Artykuł metodologiczny

Optyczna kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pH w nabłonku kanalików Malpighian Drosophila melanogaster z fluorescencyjnym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH

DOI:

10.3791/55698

⸱

11 sierpnia 2017

 , 
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension, Mayo Clinic College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórkowy transport jonów często można ocenić poprzez monitorowanie wewnątrzkomórkowego pH (pHi). Genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHIs) zapewniają optyczną kwantyfikację wewnątrzkomórkowego pH w nienaruszonych komórkach. Protokół ten szczegółowo opisuje ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowego pH za pomocą komórkowego obrazowania na żywo ex vivo kanalików Malpighiego Drosophila melanogaster z pHerry, pseudoratiometrycznym genetycznie kodowanym wskaźnikiem pH.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonkowy transport jonów jest niezbędny dla systemowej homeostazy jonów, jak również utrzymania niezbędnych komórkowych gradientów elektrochemicznych. Na pH wewnątrzkomórkowe (pHi) wpływa wiele transporterów jonów, dlatego monitorowanie pHi jest użytecznym narzędziem do oceny aktywności transportera. Nowoczesne genetycznie kodowane wskaźniki pH (GEpHI) zapewniają optyczną ocenę ilościową pHi w nienaruszonych komórkach w skali komórkowej i subkomórkowej. Protokół ten opisuje ilościowe oznaczanie w czasie rzeczywistym komórkowej regulacji pHi w kanalikach Malpighiego (MT) Drosophila melanogaster poprzez obrazowanie ex vivo na żywo pHerry, pseudoratiometrycznego GEpHI z pKdobrze nadającym się do śledzenia zmian pH w cytozolu. Wyekstrahowane dorosłe muchy MT składają się z morfologicznie i funkcjonalnie odrębnych odcinków nabłonka warstwy jednokomórkowej i mogą służyć jako dostępny i genetycznie wykonalny model do badania transportu nabłonkowego. GEpHI mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami fluorescencyjnymi wrażliwymi na pH i elektrodami jonoselektywnymi. GEpHI mogą znakować odrębne populacje komórek, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie elementy promotorowe. Oznakowanie to jest szczególnie przydatne w przypadku preparatów ex vivo, in vivo i in situ, które są z natury niejednorodne. GEpHI umożliwiają również ilościowe oznaczanie pHi w nienaruszonych tkankach w czasie bez konieczności wielokrotnego leczenia barwnikiem lub eksternalizacji tkanek. Podstawową wadą obecnych GEpHI jest tendencja do agregacji inkluzji cytozolowych w odpowiedzi na uszkodzenie tkanek i konstruowanie nadekspresji. Te niedociągnięcia, ich rozwiązania i nieodłączne zalety GEpHI zostały wykazane w tym protokole poprzez ocenę bazolateralnego transportu protonów (H+) w funkcjonalnie odrębnych komórkach głównych i gwiaździstych wyekstrahowanych MT much. Opisane techniki i analizy można łatwo dostosować do szerokiej gamy preparatów dla kręgowców i bezkręgowców, a wyrafinowanie testu można skalować od laboratoriów dydaktycznych do skomplikowanego określania strumienia jonów za pomocą określonych transporterów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest opisanie ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowego pH (pHi) za pomocą genetycznie kodowanego wskaźnika pH (GEpHI) i pokazanie, jak ta metoda może być wykorzystana do oceny podstawno-bocznego transportu H+ w modelowej strukturze nerkowej owada (D. melanogaster), kanaliku Malpighiego (MT). MT służą jako narządy wydalnicze muszki owocowej i są funkcjonalnie podobne do nefronu ssaków pod kilkoma kluczowymi względami1. MT są ułożone jako 2 pary kanalików (przedni i tylny) w klatce piersiowej i brzuchu muchy. Jednokomórkowa rurka nabłonkowa każdego MT składa się z metabolicznie aktywnych komórek głównych o wyraźnej polarności wierzchołkowej (luminalnej) i podstawno-bocznej (hemocoel), a także interkalowanych komórek gwiaździstych. Przednie MT składają się z 3 morfologicznie, funkcjonalnie i rozwojowo odrębnych segmentów, w szczególności początkowego segmentu rozszerzonego, segmentu przejściowego i głównego segmentu wydzielniczego, który łączy się z moczowodem2. W skali komórkowej transnabłonkowy transport jonów do światła odbywa się za pomocą wierzchołkowej błony plazmatycznej V-ATPase3 i wymiennika metalowo-alkalicznego/H+, a także podstawno-bocznego Na+-K+-ATPase4, kanały5, wymiennik Cl−/HCO3− sterowany Na+ (NDAE1)6 i Na+-K+-2Cl− kotransporter (NKCC; Ncc69)7, podczas gdy komórki gwiaździste pośredniczą w transporcie Cl- i wody8,9. Ten złożony, ale dostępny system fizjologiczny zapewnia doskonałe możliwości badania mechanizmów endogennego transportu jonów w połączeniu z różnorodnymi zestawami narzędzi genetycznych i behawioralnych Drosophila.

Uzasadnieniem dla tego protokołu było opisanie genetycznie plastycznego systemu do badania transportu jonów nabłonkowych z potencjałem integracji od komórki do zachowania i eksportu narzędzi do innych systemów modelowych. Wyrażenie pHerry10, GEpHI pochodzące z fuzji super-ekliptycznego pHhluorin11,12 (SEpH) i czerwonego pH-insensitive mCherry13, w MTs umożliwia ilościowe określenie transportu H+ w pojedynczych komórkach MT za pomocą techniki kalibracji o wysokiej zawartości K+/nigerycyny14. Ponieważ wiele transporterów jonów przenosi ekwiwalenty H+, kwantyfikacja wewnątrzkomórkowego pHi służy jako funkcjonalna reprezentacja ruchu jonów za pomocą różnych transporterów. System modelowy Drosophila MT oferuje również potężne narzędzia genetyczne w specyficznej dla tkanki transgene15 i interferencji RNA (RNAi)16, które można łączyć z obrazowaniem komórkowym i testami całego narządu17,18,19 funkcji kanalików, aby stworzyć solidny zestaw narzędzi z pionową integracją od cząsteczek do zachowania. Stoi to w sprzeczności z wieloma innymi protokołami oceny biologii nabłonka, ponieważ historycznie takie pomiary opierały się na skomplikowanej i zniechęcającej mikrosekcji, wyrafinowanych elektrodach jonoselektywnych20,21 i drogich barwnikach wrażliwych na pH22 z restrykcyjnymi wymaganiami dotyczącymi obciążenia i słabą swoistością komórkową w heterogenicznych tkankach. GEpHI były używane do szeroko zakrojonego pomiaru pHi w różnych typach komórek23. Wczesne prace wykorzystywały wrodzoną czułość pH białka zielonej fluorescencji (GFP) do monitorowania pHi w hodowanych komórkach nabłonkowych24, ale w ciągu ostatnich dwóch dekad GEpHI były stosowane w neuronach25, glia26, fungi27 i komórkach roślinnych28. Połączenie potencjału komórkowego celowania konstruktów genetycznych za pomocą systemu ekspresji GAL4/UAS15 oraz fizjologicznej dostępności Drosophila MT sprawia, że jest to idealne przygotowanie do badań nad regulacją pHi i nabłonkowym transportem jonów.

Regulacja pHi jest badana od dziesięcioleci i jest niezbędna do życia. Preparat MT oferuje solidny model do nauczania fizjologii regulacji pHi, ale także do wykonywania zaawansowanych badań regulacji pHi ex vivo i in vivo. Protokół ten opisuje kwantyfikację ruchu H+ przez błonę podstawno-boczną komórek nabłonkowych Drosophila MT przy użyciu techniki ładowania kwasem pulsacyjnym NH4Cl21, ale ponieważ wskaźnik pH jest kodowany genetycznie, metody te i ich ramy teoretyczne mogą być stosowane do dowolnego preparatu podatnego na transgenezę i obrazowanie na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie kroki w tym protokole są zgodne z wytycznymi Mayo Clinic (Rochester, MN) dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

1. Hodowla much

  1. Wychowuj muchy i ustawiaj krzyżówki zgodnie ze standardową hodowlą29.
    UWAGA: Ekspresja fluorescencyjnego reportera przez system GAL4/UAS jest proporcjonalna do temperatury, a zatem temperatura chowu może być dostosowana do zmiany poziomu ekspresji. Podczas gdy wysokie poziomy ekspresji często prowadzą do lepszego stosunku sygnału do szumu, warunek ten jest również związany ze zwiększonymi agregatami cytozolowymi i organellarnymi podczas stosowania konstruktów fuzji GFP z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP), takich jak pHerry10,30,31. Jeśli agregacja jest nieunikniona, kwantyfikacja jest nadal możliwa poprzez wykonanie kalibracji punktowej w każdym doświadczeniu i normalizację danych w taki sposób, aby stosunek fluorescencji 1,0 odpowiadał pH i 7,0 (patrz krok 7.4 Uwaga dotyczącakalibracji poniżej).
  2. Zestaw krzyżówek homozygotycznych capaR-GAL432 samców z homozygotycznymi UAS-pHerry10 dziewiczych samic i homozygotycznych c724-GAL42 samców do homozygotycznych dziewiczych samic UAS-pHerry, aby umożliwić obrazowanie pHi odpowiednio w głównych komórkach i komórkach gwiaździstych MT. Umieścić 6 samic UAS-pHerry z 3 samcami GAL4 w świeżych fiolkach z pokarmem i pozostawić do krycia w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Larwy powinny być widoczne w ciągu 4 dni, a dorosłe osobniki zaczną się zamykać około 10 dnia.
  3. Zebrać samice much po wylęgu i odstawić do leżakowania przez 10 dni w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Czas eksperymentowania można dostosować tak, aby odpowiadał wszelkim restrykcyjnym testom behawioralnym (takim jak test wydzielania Ramsaya17,19), które będą skorelowane z wewnątrzkomórkowym obrazowaniem pH na żywo. Można używać samców much, ale kanaliki samic są często większe i bardziej wytrzymałe.

2. Przygotowanie preparatów z poli-L-lizyny.

  1. Narysuj obwódkę o wymiarach 40 x 20 mm za pomocą hydrofobowego pisaka PAP wokół górnej części standardowych szkiełek o wymiarach 75 x 25 mm i odłóż do wyschnięcia na 15 minut w temperaturze pokojowej. Użyj dużych szkiełek nakrywkowych, jeśli szkiełka nie są kompatybilne z optyką obrazową.
  2. Przenieść 2 ml podstawowego 0,01% roztworu poli-L-lizyny (PLL) na każde szkiełko podstawowe i odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń nadmiar PLL za pomocą pipety. Roztwór należy przechowywać w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml do wykorzystania w przyszłości. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Odessać pozostały roztwór za pomocą linii próżniowej. Poprowadź przewód podciśnieniowy po całej powierzchni szkiełka, aby upewnić się, że na szkiełkach nie pozostał żaden roztwór.
  5. Przed użyciem odłóż szkiełka na 1 dodatkową godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowuj szkiełka w suchym miejscu w temperaturze pokojowej przez okres do 1 miesiąca w standardowym zeszycie slajdów.

3. Przygotowanie naczynia do preparowania i szklanych prętów

  1. Dodać 0,5 ml utwardzacza elastomerowego do 4,5 ml elastomerowej podstawy na polistyrenowej szalce Petriego o wymiarach 35 x 10 mm w temperaturze pokojowej, aby uzyskać głębokość 5 mm. Wymieszać za pomocą jednorazowej końcówki do pipety. Pozwól elastomerowi utwardzić O/N w RT.
    UWAGA: Elastomer powinien być przezroczysty i pozbawiony pęcherzyków. Usuwanie pęcherzyków może być ułatwione poprzez przechowywanie płytek elastomerowych w słoiku próżniowym przez 10 - 15 minut po naleniu.
  2. Trzymaj szklany pręt o średnicy 5 mm między rękami i rozpuść środek pręta nad zapalonym palnikiem Bunsena, jednocześnie rozsuwając końce. Gdy szkło topi się szybciej,, tworząc cienki (0,1 mm) i stożkowy trzon (Rysunek 1).
    UWAGA: Kąt 45 ° na trzpieniu jest często pomocny w obsłudze rurek. Można to osiągnąć, opuszczając jedną rękę podczas ciągnięcia trzpienia (patrz Rysunek 1).
  3. Złamij cienki trzonek pośrodku stroną jednosiecznej żyletki ze stali węglowej. Sprawdź cienki koniec pręta pod lunetą sekcyjną, aby upewnić się, że pęknięcie jest czyste.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Wytwarzanie prętów szklanych do przenoszenia kanalików Malpighiego.
A - E. Proces podgrzewania i ciągnięcia szklanego pręta w celu uzyskania stożka i kąta odpowiedniego do obsługi MT. Strzałki wskazują kierunek i wielkość siły, która ma być przyłożona. F. Fotografia odpowiednio wykonanego narzędzia szklanego. Podziałka = 10 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie roztworów i system perfuzyjny

UWAGA: Systemy perfuzyjne różnią się w zależności od producenta. Protokół ten opiera się na zasilanym grawitacyjnie 8-kanałowym otwartym zbiorniku z wejściowym regulatorem natężenia przepływu i odpływem napędzanym podciśnieniem, ale opisaną tutaj metodę montażu MT można dostosować do pracy z dowolnym systemem perfuzyjnym.

  1. Przygotuj następujące rozwiązania:
    1. Podwielokrotność pożywki Schneidera (40 ml w stożkowych fiolkach o pojemności 50 ml) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować roztwory (tj. sól fizjologiczną buforowaną fosforanami owadów (iPBS) i iPBS z NH4Cl) w temperaturze pokojowej, zgodnie z potrzebami zgodnie z tabelą 1). Ciepłe roztwory do RT przed użyciem w dniu eksperymentu.
      UWAGA: iPBS i iPBS z 40 mM NH4Cl można przygotowywać w dużych objętościach (1 l lub więcej) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować 8 roztworów kalibracyjnych w objętości 500 ml przy pH = 5,0, 6,0, 6,5, 7,0, 7,3, 7,6, 8,0 i 9,0, jak wskazano w Tabeli 1 i przechowywać w temperaturze 4 °C. Dostosować pH każdego roztworu przez miareczkowanie N-metylo-D-glukaminą (NMDG) i HCl.
    4. W dniu eksperymentów ogrzać 5 ml podwielokrotności roztworów kalibracyjnych do RT i dodać podstawowy roztwór nigerycyny (20 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)) w celu uzyskania końcowego stężenia 10 μM,
      UWAGA: Z nigerycyną należy obchodzić się w rękawiczkach. Traktuj wszystkie urządzenia, które mają kontakt z nigerycyną, jako jednorazowe. Nigerycyna pozostaje na szkle i plastiku i zagrozi przygotowaniom biologicznym, jeśli sprzęt zostanie ponownie użyty.
  2. System perfuzyjny:
    1. Zalać system perfuzyjny, napełniając wszystkie zbiorniki ddH2O (Rysunek 2). Otwieraj kanały pojedynczo, aby umożliwić napełnienie wszystkich przewodów znajdujących się proksymalnie do regulatora natężenia przepływu.
      UWAGA: Może być konieczne oczyszczenie przewodów z powietrza poprzez otwarcie zablokowanego kanału i użycie tłoka do wysterowania przepływu ze zbiornika.
    2. Otwórz 2 kanały i pozwól ddH2O spłynąć. Gdy zbiorniki są prawie puste, napełnij pierwszy zbiornik iPBS, a drugi zbiornik iPBS impulsowym NH4Cl. Ustaw natężenie przepływu na maksimum za pomocą regulatora natężenia przepływu i pozwól każdemu roztworowi płynąć przez 1 minutę, aby wypełnić dystalne linie, a następnie zatrzymaj przepływ (Rysunek 2).
    3. Pozycja 2 zestawy zacisków lutowniczych "pomocnych dłoni" na stoliku mikroskopu obrazowego. Umieść po jednym zacisku z każdej strony platformy obrazowania.
    4. Ostrożnie podgrzej dystalną 0.5 cala kawałka szkła kapilarnego (średnica wewnętrzna 1.5 mm, średnica zewnętrzna 0.86 mm, długość 100 mm) nad palnikiem Bunsena. Stwórz zagięcie pod kątem 45 °, pozwalając dystalnemu końcowi zgiąć się grawitacyjnie i usuwając szkło z płomienia po osiągnięciu pożądanego kąta. Powtórz ten proces z drugim kawałkiem szkła kapilarnego.
    5. Włóż wygięte szklane kapilary odpowiednio do przewodu dopływowego i podłączonego próżniowo przewodu odpływowego i zamontuj je w "pomocnych dłoniach", aby wyrównać je ze stolikiem obrazowania mikroskopu (Rysunek 3).

figure-protocol-2
Rysunek 2: System perfuzji i konfiguracja obrazowania.
Składniki niezbędne do fizjologicznej oceny funkcji transportu podstawno-bocznego MT poprzez jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne na żywo i szybką wymianę roztworu. Przedstawione przewody gazowe są opcjonalne i pozwalają na rozszerzenie eksperymentów o ocenę transportu HCO3-. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schemat przepływu aparatury perfuzyjnej do eksperymentów impulsowych NH4Cl.
Strzałki przedstawiają ścieżkę przepływu i punkty przełączania zaworów. Roztwór przemieszcza się ze zbiornika do próbki za pomocą przepływu grawitacyjnego i jest wciągany z komory na próbkę do kolby odpadowej przez odsysanie próżniowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Sekcja dorosłych kanalików Malpighiego przedniego.

  1. Zebrać naczynie rozwarstwiające i wyciągnięty szklany pręt z sekcji 3, szkiełko pokryte PLL z sekcji 2, adhezyjny rozdzielacz perfuzyjny, smar próżniowy, pasek folii uszczelniającej o wymiarach 4 x 2 cale, 2 pary drobnych kleszczyków #5 i 40 ml podwielokrotności lodowatego podłoża Schneidera i RT iPBS.
  2. Rozprowadź smar próżniowy na taśmie uszczelniającej i dociśnij samoprzylepną przegrodę perfuzyjną do taśmy, aby pokryć spód smarem. Zdejmij samoprzylepną przegrodę perfuzyjną i umieść ją smarem do dołu na szkiełku pokrytym PLL. Usunąć przegrodę perfuzyjną, aby pozostawić poszczególne studzienki na próbki obrysowane smarem hydrofobowym.
  3. Umieścić 200 μl RT iPBS w studzience pokrytej tłuszczem na szkiełku pokrytym PLL i przesunąć szkiełko pod stereoskopem.
  4. Umieścić muchy UAS-pHerry/capaR-GAL4 w pustej fiolce na muchy i znieczulić je na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: Ta metoda znieczulenia, w przeciwieństwie do CO2, zapewnia, że muchy nie odwadniają się.
  5. Wlej lodowatą pożywkę Schneidera do naczynia preparacyjnego i użyj cienkich kleszczy, aby przenieść pojedynczą znieczuloną samicę muchy do naczynia pod stereoskopem preparacyjnym.
  6. Przytrzymaj muchę za klatkę piersiową za pomocą zestawu kleszczy i użyj drugiego, aby delikatnie chwycić tylną część brzucha. Rozciągnij tylną część muchy za pomocą kleszczy krótkimi, przemyślanymi ruchami. Gdy tylne jelito jest widoczne, chwyć dystalny koniec i uwolnij jelito i MT z leżących poniżej tchawicy, odciągając tylne jelito od ciała poprzez powtarzające się, krótkie szarpnięcia.
    UWAGA: Przedni i tylny MT będą widoczne w miejscu, w którym stykają się z połączeniem jelita środkowego i tylnego przez moczowód. Pierwszą parą MT, które będą wolne, będą prawdopodobnie kanaliki tylne, które otaczają jelito tylne. Można je zignorować (Rysunek 4A).
  7. Ściśnij przednie MT na moczowodze za pomocą drobnych kleszczyków, gdy drugi zestaw MT jest wolny od brzucha. Spowoduje to oddzielenie przednich MT od jelita i zamknięcie moczowodu.
  8. Podnieś wolne przednie MT za pomocą ciągniętego szklanego pręta, wsuwając pręt pod moczowód tak, aby kanaliki opadły na dowolną stronę. Podnieś MT prosto do góry z roztworu.
  9. Obrócić szklany pręt tak, aby MT i moczowód przylegały do spodu pręta i opuść moczowód prosto w dół na szkiełko. Przymocuj moczowód i uszczelnij dystalne końce MTs, dociskając moczowód do szkiełka (Rysunek 4B). Nie manipuluj MT więcej niż to konieczne. MT powinny unosić się w roztworze z moczowodem zakotwiczonym do szkiełka.
  10. Użyj cienkiego końca szklanego pręta, aby delikatnie przesunąć każdą rurkę po powierzchni szkiełka. Przymocuj pręt do szkiełka, aby uniknąć zmiażdżenia kanalika i przesuń pręt przez górną część kanalika, przesuwając się dystalnie do proksymalnego, aby przymocować całą długość każdej rurki do powierzchni szkiełka pokrytego PLL (Rysunek 4C).
  11. Umieść adhezyjną przegrodę perfuzyjną z powrotem na szkiełku, aby utworzyć małą studzienkę wypełnioną płynem nad zamontowaną rurką.
  12. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Umieść kapilary wlotowe i odpływowe odpowiednio nad otworem wlotowym i wylotowym studni perfuzyjnej.
    UWAGA: Przegrodę studni można pominąć, jeśli pożądana jest otwarta komora perfuzyjna. W takim przypadku kapilary dopływu i odpływu można ustawić po przeciwnych stronach dołka obrazowego.

6. Walidacja protokołu obrazowania i zdrowia kanalików

Uwaga: Ten protokół jest wykonywany na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym o szerokim polu z zestawami filtrów GFP (SEpH) i RFP (mCherry) (wzbudzenie 470/40 nm (ex), 515 nm emisja długoprzepustowa (em), 500 nm dichroiczne i 546/10 nm ex, 590 nm długoprzepustowe em, 565 nm dichroiczne), obiektyw powietrzny 10X/0,45, monochromatyczna kamera do przechwytywania obrazu na żywo i oprogramowanie do obrazowania. Protokół można dostosować do dowolnego mikroskopu pionowego lub odwróconego z automatycznym przełączaniem filtrów między optyką GFP i RFP oraz oprogramowaniem do akwizycji obrazu, chociaż optymalne czasy ekspozycji, natężenie światła i parametry binningu będą się różnić. We wszystkich analizach intensywność fluorescencji powinna być analizowana jako średnia intensywność pikseli w obszarze zainteresowania (ROI), po odjęciu tła w każdym kanale przy użyciu ROI z brakiem fluorescencji sąsiadującej z ROI sygnału.

  1. Włącz mikroskop, źródło światła i system obrazowania.
  2. Otwórz powiązane oprogramowanie do obrazowania.
  3. Spójrz przez okular i ręcznie wyreguluj ostrość, aż światło MT będzie wyraźnie widoczne w świetle przechodzącym.
  4. Kliknij zakładkę "Akwizycja" w oprogramowaniu do analizy obrazu i wybierz "2x2" z menu rozwijanego "Binning" w sekcji "Tryb akwizycji".
  5. Umieść filtr o neutralnej gęstości 5% do ścieżki światła, aby zmniejszyć światło świetlne i zminimalizować fotowybielanie.
  6. Kliknij kanał GFP (SEpH) w menu "Kanały", a następnie kliknij "Na żywo", aby obserwować sygnał fluorescencyjny przez kamerę.
  7. Dostosuj suwak "Czas", aby ustawić czas ekspozycji tak, aby najjaśniejsze wartości pikseli na histogramie intensywności stanowiły około 40% wartości maksymalnej, a następnie kliknij "Stop", aby zatrzymać oświetlenie.
  8. Powtórz kroki 6.6 - 6.7 w kanale RFP (mCherry) i potwierdź obecność poszerzonego początkowego segmentu przedniego MT oraz brak cytozolowych agregatów mCherry (wskazujących na uszkodzenie tkanki lub nadekspresję) (Rysunek 4D).
    UWAGA: Rozszerzony segment powinien być wyraźnie widoczny, ponieważ jest to najbardziej proksymalny segment kanalika, a średnica wewnętrznego światła tego segmentu jest ~20 μm większa niż sąsiedniego segmentu przejściowego. Binning 2 x 2 pikseli jest często wystarczający, ale można go zwiększyć, aby jeszcze bardziej zmniejszyć wymaganą intensywność oświetlenia. Typowe czasy naświetlania wynoszą od 150 do 800 ms/kanał. Używaj jak najmniej światła, aby zminimalizować fotowybielanie. Minimalizacja fotowybielania ma zasadnicze znaczenie dla stosowania wskaźników podwójnego fluoroforu, takich jak pHerry, ponieważ te dwa fluorofory mogą wybielać niezależnie, unieważniając w ten sposób kalibrację proporcji.
  9. Włącz protokół obrazowania poklatkowego, klikając pole wyboru "Szeregi czasowe".
  10. Dostosuj "Czas trwania" w menu rozwijanym w sekcji "Szeregi czasowe" na 10 minut, a suwak "Interwał" na 0, aby ustawić całkowity czas przechwytywania z maksymalną szybkością pozyskiwania obrazu. Często wystarcza całkowita szybkość akwizycji 0,2 Hz.
  11. Zaznacz zarówno pola GFP (SEpH), jak i RFP (mCherry) w sekcji "Kanały".
  12. Otwórz linię iPBS systemu perfuzyjnego, aktywując odpowiedni sterownik zaworu i uruchom protokół obrazowania, klikając "Rozpocznij eksperyment". Po 1 minucie przełącz się na roztwór impulsowy NH4Cl na 20 s, otwierając odpowiedni zawór i zamykając linię iPBS, a następnie wróć do iPBS, zamykając linię NH4Cl i ponownie otwierając zawór iPBS. Poczekaj, aż pełny protokół obrazowania zostanie wypełniony przed zatrzymaniem systemu perfuzyjnego.
    UWAGA: Analiza poklatkowa powinna ujawnić stabilny sygnał mCherry i sygnał SEpH, który wzrasta w obecności NH4Cl, gaśnie po wypłukaniu i stopniowo wraca do normy.
  13. Wykonaj kalibrację 2-punktową.
    1. Usuń przegrodę studzienki, odrywając ją od leżącego poniżej szkiełka i usuń kapilary perfuzyjne i zaciski z dołka obrazowania.
    2. Nanieść 200 μl iPBS kalibracyjnego (pH 7,4, 10 μM nigerycyny) do dołka obrazowania za pomocą pipety 200 μl. Usunąć roztwór z dołka obrazowego za pomocą pipety, a następnie zastąpić go kolejnym roztworem kalibracyjnym o pojemności 200 μl. Powtórz ten proces 4 razy, aby zapewnić pełną wymianę roztworu.
    3. Preparat należy inkubować w roztworze kalibracyjnym przez 30 minut przed obrazowaniem. Powtórz protokół obrazowania, używając tych samych parametrów, które zostały określone w krokach 6.6 - 6.11, z modyfikacją tylko 1 minuty przechwytywania obrazu.
      UWAGA: System perfuzyjny i naczynia włosowate nie są potrzebne na tym etapie i nie powinny być dobrze przymocowane do obrazowania, aby uniknąć narażenia naczyń włosowatych na działanie nigerycyny.
    4. Dodać 200 μl iPBS kalibracyjnego (pH 9,0, 10 μM nigerycyny) do dołka obrazowania za pomocą pipety 200 μl. Usunąć roztwór z dołka obrazowego za pomocą pipety, a następnie zastąpić go kolejnym roztworem kalibracyjnym o pojemności 200 μl. Powtórz ten proces 4 razy, aby zapewnić pełną wymianę roztworu.
    5. Preparat należy inkubować w drugim roztworze kalibracyjnym przez 10 minut przed obrazowaniem. Powtórz protokół obrazowania, jak w kroku 6.13.3.
    6. Przejrzyj przechwycony stos obrazów w oprogramowaniu do analizy obrazu, aby upewnić się, że żadne piksele w żadnym kanale nie są nasycone, klikając "Średni zwrot z inwestycji" i przewijając stos obrazów za pomocą suwaka "Ramka", obserwując, że żadne wartości zgłoszone w histogramie intensywności nie osiągają maksymalnej wykrywalnej wartości. Jeśli jakiekolwiek klatki zawierają piksele, które osiągają maksymalną wykrywalną intensywność, zmniejsz czas ekspozycji lub intensywność oświetlenia i powtórz sekcję 6.
      nuta: Po ustaleniu nie należy zmieniać parametrów obrazowania między eksperymentami lub kalibracją, chyba że w każdym przygotowaniu mają być stosowane kalibracje punktowe (patrz krok 8.3).
  14. Przeanalizuj stos obrazów, aby wykreślić intensywność fluorescencji i współczynnik fluorescencji (SEpH/mCherry) w funkcji czasu.
    1. Kliknij "Średni zwrot z inwestycji" i wybierz narzędzie do swobodnego kształtowania. Przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby prześledzić długość MT ~50 μm. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć rysowanie ROI, a następnie powtórz w obszarze przylegającym do MT, aby zdefiniować ROI tła (Rysunek 5A).
    2. Kliknij "Średnia intensywność" w sekcji "Pomiary". Utwórz tabelę wartości intensywności, klikając "Eksportuj tabelę danych > > Utwórz".
    3. Kliknij ikonę koła zębatego konfiguracji i odznacz wszystkie parametry z wyjątkiem "Czasu" i "Średniej intensywności". Kliknij prawym przyciskiem myszy zakładkę nowo utworzonej tabeli danych, wybierz "Zapisz jako" i wyeksportuj dane jako plik .csv.
      UWAGA: Podobne pomiary można również wykonać za pomocą bezpłatnego oprogramowania, takiego jak ImageJ.
    4. Otwórz tabelę arkusza kalkulacyjnego i zaimportuj tabelę danych, wybierając kartę "Dane", a następnie "Z tekstu".
    5. Użyj funkcji w arkuszu kalkulacyjnym, aby odjąć intensywność tła SEpH od intensywności sygnału SEpH w każdym punkcie czasowym. Powtórz ten proces dla sygnału mCherry.
    6. Wykreśl intensywność każdego kanału w funkcji czasu, wybierając kolumny zawierające dane dotyczące czasu i intensywności skorygowanej w tle, a następnie klikając "Wstaw > Punktowy (wykresy) > Punktowy z liniami prostymi" (Rysunek 5B).
    7. Użyj funkcji arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć współczynnik fluorescencji SEpH/mCherry w każdym punkcie czasowym.
    8. Wykreśl współczynnik fluorescencji w funkcji czasu, zaznaczając kolumny zawierające dane czasu i stosunku, a następnie klikając "Wstaw > Scatter (wykresy) > Scatter z liniami prostymi" (Rysunek 5C).

7. Pełna kalibracja pHerry w kanalikach Malpighian ex vivo.

  1. Wypreparować i zamontować nowy zestaw przednich MT, jak opisano w sekcji 5.
  2. Wymień iPBS na kalibrację iPBS (pH 7,4, 10 μM nigerycyny) zgodnie z opisem w kroku 6.13.2. Inkubować przez 30 minut.
  3. Zlokalizuj MT i zbierz pary obrazów SEpH/mCherry zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.11. Zastąp roztwór innym zapasem iPBS do kalibracji zgodnie z opisem w kroku 6.13.4, odczekaj 10 minut i ponownie zobrazuj. Powtarzaj ten proces, aż stosunek SEpH/mCherry zostanie zobrazowany we wszystkich roztworach. Obrazy pH 9,0 należy uzyskać na końcu, ponieważ próbka rzadko wraca do zdrowia po wysokim pH.
  4. Wykreślić stosunek fluorescencji SEpH do mCherry z kalibracji w ośmiu próbkach jako funkcję narzuconego pHi, jak opisano w kroku 6.14.9. Dopasuj dane kalibracyjne do krzywej Boltzmanna, aby uzyskać pełną funkcję kalibracji zgodnie z równaniem 1 ( Rysunek 5D). Jeśli dane są niespójne, wykreśl zestawy kalibracyjne z każdej próbki znormalizowane tak, aby współczynnik fluorescencji 1,0 odpowiadał pHi 7,0 i ponownie przeanalizuj (Rysunek 5E).
    UWAGA: Jeśli ten drugi proces jest konieczny, poszczególne eksperymenty będą wymagały własnych wewnętrznych kalibracji punktowych33 (patrz procedura kwantyfikacji poniżej (krok 8.3)).
  5. Równanie 1
    figure-protocol-4
    Gdzie R = stosunek SEpH/mCherry i A1, A2, xo i dx są parametrami dopasowania krzywej reprezentującymi odpowiednio minimalny współczynnik fluorescencji, maksymalny współczynnik fluorescencji, pKa i szerokość funkcji. xo = pozorne pKa pHerry, które może wahać się między 7,1 a 7,4 w zależności od typu ogniwa i dokładnych warunków kalibracji.

8. Kwantyfikacja wytłaczania kwasu podstawno-bocznego z nabłonka kanalików Malpighiego ex vivo.

  1. Obraz komórek gwiaździstych eksprymujących pHerry i głównych komórek eksprymujących pHerry jednocześnie.
    1. Przeprowadzić preparację przednich MT z muchy UAS-pHerry/capaR-GAL4 zgodnie z opisem w sekcji 5, ale nie należy przenosić MT z pożywki Schneidera do dołka obrazowania.
    2. Wypreparować przednie MT z muchy UAS-pHerry/c724-GAL4 w tej samej naczyniu preparacyjnym, stosując procedurę opisaną w sekcji 5.
    3. Przenieś 2 zestawy MT do tej samej studzienki obrazowania, jak opisano w krokach 5.8 - 5.11.
      UWAGA: Podczas przesuwania ramion MT w dół do szkiełka, umieść MT kanalików UAS-pHerry/c724-GAL4 i UAS-pHerry/capaR-GAL4 blisko siebie, tak aby można było zwizualizować komórki główne i gwiaździste wyrażające pHerry w tym samym polu (Rysunek 6A).
  2. Zastosuj impuls wstępny NH4Cl zgodnie z opisem w kroku 6.12.
    UWAGA: Jeśli nie można osiągnąć spójnej kalibracji (Rysunek 4B), wykonaj kalibrację punktową, ustawiając pHi na 7,0 na końcu każdego eksperymentu za pomocą Kalibracji iPBS (pH 7,0, 10 μM nigerycyny, 30 min inkubacji) po usunięciu adhezyjnego rozdzielacza perfuzyjnego i sprzętu do perfuzji.
  3. Skalibruj ślady z komórek gwiaździstych i głównych różnych segmentów MT (używając odpowiednio stosunku bezwzględnego lub znormalizowanego) za pomocą równania 2 i przeanalizuj fazę odzyskiwania po wycofaniu NH4Cl, stosując funkcje rozkładu wykładniczego za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej i odnotowując stałą rozpadu (τ) (Rysunek 6B).
    Równanie 2
    figure-protocol-5
    Gdzie R = stosunek SEpH/mCherry i A1, A2, xo i dx są parametrami dopasowania krzywej określonymi przez kalibrację w kroku 7.4 (równanie 1).
    1. Oblicz szybkość wytłaczania kwasu (JH+, patrz równanie 3) jako funkcję pHi, aby uwzględnić zmiany pH spoczynkowegoi i obciążenia kwasem między preparatami34. Użyj funkcji wykładniczych wyprowadzonych w kroku 8.3, aby obliczyć pochodną pHi w odniesieniu do czasu w każdym przedziale czasu.
      Równanie 3
      figure-protocol-6
    2. Obliczyć wewnętrzną pojemność buforową (βi; Równanie 4) cytozolu o pHi od początku każdego przedziału w kroku 8.3.1 na podstawie wcześniejszej literatury (patrz równanie 4).
      UWAGA: U Drosophila najdokładniejsza charakterystyka βi pochodzi z zakończeń nerwów ruchowych larw35 i można założyć, że dane te są prawdziwe dla komórek MT przy braku innych dostępnych danych.
      równanie 4
      figure-protocol-7
    3. Obliczyć iloczyn βT (z kroku 8.3.2) i dpHi/dt (z kroku 8.3.1), aby wyznaczyć JH+ (równanie 3).
      UWAGA: W roztworach nominalnie wolnych od wodorowęglanów, takich jak te opisane w niniejszym protokole, przyjmuje się, że pojemność buforowa pochodząca z wodorowęglanów (βb) wynosi ~0 mM. Całkowita pojemność buforowa (βT) jest sumą βi i βb, a zatemβ i = βT przy braku HCO3-/CO236.
    4. Wykreślić JH+ w funkcji pHi na początku każdego przedziału czasu, jak opisano w kroku 6.14.9.
    5. Zastosuj funkcje rozkładu wykładniczego do części wszystkich zbiorów danych, które nakładają się na siebie w pHi, za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Porównaj szybkości zmian wynikowych funkcji, aby porównać szybkość wytłaczania kwasu między komórkami i segmentami MT (Rysunek 6C).
      UWAGA: Najbardziej odpowiednią funkcją używaną do dopasowywania krzywej nie zawsze musi być pojedyncza wartość wykładnicza. Inne funkcje można zastąpić, jeśli poprawiają dobroć dopasowania.
    6. Oblicz strumień kwasu (patrz równanie 5) w funkcji pHi, aby uwzględnić różnice w wielkości i kształcie komórki.
      równanie 5
      figure-protocol-8
      UWAGA: Wymiary komórki można mierzyć bezpośrednio na obrazach lub w przybliżeniu. Główne komórki można przedstawić jako połówki pustej rurki o następujących wymiarach: średnica wewnętrzna 24 μm; średnica zewnętrzna 48 μm; wysokość 50 μm. Przejściowe komórki gwiaździste są zmienne, ale można je z grubsza przedstawić jako cylindry o wysokości 50 μm i średnicy 10 μm. Patrz ostatni akapit reprezentatywnych wyników poniżej.
    7. Zastosuj funkcje rozkładu wykładniczego do części wszystkich zestawów danych, które nakładają się na pHi, za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Porównaj szybkości zmian wynikowych funkcji, aby porównać strumienie kwasu między komórkami i segmentami MT (Rysunek 6D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdrowe tkanki i właściwa identyfikacja przednich MT są kluczowe dla powodzenia tego protokołu. Podczas sekcji należy uważać, aby nie dotykać bezpośrednio MT i dotykać ich tylko za moczowód, ponieważ bezpośrednie chwytanie MT doprowadzi do pęknięcia (Rysunek 4A - B). Gdy MT są zamiatane płasko na szkiełko, kanaliki muszą być dotykane tak rzadko, jak to możliwe i unika się nadmiernego ruchu, ponieważ spowoduje to uszkodzenie warstwy nabł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powodzenie ilościowego oznaczania pHi w MT Drosophila zależy całkowicie od stanu wyekstrahowanych MT oraz jakości montażu i rozwarstwienia (ryc. A - C). Dlatego konieczne jest ostrożne obchodzenie się z tkanką zgodnie z opisem. Prowadnice świeżo pokryte powłoką PLL znacznie ułatwiają montaż MT, ponieważ są zwykle znacznie bardziej przyczepne niż prowadnice, które wcześniej były narażone na działanie roztworu. Staranny montaż pomoże również w identyfik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH DK092408 i DK100227 MFR. AJR był wspierany przez T32-DK007013. Autorzy pragną podziękować dr Julianowi A.T. Dowowi za akcje CapaR-GAL4 i c724-GAL4 Drosophila. Dziękujemy również Jacobowi B. Andersonowi za pomoc w utrzymaniu eksperymentalnych krzyżówek muchowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór poli-L-lizyny (PLL)Sigma-AldrichP4832Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, może być ponownie użyty.
Nigericin Sodium SaltSigma-AldrichN7143UWAGA: Obnosić się w rękawiczkach. Przechowywać jako podwielokrotności 20 mM roztworu podstawowego w DMSO w temperaturze 4 °C.
Klejone pokrywy komór perfuzyjnych, rozmiar kleju 1 mm, średnica i grubość komory 9 mm i razy 0,9 mm, średnica portów 1,5 mmSigma-AldrichGBL622105Można zastąpić w razie potrzeby, aby dopasować do systemu perfuzyjnego.
Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowychKleje Ellsworth184 SIL ELAST KIT 0,5 KGDostępne u wielu dostawców.
Pomocne dłonie Stojaki lutowniczeNarzędzia do frachtu portowego60501Dostępne u wielu dostawców.
Otwarty grawitacyjny system perfuzyjny ze sterownikiem zaworu, kolektorem 8 do 1 i rezerwatoramiBioscience ToolsPS-8SMożna zastosować dowolny porównywalny system perfuzyjny.
Regulator przepływuWarner Instruments64-0221Może być zastąpiony w razie potrzeby w celu dopasowania do systemu perfuzyjnego.
Schneider's MediumFisher Scientific 21720024Store pod adresem 4 ° C w sterylnych podwielokrotnościach.
#5 Kleszcze ze stali nierdzewnejFine Science Tools11252-20Można zastąpić w zależności od komfortu eksperymentatora.
35 x 10 mm polistyrenowa szalka PetriegoCorning Life SciencesFisher Scientific 08-757-100ADokładna marka i rozmiar nie mają znaczenia.
Szkiełka mikroskopowe 75 x 25 mmCorning Life Sciences2949-75X25Dokładna marka i rozmiar mogą się różnić, o ile studzienki perfuzyjne są kompatybilne.
Filimentowane borokrzemianowe szkło kapilarne, ID 1,5 mm, OD 0,86 mm, grubość 0,32 mmWarner Instruments64-0796Filiment nie jest konieczny, szkło można zastąpić w celu dopasowania do rurki perfuzyjnej i studzienek perfuzyjnych.
Rurka Tygon, ID 1/16", OD 1/8", grubość 1/32"Fisher Scientific14-171-129Dostępne u wielu dostawców, mogą być zastąpione w celu dopasowania do systemu perfuzji.
Próżniowy smar silikonowySigma-AldrichZ273554dostępny u wielu dostawców.
Plastikowy zacisk kontroli przepływuFisher Scientific05-869Dostępne u wielu dostawców, sterylność nie jest wymagana
Pręty szklane, średnica 5 mmdelphiglass.com9198Dokładny rozmiar to osobiste preferencje, dostępnych jest wielu dostawców
Długopis hydrofobowy PAPSigma-AldrichZ377821Dostępne u wielu dostawców.
Folia uszczelniającaSigma-AldrichP7668Dostępna u wielu dostawców.
15 ml probówka FalconBD Falcon352096Dostępne u wielu dostawców.
Probówka Falcon 50 mlBD Falcon352070Dostępne u wielu dostawców.
HEPES; Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowySigma-AldrichH3375Dostępne u wielu dostawców.
MES; Kwas 4-morpholineethanosulfonowy monohydratSigma-Aldrich69892Dostępne u wielu dostawców.
Zawory; Kwas N-[tris(hydroksymetylo)metylo]-3-aminopropanosulfonowySigma-AldrichT5130Dostępne u wielu dostawców.
Obiektyw powietrzny 10X/0,45Zeiss000000-1063-139Można zastąpić porównywalne obiektywy. Obiektywy 40X mogą być używane do obrazowania pojedynczych komórek.
Stereoskop preparacyjnyZeissDiscovery.V8Można użyć dowolnego stereoskopu preparacyjnego.
Transgeniczny Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowano: Cytat 10
Linia sterownika capaR-GAL4 Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowane: Cytat 32
linia sterownika c724-GAL4 Drosophila melagnogasterDostępne w Romero LabPo raz pierwszy opublikowane: Cytat 2
Monochromatyczny aparat cyfrowy o wysokiej czułościZeissAxiocam 506 monoDokładna marka i model mogą się różnić, można je zastąpić dowolnym monochromatycznym aparatem o wysokiej czułości przystosowanym do obrazowania komórkowego na żywo.
Zestaw filtrów GFP/FITC, np. 470/40 nm, długoprzepustowy em. 515 nm., dichroiczny 500 nmChromaCZ909Można wymienić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.
Zestaw filtrów RFP/TRITC, np. 546/10 nm, 590 nm długoprzepustowy em., 565 nm dichroicznyChromaCZ915Można zastąpić dowolny zestaw filtrów GFP/FITC.
Odwrócony mikroskop epifluescencyjnyZeissAxio Observer Z.1Można użyć dowolnego porównywalnego mikroskopu z silnikowym przełączaniem filtrów. Mikroskopy pionowe mogą być używane z otwartymi kąpielami perfuzyjnymi i obiektywami zanurzonymi w wodzie.
Oprogramowanie do analizy statystycznejMicrocalOrigin 6.0Można zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności
Oprogramowanie do analizy obrazuNational Institutes of HealthImageJ 1.50iMożna zastąpić dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalności
Oprogramowanie do akwizycji obrazuZeissZen 1.1.2.0Można zastąpić
dowolnym oprogramowaniem o porównywalnej funkcjonalnościJednosieczna żyletka ze stali węglowejMikroskopia elektronowa Sciences71960Dostępne u wielu dostawców.
Teczka na szkiełka mikroskopoweFisher Scientific16-04Dostępne u wielu dostawców.
Palnik BunsenaFisher Scientific50-110-1231Dostępne u wielu dostawców.
Polystrene Drosophila Fiolki do hodowli z FlugsGenesee Scientific32-109BFPorównywalne produkty można zastąpić.
Laboratoryjne wiadro na lód 2,5 lFisher Scientific07-210-129Dostępne u wielu dostawców.
NMDG; N-metylo-D-glukaminaSigma-AldrichM2004Dostępne u wielu dostawców.
Barierowe końcówki do pipet 200 μMidSciAV200Dostępne u wielu dostawców.
200 μ L Pipeta o zmiennej objętościGilson IncorporatedPIPETMAN P200Dostępne u wielu dostawców.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151(2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68(2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202(2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897(2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7(2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cewki Malpighiego Drosophilaepitelialny transport jon wobrazowanie na ywotransport proton wkalibracja pHfluorescencyjny biosensorkom rki g wnekom rki gwia dziste

Powiązane artykuły