Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55698

⸱

11 sierpnia 2017

 , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension, Mayo Clinic College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Komórkowy transport jonów często można ocenić poprzez monitorowanie wewnątrzkomórkowego pH (pHi). Genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHIs) zapewniają optyczną kwantyfikację wewnątrzkomórkowego pH w nienaruszonych komórkach. Protokół ten szczegółowo opisuje ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowego pH za pomocą komórkowego obrazowania na żywo ex vivo kanalików Malpighiego Drosophila melanogaster z pHerry, pseudoratiometrycznym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH.

Streszczenie

Nabłonkowy transport jonów jest niezbędny dla systemowej homeostazy jonów, jak również utrzymania niezbędnych komórkowych gradientów elektrochemicznych. Na pH wewnątrzkomórkowe (pHi) wpływa wiele transporterów jonów, dlatego monitorowanie pHi jest użytecznym narzędziem do oceny aktywności transportera. Nowoczesne genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHI) zapewniają optyczną ocenę ilościową pHi w nienaruszonych komórkach w skali komórkowej i subkomórkowej. Protokół ten opisuje ilościowe oznaczanie w czasie rzeczywistym komórkowej regulacji pHi w kanalikach Malpighiego (MT) Drosophila melanogaster poprzez obrazowanie ex vivo na żywo pHerry, pseudoratiometrycznego GEpHI z pKdobrze nadającym się do śledzenia zmian pH w cytozolu. Wyekstrahowane dorosłe muchy MT składają się z morfologicznie i funkcjonalnie odrębnych odcinków nabłonka warstwy jednokomórkowej i mogą służyć jako dostępny i genetycznie wykonalny model do badania transportu nabłonkowego. GEpHI mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na pH i elektrodami jonoselektywnymi. GEpHI mogą znakować odrębne populacje komórek, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie elementy promotorowe. Oznakowanie to jest szczególnie przydatne w przypadku preparatów ex vivo, in vivo i in situ, które są z natury niejednorodne. GEpHI umożliwiają również ilościowe oznaczanie pHi w nienaruszonych tkankach w czasie bez konieczności wielokrotnego leczenia barwnikiem lub eksternalizacji tkanek. Podstawową wadą obecnych GEpHI jest tendencja do agregacji inkluzji cytozolowych w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek i konstruowanie nadekspresji. Te niedociągnięcia, ich rozwiązania i nieodłączne zalety GEpHI zostały wykazane w tym protokole poprzez ocenę bazolateralnego transportu protonów (H+) w funkcjonalnie odrębnych komórkach głównych i gwiaździstych wyekstrahowanych MT much. Opisane techniki i analizy można łatwo dostosować do szerokiej gamy preparatów dla kręgowców i bezkręgowców, a wyrafinowanie testu można skalować od laboratoriów dydaktycznych do skomplikowanego określania strumienia jonów za pomocą określonych transporterów.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest opisanie ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowego pH (pHi) za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika pH (GEpHI) i pokazanie, jak ta metoda może być wykorzystana do oceny podstawno-bocznego transportu H+ w modelowej strukturze nerkowej owada (D. melanogaster), kanaliku Malpighiego (MT). MT służą jako narządy wydalnicze muszki owocowej i są funkcjonalnie podobne do nefronu ssaków pod kilkoma kluczowymi względami1. MT są ułożone jako 2 pary kanalików (przedni i tylny) w klatce piersiowej i brzuchu muchy. Jednokomórkowa rurka nabłonkowa każdego MT składa się z metabolicznie aktywnych komórek głównych o wyraźnej polarności wierzchołkowej (luminalnej) i podstawno-bocznej (hemocoel), a także interkalowanych komórek gwiaździstych. Przednie MT składają się z 3 morfologicznie, funkcjonalnie i rozwojowo odrębnych segmentów, w szczególności początkowego segmentu rozszerzonego, segmentu przejściowego i głównego segmentu wydzielniczego, który łączy się z moczowodem2. W skali komórkowej transnabłonkowy transport jonów do światła odbywa się za pomocą wierzchołkowej błony plazmatycznej V-ATPase3 i wymiennika metalowo-alkalicznego/H+, a także podstawno-bocznego Na+-K+-ATPase4, kanały5, wymiennik Cl−/HCO3− sterowany Na+ (NDAE1)6 i Na+-K+-2Cl− kotransporter (NKCC; Ncc69)7, podczas gdy komórki gwiaździste pośredniczą w transporcie Cl- i wody8,9. Ten złożony, ale dostępny system fizjologiczny zapewnia doskonałe możliwości badania mechanizmów endogennego transportu jonów w połączeniu z różnorodnymi zestawami narzędzi genetycznych i behawioralnych Drosophila.

Uzasadnieniem dla tego protokołu było opisanie genetycznie plastycznego systemu do badania transportu jonów nabłonkowych z potencjałem integracji od komórki do zachowania i eksportu narzędzi do innych systemów modelowych. Wyrażenie pHerry10, GEpHI pochodzące z fuzji super-ekliptycznego pHhluorin11,12 (SEpH) i czerwonego pH-insensitive mCherry13, w MTs umożliwia ilościowe określenie transportu H+ w pojedynczych komórkach MT za pomocą techniki kalibracji o wysokiej zawartości K+/nigerycyny14. Ponieważ wiele transporterów jonów przenosi ekwiwalenty H+, kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pHi służy jako funkcjonalna reprezentacja ruchu jonów za pomocą różnych transporterów. System modelowy Drosophila MT oferuje również potężne narzędzia genetyczne w specyficznej dla tkanki transgene15 i interferencji RNA (RNAi)16, które można łączyć z obrazowaniem komórkowym i testami całego narządu17,18,19 funkcji kanalików, aby stworzyć solidny zestaw narzędzi z pionową integracją od cząsteczek do zachowania. Stoi to w sprzeczności z wieloma innymi protokołami oceny biologii nabłonka, ponieważ historycznie takie pomiary opierały się na skomplikowanej i zniechęcającej mikrosekcji, wyrafinowanych elektrodach jonoselektywnych20,21 i drogich barwnikach wrażliwych na pH22 z restrykcyjnymi wymaganiami dotyczącymi obciążenia i słabą swoistością komórkową w heterogenicznych tkankach. GEpHI były używane do szeroko zakrojonego pomiaru pHi w różnych typach komórek23. Wczesne prace wykorzystywały wrodzoną czułość pH białka zielonej fluorescencji (GFP) do monitorowania pHi w hodowanych komórkach nabłonkowych24, ale w ciągu ostatnich dwóch dekad GEpHI były stosowane w neuronach25, glia26, fungi27 i komórkach roślinnych28. Połączenie potencjału komórkowego celowania konstruktów genetycznych za pomocą systemu ekspresji GAL4/UAS15 oraz fizjologicznej dostępności Drosophila MT sprawia, że jest to idealne przygotowanie do badań nad regulacją pHi i nabłonkowym transportem jonów.

Regulacja pHi jest badana od dziesięcioleci i jest niezbędna do życia. Preparat MT oferuje solidny model do nauczania fizjologii regulacji pHi, ale także do wykonywania zaawansowanych badań regulacji pHi ex vivo i in vivo. Protokół ten opisuje kwantyfikację ruchu H+ przez błonę podstawno-boczną komórek nabłonkowych Drosophila MT przy użyciu techniki ładowania kwasem pulsacyjnym NH4Cl21, ale ponieważ wskaźnik pH jest kodowany genetycznie, metody te i ich ramy teoretyczne mogą być stosowane do dowolnego preparatu podatnego na transgenezę i obrazowanie na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie etapy niniejszego protokołu są zgodne z wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt Mayo Clinic (Rochester, MN).

1. Hodowla muszek

  1. Hodować muchy i przeprowadzić krzyżówki zgodnie ze standardowymi zasadami hodowli29.
    UWAGA: Ekspresja reporterów fluorescencyjnych w systemie GAL4/UAS jest proporcjonalna do temperatury, zatem temperaturę hodowli można dostosować w celu zmiany poziomu ekspresji. Chociaż wysokie poziomy ekspresji często prowadzą do lepszego stosunku sygnału do szumu, warunek ten wiąże się również ze zwiększoną liczbą agregatów cytozolowych i organellarnych przy użyciu konstruktów fuzyjnych GFP z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP), takich jak pHerry10,30,31. Jeśli agregacja jest nieunikniona, kwantyfikacja jest nadal możliwa dzięki przeprowadzaniu kalibracji punktowej w każdym eksperymencie i normalizacji danych w taki sposób, aby stosunek fluorescencji 1,0 odpowiadał pHi 7,0 (patrz krok 7.4 Uwaga dotycząca kalibracji poniżej).
  2. Przeprowadzić krzyżówki homozygotycznych samców capaR-GAL432 z homozygotycznymi dziewiczymi samicami UAS-pHerry10 oraz homozygotycznych samców c724-GAL42 z homozygotycznymi dziewiczymi samicami UAS-pHerry, aby umożliwić obrazowanie pHi odpowiednio w komórkach głównych i komórkach gwieździstych MT. Umieścić 6 samic UAS-pHerry z 3 samcami GAL4 w świeżych fiolkach z pożywką i pozostawić do kopulacji w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Larwy powinny pojawić się w ciągu 4 dni, a dorosłe osobniki zaczną się wykluwać około 10. dnia.
  3. Zebrać samice zaraz po wykluciu i odstawić na 10 dni w temperaturze 28 °C w celu osiągnięcia odpowiedniego wieku.
    UWAGA: Harmonogram eksperymentów można dostosować do wszelkich ograniczających testów behawioralnych (takich jak test wydzielniczy Ramsaya17,19), które będą korelowane z obrazowaniem pH wewnątrzkomórkowym na żywo. Można używać samców, jednak kanaliksamyc u samic są często większe i bardziej wytrzymałe.

2. Przygotowanie szkiełek z poli-L-lizyną.

  1. Narysować obramowanie o wymiarach 40 x 20 mm za pomocą hydrofobowego pisaka PAP w górnej części standardowych szkiełek przedmiotowych 75 x 25 mm i pozostawić do wyschnięcia na 15 min w RT. W przypadku, gdy szkiełka nie są kompatybilne z optyką obrazowania, należy zastosować duże szkiełka nakrywkowe.
  2. Przenieść 2 mL roztworu zapasu 0,01% poli-L-lizyny (PLL) na każde szkiełko i odstawić na 1 h w RT.
  3. Usunąć nadmiar PLL za pomocą pipety. Roztwór zachować w stożkowej probówce 50 mL do późniejszego użycia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Odssać pozostały roztwór za pomocą linii próżniowej. Przesunąć linię próżniową po całej powierzchni szkiełka, aby upewnić się, że na szkiełkach nie pozostał żaden roztwór.
  5. Odstawić szkiełka na dodatkową 1 h w RT przed użyciem. Suche szkiełka można przechowywać w RT do 1 miesiąca w standardowym etui na szkiełka.

3. Przygotowanie szalki do sekcji i szklanych pręcików

  1. Do polistyrenowej szalki Petriego o wymiarach 35 x 10 mm dodać w temperaturze pokojowej (RT) 0,5 mL utwardzacza elastomeru do 4,5 mL bazy elastomeru, aby uzyskać grubość warstwy 5 mm. Wymieszać za pomocą jednorazowej końcówki do pipety. Pozostawić elastomer do utwardzenia przez noc (O/N) w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Elastomer powinien być przejrzysty i pozbawiony pęcherzyków powietrza. Usuwanie pęcherzyków można ułatwić, umieszczając płytki elastomerowe w naczyniu próżniowym na 10 - 15 min po wylaniu.
  2. Trzymając w dłoniach szklaną rurkę o średnicy 5 mm, stopić jej środek nad zapalonym palnikiem Bunsena, jednocześnie rozciągając końce w przeciwnych kierunkach. W miarę topnienia szkła przyśpieszyć rozciąganie, aby uzyskać cienki (0,1 mm) i zwężający się trzon (Rysunek 1).
    UWAGA: Kąt 45° przy trzonie często ułatwia manipulację tubulami. Można to osiągnąć, obniżając jedną dłoń podczas rozciągania trzonu (patrz Rysunek 1).
  3. Przełamać cienki trzon w połowie, używając tępego końca jednoostrznego ostrza z węglowej stali. Sprawdzić cienki koniec rurki pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że przełom jest czysty.

Schemat cięcia szkła przedstawiający kroki z użyciem palnika i żyletki, ukazujący precyzyjne nacięcie pod kątem.
Rysunek 1: Wytwarzanie szklanych prętów do manipulacji cewkami Malpighiego.
A - E. Proces podgrzewania i wyciągania szklanego pręta w celu uzyskania zwężenia i kąta odpowiedniego do manipulacji MT. Strzałki oznaczają kierunek i wielkość przyłożonej siły. F. Fotografia odpowiednio wykonanego szklanego narzędzia. Pasek skali = 10 mm. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie roztworów i systemu perfuzyjnego

UWAGA: Systemy perfuzyjne różnią się w zależności od producenta. Niniejszy protokół opiera się na 8-kanałowym otwartym zbiorniku zasilanym grawitacyjnie, z regulatorem przepływu wejściowego i odpływem sterowanym podciśnieniem, jednak opisana tutaj metoda montowania MT może zostać dostosowana do każdego systemu perfuzyjnego.

  1. Przygotować następujące roztwory:
    1. Odmiarkować pożywkę Schneidera (40 ml do stożkowych probówek o pojemności 50 ml) i przechowywać w 4 °C.
    2. Przygotuj roztwory (t. j. bufor fosforanowy dla owadów (iPBS) oraz iPBS z NH44Cl) w temperaturze pokojowej w razie potrzeby zgodnie z Tabela 1). Przed użyciem w dniu eksperymentu ogrzać roztwory do temperatury pokojowej.
      UWAGA: iPBS oraz iPBS z 40 mM NH4Cl4Roztwór Cl można przygotować w dużych objętościach (1 l lub więcej) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować 8 roztworów kalibracyjnych o objętości 500 ml przy pH = 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,3, 7,6, 8,0 oraz 9,0, zgodnie z treścią Tabela 1 i przechowywać w temperaturze 4 °CDostosować pH każdego roztworu poprzez miareczkowanie N-metylod-glukaminą (NMDG) i HCl.
    4. W dniu przeprowadzenia eksperymentów ogrzać aliquoty roztworów kalibracyjnych o objętości 5 ml do temperatury pokojowej i dodać roztwór stokowy nigerycyny (20 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)), aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 10 µM.
      UWAGA: Nigerycynę należy obsługiwać w rękawiczkach. Wszystkie urządzenia, które miały kontakt z nigerycyną, należy traktować jako jednorazowe. Nigerycyna osadza się na szkle i plastiku, co w przypadku ponownego użycia sprzętu może negatywnie wpłynąć na preparaty biologiczne.
  2. System perfuzyjny:
    1. Przygotuj system perfuzyjny, napełniając wszystkie zbiorniki wodą ddH2O2O (Rysunek 2). Otwieraj kanały pojedynczo, aby umożliwić napełnienie wszystkich linii znajdujących się proksymalnie względem regulatora przepływu.
      UWAGA: Może być konieczne odpowietrzenie linii poprzez otwarcie zablokowanego kanału i użycie tłoka w celu wymuszenia przepływu z rezerwuaru.
    2. Otwórz 2 kanały i dopuść ddH2O2O do odprowadzenia. Gdy zbiorniki będą prawie puste, należy napełnić pierwszy zbiornik roztworem iPBS, a drugi roztworem NH4iPBS z impulsami Cl-. Za pomocą regulatora przepływu ustaw maksymalną prędkość przepływu i pozwól każdemu roztworowi przepływać przez 1 min, aby wypełnić linie dystalne, a następnie zatrzymaj przepływ (Rysunek 2).
    3. Umieść dwa zestawy uchwytów pomocniczych do lutowania na stole mikroskopu obrazującego. Jeden uchwyt należy umieścić po każdej stronie platformy obrazującej.
    4. Ostrożnie podgrzej końcowe 0,5 cala odcinka rurki kapilarnej (średnica wewnętrzna 1,5 mm, średnica zewnętrzna 0,86 mm, długość 100 mm) nad palnikiem Bunsena. Utwórz 45 ° wygiąć, pozwalając na odgięcie dystalnego końca pod wpływem grawitacji i usuwając szkło z płomienia po osiągnięciu pożątego kąta. Powtórzyć tę procedurę z drugim kawałkiem szkła kapilarnego.
    5. Wprowadź zgięte kapilary szklane odpowiednio do linii dopływu oraz podłączonej do próżni linii odpływu, a następnie zamocuj je w uchwytach typu „helping hands”, aby wyrównać je z platformą obrazującą mikroskopu (Rycina 3).

Układ mikroskopii perfuzyjnej; sterowanie zaworami, linie gazowe, kapilary do eksperymentu z mikroprzepływami komórkowymi.
Rycina 2: System perfuzji i konfiguracja obrazowania.
Komponenty niezbędne do fizjologicznej oceny funkcji transportu podstawno-bocznego MT poprzez jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne na żywo i szybką wymianę roztworów. Przedstawione linie gazowe są opcjonalne i umożliwiają rozszerzenie eksperymentów o ocenę transportu HCO3-. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat kontroli przepływu dla systemu obsługi płynów z zbiornikami, rozdzielaczem, zaworami i układem próżniowym.
Rycina 3: Schemat przepływu aparatury perfuzyjnej do eksperymentów z impulsami NH4Cl.
Strzałki przedstawiają ścieżkę przepływu i punkty przełączania zaworów. Roztwór przemieszcza się ze zbiornika do preparatu dzięki przepływowi grawitacyjnemu i jest zasysany z komory z preparatem do kolby z odpadami za pomocą ssania próżniowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

5. Disekcja przednich cewek Malpighiego u dorosłych osobników Drosophila.

  1. Przygotować szalkę do sekcji i wyciągniętą szklaną rurkę z sekcji 3, szkiełko pokryte PLL z sekcji 2, samoprzylepny divider do studni perfuzyjnych, smar próżniowy, pasek folii uszczelniającej o wymiarach 4 x 2", 2 pary precyzyjnych pincet nr 5 oraz aliquoty po 40 mL lodowatego pożywki Schneidera i iPBS w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Nanieść smar próżniowy na taśmę uszczelniającą i docisnąć samoprzylepny divider do studni perfuzyjnych do taśmy, aby pokryć jego spód smarem. Odkleić divider do studni perfuzyjnych i położyć go stroną ze smarem na szkiełku pokrytym PLL. Zdjąć divider, pozostawiając na szkiełku obrysy poszczególnych studni dla preparatów wykonane z hydrofobowego smaru.
  3. Nalać 200 µL iPBS w temperaturze pokojowej do obrysowanej smarem studni na szkiełku pokrytym PLL i przesunąć szkiełko pod stereomikroskop.
  4. Umieścić muchy UAS-pHerry/capaR-GAL4 w pustej fiolce i znieczulić je na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Ta metoda znieczulania, w przeciwieństwie do CO2, zapobiega odwodnieniu much.
  5. Nalać lodowatą pożywkę Schneidera do szalki do sekcji i za pomocą precyzyjnej pincety przenieść jedną znieczuloną samicę muchy do szalki pod stereomikroskopem.
  6. Utrzymać muchę za tułów jedną pincetą, a drugą delikatnie chwycić tylną część odwłoka. Rozchylić tylną część muchy, wykonując pincetą krótkie, zdecydowane ruchy. Gdy jelito tylne stanie się widoczne, chwycić jego koniec dystalny i oddzielić jelito oraz cewki Malpighiego (MTs) od leżących pod nimi tchawików, odciągając jelito tylne od ciała poprzez powtarzalne, krótkie pociągnięcia.
    UWAGA: Przednie i tylne MTs będą widoczne w miejscu ich połączenia ze złączem jelita środkowego i tylnego poprzez moczowód. Pierwszą parą uwolnionych MTs będą prawdopodobnie cewki tylne, ponieważ otaczają one jelito tylne. Można je zignorować (Rysunek 4A).
  7. Odciąć przednie MTs w miejscu moczowodu precyzyjną pincetą, gdy drugi zestaw MTs zostanie uwolniony z odwłoka. Pozwoli to oddzielić przednie MTs od jelita i zamknąć moczowód.
  8. Podnieść uwolnione przednie MTs za pomocą wyciągniętej szklanej rurki, wsuwając rurkę pod moczowód tak, aby cewki opadły po obu jego stronach. Unieść MTs pionowo w górę z roztworu.
  9. Obrócić szklaną rurkę tak, aby MTs i moczowód przylgały do jej dolnej strony, a następnie opuścić moczowód pionowo na szkiełko. Przymocować moczowód i uszczelnić końce dystalne MTs, dociskając moczowód do szkiełka (Rysunek 4B). Nie manipulować MTs bardziej, niż jest to konieczne. MTs powinny unosić się w roztworze, podczas gdy moczowód pozostaje zakotwiczony na szkiełku.
  10. Użyć cienkiego końca szklanej rurki, aby delikatnie przesunąć każdą cewkę po powierzchni szkiełka. Oprzzeć rurkę o szkiełko, aby uniknąć zmiażdżenia cewki, i przesunąć rurkę nad cewką, kierując się od strony dystalnej do proksymalnej, aby przymocować pełną długość każdej cewki do powierzchni szkiełka pokrytego PLL (Rysunek 4C).
  11. Nałożyć samoprzylepny divider do studni perfuzyjnych z powrotem na szkiełko, aby utworzyć małą, wypełnioną cieczą studnię nad zamocowaną cewką.
  12. Umieścić preparat na stoliku mikroskopu. Ustawić kapilary doprowadzające i odprowadzające ciecz odpowiednio nad otworem wlotowym i wylotowym studni perfuzyjnej.
    UWAGA: Divider można pominąć, jeśli pożądana jest otwarta komora perfuzyjna. W takim przypadku kapilary doprowadzająca i odprowadzająca mogą zostać ustawione po przeciwnych stronach studni obrazowej.

6. Walidacja protokołu obrazowania i stanu zdrowia kanalików

Uwaga: Protokół ten jest wykonywany na odwróconym szerokokątnym mikroskopie epifluorescencyjnym z zestawami filtrów dla GFP (SEpH) i RFP (mCherry) (wzbudzanie (ex) 470/40 nm, emisja (em) długoprzepustowa 515 nm, dichroik 500 nm oraz wzbudzanie (ex) 546/10 nm, emisja (em) długoprzepustowa 590 nm, dichroik 565 nm), obiektywem powietrznym 10X/0,45, kamerą monochromatyczną do rejestracji obrazów na żywo oraz oprogramowaniem do obrazowania. Protokół można dostosować do każdego mikroskopu przystojnego lub odwróconego z automatyczną zmianą filtrów między optyką GFP a RFP oraz oprogramowaniem do akwizycji obrazu, choć optymalne czasy ekspozycji, natężenie światła i parametry binningu będą się różnić. We wszystkich analizach intensywność fluorescencji powinna być analizowana jako średnia intensywność pikseli w obszarze zainteresowania (ROI), po odjęciu tła w każdym kanale przy użyciu ROI, który nie wykazuje fluorescencji i znajduje się bezpośrednio obok ROI sygnału.

  1. Włącz mikroskop, źródło światła oraz system obrazowania.
  2. Otwórz powiązane oprogramowanie do obrazowania.
  3. Patrząc przez okular, ręcznie dostrój ostrość, aż światło MT stanie się wyraźnie widoczne w świetle przechodzącym.
  4. Kliknij zakładkę „Acquisition” w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz „2x2” z menu rozwijanego „Binning” w sekcji „Acquisition Mode”.
  5. Wstaw filtr neutralnej gęstości 5% do drogi optycznej, aby zmniejszyć natężenie oświetlenia i zminimalizować fotowyblakanie.
  6. Kliknij kanał GFP (SEpH) w menu „Channels”, a następnie kliknij „Live”, aby obserwować sygnał fluorescencyjny za pomocą kamery.
  7. Dostosuj suwak „Time”, aby ustawić czas ekspozycji tak, by najwyższe wartości pikseli na histogramie intensywności wynosiły około 40% wartości maksymalnej, a następnie kliknij „Stop”, aby wyłączyć oświetlenie.
  8. Powtórz kroki 6.6 - 6.7 w kanale RFP (mCherry) i potwierdź obecność rozszerzonego segmentu początkowego przedniego MT oraz brak agregatów mCherry w cytozolu (co świadczy o uszkodzeniu tkanki lub nadekspresji) (Rycina 4D).
    UWAGA: Rozszerzony segment powinien być wyraźnie widoczny, ponieważ jest to najbardziej proksymalny odcinek kanalika, a średnica jego wewnętrznego światła jest o ok. 20 µm większa niż w sąsiednim segmencie przejściowym. Binning pikseli 2 x 2 jest często wystarczający, ale można go zwiększyć, aby dodatkowo zmniejszyć wymaganą intensywność oświetlenia. Typowe czasy ekspozycji wynoszą od 150 do 800 ms/kanał. Należy używać jak najmniejszej ilości światła, aby zminimalizować fotowyblakanie. Minimalizacja fotowyblakania jest kluczowa przy stosowaniu wskaźników z dwoma fluoroforami, takich jak pHerry, ponieważ oba fluorofory mogą wyblaknąć niezależnie, co unieważnia każdą kalibrację stosunku.
  9. Włącz protokół obrazowania time-lapse, zaznaczając pole wyboru „Time Series”.
  10. W menu rozwijanym w sekcji „Time Series” ustaw „Duration” na 10 min, a suwak „Interval” na 0, aby ustawić całkowity czas rejestracji przy maksymalnej częstotliwości akwizycji obrazów. Częstotliwość akwizycji 0,2 Hz jest zazwyczaj wystarczająca.
  11. Zaznacz pola GFP (SEpH) i RFP (mCherry) w sekcji „Channels”.
  12. Otwórz linię iPBS systemu perfuzyjnego, aktywując odpowiedni sterownik zaworu, i rozpocznij protokół obrazowania, klikając „Start Experiment”. Po 1 min przełącz na roztwór impulsowy NH4Cl na 20 s, otwierając odpowiedni zawór i zamykając linię iPBS, a następnie powróć do iPBS, zamykając linię NH4Cl i ponownie otwierając zawór iPBS. Pozwól na całkowite zakończenie protokołu obrazowania przed zatrzymaniem systemu perfuzyjnego.
    UWAGA: Analiza time-lapse powinna wykazać stabilny sygnał mCherry oraz sygnał SEpH, który wzrasta w obecności NH4Cl, wygasza się podczas wypłukiwania i stopniowo powraca.
  13. Wykonaj kalibrację dwupunktową.
    1. Usuń divider do dołków, odklejając go od leżącego pod nim szkiełka, a następnie usuń kapilary perfuzyjne i zaciski z dołka obrazującego.
    2. Nanieś 200 µL kalibracyjnego iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericyny) do dołka obrazującego za pomocą pipety 200 µL. Usuń roztwór z dołka pipetą, a następnie zastąp go kolejnymi 200 µL roztworu kalibracyjnego. Powtórz ten proces 4 razy, aby zapewnić całkowitą wymianę roztworu.
    3. Inkubuj preparat w roztworze kalibracyjnym przez 30 min przed obrazowaniem. Powtórz protokół obrazowania, korzystając z tych samych parametrów ustalonych w krokach 6.6 - 6.11, z modyfikacją polegającą na rejestracji obrazów tylko przez 1 min.
      UWAGA: System perfuzyjny i kapilary nie są potrzebne w tym kroku i nie powinny być podłączone do dołka obrazującego, aby uniknąć wystawienia kapilar na działanie nigericyny.
    4. Dodaj 200 µL kalibracyjnego iPBS (pH 9.0, 10 µM nigericyny) do dołka obrazującego za pomocą pipety 200 µL. Usuń roztwór z dołka pipetą, a następnie zastąp go kolejnymi 200 µL roztworu kalibracyjnego. Powtórz ten proces 4 razy, aby zapewnić całkowitą wymianę roztworu.
    5. Inkubuj preparat w drugim roztworze kalibracyjnym przez 10 min przed obrazowaniem. Powtórz protokół obrazowania zgodnie z krokiem 6.13.3.
    6. Przejrzyj zarejestrowany stos obrazów w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby potwierdzić, że żadne piksele w żadnym z kanałów nie są nasycone, klikając „Mean ROI” i przewijając stos obrazów suwakiem „Frame”, obserwując, czy żadne wartości na histogramie intensywności nie osiągają maksymalnej wartości wykrywalnej. Jeśli jakiekolwiek klatki zawierają piksele osiągające maksymalną wykrywalną intensywność, zmniejsz czas ekspozycji lub natężenie oświetlenia i powtórz sekcję 6.
      Uwaga: Po ustaleniu parametrów obrazowania nie zmieniaj ich między eksperymentami ani kalibracjami, chyba że kalibracje punktowe mają być stosowane dla każdego preparatu (patrz krok 8.3).
  14. Przeanalizuj stos obrazów, aby wykreślić intensywność fluorescencji i stosunek fluorescencji (SEpH/mCherry) w funkcji czasu.
    1. Kliknij „Mean ROI” i wybierz narzędzie do rysowania dowolnych kształtów. Przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby obrysować odcinek MT o długości ok. 50 µm. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć rysowanie ROI, a następnie powtórz czynność w obszarze sąsiadującym z MT, aby zdefiniować ROI tła (Rycina 5A).
    2. Kliknij „Mean Intensity” w sekcji „Measurements”. Utwórz tabelę wartości intensywności, klikając „Export > Data Table > Create”.
    3. Kliknij ikonę koła zębatego konfiguracji i odznacz wszystkie parametry poza „Time” i „Mean Intensity”. Kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę nowo utworzonej tabeli danych, wybierz „Save As” i wyeksportuj dane jako plik .csv.
      UWAGA: Podobne pomiary można przeprowadzić za pomocą bezpłatnego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
    4. Otwórz arkusz kalkulacyjny i zaimportuj tabelę danych, wybierając zakładkę „Data”, a następnie „From Text”.
    5. Użyj funkcji arkusza, aby odjąć intensywność tła SEpH od intensywności sygnału SEpH dla każdego punktu czasowego. Powtórz ten proces dla sygnału mCherry.
    6. Wykreśl intensywność każdego kanału w funkcji czasu, wybierając kolumny zawierające dane czasu oraz skorygowanej o tło intensywności, a następnie klikając „Insert > Scatter (Charts) > Scatter with Straight Lines” (Rycina 5B).
    7. Użyj funkcji arkusza do obliczenia stosunku fluorescencji SEpH/mCherry dla każdego punktu czasowego.
    8. Wykreśl stosunek fluorescencji w funkcji czasu, wybierając kolumny zawierające dane czasu i stosunku, a następnie klikając „Insert > Scatter (Charts) > Scatter with Straight Lines” (Rycina 5C).

7. Pełna kalibracja pHerry w cewkach Malpighiego ex vivo.

  1. Wypreparować i zamontować świeży zestaw przednich MT zgodnie z opisem w sekcji 5.
  2. Wymienić iPBS na Calibration iPBS (pH 7.4, 10 µM nigericyny) zgodnie z opisem w kroku 6.13.2. Inkubować przez 30 min.
  3. Zlokalizować MT i zebrać pary obrazów SEpH/mCherry zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.11. Zastąpić roztwór kolejną porcją Calibration iPBS zgodnie z opisem w kroku 6.13.4, odczekać 10 min i ponownie wykonać obrazowanie. Powtarzać ten proces, aż stosunek SEpH/mCherry zostanie zobrazowany we wszystkich roztworach. Obrazy dla pH 9.0 uzyskać na samym końcu, ponieważ preparat rzadko regeneruje się po wysokim pH.
  4. Wykreślić stosunek fluorescencji SEpH do mCherry z kalibracji w ośmiu preparatach jako funkcję narzuconego pHi zgodnie z opisem w kroku 6.14.9. Dopasować dane kalibracyjne do krzywej Boltzmanna, aby uzyskać pełną funkcję kalibracyjną zgodnie z Równaniem 1 (Rycina 5D). Jeśli dane są niespójne, wykreślić zestawy kalibracyjne z każdego preparatu w sposób znormalizowany tak, aby stosunek fluorescencji 1.0 odpowiadał pHi 7.0 i przeprowadzić ponowną analizę (Rycina 5E).
    UWAGA: Jeśli ten drugi proces okaże się konieczny, poszczególne eksperymenty będą wymagały własnych wewnętrznych kalibracji punktowych33 (patrz procedura kwantyfikacji poniżej (krok 8.3)).
  5. Równanie 1
    Równanie sigmoidalne używane w dopasowaniu danych dla miareczkowań kwasowo-zasadowych; wzór R=((A1-A2)/(1+e^(pHi-x0)/dx))+A2.
    Gdzie R = stosunek SEpH/mCherry, a A1, A2, xo oraz dx są parametrami dopasowania krzywej reprezentującymi odpowiednio minimalny stosunek fluorescencji, maksymalny stosunek fluorescencji, pKa oraz szerokość funkcji. xo = pozorne pKa pHerry, które może wynosić od 7.1 do 7.4 w zależności od typu komórek i dokładnych warunków kalibracji.

8. Ilościowe oznaczenie bazolateralnej ekstruzji kwasu z nabłonka cewek Malpighiego ex vivo.

  1. Obrazuj jednocześnie komórki gwiaździste wykazujące ekspresję pHerry oraz komórki główne wykazujące ekspresję pHerry.
    1. Wypreparuj przednie mięśnie tybiowe (MT) z UAS-pHerry/capaR-GAL4 muchy zgodnie z opisem w sekcji 5, jednak nie przenosić MT z medium do sekcji Schneidera do studzienki obrazowej.
    2. Wypreparuj przednie mięśnie kłębowate (MTs) z UAS-pHerry/c724-GAL4 muchę w tej samej płytce sekcyjnej, stosując procedurę opisaną w sekcji 5.
    3. Przenieś 2 zestawy MT do tej samej studni obrazującej, zgodnie z opisem w krokach 5.8 – 5.11.
      UWAGA: Podczas przesuwania ramion MT w dół w kierunku preparatu, umieść MT-y... UAS-pHerry/c724-GAL4 i UAS-pHerry/capaR-GAL4 kanalików blisko siebie, aby można było zwizualizować komórki główne i gwiaździste wykazujące ekspresję pHerry w tym samym polu (Rysunek 6A).
  2. Zastosuj NH4Wstępny impuls chlorowy (Cl prepulse) zgodnie z opisem w kroku 6.12.
    UWAGA: Jeśli spójna kalibracja (Rysunek 4B) nie udało się przeprowadzić, należy wykonać kalibrację punktową poprzez ustawienie pHi do 7,0 po zakończeniu każdego eksperymentu za pomocą buforu kalibracyjnego iPBS (pH 7,0, 10 µM (nigerycyna, 30 min inkubacji) po usunięciu przylepnego dzielnika studzienki perfuzyjnej oraz sprzętu do perfuzji.
  3. Kalibruj rejestracje z komórek gwiaździstych i głównych z różnych segmentów MT (stosując odpowiednio stosunek bezwzględny lub znormalizowany) za pomocą równania 2 i analizuj fazę regeneracji po NH4wycofanie Cl poprzez zastosowanie funkcji wykładniczego zaniku przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej i odnotowanie stałej czasowej zaniku (τ) (Rycina 6B).
    Równanie 2
    Równanie dla pH wewnętrznego; wzór przedstawiający logarytmiczną zależność stężeń w programie nauczania chemii.
    gdzie R = stosunek SEpH/mCherry i A1, A2, Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.oi dx czy parametry dopasowania krzywej są wyznaczane podczas kalibracji w kroku 7.4 (Równanie 1).
    1. Oblicz szybkość ekstruzji kwasu (JH+, patrz Równanie 3) w funkcji pHi aby uwzględnić różnice w pH spoczynkowymi or obciążenie kwasowe pomiędzy preparatami34Należy wykorzystać funkcje wykładnicze wyprowadzone w kroku 8.3, aby obliczyć pochodną pH.i w odniesieniu do czasu w każdym przedziale czasowym.
      Równanie 3
      Równanie ekstruzji kwasu: J_H+=β_T×dpH_i/dt. Istotne dla badań nad regulacją pH komórkowego.
    2. Oblicz wewnętrzną pojemność buforową (βi; Równanie 4) cytozolu przy pHi od początku każdego interwału w kroku 8.3.1 na podstawie wcześniejszej literatury (patrz Równanie 4).
      UWAGA: W Muszka owocówka, najdokładniejsza charakterystyka βi pochodzi z zakończeń nerwów ruchowych larwy35 i można przyjąć, że dane te są aktualne dla komórek MT w przypadku braku innych dostępnych danych.
      Równanie 4
      Równanie: β₁ = (-26,53×pHᵢ) + 205,65, przedstawiające wynik analizy regresji liniowej.
    3. Oblicz iloczyn βT (z kroku 8.3.2)i dpHi/dt (z kroku 8.3.1) w celu wyznaczenia JH+ (Równanie 3).
      UWAGA: W roztworach nominalnie wolnych od wodorowęglanów, takich jak opisane w niniejszym protokole, pojemność buforowa pochodząca z wodorowęglanów (βb) przyjmuje się, że wynosi ~0 mM. Całkowita pojemność buforowa (βT) jest sumą βi iβb, a zatem βi = βT wobec braku HCO₃⁻3-/CO236.
    4. Wykres JH+ w zależności od pHi na początku każdego przedziału czasowego, zgodnie z opisem w kroku 6.14.9.
    5. Zastosuj funkcje wykładniczego zaniku do części wszystkich zestawów danych, które pokrywają się pod względem pHi przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Porównaj tempo zmian otrzymanych funkcji, aby zestawić szybkości ekstruzji kwasu w komórkach i segmentach MT (Rysunek 6C).
      UWAGA: Najodpowiedniejsza funkcja stosowana do dopasowania krzywej nie zawsze musi być funkcją pojedynczej wykładniczej. W celu poprawy jakości dopasowania można zastosować inne funkcje.
    6. Oblicz strumień kwasu (patrz Równanie 5) jako funkcja pHi aby uwzględnić różnice w wielkości i kształcie komórek.
      Równanie 5
      Równanie strumienia kwasów, JH+ × (objętość komórki/powierzchnia komórki), wzór chemiczny, schemat.
      UWAGA: Wymiary komórek można zmierzyć bezpośrednio na obrazach lub określić w przybliżeniu. Komórki główne można przedstawić jako połowy pustej rurki o następujących wymiarach: średnica wewnętrzna 24 µm; średnica zewnętrzna 48 µm; wysokość 50 µmKomórki gwiaździste w stadium przejściowym są zróżnicowane, lecz można je w przybliżeniu przedstawić jako cylindry o wysokościach wynoszących 50 µm oraz średnice 10 µmPatrz ostatni akapit w Reprezentatywne wyniki Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
    7. Zastosuj funkcje wykładniczego zaniku do części wszystkich zestawów danych, które nakładają się pod względem pHi przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej. Porównaj szybkości zmian otrzymanych funkcji, aby porównać strumienie kwasów między komórkami a segmentami MT (Rysunek 6D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zdrowe tkanki i prawidłowa identyfikacja przednich MT są kluczowe dla powodzenia tego protokołu. Podczas sekcji należy zachować ostrożność, aby nie dotykać bezpośrednio MT, a manipulować nimi wyłącznie za pomocą mocznika, ponieważ bezpośrednie chwyytanie MT doprowadzi do ich uszkodzenia (Ryc. 4A - B). Podczas rozkładania MT na szkiełku przedmiotowym, należy jak najmniej dotykać kanalików i unikać nadmiernych ruchów, gdyż może...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Powodzenie ilościowego oznaczania pHi w MT Drosophila zależy całkowicie od stanu wyekstrahowanych MT oraz jakości montażu i rozwarstwienia (ryc. A - C). Dlatego konieczne jest ostrożne obchodzenie się z tkanką zgodnie z opisem. Prowadnice świeżo pokryte powłoką PLL znacznie ułatwiają montaż MT, ponieważ są zwykle znacznie bardziej przyczepne niż prowadnice, które wcześniej były narażone na działanie roztworu. Staranny montaż pomoże również w identyfik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH DK092408 i DK100227 MFR. AJR był wspierany przez T32-DK007013. Autorzy pragną podziękować dr Julianowi A.T. Dowowi za akcje CapaR-GAL4 i c724-GAL4 Drosophila. Dziękujemy również Jacobowi B. Andersonowi za pomoc w utrzymaniu eksperymentalnych krzyżówek muchowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór poli-L-lizyny (PLL)Sigma-AldrichP4832Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, może być ponownie użyty.
Nigericin Sodium SaltSigma-AldrichN7143UWAGA: Obnosić się w rękawiczkach. Przechowywać jako podwielokrotności 20 mM roztworu podstawowego w DMSO w temperaturze 4 °C.
Klejone pokrywy komór perfuzyjnych, rozmiar kleju 1 mm, średnica i grubość komory 9 mm i razy 0,9 mm, średnica portów 1,5 mmSigma-AldrichGBL622105Można zastąpić w razie potrzeby, aby dopasować do systemu perfuzyjnego.
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychKleje Ellsworth184 SIL ELAST KIT 0,5 KGDostępne u wielu dostawców.
Pomocne dłonie Stojaki lutowniczeNarzędzia do frachtu portowego60501Dostępne u wielu dostawców.
Otwarty grawitacyjny system perfuzyjny ze sterownikiem zaworu, kolektorem 8 do 1 i rezerwatoramiBioscience ToolsPS-8SMożna zastosować dowolny porównywalny system perfuzyjny.
Regulator przepływuWarner Instruments64-0221Może być zastąpiony w razie potrzeby w celu dopasowania do systemu perfuzyjnego.
Schneider's MediumFisher Scientific 21720024Store pod adresem 4 ° C w sterylnych podwielokrotnościach.
#5 Kleszcze ze stali nierdzewnejFine Science Tools11252-20Można zastąpić w zależności od komfortu eksperymentatora.
35 x 10 mm polistyrenowa szalka PetriegoCorning Life SciencesFisher Scientific 08-757-100ADokładna marka i rozmiar nie mają znaczenia.
Szkiełka mikroskopowe 75 x 25 mmCorning Life Sciences2949-75X25Dokładna marka i rozmiar mogą się różnić, o ile studzienki perfuzyjne są kompatybilne.
Filimentowane borokrzemianowe szkło kapilarne, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, grubość 0,32 mmWarner Instruments64-0796Filiment nie jest konieczny, szkło można zastąpić w celu dopasowania do rurki perfuzyjnej i studzienek perfuzyjnych.
Rurka Tygon, ID 1/16", OD 1/8", grubość 1/32"Fisher Scientific14-171-129Dostępne u wielu dostawców, mogą być zastąpione w celu dopasowania do systemu perfuzji.
Próżniowy smar silikonowySigma-AldrichZ273554dostępny u wielu dostawców.
Plastikowy zacisk kontroli przepływuFisher Scientific05-869Dostępne u wielu dostawców, sterylność nie jest wymagana
Pręty szklane, średnica 5 mmdelphiglass.com9198Dokładny rozmiar to osobiste preferencje, dostępnych jest wielu dostawców
Długopis hydrofobowy PAPSigma-AldrichZ377821Dostępne u wielu dostawców.
Folia uszczelniającaSigma-AldrichP7668Dostępna u wielu dostawców.
15 ml probówka FalconBD Falcon352096Dostępne u wielu dostawców.
Probówka Falcon 50 mlBD Falcon352070Dostępne u wielu dostawców.
HEPES; Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowySigma-AldrichH3375Dostępne u wielu dostawców.
MES; Kwas 4-morpholineethanosulfonowy monohydratSigma-Aldrich69892Dostępne u wielu dostawców.
Zawory; Kwas N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-3-aminopropanosulfonowySigma-AldrichT5130Dostępne u wielu dostawców.
Obiektyw powietrzny 10X/0,45Zeiss000000-1063-139Można zastąpić porównywalne obiektywy. Obiektywy 40X mogą być używane do obrazowania pojedynczych komórek.
Stereoskop preparacyjnyZeissDiscovery.V8Można użyć dowolnego stereoskopu preparacyjnego.
Transgeniczny Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowano: Cytat 10
Linia sterownika capaR-GAL4 Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowane: Cytat 32
linia sterownika c724-GAL4 Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowane: Cytat 2
Monochromatyczny aparat cyfrowy o wysokiej czułościZeissAxiocam 506 monoDokładna marka i model mogą się różnić, można je zastąpić dowolnym monochromatycznym aparatem o wysokiej czułości przystosowanym do obrazowania komórkowego na żywo.
Zestaw filtrów GFP/FITC, np. 470/40 nm, długoprzepustowy em. 515 nm., dichroiczny 500 nmChromaCZ909Można wymienić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.
Zestaw filtrów RFP/TRITC, np. 546/10 nm, 590 nm długoprzepustowy em., 565 nm dichroicznyChromaCZ915Można zastąpić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.
Odwrócony mikroskop epifluescencyjnyZeissAxio Observer Z.1Można użyć dowolnego porównywalnego mikroskopu z silnikowym przełączaniem filtrów. Mikroskopy pionowe mogą być używane z otwartymi kąpielami perfuzyjnymi i obiektywami zanurzonymi w wodzie.
Oprogramowanie do analizy statystycznejMicrocalOrigin 6.0Można zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności
Oprogramowanie do analizy obrazuNational Institutes of HealthImageJ 1.50iMożna zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności
Oprogramowanie do akwizycji obrazuZeissZen 1.1.2.0Można zastąpić
dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalnościJednosieczna żyletka ze stali węglowejMikroskopia elektronowa Sciences71960Dostępne u wielu dostawców.
Teczka na szkiełka mikroskopoweFisher Scientific16-04Dostępne u wielu dostawców.
Palnik BunsenaFisher Scientific50-110-1231Dostępne u wielu dostawców.
Polystrene Drosophila Fiolki do hodowli z FlugsGenesee Scientific32-109BFPorównywalne produkty można zastąpić.
Laboratoryjne wiadro na lód 2,5 lFisher Scientific07-210-129Dostępne u wielu dostawców.
NMDG; N-metylo-D-glukaminaSigma-AldrichM2004Dostępne u wielu dostawców.
Barierowe końcówki do pipet 200 μMidSciAV200Dostępne u wielu dostawców.
200 μ L Pipeta o zmiennej objętościGilson IncorporatedPIPETMAN P200Dostępne u wielu dostawców.

Bibliografia

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151(2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68(2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202(2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897(2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7(2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cewki Malpighiego Drosophilaepitelialny transport jonówobrazowanie na żywotransport protonówkalibracja pHfluorescencyjny biosensorkomórki głównekomórki gwiaździste
Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.