płytki na ich pokrywkach numerami w porządku rosnącym od lewej do prawej i od góry do dołu.
  2. Przygotuj dwie lub trzy 12-dołkowe płytki na mózg, jeśli dzielisz cały mózg na sekcje.
    1. Oznaczyć górną część każdej pokrywy płytki 12-dołkowej numerem identyfikacyjnym mózgu, który został podzielony na sekcje.
    2. Odpipetować 2 ml 1x PBS do każdego dołka każdej płytki.
  3. Ustaw scenę i włącz wibratom; upewnij się, że w pojemniku jest wystarczająca ilość 1x PBS, aby przykryć tkankę.
    1. Wytnij dwa kawałki plastikowej folii parafinowej i złóż je dwukrotnie. Umieść je nad otworami na pokrętła uchwytu próbki, aby zapobiec wyciekaniu 1x PBS na blat.
    2. Nałóż taśmę na blok tkanki uchwytu próbki, a następnie nałóż na niego klej z cyjanoakrylanu (patrz tabela materiałów).
  4. Wyjmij mózg z płytki 6-dołkowej i umieść go na plastikowym lub szklanym naczyniu. Użyj obosiecznego ostrza ze stali nierdzewnej, aby odciąć około połowy móżdżku.
    1. Przetnij móżdżek doogonowo. Upewnij się, że pozostała część móżdżku jest równa.
  5. Natychmiast umieść płaską powierzchnię pozostałego móżdżku na kleju.
    UWAGA: Grzbietowa część tkanki (kora mózgowa) powinna być skierowana w lewo lub w prawo w stosunku do ostrza. Koniec rostralny, który wcześniej zawierał przyczepioną opuszkę węchową, powinien być skierowany do góry.
    1. Odczekaj co najmniej kilka minut, aby upewnić się, że klej całkowicie wyschnie.
  6. Podczas gdy klej, który utrzymuje mózg na miejscu, wysycha, wlej 1x PBS do kąpieli z próbką. Po wyschnięciu kleju umieść uchwyt na próbkę wraz z chusteczką w kąpieli z próbką.
    1. Jeśli próbka tkanki nie jest całkowicie pokryta, wlej więcej 1x PBS do kąpieli z próbką.
  7. Przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibratomu i powoli opuść ostrze do kąpieli próbki, aż zostanie całkowicie zanurzone w 1x PBS. Kontynuuj opuszczanie ostrza, aż znajdzie się nieco poniżej górnej części tkanki.
  8. Ustaw prędkość wibratomu na 7, amplitudę na 6, a kąt cięcia na 12° (patrz tabela materiałów dla modelu wibratomu). Rozpocznij wibracje i wytnij sekcje 200 μm23.
    1. Użyj dużego pędzla, aby przesunąć skrawki tkanki z kąpieli próbki do każdego wyznaczonego dołka na 12-dołkowych płytkach.
  9. Kontynuuj cięcie tkanki, aż zostanie osiągnięta żądana liczba odcinków tkanki.

5. Barwienie po

  1. Do każdego z kolejnych etapów barwienia i płukania użyj 2 ml wskazanego roztworu na studzienkę. Użyj zmotoryzowanego napełniacza do pipet (patrz tabela materiałów), aby przenieść roztwory do studzienek. Za pomocą pipety transferowej (patrz tabela materiałów) przenieść roztwory ze studzienek do odpowiednich pojemników na odpady.
  2. Wypłucz sekcje w jednym 30-minutowym praniu 0,01 M PBS-T (dodać 3,0 ml detergentu (patrz tabela materiałów) do 1 000 ml 0,01 M PBS).
  3. Rozcieńczyć roztwór wodorotlenku amonu (Uwaga) w stosunku objętościowym 3:5 zdH2Obezpośrednio przed użyciem. Wybarwić skrawki w rozcieńczonym roztworze wodorotlenku amonu przez 19-21 min.
    1. Wrażliwy na światło roztwór wodorotlenku amonu chronić folią.
      UWAGA: Wodorotlenek amonu w roztworze ma stężenie ~10% i jest klasyfikowany jako "niebezpieczny". Roztwór wodorotlenku amonu może powodować oparzenia, jeśli zetknie się ze skórą. Wdychanie może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
  4. Wybarwić skrawki w buforze po barwieniu (dodać 90 g odczynnika D w 500 ml dH2O) przez 19-21 minut. Bufor po barwieniu jest wrażliwy na światło; Zabezpiecz go folią22.
  5. Wypłucz sekcje w trzech, 5-10 minutowych praniach 0,01 M PBS-T.

6. Montaż, czyszczenie i pokrywanie

  1. Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną 1% za pomocą dużego pędzla. Pozostaw je do wyschnięcia na 20-30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieść je na noc w słoiku Coplin.
  2. Wyjmij szkiełka w rękawiczkach ze słoika Coplin i umieść je w plastikowym stojaku (patrz tabela materiałów). Umieść plastikowy ruszt w naczyniu do barwienia (patrz tabela materiałów) zawierającym 100% etanolu. Odwodnij je trzema 5-minutowymi myciami.
  3. Umyj szkiełka dwukrotnie po 5 minut w 99% ksylenie. Umieść szkiełka w szklanym stojaku i opuść ruszt do szklanego naczynia do barwienia zawierającego ksylen z metalowym uchwytem (patrz tabela materiałów).
    UWAGA, ksylen jest szkodliwy w przypadku wdychania i powoduje podrażnienie, jeśli dotknie skóry. Jest wysoce łatwopalny w stanie ciekłym i parowym. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.
  4. Wyjmuj szkiełka z ksylenu pojedynczo i szybko przykryj tkankę ~0,25 ml podłoża montażowego (patrz tabela materiałów). Następnie weź prowadnice i połóż je na nośniku.
    1. Wepchnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza pod osłonami prowadnic do krawędzi przedmiotem, takim jak końcówka pędzla.
  5. Umieść szkiełka w miejscu z dala od światła słonecznego i pozostaw do wyschnięcia na 2-3 dni.
  6. Przejdź do pozyskiwania obrazów za pomocą mikroskopu i analizy za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

7. Zdobądź stos obrazów

  1. Otwórz program do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. W menu u góry programu kliknij "Akwizycja", a następnie kliknij "Obraz na żywo".
  2. Ustaw mikroskop na 10X. Zidentyfikuj preferowany neuron, a następnie przesuń kursor, który wygląda jak czerwony X, na środek somy. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby ustawić punkt odniesienia.
  3. Ustaw mikroskop na 40X. Kliknij "Przenieś" w menu u góry programu, a następnie kliknij "Do punktu odniesienia".
  4. Rozpocznij tworzenie stosu obrazów, ręcznie przewijając z precyzyjnym obiektywem nad tkanką, aż będzie lekko nieostry.
    1. Kliknij "Ustaw górę" w prawym dolnym rogu programu pod nagłówkiem "Akwizycja obrazu".
    2. Przewiń lekko pod tkanką, aż będzie nieco nieostra, a następnie kliknij "Ustaw dół" w sekcji "Akwizycja obrazu". Następnie kliknij "Pobierz stos obrazów".
  5. Po pobraniu stosu obrazów wpisz żądaną nazwę pliku obrazu w wyświetlonym oknie. Zapisz jako "MBF plik Ascii".
    1. Po wyświetleniu monitu wybierz typ pliku jako "MBF JPEG2000 plik stosu", a następnie kliknij "Zapisz".

8. Śledzenie neuronów

  1. Na pasku narzędzi pod menu kliknij pole zatytułowane "Nazwa konturu". Wybierz "Soma" z menu rozwijanego.
  2. Ręcznie prześledź somę. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zakończ treść komórki" po zakończeniu śledzenia.
  3. Wybierz "AutoNeuron", aby wyświetlić kolejną zakładkę zatytułowaną "AutoNeuron Workflow".
  4. W sekcji "Typ konfiguracji" wybierz "Nowa". Ustaw parametry, a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Wykrywanie somy".
    1. Aby ustawić parametry, wybierz "Jasne pole". Następnie w sekcji "Maksymalna średnica procesu" kliknij "Rozpocznij pomiar". Za pomocą kursora przejdź do podstawy dendrytu i ręcznie ustaw średnicę.
  5. Kliknij "Tak" w oknie, które prosi użytkownika o prześledzenie całego obrazu. Ręcznie prześledź somę. Odznacz, a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Umieszczenie nasion".
  6. Kliknij "Sprawdź poprawność nasion", a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Rekonstrukcja neuronów".
  7. W sekcji "Neuron" kliknij "Interaktywny". Wykonaj interaktywne śledzenie, postępując zgodnie ze wskazówkami programu dendrytów i klikając prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć podświetlony obszar śledzony przez program. Po prześledzeniu wszystkich dendrytów kliknij "Następny krok".
  8. Po wyświetleniu nowego okna zapisz nową konfigurację z żądanym tytułem. Kliknij "Zapisz".

9. Analiza

  1. Otwórz program analityczny (patrz tabela materiałów).
  2. Kliknij "Plik" w górnym menu, a następnie kliknij "Otwórz plik danych". Wybierz interesujący Cię plik.
  3. Pod podnagłówkiem analizy wybierz opcję "Analiza Sholla".
  4. W oknie "Analiza Sholla" ustaw promień początkowy na 10 μm. W sekcji "Analiza" kliknij pola "Dendryty" i "Zamówienia gałęzi".
  5. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarte okna i kliknij "Eksport Excela". Kliknij "Zapisz".
  6. Pod analizą kliknąć "Analizy struktury rozgałęzionej". Wybrać "Wszystkie możliwe analizy".
  7. Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarte okno i kliknij "Eksport Excela"24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ leczenia 5-Fu na arboryzację dendrytyczną i złożoność w hipokampie wycinków mózgu zabarwionych metodą Golgiego został określony ilościowo i prześledzony za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania. Po śledzeniu arboryzację dendrytyczną, gęstość kręgosłupa i morfologię kręgosłupa analizowano za pomocą analizy Sholla i wskaźnika złożoności dendrytycznej (DCI). Analiza Sholla to ilościowa metoda analityczna, która może być wykorzystana do określenia morfologii trzpieni ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z bardziej nowoczesnymi technikami, metoda Golgiego-Coxa ma kilka zalet, które sprawiają, że jest preferowaną metodą badania morfologii kręgosłupa: 1) barwienie może być stosowane do praktycznie każdej tkanki, 2) podstawowa konfiguracja mikroskopu świetlnego to wszystko, co jest potrzebne do uzyskania obrazów opartych na Golgim, 3) obrazowanie Golgiego-Coxa jest szybsze niż obrazowanie konfokalne oraz 4) wybarwione skrawki Golgiego są żywotne przez kilka miesięcy do lat dłużej niż próbki znakowane fluorescen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant pilotażowy w ramach NIH P20 GM109005 (A.R.A.) oraz przez program Center for Translational Neuroscience IDeA w GM110702.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw superGolgi Bioenno Nauki Przyrodnicze30100  Zawiera materiały niebezpieczne. 
PBS 10x koncentrat w proszkuFisher BP665-1
Triton X-100Sigma9002-93-1
Permount Rybacy SP 15-100
Pokrywa przesuwna Rybacy 12-546-14
Pipeta transferowa 7 ml Globe Naukowy 135030
Probówki Falcon 10 ml BD Nauki Biologiczne 
352099 Folia Rybacy 01-213-105
Płytka 12-dołkowa BD Nauki Biologiczne 
200 proof Etanol Pharmco-AAPER111000200
Ksyleny Acros Organics 1330-20-7Niebezpieczne. 
Permabond 200Permabond LLCGF2492
Pipeta serologiczna 25 mlSigmaSIAL1489
ParafilmMidsciHS234526C 
Wibratom Światowe instrumenty precyzyjne Myszy męskie NVSLM1
C57Bl/6 Laboratorium Jacksona 
Axio Imager 2ZEISSWiele komponentów, szczegółowe informacje można znaleźć na stronie internetowej. 
Kamera AxioCam MRcZEISS426508-9902-000
Naczynie do barwienia, zestawTissue-Tek62541-12
 Nauki o mikroskopii elektronowej 70312-20
Zmotoryzowany napełniacz do pipet Rybacy 03-692-168
Neurolucida mbf Bioscience 
Odkrywca Neurolucida mbf Bioscience 
Pryzmat Podkładka
353043000664 naczyń do barwienia Green graficzna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stuart, G. J., Spruston, N. Dendritic integration: 60 years of progress. Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).
  2. Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
  3. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).
  4. Kasai, H. Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition. Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).
  5. von Bohlen Und Halbach, O. Structure and function of dendritic spines within the hippocampus. Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).
  6. Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
  7. Bourne, J. N., Harris, K. M. Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines. Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).
  8. Lai, K. O., Ip, N. Y. Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders. Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).
  9. Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  10. Harris, K. M., Kater, S. B. Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function. Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).
  11. Leuner, B., Shors, T. J. Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections. Neuroscience. 251, 108-119 (2013).
  12. Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).
  13. Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. Structure-stability-function relationships of dendritic spines. Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).
  14. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  15. Koyama, Y. The unending fascination with the Golgi method. OA Anat. 1 (3), 24(2013).
  16. Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. On the "selectivity" of the Golgi-Cox method. J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).
  17. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  18. Rosoklija, G., et al. Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys. J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).
  19. de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. Cajal: lessons on brain development. Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).
  20. Gabbott, P. L., Somogyi, J. The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description. J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
  21. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox staining step by step. Front Neuroanat. 10 (38), (2016).
  22. superGolgi Kit. , Available from: http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf (2017).
  23. Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf (2000).
  24. Neurolucida 11.03. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).
  25. Sholl, D. A. Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  26. Pillai, A. G., et al. Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity. PLoS ONE. 7 (6), (2012).
  27. Morley, B. J., Mervis, R. F. Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice. Neuroscience. 233, 54-63 (2013).
  28. Titus, A. D., et al. Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats. Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).
  29. Groves, T. R., et al. 5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice. Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).
  30. Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines. PloS One. 9 (9), (2014).
  31. Kaufmann, W. E., Moser, H. W. Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation. Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).
  32. Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. The dendritic tree and brain disorders. Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

morfologia dendryt wdendryty hipokampabarwienie tkanki m zgowejroztw r chlorku rt ciroztw r wodorotlenku amonusekcjonowanie w wibratomieanaliza Shollaocena g sto ci kolc warboryzacja dendrytyczna

Powiązane artykuły