Artykuł metodologiczny

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 czerwca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uraz mózgu i rdzenia kręgowego może prowadzić do trwałego kalectwa i śmierci, ponieważ nadal nie jest możliwe zregenerowanie neuronów na duże odległości i dokładne połączenie ich z odpowiednim celem. Tutaj opisano procedurę szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Osiągnięte tempo wydłużania sięga ponad 1,2 mm/h, 30-60 razy szybciej niż tempo in vivo najszybciej rosnących aksonów z obwodowego układu nerwowego (0,02 do 0,04 mm/h)28 i 10 razy szybciej niż wcześniej zgłaszano dla tego samego typu neuronu na wcześniejszym etapie rozwoju4. Po pierwsze, izolowane populacje neuronów hipokampa szczurów są hodowane przez 2-3 tygodnie w urządzeniach mikroprzepływowych w celu precyzyjnego pozycjonowania komórek, umożliwiając łatwą mikromanipulację i odtwarzalność eksperymentalną. Następnie kulki pokryte poli-D-lizyną (PDL) są umieszczane na neurytach w celu utworzenia kontaktów adhezyjnych, a mikromanipulacja pipetami jest stosowana do przesuwania powstałego kompleksu koraliko-neuryt. Gdy koralik jest poruszany, wyciąga nowy neuryt, który można rozciągnąć na setki mikrometrów i funkcjonalnie połączyć z komórką docelową w czasie krótszym niż 1 godzina. Proces ten umożliwia eksperymentalną powtarzalność i łatwość manipulacji przy jednoczesnym ominięciu wolniejszych strategii chemicznych w celu wywołania wzrostu neurytów. Przedstawione tu wstępne pomiary wskazują na tempo wzrostu neuronów znacznie przewyższające tempo fizjologiczne. Połączenie tych innowacji pozwala na precyzyjne tworzenie sieci neuronalnych w kulturze z niespotykanym dotąd stopniem kontroli. Jest to nowatorska metoda, która otwiera drzwi do mnóstwa informacji i wglądów w transmisję sygnałów i komunikację w sieci neuronalnej, a także jest placem zabaw, na którym można badać granice wzrostu neuronów. Potencjalne zastosowania i eksperymenty są szeroko rozpowszechnione i mają bezpośrednie implikacje dla terapii, które mają na celu ponowne połączenie obwodów neuronalnych po urazie lub w chorobach neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u dorosłych mogą prowadzić do trwałego kalectwa z powodu wielu mechanizmów ograniczających odrastanie aksonów1. Po urazie wiele aksonów OUN nie tworzy nowego stożka wzrostu i nie jest w stanie wytworzyć skutecznej odpowiedzi regeneracyjnej2. Ponadto uszkodzenia i blizny otaczające zmiany w OUN znacznie hamują wzrost aksonów1,2,3. Obecne terapie wspomagające regenerację ośrodkowego układu nerwowego po urazie koncentrują się na zwiększaniu wewnętrznego potencjału wzrostu uszkodzonego neuronu i maskowaniu inhibitorów wydłużenia aksonów związanych z resztkami mieliny i blizną glejową1,3. Mimo to zdolność do regeneracji długich aksonów do odległych celów i tworzenia odpowiednich funkcjonalnych synaps pozostaje poważnie ograniczona4,5,6,7.

W obecnej pracy, mikrogranulki, mikromanipulacja pipetami i urządzenia mikroprzepływowe są używane do szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Wcześniejsze prace wykazały, że kulki pokryte poli-D-lizyną (kulki PDL) indukują adhezję błony, a następnie grupowanie kompleksów pęcherzyków synaptycznych i tworzenie funkcjonalnych butonów presynaptycznych8. Wykazano również, że gdy koralik PDL jest mechanicznie odciągany po różnicowaniu presynaptycznym, klaster białek synaptycznych podąża za koralikiem, inicjując nową klasę neurite9. Poniższa procedura wykorzystuje ten fakt wraz ze zdolnością do hodowli embrionalnych neuronów hipokampa szczurów w zorganizowanych regionach na szkiełku nakrywkowym za pomocą urządzeń mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu (PDMS) w celu precyzyjnego przeprogramowania obwodu neuronalnego.

Te urządzenia mikroprzepływowe PDMS są nietoksyczne, optycznie przezroczyste i składają się z dwóch komór połączonych systemem mikrokanałów. Po zamontowaniu na szkiełku nakrywkowym każde urządzenie służy jako forma do kierowania wzrostem neuronów i utrzymywania zdrowych kultur neuronalnych na precyzyjnych wzorcach przez okres dłuższy niż 4 tygodnie in vitro.

Tutaj przedstawiono ramy, w których można badać granice rozszerzenia i funkcjonalności nowego neurytu. Tworzone są nowe, funkcjonalne neuryty, które są pozycjonowane w celu kontrolowanego (prze)łączenia sieci neuronowych. Osiągane prędkości wydłużania są większe niż 20 μm/min na odległości w skali milimetrowej i ustanawiane są funkcjonalne połączenia. Wyniki te pokazują nieoczekiwanie, że wewnętrzna zdolność tych neurytów do wydłużania jest znacznie szybsza niż wcześniej sądzono. To proponowane mechaniczne podejście omija powolne strategie chemiczne i umożliwia kontrolowane połączenie z określonym celem. Technika ta otwiera nowe możliwości w badaniach in vitro nad nowymi terapiami w celu przywrócenia połączeń neuronalnych po urazie. Umożliwia również manipulowanie i ponowne okablowanie sieci neuronowych w celu zbadania podstawowych aspektów przetwarzania sygnałów neuronalnych i funkcji neuronów in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill i były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami.

1. Standaryzacja kultur neuronalnych za pomocą urządzeń mikroprzepływowych: montaż urządzenia

  1. Wybierz odpowiednie urządzenie mikroprzepływowe do żądanego eksperymentu. Aby połączyć neurony w tej samej populacji, użyj urządzeń neurologicznych (Rysunek 1), a aby połączyć neurony w różnych populacjach, użyj urządzeń do współhodowli (Rysunek 6).
  2. Oczyść i przygotuj żądaną liczbę sterylnych szkiełek nakrywkowych lub naczyń ze szklanym dnem. Aby uzyskać najlepsze rezultaty na powierzchniach plastikowych, używaj naczyń o średnicy 35 mm, na szkle użyj szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm lub naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Wybierz grubość szkła w zależności od systemu obrazowania, na przykład 0,15 mm.
  3. Pokryj naczynia lub szkiełka nakrywkowe 0,5-1 ml 100 μg/ml PDL przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać protokół i w razie potrzeby wznowić go następnego dnia. Co więcej, naczynia mogą być pokryte PDL rozcieńczonym buforem boranowym, poli-L-lizyną (PLL), lamininą lub dowolną inną cząsteczką adhezyjną komórek.
  4. Umyj naczynia dwukrotnie wodą (nie używaj soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ kryształki soli mogą zablokować kanały), usuń cały płyn i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym środowisku, takim jak szafka bezpieczeństwa biologicznego, przez 5-10 minut lub do całkowitego wyschnięcia powierzchni.
    Uwaga: Należy uważać, aby szkiełka nakrywkowe były całkowicie suche, ponieważ pozostały płyn będzie zakłócał przyleganie układów mikroprzepływowych.
  5. Umieść urządzenia mikroprzepływowe z wzorami skierowanymi do góry pod wpływem światła UV w sterylnym środowisku (komora bezpieczeństwa biologicznego) na 10 minut. Upewnij się, że przestrzegasz sterylnych procedur podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego10.
  6. Za pomocą pęsety umieść urządzenie mikroprzepływowe wzorem skierowanym w dół w kontakcie z czystym szkiełkiem nakrywkowym/naczyniem. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij urządzenie, aby przylegało do szkła.
    Uwaga: Przezroczystość przyleganego obszaru będzie widoczna, gdy patrzy się pod światło. Upewnij się, że wszystkie rogi stykają się ze szkłem. Zrób to ze wszystkimi urządzeniami mikroprzepływowymi. Zobacz Rysunek 1a .
  7. Aby napełnić urządzenie jednopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 50 μl kompletnej pożywki komórkowej uzupełnionej bezsurowicą B-27 (stosunek objętości 1:50) i 500 μg/ml penicyliny/streptomycyny/glutaminy (zwanych łącznie NBM) do prawej górnej studzienki, a następnie dodaj kolejne 50 μl do studzienki leżącej po przekątnej. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych 2 dołków. Zobacz Rysunek 2a .
    1. Aby napełnić urządzenie wielopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 30 μl pełnego NBM do odpowiednich studzienek, patrz Rysunek 6a. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych 4 studzienek.
  8. Umieścić urządzenia na większej płycie z otwartym naczyniem z autoklawowaną wodą (komora mokra) i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) na 1-2 godziny podczas przygotowywania hodowli komórkowej. Zobacz Rysunek 2b .

2. Powlekanie neuronów w układach mikroprzepływowych

  1. Postępując zgodnie z protokołem opisanym w Ref.8, uzyskaj zdysocjowane neurony hipokampa lub kory mózgowej z zarodków szczurów Sprague Dawley (dowolnej płci).
  2. Ponownie zawiesić neurony embrionalne w NBM w stężeniu 1-2 milionów neuronów/ml. Sprawdź stężenia komórek w mikroskopie za pomocą hemocytometru i postępuj zgodnie z odniesieniem8. Dostosuj stężenie komórek zgodnie z żądaną gęstością komórek. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie pojedynczych aksonów hipokampa na kanał, umieść 10 000 neuronów na urządzenie. Aby mieć wiele aksonów w tym samym kanale, umieść 60 000 neuronów na urządzenie.
    Uwaga: Liczby te różnią się w zależności od użytego typu neuronu.
  3. Usunąć pożywkę z urządzeń mikroprzepływowych bez opróżniania studzienek. Pozostaw około 5 μl w każdym.
  4. Aby umieścić komórki w urządzeniu z pojedynczą populacją, dodaj 50 μl NBM do prawego dolnego dołka. W tym momencie medium przepływa samoistnie, aby wypełnić drugą dolną studzienkę. Dodać 20 μl roztworu komórki koncentratu do prawego górnego dołka urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano w Rysunek 1b.
    1. Do komórek płytki w urządzeniu wielopopulacyjnym dodaj 20 μl roztworu komórek koncentratu do każdej z prawych studzienek w Rysunek 6a.
  5. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki znajdują się w komorach i umieść urządzenia w inkubatorze na 15-30 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek do podłoża.
  6. Sprawdź w mikroskopie, czy w komorach jest wystarczająca liczba komórek. Jeśli potrzeba więcej, powtórz kroki 2.4 i 2.5.
  7. Dodać 50 μl NBM do 2 górnych studzienek urządzenia z pojedynczą populacją i 20 μl NBM do tego samego dołka, w którym komórki zostały wstrzyknięte do urządzenia wielopopulacyjnego. Podłoże lekko wystaje, tworząc dodatni menisk, nadając studzienkom górny wygląd muffinki. Ponownie zobacz Rysunek 2a.
  8. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

3. Utrzymanie kultur neuronalnych

  1. Usunąć NBM (około 30 μl za pomocą pipety) z komórek i nałożyć nowy, wstępnie podgrzany NBM następnego dnia po ich wprowadzeniu do urządzeń (tj. 1 d po kroku 2).
  2. Sprawdzaj co 2 dni, czy w każdym kanale jest wystarczająca ilość nośnika. Jeśli wierzch muffinek jest niski, po prostu dodaj więcej podłoża do górnych dołków.
  3. Hodować komórki przez co najmniej 7 dni przed usunięciem urządzeń mikroprzepływowych. Komórki mogą przetrwać w tych urządzeniach przez kilka tygodni. Wyjmij urządzenia 1-2 dni przed przeprowadzeniem eksperymentów na próbkach.

4. Usuwanie urządzeń mikroprzepływowych

  1. 1 - 2 dni przed wyjęciem urządzeń mikroprzepływowych, dodać 2 ml NBM wstępnie podgrzanego do 37 °C do każdej płytki na próbkę, zalewając komory, i konserwować urządzenia w inkubatorze.
  2. Użyj sterylnej pęsety i jednej końcówki, aby usunąć urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorzystą konfigurację neuronów. Użyj końcówki, aby przytrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu, a pęsety zacisnąć krawędź urządzenia w lewym dolnym rogu studni. Delikatnie przykręć urządzenie, podnosząc urządzenie pęsetą do góry, aby odkleiło się od szkiełka nakrywkowego. Zobacz Rysunek 2c-2d.
  3. Co 2-3 dni wymieniaj połowę NBM, aż próbka zostanie wykorzystana do eksperymentów.
  4. Przed wykonaniem eksperymentów z ponownym okablowaniem na próbce należy sprawdzić, czy neuryty w kanałach urządzenia z pojedynczą populacją i populacje neuronów w urządzeniu z wieloma populacjami są izolowane, badając przerwy między nimi w mikroskopie, aby upewnić się, że nie ma włókien łączących populacje neuronów.

5. Przygotowanie koralików pokrytych PDL

  1. Dodaj 2 krople po 50 μl 4, 10 lub 20 μm kulek polistyrenowych rozcieńczonych w wodzie (1:500) do 1 ml PDL (100 μg/ml). Pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu i wznowiony następnego dnia.
  2. Odwirować roztwór o stężeniu 8,820 x g przez 1 minutę. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek nagromadzonych na dnie pojemnika.
  3. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml sterylnego 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.
  4. Zawiesić kulki pokryte PDL w 200 ml 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.

6. Przygotowanie mikropipet

  1. Przygotuj pipety ze szklanych rurek kapilarnych (średnica wewnętrzna 1 mm, średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą poziomego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia tak, aby zewnętrzna końcówka wyciągniętej mikropipety wynosiła ~ 2-5 μm. Przed pociągnięciem upewnij się, że szklane rurki są czyste.
  2. Przymocuj pipety do szkiełek podstawowych na czas przechowywania i upewnij się, że końcówka nie styka się z powierzchnią szkiełka, ponieważ końcówka jest delikatna. Przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pojemniku w celu ochrony przed kurzem. Pipet należy używać tego samego dnia, w którym zostały pobrane.

7. Adhezja PDL do neuronów

  1. Dodać 40-60 μl kulek pokrytych PDL przygotowanych w kroku 5 do kultury komórkowej przygotowanej w kroku 4. Wyśrodkuj końcówkę pipety nad neuronami, które są słabo widoczne na szkiełku nakrywkowym, i dodaj koraliki (patrz Rysunek 3).
  2. Umieść próbkę w inkubatorze na 1 godzinę, aby ułatwić tworzenie kontaktów synaptycznych 8,9.
  3. Po inkubacji usuń wszelkie nieprzylegające kulki, delikatnie myjąc kulturę wstępnie podgrzanym NBM.

8. Przygotowanie roztworu soli fizjologicznej (do eksperymentów w temperaturze pokojowej)

  1. Przygotuj fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej, łącząc składniki wymienione w bibliografii7,8. Ma to na celu regulację środowiska komórkowego na zewnątrz inkubatora.
  2. Sprawdź osmolarność i poziomy pH zgodnie z odniesieniami7,8.
  3. Stale wlewaj roztwórO2, aby zminimalizować wahania pH podczas przeprowadzania eksperymentów.
  4. Podgrzać do temperatury pokojowej.
  5. Ustawić system perfuzji, wkładając jeden koniec plastikowej rurki (wymiary opcjonalne) do roztworu fizjologicznego w infuzjiO2 i mocując drugi koniec do igły wprowadzonej w uchwyt na próbkę. Umieść rurkę i roztwór wyżej niż próbka (patrz Rysunek 4).
    1. Odłączyć rurkę od igły i podłączyć ją do strzykawki. Za pomocą strzykawki wywrzeć nacisk i pobrać płyn, napełniając probówkę. Uszczelnić za pomocą zacisku rolkowego i ponownie podłączyć igłę.

9. Mikromanipulacja koralikami

  1. Umieścić próbkę w układzie doświadczalnym w taki sposób, aby dwie mikropipety zamontowane w mikropipetach mogły uzyskać dostęp od góry i uzyskać do nich dostęp optycznie poniżej, na przykład za pomocą obiektywu 40-fazowego (apertura numeryczna 0,6) odwróconego mikroskopu optycznego. W tej konfiguracji należy zamontować kamerę CCD do przechwytywania obrazu w bocznym porcie mikroskopu. Podłącz każdą pipetę do strzykawek o pojemności 1 ml za pomocą plastikowej rurki. Na tym etapie zastąp NBM roztworem soli fizjologicznej (1-2 ml) (patrz Rysunek 4).
  2. Podczas eksperymentów należy w sposób ciągły perflerować komórki roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 8 z szybkością 0,5-1 ml/min.
  3. Wybierz koralik PDL, który NIE jest przyczepiony do neuronu w polu widzenia. Wyrównaj koralik z końcówką mikropipety, skupiając się na kulce, a następnie w górę na mikropipecie. Przyłóż końcówkę jak najbliżej ściegu, monitorując ją przez mikroskop.
  4. Zastosuj podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do pipety, aby pobrać kulkę. Utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.

10. Ciągnięcie neurytów

  1. Wybierz kulkę PDL przyczepioną do neuronu w polu widzenia i podłącz ją do drugiej mikropipety za pomocą ssania, jak opisano w krokach 9.3-9.4.
  2. Pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron, powoli (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 1 μm i zatrzymaj się na 5 minut, aby umożliwić inicjację neurytów.
  3. Powtórz krok 10.2 dwa razy.
    Uwaga: Pierwsze 3 μm muszą być pobierane bardzo powoli, aby zagwarantować sukces eksperymentalny, który występuje w ponad 95% przypadków.
  4. Pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron, powoli (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 2 μm i zatrzymaj się na 5 minut, aby umożliwić wydłużenie neurytów.
  5. Po udanej inicjacji i rozciągnięciu neurytu przez pierwsze 5 μm, pociągnij neuryt z prędkością 20 μm/min na odległości w skali milimetrowej.
    Uwaga: Ciągnięcie może odbywać się w sposób ciągły lub skokowo i z różną szybkością. Zobacz Rysunek 5b-5c .

11. Łączenie neuronów

  1. Wybierz region bogaty w neuryty i obniż kompleks PDL-koralik-neuryt, aby fizycznie się z nim stykał. Użyj innych koralików, aby ocenić wysokość końcówki nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Zobacz Rysunek 5d.
  2. Pozostawić kompleks PDL-kulka-neuryt w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzonej neurycie około 20 μm od pierwszego koralika. Użyj drugiego koralika PDL, aby popchnąć nowy filament neurytu w kierunku komórki docelowej.
  3. Przytrzymaj oba koraliki na miejscu przez co najmniej 1 godzinę. Sprawdź za pomocą mikroskopu, czy nie ma ogniskowego obrzęku, pogrubienia neurytów stykających się z koralikiem16.
  4. W tym czasie użyj perfuzji, aby powoli zmienić pożywkę próbki z soli fizjologicznej na wstępnie podgrzany, zrównoważony CO2 NBM.
  5. Zwolnij kulkę z drugiej pipety, zwalniając ssanie. Jeśli nowy neuryt pozostaje przyczepiony, zwolnij również pierwszą kulkę. Zobacz Rysunek 5e .
  6. Delikatnie usuń roztwór soli fizjologicznej i zastąp NBM (~2 ml).
  7. Ostrożnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne do przyszłych eksperymentów. To połączenie jest stabilne dla >24 h7.

12. Weryfikacja funkcjonalności nowego połączenia za pomocą nagrań z użyciem zacisków krosowych dla całej komórki

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami references7,18,19. aby zmontować zestaw do elektrofizjologii.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami references7. aby przygotować elektrody pre- i postsynaptyczne.
  3. Zbierz dane zacisku łatki, ponownie postępując zgodnie z odwołaniami18,19.
  4. Porównaj wyniki z naturalnie występującymi sygnałami7, aby określić typ połączenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne neurony hipokampa szczura są hodowane w urządzeniach mikroprzepływowych, aby umożliwić precyzyjne pozycjonowanie komórek, kulek PDL i mikromanipulatorów. Pierwszym krokiem jest prawidłowe zmontowanie urządzenia mikroprzepływowego na szklanym szkiełku nakrywkowym lub naczyniu. Istotne jest, aby urządzenie mikroprzepływowe było dobrze przymocowane do podłoża, aby uniknąć wydostania się komórek z komór i przesunięcia się pod częściami urządzenia, które powinny być uszczelnione (<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystując standardowe mikromanipulacje i innowacyjne urządzenia mikroprzepływowe, opracowano nową technikę szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Mikromanipulacja pipetami jest powszechnym narzędziem w większości laboratoriów neurobiologicznych 4,13. Prawdziwym wyzwaniem dla osiągnięcia powtarzalnych i wiarygodnych wyników była standaryzacja zdrowych, precyzyjnie ustawionych kul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorka Margaret H. Magdesian jest dyrektorem generalnym firmy Ananda Devices, która produkuje instrumenty używane w tym artykule.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Yoichi Miyaharze za wiele pomocnych dyskusji i spostrzeżeń. MA i PG potwierdzają finansowanie z NSERC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Urządzenia do wspólnej hodowliUrządzeniaDostępne w handlu w http://www.anandadevices.com
Neuro devicesUrządzeniaDostępne w handlu pod adresem http://www.anandadevices.com
No. 1 Szkiełko nakrywkowe szklane 25 mm okrągłeWarner Instruments64-0705
35 mm Naczynia ze szklanym dnem #0, niepowlekane, napromieniowane promieniami gammaMatTex IncorporationP35G-0-20-C
Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm, niepirogenne, sterylneCorning Inc430165
95 mm x 15 mm szalka Petriego, pokrywa ślizgowa, sterylny polistyrenFisherbrandFB0875714G
50 ml Probówki wirówkowe z nadrukowaną podziałką i płaskimi nakrętkamiVWR89039-656
15 ml Polipropylenowa probówka stożkowa, 17 x 120 mm, bez pirogeny, sterylnyFalcon
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049Roztwór zewnątrzkomórkowy
Suplement B-27 (50X),B-27 bez surowicy (50X), bez surowicy17504044Roztwór zewnątrzkomórkowy
Pennicylina, Streptomyocyna, GlutaminaThermo Fisher Scientific 11995-065Roztwór zewnątrzkomórkowy
200 μ L PipetyVWR89079-458
2 - 20 μ L PipetyKońcówki odporne na aerozole2149P
Pipety transferowe BD Falcon 3 ml [niesterylne]BD Falcon357524
GlucoseGibco15023-021Roztwór zewnątrzkomórkowy
HEPESSigma7365-45-9Roztwór zewnątrzkomórkowy/Koraliki
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Roztwór
zewnątrzkomórkowyKClSigma-Aldrich7447-40-7Roztwór zewnątrzkomórkowy
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Roztwór zewnątrzkomórkowy
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Roztwór zewnątrzkomórkowy
#5 Pęseta Dumont Dumostar 11 cmWorld Precision Instruments500233
Narzędzia do preparacjiBraun, Aesculap
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichP6407
Mikrocząsteczki na bazie polistyrenu, 10 μ mSigma-Aldrich72986
Rury borokrzemianoweKing Precision Glass, Inc.14696-2
Poziomy ściągacz do pipetSutter InstrumentsBrązowo-płonące mikromanipulatory P-97
, seria PCS-5000Instrumenty SDMC7600R
Strzykawka 1 mlBD Luer-Lok309628
Mikroskop odwróconyOlympus IX71
ObiektywOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
Kamera CCDKaskada fotometrycznaII: 512
Leibovitz's (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Tysyna do rozwarstwiania szczurów
(0,05%), czerwień fenolowaLife Technologies25300054Sekcja
szczurówDMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4,5 g/L D-glukozy, + L-glutamina, + 110 mg/l pirogronianu sodu]Life Technologies11995-065Analiza szczurów
HBSS (1x) Zbilansowany roztwór soli Hanka [- Chlorek wapnia, - Chlorek magnezu, - Siarczan magnezu]Life Technologies14170-112Sekcja szczurów
Ananda Ananda 352097 suplement

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Urz dzenia mikroprzep ywowekulki powlekane PDLmikromanipulacja pipetneurony hipokampa szczuratempo wzrostu neuron wfunkcjonalne obwody neuronalnewhole cell patch clamppowtarzalno eksperymentalna

Powiązane artykuły