Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Summary

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Abstract

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek, które mogą być stosowane do testów toksyczności in vitro na ludziach. Jedną z głównych zalet jest to, że przeprogramowanie komórek somatycznych w celu wytworzenia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pozwala uniknąć problemów etycznych i legislacyjnych związanych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Komórki HiPSC mogą być namnażane i skutecznie różnicowane w różne typy komórek nerwowych i glejowych, służąc jako systemy testowe do badania toksyczności, a w szczególności do oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność. W pracy opisano protokół różnicowania hiPSC w mieszane kultury komórek neuronalnych i glejowych. Zdefiniowano szlaki sygnałowe, które są regulowane i/lub aktywowane przez różnicowanie neuronów. Informacje te mają kluczowe znaczenie dla zastosowania modelu komórkowego do nowego paradygmatu badania toksyczności, w którym substancje chemiczne są oceniane na podstawie ich zdolności do zakłócania szlaków biologicznych. Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon, inhibitor mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, został wykorzystany do oceny aktywacji szlaku sygnałowego Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmu obrony komórkowej przed stresem oksydacyjnym napędzanego przez element odpowiedzi przeciwutleniającej (ARE).

Introduction

Raport Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Stanów Zjednoczonych¹ przewidział nowy paradygmat testowania toksyczności, w którym regulacyjne testy toksyczności zostałyby zmienione z podejścia polegającego na zmianach fenotypowych obserwowanych u zwierząt na podejście skupiające się na mechanistycznych testach in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek. Pochodne pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) mogą stanowić alternatywę dla modeli komórek nowotworowych, ponieważ uzyskane komórki mogą bardziej przypominać warunki fizjologiczne tkanek ludzkich i dostarczać bardziej odpowiednich narzędzi do badania niepożądanych skutków wywołanych chemikaliami. Dwa główne typy kultur PSC, które są najbardziej obiecujące do badań toksyczności, to ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które są obecnie szeroko stosowane w obszarach badań podstawowych i medycyny regeneracyjnej^2,3. Wiedza ta może być teraz wykorzystana do opracowania nowej klasy badań toksykologicznych in vitro, których celem jest identyfikacja zaburzonych szlaków fizjologicznych związanych z rozwojem niekorzystnych skutków in vivo. Jest jednak mało prawdopodobne, aby metody badawcze do regulacyjnej oceny bezpieczeństwa oparte na hESC były akceptowane przez wszystkie państwa członkowskie UE i kraje na całym świecie ze względu na możliwe obawy etyczne i zróżnicowane krajowe polityki legislacyjne regulujące wykorzystanie komórek pochodzących z zarodków.

hiPSCs mają cechy podobne do hESCs^4,5 i mają duży potencjał dla metod in vitro, zarówno do identyfikacji celów terapeutycznych, jak i do oceny bezpieczeństwa. Ponadto technologia hiPSC łagodzi ograniczenia związane z ograniczoną pulą dawców oraz obawy etyczne związane z komórkami pochodzącymi z zarodków. Głównym wyzwaniem dla hiPSC jest wykazanie, że komórki te mogą w sposób powtarzalny wytwarzać znaczny zakres istotnych z toksykologicznego punktu widzenia pochodnych komórkowych, o cechach i reakcjach typowych dla tkanek ludzkich. Predefiniowane poziomy wybranych markerów są zazwyczaj wykorzystywane do charakteryzowania populacji komórek po procesie różnicowania oraz do zapewnienia wglądu w stabilność procesu różnicowania.

Poprzednie prace oceniały przydatność hiPSC do generowania mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych oraz do oceny wpływu rotenonu, inhibitora mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, na aktywację szlaku Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmów obrony przed antyoksydantami w wielu typach komórek^6,7.

Ta praca opisuje protokół używany do różnicowania hiPSC na mieszane kultury neuronalne i glejowe, dostarczając szczegółów na temat szlaków sygnałowych (poziom genów i białek), które są aktywowane podczas różnicowania neuronalnego/glejowego. Ponadto praca przedstawia reprezentatywne wyniki pokazujące, w jaki sposób ten model komórek neuronalnych i glejowych pochodzący z hiPSC może być wykorzystany do oceny aktywacji sygnalizacji Nrf2 indukowanej ostrym (24-godzinnym) leczeniem rotenonem, co pozwala na ocenę indukcji stresu oksydacyjnego.

IMR90 fibroblasty zostały przeprogramowane na hiPSC w I-Stem (Francja) przez wirusową transdukcję 2 czynników transkrypcyjnych (Oct4 i Sox2) przy użyciu wektorów pMIG⁶. Można również zastosować analogiczne modele hiPSC. Opisane poniżej protokoły podsumowują wszystkie etapy różnicowania się hiPSC w nerwowe komórki macierzyste (NSC), a następnie w mieszane hodowle postmitotycznych neuronów i komórek glejowych (kroki 1 i 2, szczegółowy opis protokołu można znaleźć również na stronie internetowej EURL ECVAM DBALM)⁸.

Dodatkowy protokół do izolacji, ekspansji, krioprezerwacji i dalszego różnicowania NSC na mieszane neurony i komórki glejowe jest szczegółowo opisany w krokach 3 i 4 (zobacz również na stronie EURL ECVAM DBALM w celu szczegółowego opisu tego protokołu)⁹. Krok 5 opisuje analizy, które można przeprowadzić, aby ocenić tożsamość fenotypową komórek podczas kilku etapów zaangażowania i różnicowania.

Protocol

1. Indukowana przez człowieka ekspansja pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)

UWAGA: hiPSC mogą być hodowane na odpowiednim substracie mieszanki białkowej w obecności pożywki mTeSR1 zawierającej mTeSR1 5x suplementy (przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta; tabliczka ~100 fragmentów kolonii/60-mm szalka Petriego). Gdy kolonie hiPSC osiągną odpowiednią wielkość (patrz przykład kolonii w Rysunek 2A), należy przejść przez komórki zgodnie z opisem poniżej (raz w tygodniu).

1. Pokryć naczynia matrycą błony podstawnej zakwalifikowaną do kwalifikacji hESC (zwaną dalej "matrycą kwalifikowaną") lub innym odpowiednim substratem białkowym.
   1. Przechowywać kwalifikowaną matrycę (patrz tabela materiałów) w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 200 μl w zimnych probówkach o pojemności 1,5 ml i zimnych pipetach o pojemności 5 lub 10 ml.
   2. Przed pasażowaniem rozmrozić 200 μl kwalifikowanej matrycy na lodzie.
   3. Rozcieńczyć 200 μl kwalifikowanej matrycy w 20 ml pożywki DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:100).
   4. Tym roztworem pokryj 60-milimetrowe szalki Petriego (5 ml na szalkę).
   5. Inkubować powlekane naczynia w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
2. Kriokonserwacja i rozmrażanie fragmentów kolonii HiPSC
   1. Po przecięciu kolonii hiPSC (patrz krok 1.3 dla procedury cięcia kolonii hiPSC), delikatnie i powoli ponownie zawiesić fragmenty kolonii hiPSC w pożywce do zamrażania komórek macierzystych, ~100 fragmentów/250 μL (patrz Tabela Materiałów).
   2. Podwielokrotność fragmentów kolonii umieścić w odpowiednich fiolkach do kriokonserwacji (250 μl/fiolkę).
   3. Umieścić fiolki w pojemniku wypełnionym 2-propanolem i umieścić pojemnik w temperaturze -80 °C na minimum 2 godziny do 2 tygodni.
   4. Przenieść fiolki do fazy gazowej zbiornika z ciekłym azotem.
   5. Aby ponownie uruchomić hodowlę, rozmrozić 1 zamrożoną fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
   6. Delikatnie zebrać fragmenty kolonii hiPSC w 7 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki hiPSC (patrz Tabela materiałów) w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
   7. Odwirować fragmenty kolonii hiPSC w stężeniu 130 x g przez 3 minuty.
   8. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić fragmenty kolonii hiPSC w 1 ml kompletnej pożywki hiPSC za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
   9. Zawiesinę komórkową należy następnie rozcieńczyć w 3 lub 4 ml kompletnej pożywki hiPSC.
   10. Umieść fragmenty kolonii hiPSC na kwalifikowanej 60-milimetrowej szalce Petriego pokrytej matrycą (~100 fragmentów/szalkę; pokryj szalki zgodnie z opisem w kroku 1.1).
   11. Inkubować hiPSC w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   12. Każdego dnia wykonuj całkowitą wymianę podłoża.
3. Pasażowanie kolonii hiPSC
   UWAGA: Niezróżnicowane hiPSC powinny mieć okrągły kształt, z dużymi jąderkami i bez obfitej cytoplazmy. Niezróżnicowane kolonie powinny charakteryzować się płaską i ciasno upakowaną morfologią. Tylko niezróżnicowane kolonie (o średnicy około 1 mm) powinny być cięte w celu dalszego pasażowania.
   1. Pokrój kolonie komórek macierzystych w kwadraty o wymiarach około 200 μm x 200 μm za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 30G lub innych dostępnych na rynku narzędzi (patrz tabela materiałów). Użyj mikroskopu stereoskopowego przy 4-krotnym powiększeniu w komorze laminarnej w temperaturze pokojowej.
   2. Oderwij fragmenty kolonii od powierzchni naczynia za pomocą pipety o pojemności 200 μl, delikatnie pipetując pożywkę znajdującą się pod spodem, aby podnieść kawałki.
   3. Przenieść fragmenty kolonii (~100 sztuk) na kwalifikowaną płytkę pokrytą matrycą-DMEM/F12 wypełnioną 4 ml kompletnej pożywki hiPSC (patrz Tabela materiałów; pokryć szalki zgodnie z opisem w kroku 1.1).
   4. Inkubować nową płytkę (płytki) w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   5. Codziennie wykonuj całkowitą zmianę podłoża i sprawdzaj morfologię kolonii za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przy powiększeniach 4x i 10x.

2. Różnicowanie HiPSC na mieszane neurony i glej

UWAGA: Procedura trwa około 28 dni, a główne kroki przedstawiono w Rysunek 1 (górna część).

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu różnicowania neuronów. (Górna część) Kolonie IMR90-hiPSC mogą być cięte na fragmenty, tworząc ciała zarodkowe (EB). Po 2 dniach in vitro (DIV) EB można posiać na szalkach pokrytych lamininą lub standardową matrycą i hodować w obecności pożywki do indukcji neuroepitelialnej (NRI) w celu wytworzenia pochodnych neuroektodermalnych (rozety, tutaj barwione na gniazdynę (zielony) i β-III-tubulinę (czerwony)). Rozety mogą być dysocjowane, zbierane, ponownie powlekane na płytkach pokrytych lamininą lub standardową matrycą, a następnie różnicowane w dojrzałe komórki neuronalne (NF200, czerwone) i glejowe (GFAP, zielone) w obecności pożywki różnicowania neuronów (ND). (Dolna część) NSC pochodzące z rozety (nestyna, czerwona) mogą być ekspandowane w obecności pożywki indukcji neuronalnej (NI), kriokonserwowane lub dalej różnicowane w obecności pożywki ND, tworząc mieszane hodowle neuronalne (NF200, zielony) i glejowy (GFAP, czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Wytwarzanie ciał zarodków (EB) (dni 0 → 1)
   UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji. Fragmenty kolonii HiPSC powinny być jednakowej wielkości, aby w kolejnych krokach uzyskać jednorodne ciała zarodkowe (EB). Morfologicznie zróżnicowane kolonie (z dużymi frakcjami cytoplazmatycznymi i małymi jąderkami) należy odrzucić.
   1. Odśwież pożywkę hiPSC (3 ml/60 mm szalka Petriego) przed cięciem niezróżnicowanych kolonii hiPSC (o średnicy około 1 mm, patrz Rysunek 2A) w sterylnych warunkach (jak opisano w kroku 1).
   2. Pokrój niezróżnicowane kolonie (jak pokazano na Rysunek 2A i Rysunek 2B) na fragmenty o wymiarach około 200 μm x 200 μm za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 30G. Użyj mikroskopu stereoskopowego przy 4-krotnym powiększeniu w komorze laminarnej w temperaturze pokojowej.
   3. Odłącz fragmenty kolonii od powierzchni naczynia za pomocą pipety o pojemności 200 μl, delikatnie pipetując podłoże pod spodem, aby podnieść kawałki.
   4. Przenieś wszystkie oderwane fragmenty i pożywkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
   5. Opłucz naczynie 2 ml kompletnej pożywki hiPSC, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
   6. Wirować przy 112 x g przez 1 min.
   7. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić fragmenty w 5 ml kompletnej pożywki hiPSC EB (patrz tabela materiałów).
   8. Umieść fragmenty kolonii na szalce Petriego o bardzo niskim nasadce o średnicy 60 mm (5 ml/60 mm szalka Petriego).
   9. Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
   10. Następnego dnia (dzień 1) zebrać EBs i ich pożywkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
   11. Odwirować EB przy 112 x g przez 1 minutę.
   12. Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie zawiesić EB w 5 ml kompletnej pożywki hiPSC EB za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
   13. Ponownie umieść EB na nowej szalce Petriego o bardzo niskim nasadce 60 mm (5 ml/60 mm szalka Petriego).
   14. Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ .
2. W dniu 1 pokryj naczynia macierzą błony podstawnej (np. matrigelem, zwanym dalej "matrycą standardową") lub innym odpowiednim substratem białkowym (np. lamininą).
   1. Przechowywać wzorcową matrycę (patrz tabela materiałów) w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 200 μl, używając zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i zimnych pipet o pojemności 5 lub 10 ml.
   2. Rozmrozić 200 μl wzorcowej matrycy na lodzie.
   3. Rozcieńczyć 200 μl matrycy wzorcowej w 20 ml pożywki DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:100).
   4. Tym roztworem pokryj 60-milimetrowe szalki Petriego (5 ml na szalkę).
   5. Inkubować panierowane naczynia w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Naczynia te będą używane do nakładania EB (około 50 EB/naczynie) i generowania agregatów neuroepitelialnych (rozet); Zobacz krok 2.3.
3. Wytwarzanie agregatów neuronabłonkowych (rozet) (dni 2 → 7)
   1. W dniu 2 usunąć wzorcowy roztwór powlekający matrycę z 60-milimetrowych szalek Petriego (nie ma potrzeby płukania płytek) i napełnić je 5 ml na szalkę kompletnej pożywki do indukcji neuroepitelialnej (NRI); patrz Tabela materiałów.
   2. Przenieść pływające EBs (z kroku 2.1.14) na powlekane naczynia (~50 EBs/szalkę) za pomocą pipety 200 μL pod mikroskopem stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu i umieścić w komorze laminarnej.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wybrać jednorodne, średniej wielkości EB (o średnicy ~200-300 μm). Zbyt małe EB mogą nie przetrwać dobrze podczas różnicowania neuroektodermalnego, podczas gdy zbyt duże EB mają tendencję do ulegania martwicy rdzenia.
   3. Inkubować naczynia w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   4. Dzień po (dzień 3) sprawdź naczynia pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że wszystkie EB są przymocowane.
   5. Delikatnie wykonać całkowitą wymianę pożywki z kompletnym podłożem NRI.
   6. Zmieniaj pożywkę NRI co drugi dzień do 7 dnia, kiedy powinny być widoczne agregaty neuronabłonkowe (rozety).
   7. W dniu 7 pokryć standardową matrycę (lub lamininę), jak opisano w kroku 2.2, na dowolny wymagany format płytki lub szalki: płytki 96-dołkowe (100 μl/dołek), płytki 24-dołkowe (250 μl/dołek), płytki 12-dołkowe (500 μl/dołek), wióry MEA (do aktywności elektrycznej, 1 ml/wiór jednodołkowy) lub szalki Petriego o średnicy 60 mm (4 ml/szalkę).
   8. Inkubować powlekane płytki/szalki przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Dysocjacja rozety i różnicowanie neuronalne (dni 8 → 28)
   UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji. Aby uniknąć zbierania komórek mezodermalnych i endodermalnych, należy dysocjować i zebrać tylko struktury przypominające rozetę ektodermy.
   1. W dniu 8 pokrój struktury przypominające rozetę na fragmenty pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu w sterylnych warunkach. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G. Zwróć uwagę, że rozety mają tendencję do łatwego odklejania się od naczynia po dotknięciu igłą.
   2. Zakończ odłączanie fragmentów rozety za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
   3. Przenieś naczynie pod okap z przepływem laminarnym i zbierz fragmenty rozety oraz ich podłoże do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml. Opłucz naczynie 2 ml pożywki NRI, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
   4. Wirować fragmenty rozety w odległości 112 x g przez 2 min.
   5. Odessać supernatant.
   6. Delikatnie ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x DPBS (bez wapnia i magnezu) i delikatnie pipetować fragmenty rozety w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby częściowo je oddzielić.
   7. Dodać 4 ml kompletnej pożywki NRI i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek (patrz Tabela Materiałów)
      UWAGA: Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórek w 20 μl błękitu trypanowego. Etap ten można pominąć, jeżeli komórki nie mogą zostać wprowadzone do zawiesiny jednokomórkowej. Jeśli fragmenty rozety nie wyglądają na całkowicie zdysocjowane, fragmenty rozet pochodzące z około 50 EBs/60-mm szalki można ponownie zawiesić w 50 ml kompletnej pożywki NRI i pokryć na płytkę, jak wskazano w tabeli 1.
   8. Odessać wzorcowy roztwór powlekający matrycę (lub lamininę) z szalek Petriego, płytek i/lub wiórów MEA (od kroku 2.3.7). Nie pozwól im wyschnąć.
   9. Umieść komórki w kompletnym pożywce NRI zgodnie z planem badania (około 15 000 komórek/^cm2; patrz Tabela 1 dla wskazań objętości posiewu).
   10. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   11. W dniu 10 należy przeprowadzić całkowitą zmianę pożywki przy użyciu pożywki z całkowitym różnicowaniem neuronalnym (ND); patrz Tabela Materiałów.
   12. Odświeżaj kompletną pożywkę ND dwa razy w tygodniu aż do 28 dnia.
   13. Scharakteryzuj pochodne komórek neuronalnych/glejowych, jak opisano w kroku 5 (patrz Tabela 2 dla ogólnych kryteriów akceptacji).

3. Ekspansja i różnicowanie nerwowych komórek macierzystych (NSC) pochodzących z HiPSC w mieszane neurony i glej

UWAGA: NSC pochodzące z fragmentów rozety mogą być rozbudowywane i utrzymywane zgodnie z procedurą opisaną poniżej (Rysunek 1, dolna część). Pozwala to na zwiększenie liczby komórek do różnicowania i testów chemicznych.

1. Pokryć szalkę Petriego o średnicy 60 mm (lub kolbę T-25) 5 ml roztworu powlekającego DMEM/F12 o standardowej matrycy i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (jak opisano w kroku 2.2).
2. Odwirować fragmenty rozety pochodzące z kroków 1-2 (patrz krok 2.4.) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o pojemności 112 x g przez 2 minuty.
3. Delikatnie zawiesić osad w 5 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NI); patrz Tabela Materiałów.
4. Przenieść komórki na standardową, pokrytą matrycą płytkę Petriego o średnicy 60 mm (lub kolbę T-25).
5. Hoduj NSC pochodzące z rozety w obecności pożywki NI, odświeżając pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną zbieg.
6. W przypadku konfluencji przejdź przez NSC zgodnie z opisem w poniższych krokach.
   UWAGA: Przechodź przez NSC mniej więcej raz w tygodniu; Rozważ użycie świeżo pokrytych naczyń, kolb lub talerzy, w zależności od planu studiów.
7. Usunąć całą pożywkę NI i delikatnie przepłukać NSC DPBS (bez wapnia i magnezu).
8. Dodać 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA, wstępnie ogrzanej do temperatury 37 °C, do 60-milimetrowej płytki Petriego (lub kolby T-25) zawierającej komórki i umieścić ją w inkubatorze na 1 minutę.
9. Delikatnie postukaj w naczynie (lub kolbę), aby odłączyć komórki.
10. Dodać 1,5 ml inhibitora trypsyny podgrzanego do temperatury 37 °C i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml.
11. Przepłukać szalkę Petriego (lub kolbę T-25) równą objętością pożywki NI (1,5 ml) i zebrać objętość do tej samej probówki o pojemności 15 ml.
12. Odwirować komórki przy sile 130 x g przez 3 min.
13. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki NI za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
14. Zawiesinę komórek należy następnie rozcieńczyć w 3 lub 4 ml kompletnej pożywki NI i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek.
15. Umieścić NSC na 60-milimetrowej szalce Petriego (lub kolbie T-25) z kroku 3.1 o gęstości około 50 000 komórek/^cm2.
16. Wykonuj całkowitą wymianę pożywki z pełną pożywką NI co drugi dzień.
17. Scharakteryzuj komórki pod kątem obecności pochodnych komórek neuronalnych/glejowych, jak opisano w kroku 5.
    UWAGA: NSC można różnicować w mieszane kultury neuronów i gleju w kompletnej pożywce ND (jak opisano w krokach 2.4.11-2.4.13), odświeżając kompletną pożywkę ND dwa razy w tygodniu przez 21 dni.

4. Kriokonserwacja i rozmrażanie NSC pochodzące z HiPSC

UWAGA: Po przejściu, NSC mogą być zamrożone i ponownie rozmrożone zgodnie z tą procedurą.

1. Odwirować pasażowane NSC (od kroku 3.12) przy 130 x g przez 3 min.
   UWAGA: Komórki należy policzyć w kroku 3.14.
2. Delikatnie i powoli zawiesić NSC w roztworze zamrażającym 3 x 10⁶/ml (patrz Tabela Materiałów).
3. Podwielokrotnić komórki w odpowiednich fiolkach do kriokonserwacji (około 0,5 ml = 1,5 x 10⁶ na fiolkę).
4. Umieścić fiolki w pojemniku wypełnionym 2-propanolem i umieścić pojemnik w temperaturze -80 °C na minimum 2 godziny do 2 tygodni.
5. Przenieść fiolki do fazy gazowej zbiornika z ciekłym azotem.
6. Aby ponownie uruchomić hodowlę komórkową, rozmrozić 1 zamrożoną fiolkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
7. Delikatnie zebrać komórki w 7 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki NI w probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
8. Odwirować komórki przy sile 130 x g przez 3 min.
9. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml kompletnej pożywki NI za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl.
10. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek w 3 lub 4 ml kompletnej pożywki NI i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek (uwaga: rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórek w 20 μl błękitu trypanowego; żywotność po rozmrożeniu powinna wynosić ≥ 80%).
11. Płytkę NSC na powlekanej 60-milimetrowej szalce Petriego (lub kolbie T25) o gęstości około 50 000 komórek/^cm2.

5. Charakterystyka komórek neuronalnych i glejowych pochodzących z hiPSC

UWAGA: Po różnicowaniu, pochodne neuronalne i glejowe mogą być charakteryzowane za pomocą różnych technik, takich jak te opisane w poniższych sekcjach.

1. Ilościowe analizy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)¹⁰
   1. Odwiruj fragmenty kolonii hiPSC, EB i/lub NSC w temperaturze 130 x g przez 3 minuty.
   2. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl zimnego buforu do lizy RNA dostarczonego w odpowiednim zestawie do ekstrakcji RNA.
   3. Alternatywnie, zbierz pochodne neuronalne / glejowe bezpośrednio z płytek, odsysając pożywkę i dodając zimny bufor do lizy RNA do studzienek w celu zebrania komórek.
   4. Wyizolować RNA zgodnie z instrukcją producenta.
   5. Odwrotna transkrypcja 500 ng całkowitego RNA przy użyciu odpowiedniego zestawu do retrotranskrypcji RNA do cDNA.
   6. Przeprowadzić reakcje qPCR w dwóch egzemplarzach, stosując odpowiednie zestawy mieszanek wzorcowych i starterów (patrz Tabela materiałów).
   7. Rejestruj emisję fluorescencyjną w czasie rzeczywistym: 45 cykli z wyżarzaniem starterów w temperaturze 60 °C.
   8. Znormalizuj względne ilości RNA do GAPDH i β-aktyny jako genów referencyjnych i użyj niezróżnicowanych hiPSC lub nieleczonych komórek do warunków kalibracji (metoda ΔΔCt). Alternatywnie użyj innej odpowiedniej metody.
2. Immunocytochemia i obrazowanie o wysokiej zawartości (HCI)^6,11
   1. Utrwal kolonie hiPSC, NSC i/lub pochodne neuronalne/glejowe zimnym 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Delikatnie umyj komórki w 1X PBS i przechowuj płytki w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
   3. Gdy są gotowe do barwienia, przepuszczalność komórek w buforze permeabilizacji (1x DPBS zawierający 0,1% trytonu-X-100 i 3% BSA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Usunąć bufor permeabilizacji i inkubować komórki w buforze blokującym (3% BSA/1X DPBS) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
   5. Usunąć bufor blokujący i inkubować komórki przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym zawierającym odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe (patrz tabela materiałów).
   6. Umyj komórki 3 razy za pomocą 1x PBS.
   7. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze pokojowej w buforze blokującym zawierającym przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorochromem (patrz tabela materiałów), mieszając jądra barwnikiem DAPI.
   8. Określić ilościowo średnią intensywność fluorescencji i względną zawartość procentową typów komórek, korzystając z odpowiedniej platformy do obrazowania o wysokiej zawartości, jeśli jest dostępna (patrz tabela materiałów).
      UWAGI: Aby określić poziom intensywności tła fluorescencyjnego, inkubuj niektóre komórki/studzienki z samymi przeciwciałami drugorzędowymi. Analizę cytometryczną żywych, nieustalonych, niezróżnicowanych hiPSC można przeprowadzić w celu oceny ekspresji markerów specyficznych dla PSC, takich jak SSEA4 (patrz tabela materiałów). Niezróżnicowane kolonie hiPSC można analizować pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów BCIP/NBT, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Dodatkowo można przeprowadzić testy i analizy macierzy białek z odwróconymi fazami (RPPA), zgodnie z opisem w pozycji bibliograficznej 12 (wykaz badanych przeciwciał znajduje się w Tabeli materiałów).
3. Pomiary elektrofizjologiczne¹³
   1. Płytkować zdysocjowane fragmenty rozety (po 7 DIV) lub NSC pochodzące z rozet na powlekanych matrycach wieloelektrodowych (MEA; patrz Tabela materiałów) w kompletnym podłożu ND (~1 x 10⁵ ogniw / jednodołkowy chip MEA).
   2. Różnicuj komórki przez 3 tygodnie w kompletnym pożywce ND, odświeżając pożywkę dwa razy w tygodniu.
   3. Pod koniec różnicowania uszczelnij wióry MEA półprzepuszczalną membraną pod okapem z przepływem laminarnym, aby utrzymać sterylność kultur do wielokrotnych pomiarów.
   4. Zastąp jedną z elektrod jednym odniesieniem do masy, co pozwoli na zapisy z pozostałych elektrod.
   5. Zapisać średnią szybkość wypalania (MFR; liczba skoków/min) za pomocą wzmacniacza MEA ze zintegrowanym regulatorem temperatury procesu dostosowanym do 37 °C i 5% CO₂ .
   6. Wykryj piki na podstawie surowych danych MEA, używając limitu progowego -4,7σ (σ oznacza odchylenie standardowe szumu podstawowego).
   7. Przetwarzaj dane po nagraniu za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Results

Charakterystyka niezróżnicowanych hiPSC

Aby ocenić fenotyp hiPSC, należy przeprowadzić analizę morfologii kolonii/komórki, określenie markerów specyficznych dla PSC oraz badanie ekspresji genów i aktywności fosforanów alkalicznych. Niezróżnicowane hiPSC powinny być okrągłe, z dużymi jąderkami i bez obfitej cytoplazmy. Większość kolonii powinna charakteryzować się płaską i ciasno upakowaną morfologią, wskazującą na niezróżnicowany fenotyp (Ryc. 2A i Ryc. 2B). Dodatkowo, ponad 80% kolonii powinno być dodatnich pod kątem barwienia aktywnością fosfatazy alkalicznej (Rysunek 2C).

Około 80% komórek powinno być dodatnich dla klasycznych markerów związanych z pluripotencją, takich jak Oct4, SSEA3, SSEA4 i Tra1-60 (Rysunek 2D-H), jak pokazują immunocytochemia i cytometria przepływowa, podczas gdy odsetek komórek nestin⁺ i β-III-tubuliny⁺ powinien być znacznie niski (odpowiednio około 8% i 3%, jak pokazano w Rysunek 2H)). Wyniki te powinny być powtarzalne w różnych fragmentach.

Rysunek 2. Charakterystyka niezróżnicowanych IMR90-hiPSC. (A i B) Reprezentatywne obrazy z kontrastem fazowym (powiększenia 10x i 20x) niezróżnicowanych kolonii IMR90-hiPSC. (C) reprezentatywne obrazy kolonii barwionych fosfatazą alkaliczną (powiększenie 4X). (D-F) Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne (D) Oct4 (czerwony), (E) SSEA3 (zielony) i (F) Tra1-60 (zielony). (G) Reprezentatywny wykres punktowy barwienia SSEA1 (CD15) i SSEA4, analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. (H) Wykres słupkowy pokazuje procenty komórek Oct4⁺ (~75 - 80%), Tra1-60⁺ (~75 - 80%), SSEA3⁺ (~75 - 80%), nestin⁺ (~10 - 15%) i β-III-tubulina⁺ (~3 - 7%), wybarwionych przeciwwagą DAPI i oznaczonych ilościowo HCI, ze średnią od 3 do 5 powtórzeń biologicznych ± SEM (wykres zmodyfikowany z Odniesienia 6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ocena pluripotencji za pomocą tworzenia EB

HiPSC są pluripotencjalne, co oznacza, że w odpowiednich warunkach wyrażają trzy geny związane z listkiem zarodkowym. Aby ocenić pluripotencję hiPSC, można zastosować powszechne podejście oparte na spontanicznym tworzeniu EB, które indukuje tworzenie się trzech listków zarodkowych¹⁴. Analizy genów specyficznych dla listka zarodkowego muszą wykazać zależny od czasu wzrost ekspresji genów związanych z endodermą (α-fetoproteiną (AFP) i cytokeratyną 18 (KRT18)), ektodermą (Nestin, SRY-box 1 (Sox1) i sparowaną ramką 6 (Pax6)) i mezodermą (peptyd natriuretyczny A (NPPA) i Brachyury-T) (Figura 3A i Figura 3B); patrz Tabela Materiałów.

Rysunek 3. Ocena pluripotencji na podstawie tworzenia EB. (A) Reprezentatywny obraz EB z kontrastem fazowym w dniu 1. (B) Wykres słupkowy przedstawia analizy qPCR genów mezodermalnych (NPPA i brachyury), ektodermalnych (Pax6, Sox1 i nestin) i endodermalnych (AFP i KRT18), znormalizowanych do genów referencyjnych, β-aktyny i GAPDH, i skalibrowanych do komórek niezróżnicowanych (Dzień 0). Jest to metoda ΔΔCt, ze średnią 5 niezależnych analiz ± S.E.M. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; wykres zmodyfikowany z Odnośnika 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Indukcja różnicowania neuronów i gleju

IMR90-iPSC można różnicować na mieszane kultury postmitotycznych neuronów i komórek glejowych, postępując zgodnie z krokami podsumowanymi w Rysunek 1 oraz w sekcjach protokołu. 5-8 dni po posiewie EB na standardowych naczyniach pokrytych matrycą lub lamininą w obecności kompletnego podłoża NRI, struktury przypominające rozety powinny zacząć być widoczne (Rysunek 4A). Rozety charakteryzują się obecnością komórek nestin⁺ (prekursory neuronalne, ~90%), z niewielką liczbą komórek β-III-tubuliny⁺ (zaangażowane komórki neuronalne, ~5 - 10%), te ostatnie są na ogół zlokalizowane głównie na obrzeżach rozet (Figura 4B, rozety w dniu 12).

Po dysocjacji rozety i ponownym posadzeniu na płytkach lub płytkach pokrytych lamininą lub standardową matrycą w obecności kompletnego podłoża ND, komórki zaczynają się różnicować w mieszane kultury neuronów i gleju, stopniowo tworząc skupiska ciał komórek nerwowych połączonych wiązkami neurytów (Rysunek 4C i Rysunek 4D). Podobne wyniki należy uzyskać, analizując populacje neuronów uzyskane przez rozszerzanie NSC pochodzących z rozety i różnicowanie ich w neurony i glej. NSC rozwinięte z rozet powinny być nestin⁺ (Rysunek 4E, wstawka pokazująca komórki nestin⁺).

Po 21 dniach różnicowania, komórki powinny być dodatnie dla β-III-tubuliny; NF200; Tau; i MAP2, późny marker dendrytów (Figura 4D, 4F i Figura 4H), z co najmniej 10 - 15% komórek dodatnich dla kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP), markera astroglejowego (Rysunek 4G i Rysunek 4H). Co więcej, ~20 - 30% komórek powinno zachować ekspresję gniazda po różnicowaniu (Rysunek 4H). Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że procent każdego typu komórek (tj. neuronu, astrocytu, komórek gniazdin⁺) może się różnić w zależności od pasaży i można zaobserwować zmienność zależną od użytkownika.

Analizując określone subpopulacje neuronów, neurony GABA-ergiczne stanowią ~15 - 20% wszystkich komórek, neurony dopaminergiczne ~13 - 20%, a neurony glutaminergiczne ~35 - 42%, jak wykazano za pomocą barwienia immunologicznego dla kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), hydroksylazy tyrozynowej (TH) i pęcherzykowego transportera glutaminianu 1 (VGlut1), odpowiednio (zobacz reprezentatywną kwantyfikację w Rysunek 4H). Indukcję różnicowania można również ocenić poprzez analizę markerów związanych z pluripotencją (np. Oct4, Tra1-60 i SSEA3), które powinny być znacznie obniżone w zróżnicowanych komórkach w porównaniu z niezróżnicowanymi hiPSC (nie pokazano, patrz odniesienie 6). Można to również potwierdzić poprzez analizę ekspresji genów metodą qPCR, która powinna wskazywać na spadek Oct4 i Nanog oraz regulację w górę genów neuronalnych, takich jak cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych 1 (NCAM1) i białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2); gen presynaptyczny, synaptofizyna (SYP); oraz gen postsynaptyczny, białko tau związane z mikrotubulami (MAPT), jak pokazano na Rysunek 4I. Ponadto geny związane z neuronami dopaminergicznymi (TH i NR4A1), noradrenergicznymi (PHOX2A i PHOX2B), glutaminergicznymi (NARG2, GRIA1 i GAP43), GABA-ergicznymi (GABRA1 i GABRA3), ruchowymi (ISL1 i LHX3) i cholinergicznymi (SLC5A7 i SLC18A13) powodują zwiększenie liczby komórek neuronalnych w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi (Figura 4J).

Analiza spontanicznej aktywności elektrycznej za pomocą MEA jest cennym odczytem dla oceny funkcjonalności sieci neuronalnej w zróżnicowanych hiPSC. Pod koniec okresu różnicowania, pochodne neuronów charakteryzują się na ogół średnią szybkością wypalania (MFR) wynoszącą co najmniej 60 skoków/min (patrz reprezentatywny wykres rastrowy w Rysunek 4K). Nie obserwuje się jednak rozbłysków.

Rysunek 4. Różnicowanie IMR90-hiPSC w mieszane kultury neuronów i gleju. (A i B) Reprezentatywne obrazy rozet po 7 DIV (A) i po 12 DIV (B), barwionych na gniazdo (zielony) i tubulinę β-III-tubuliny (czerwony)). (C oraz D) Reprezentatywne obrazy zróżnicowanych komórek po 22 DIV (C) i 28 DIV (D), barwione na β-III-tubulinę (czerwony) i NF200 (zielony)). (E) Reprezentatywny obraz NSC pochodzących z dysocjacji i ekspansji rozety (wstawka pokazuje komórki nestin⁺, czerwone). (F oraz G) Reprezentatywne obrazy komórek neuronalnych (F, barwione na NF200 (czerwony) i Tau (zielony)) oraz komórek glejowych (G, barwione na GFAP (czerwony)) różnicowały się od NSC (po 21 DIV). (H) Kwantyfikacja komórek nestyny, MAP2, GFAP, kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), pęcherzykowego transportera glutaminianu 1 (VGlut1) i hydroksylazy tyrozynowej (TH) -dodatnich za pomocą HCI, porównując pochodne IMR90-hiPSC i komórki zróżnicowane z NSC pochodzących z IMR90-hiPSC (wykres zmodyfikowany z odniesienia 7). (I i J) Wykresy słupkowe przedstawiające analizy qPCR genów pluripotencji (Oct4 i Nanog) i genów neuronalnych (NCAM1, MAP2, SYP i MAPT) (I) oraz genów dopaminergicznych (TH i NR4A1), noradrenergicznych (PHOX2A i PHOX2B), glutaminergicznych (NARG2, GRIA1 i GAP43), GABA-ergicznych (GABRA1 i GABRA3), neuronów ruchowych (ISL1 i LHX3) oraz genów cholinergicznych (SLC5A7 i SLC18A13) (J). Wszystkie analizy zostały znormalizowane do genów referencyjnych, β-aktyny i GAPDH, a następnie skalibrowane do niezróżnicowanych komórek (zielone paski). Jest to metoda ΔΔCt, ze średnią 5 niezależnych analiz ± S.E.M. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Wykresy w I i J zostały zmodyfikowane w stosunku do Odnośnika 6. (K) Reprezentatywny wykres rastrowy neuronów pochodzących z IMR90-NSC (zapis był prowadzony przez minimum 600 s; pionowe słupki reprezentują pojedyncze skoki). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Specyficzna sygnatura markerów neuronalnych jest regulowana w górę w zróżnicowanych IMR90-hiPSC

W nowym paradygmacie testowania toksyczności niezbędne jest zdefiniowanie molekularnych i komórkowych zdarzeń zachodzących w komórce po ekspozycji na dany środek toksyczny. Dlatego ważne jest scharakteryzowanie, które szlaki sygnałowe są aktywowane i/lub regulowane w górę w badanym modelu komórkowym.

Dostępne na rynku tablice do analizy ekspresji genów kinazy białkowej mogą być używane do porównywania niezróżnicowanych komórek hiPSC w porównaniu ze zróżnicowanymi komórkami. Zróżnicowane IMR90-hiPSC ulegają regulacji w górę genów zaangażowanych w kontrolę receptorów neurotrofiny, regulację kierowania aksonami, modulację wzrostu neurytów, receptory czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF), szlak białka morfogenetycznego kości (BMP)/TGF-beta oraz receptory płytkowego czynnika wzrostu (PDGF) (Rysunek 5A i Rysunek 5B).

Analiza RPPA pokazuje regulację w górę specyficznej sygnatury neuronalnej w zróżnicowanych IMR90-hiPSC. W szczególności szlaki sygnałowe Erk/CREB, Akt/PDK1/mTOR i Notch1 są aktywowane po różnicowaniu (Rysunek 5C).

Rysunek 5. Zróżnicowane komórki neuronalne i glejowe wykazują aktywację szlaków związanych z neuronami. (A i B) Wykresy słupkowe przedstawiają analizy qPCR kinaz związanych z neuronami (A) i innych genów związanych z kinazami (B). Dane dotyczące ekspresji genów znormalizowano do genów referencyjnych 18S i GAPDH (dostarczonych w macierzy) i skalibrowano do niezróżnicowanych komórek. W tych analizach gen został uznany za znacznie podwyższony, gdy jego ekspresja była co najmniej 2 razy wyższa niż w komórkach niezróżnicowanych (^2-ΔΔCt≥ 2); średnia z 3 niezależnych analiz przeprowadzonych ± S.E.M.). (C) Wykres słupkowy przedstawia bezwzględne kwantyfikacje białek za pomocą analizy RPPA, porównując komórki zróżnicowane (czerwone słupki) i niezróżnicowane (zielone słupki). Białka należące do tych samych kaskad szlaków sygnałowych są zgrupowane razem w następujący sposób: CREB/Erk/Akt, PDK1/mTOR/Erk/Akt, Notch1, Shh i Wnt, SAPK/JNK i BMP/SMAD. Średnia ± S.E.M. z 4 niezależnych analiz. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; wykres zmodyfikowany z Odnośnika 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Hodowle neuronów/glejów pochodzące z IMR90-hiPSC mogą być wykorzystane do oceny wpływu rotenonu

Rotenon, inhibitor kompleksu I mitochondrialnego łańcucha oddechowego, jest znany z tego, że powoduje stres oksydacyjny poprzez aktywację szlaku Nrf2. W warunkach spoczynku Nrf2 jest zakotwiczony w cytoplazmie przez Keap1 (białko 1 związane z ECH podobne do Kelcha), represor Nrf2, który ułatwia ubikwitynację i proteolizę Nrf2¹⁵. Po wywołaniu stresu oksydacyjnego Nrf2 przemieszcza się do jądra i aktywuje ekspresję docelowych genów Nrf2-ARE¹⁶.

Neurony i komórki glejowe pochodzące z IMR90-hiPSC mogą być wykorzystane do oceny wpływu rotenonu na aktywację Nrf2 poprzez wystawienie komórek na działanie różnych stężeń rotenonu (np. 1, 10 i 100 nM) przez 24 godziny. Stężenia te zostały ustalone zgodnie z wcześniejszymi badaniami^17,18.

Przy tych stężeniach i czasach ekspozycji, rotenon nie powodował cytotoksyczności, jak pokazuje kwantyfikacja żywych jąder komórkowych DAPI⁺ (Rysunek 6A). Rotenon indukował translokację jądrową Nrf2, zwłaszcza po wystawieniu komórek na działanie rotenonu 100 nM (Rysunek 6B i Rysunek 6E). Przy tym samym stężeniu zaobserwowano znaczny spadek cytoplazmatycznego Keap1 (Figura 6C), wraz ze wzrostem zarówno oksydoreduktazy chinonowej NAD(P)H 1 (NQO1), jak i sulfiredoksyny 1 (SRXN1), dwóch enzymów docelowych dla Nrf2^19,20 (Rysunek 6D).

Rysunek 6. Wpływ rotenonu na translokację jądrową Nrf2, poziomy białka Keap1, SRXN1 i NQO1. (A) Kwantyfikacja żywych komórek DAPI⁺ (tj. jąder niepiknotycznych) po 24-godzinnym traktowaniu rotenonem 1, 10, 100 nM i znormalizowanych do komórek nietraktowanych (kontrola, Ctr). (B) Translokacja jądrowa białka Nrf2 (tj. stosunek jądra do cytoplazmy) po 24 godzinach ekspozycji na rotenon, oceniana za pomocą pomiarów intensywności fluorescencji przy użyciu analizy HCI. (C) Kwantyfikacja poziomów cytoplazmatycznego białka Keap1 po podaniu działaniu rotenonu, oceniana za pomocą analizy HCI. (D) Oznaczanie ilościowe oksydoreduktazy chinonowej 1 (NQO1) i sulfiredoksyny 1 (SRXN1) za pomocą immunofluorescencji i HCI po 24 godzinach leczenia rotenonem. (E) Reprezentatywne obrazy lokalizacji białka Nrf2 (zielony). Wszystkie wartości są przedstawione jako średnia ± S.E.M. z 3 kontrprób biologicznych. * p < 0,05, ** p < 0,01; rysunek zmodyfikowany w stosunku do odnośnika 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przy tych stężeniach i czasach leczenia, rotenon spowodował również zależny od stężenia wzrost procentu komórek astroglejowych (GFAP⁺) (Rysunek 7A i Rysunek 7B), nie wpływając na proporcje NSC (nestin⁺) i neuronów (MAP2⁺) (Rysunek 7B). Patrząc na proporcje określonych podtypów neuronów, leczenie rotenonem (10 nM i 100 nM) znacznie zmniejszyło liczbę neuronów dopaminergicznych (TH⁺) (Figura 7C i D), podczas gdy procenty neuronów GABA-ergicznych (GABA⁺) i glutaminergicznego (VGlut1⁺) nie zmieniły się (Figura 7D). Analogicznie, wcześniejsze badania in vivo i in vitro opisywały zależną od rotenonu i selektywną dopaminergiczną śmierć komórek neuronalnych^21,22,23.

Rysunek 7. Wpływ rotenonu na komórki glejowe i neurony dopaminergiczne. (A) Reprezentatywne obrazy komórek GFAP⁺ (czerwone), z 40-krotnym powiększeniem we wstawkach, nieleczonych lub traktowanych rotenonem 100 nM przez 24 godziny. (B) Kwantyfikacja komórek nestin⁺, MAP2⁺ i GFAP⁺, znormalizowanych do komórek nieleczonych (kontrola, Ctr). (C) Reprezentatywne obrazy dopaminergicznych neuronów TH ⁺ (zielone), z 40-krotnym powiększeniem we wstawkach, nieleczone lub leczone rotenonem 100 nM przez 24 godziny. (D) Kwantyfikacja komórek neuronalnych GABA⁺, VGlut1⁺ i TH⁺, znormalizowanych do komórek nieleczonych (Ctr). Wszystkie wartości są przedstawione jako średnia ± S.E.M. z 3 kontrprób biologicznych. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; rysunek zmodyfikowany w stosunku do odnośnika 7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Istotność statystyczna została oceniona za pomocą jednoczynnikowego ANOVA z Wielokrotnym Testem Porównawczym Dunnetta jako test końcowy (porównujący wszystkie kolumny z kolumną kontrolną)²⁴ lub za pomocą dwustronnego niesparowanego lub sparowanego testu t, w zależności od rodzaju analizy. Wszystkie dane reprezentują średnią z co najmniej trzech kontrprób biologicznych ± błędem standardowym średniej (S.E.M.). Gwiazdka nad paskiem wskazuje na istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Tabela 1.
Uwaga dotycząca gęstości posiewu rozety zdysocjowanej: jeśli fragmenty rozety nie wyglądają na całkowicie zdysocjowane, w celu osiągnięcia gęstości posiewu komórek około 15 000 komórek/cm², zdysocjowane fragmenty rozet pochodzące z około 50 EB / 1 x szalka 60 mm mogą być ponownie zawieszone w 50 ml kompletnego podłoża NRI i posiane w następujący sposób (w zależności od formatu płytki):

Płytki wielodołkowe / MEA	Obszar wzrostu (cm2 / studzienka)	Objętość zawiesiny komórek na płytkę na dołek (lub chip MEA)	Maksymalna liczba płytek, które można posiać (z 50 ml zawiesiny komórek)
96 studni	0,3	100 ul	5
48 studni	0,7	220 ul	4
24 dołki	cyfra arabska	625 ul	3
12 studni	4	Pojemność 1,25 ml	3
6 dołków	10	3,125 ml	cyfra arabska
Pojedynczy dołek MEA	3,5	1,1 ml	Rozdział 45

Tabela 2: Kryteria akceptacji

)

Marker / Przeciwciało	Procent (na komórkach DAPI+ (na żywo)) po 28 DIV
B-III-tubulina (Tuj1)	35-45%
MAP2	50-60%
Klasa NF200	45-55%
GFAP (Protokół GFAP	10-25%
Gniazdo	15-25%

Discussion

W niniejszej pracy opisano solidny i stosunkowo szybki protokół różnicowania IMR90-hiPSC w neurony postmitotyczne i komórki glejowe. Wcześniej opublikowane protokoły różnicowania neuronów oparte na hESC i hiPSC zwykle dają wysoki odsetek prekursorów neuronalnych^25,26 i znaczną liczbę neuronalnych komórek docelowych 27,28,29,30,31,32,33. Analogicznie, opisany tutaj protokół różnicowania jest odpowiedni do generowania heterogenicznych kultur komórek neuronalnych GABA-ergicznych, glutaminergicznych i dopaminergicznych, wraz z glejem i dyskretną proporcją komórek nestin⁺. Obecność komórek nerwowych glutaminergicznego (~35-42%) i GABAergicznego (~15-20%) sugeruje, że kultura ta posiada przodomózgowie, cechy podobne do kory mózgowiowej, a obecność dyskretnej liczby neuronów dopaminergicznych (~13-20%) może również wskazywać na specyficzność śródmózgowia. Dodatkowo, trwałość skromnej proporcji komórek nestin⁺ może okazać się odpowiednia do badania neurogenezy i możliwego wpływu substancji chemicznych na NSC, które są głównie ograniczone zarówno do hipokampa, jak i strefy podkomorowej (SVZ) przodomózgowia³⁴. Dalsze analizy immunocytochemiczne i ekspresji genów pomogłyby lepiej określić regionalną specyficzność zróżnicowanych pochodnych komórek.

Dwa najbardziej krytyczne etapy w protokole różnicowania opisanym w niniejszym dokumencie to: (i) cięcie kolonii hiPSC na jednorodne fragmenty (co ma kluczowe znaczenie dla wytwarzania EB o jednorodnych rozmiarach) oraz (ii) cięcie struktur neuroektodermalnych (rozet) w celu różnicowania NSC, co wymaga znacznych umiejętności manualnych i precyzji, aby uniknąć pobierania komórek mezodermalnych i endodermalnych, które mogą zmniejszyć proporcje neuronów i komórek glejowych uzyskanych po różniczkowanie.

Kluczowe znaczenie ma scharakteryzowanie fenotypów komórek podczas ekspansji (jako niezróżnicowanych kolonii lub NSC) oraz podczas wszystkich etapów różnicowania. W szczególności profile ekspresji genów i białek pochodnych komórek neuronalnych/glejowych powinny wykazywać regulację w górę i aktywację szlaków sygnałowych związanych z neuronami, podczas gdy ekspresja markerów pluripotencji powinna być zmniejszona.

Generowanie EB i pochodnych neuroektodermalnych (rozet) może być trudne manualnie i podatne na zmienność. Z tego powodu opracowaliśmy protokół ekspansji NSC pochodzących z rozety i ich dalszego różnicowania w komórki neuronalne/glejowe.

Możliwymi ograniczeniami tego protokołu różnicowania są głównie (i) stosunkowo niski odsetek zróżnicowanych pochodnych gleju oraz (ii) brak dojrzałych funkcji sieci neuronalnej (na co wskazuje brak impulsów). Co więcej, określone subpopulacje astrocytów mogą funkcjonować jako pierwotni pregentorzy lub NSC³⁵. Chociaż w tej zróżnicowanej hodowli komórkowej nie zaobserwowano podwójnie dodatnich komórek nestyny/GFAP (dane nie pokazane), przypuszcza się, że komórki GFAP ⁺ w tych mieszanych kulturach są astrocytami progenitorowymi i astrocytami. Jest prawdopodobne, że wydłużając czas różnicowania, liczba astrocytów może wzrosnąć, a ich morfologia może stać się bardziej dojrzała, na co wskazują już wcześniejsze prace z grupy^{Zhanga 36,37}.

W nowym paradygmacie badania toksyczności wiedza na temat wywołanych chemikaliami zaburzeń szlaków biologicznych ma ogromne znaczenie przy ocenie przeciwności chemicznych. W związku z tym systemy badań in vitro powinny być w stanie powiązać niekorzystne skutki z zakłóceniami szlaków sygnałowych, zgodnie z koncepcją ścieżki niepożądanych skutków (AOP). Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon może być wykorzystany do oceny aktywacji szlaku Nrf2, który bierze udział w obronie komórkowej przed stresem oksydacyjnym lub elektrofilowym³⁸, a stres oksydacyjny jest ważnym i powszechnym kluczowym zdarzeniem w różnych AOP istotnych dla neurotoksyczności rozwojowej i dorosłej³⁹.

Rotenon powinien wywołać aktywację szlaku Nrf2, co można wykazać poprzez translokację jądrową białka Nrf2 i zwiększoną ekspresję enzymów docelowych Nrf2, w tym NQO1 i SRXN1. Stwierdzono, że rotenon indukuje zależny od dawki wzrost poziomu białka GFAP, co wskazuje na aktywację astrocytów^40,41. Rotenon zmniejsza również liczbę komórek dopaminergicznych (TH⁺), co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami in vitro i in vivo wykazującymi zależną od rotenonu śmierć komórek dopaminergicznych, ponieważ ten typ neuronów jest szczególnie wrażliwy na stres oksydacyjny 21,22,23.

Podsumowując, ten model hodowli neuronów i komórek glejowych pochodzący z hiPSC jest cennym narzędziem do oceny neurotoksycznych skutków substancji chemicznych, które wywołują stres oksydacyjny powodujący aktywację szlaku Nrf2. Ponieważ ten protokół różnicowania pozwala na generowanie mieszanych kultur komórek neuronalnych (neuronów GABA-ergicznych, dopaminergicznych i glutaminergicznych) i astrocytów, może okazać się odpowiedni do badania przesłuchów między neuronami a glejem w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne (np . Choroba Parkinsona). Co więcej, obecność znacznej części NSC może pomóc w ocenie możliwego wpływu substancji chemicznych na progenitory nerwowe, o których wiadomo, że są głównym celem mutacji indukowanych chemicznie lub infekcji wirusowych⁴².

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium Stem	Cell Technologies	05851	(krok 1.2.6). Kompletny mTeSR1 jest stabilny, gdy jest przechowywany w temperaturze 2 - 8 stopni; C do 2 tygodni. 5x Suplementy mogą być dozowane do porcji roboczych i przechowywane w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Zamrożone porcje należy zużyć w ciągu 3 miesięcy.
mTeSR1 5x Suplementy	Stem Cell Technologies	05852
Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix	Corning	354277	1:100 (krok 1.1). Rozmrozić Matrigel na lodzie, przygotować 200 μ L i przechowywać je w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Do powlekania rozcieńczyć 200 μ L podwielokrotność w 20 ml pożywki DMEM/F12.
CryoStem Freezing Medium	Stemgent	01-0013-50	Zamrażanie ~ 100 fragmentów/250 μ L / fiolka (krok 1.2.1)
< silny> Nazwa< / silny>	Firma< / silny>	Numer katalogowy	Komentarze< / silny>
hiPSC EB średni:< / silny>
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	(Krok 2.1.7)
Zamiennik surowicy do nokautowania ( KOSR)	Thermo-Fisher	10828-028	20% stężenie końcowe (krok 2.1.7)
Aminokwasy endogenne	Thermo-Fisher	11140-035	(Krok 2.1.7)
Penicylina/Streptomycyna	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/ml stężenie końcowe (krok 2.1.7)
L-glutamina 200 mM roztwór	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM stężenie końcowe (krok 2.1.7)
β-Merkaptoetanol	Thermo-Fisher	31350-010	50 &mikro; Końcowe stężenie M (krok 2.1.7)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kompletny środek do indukcji neuroepitelialnej (NRI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Krok 2.3.1)
Aminokwasy endogenne	Thermo-Fisher	11140-035	(krok 2.3.1)
Suplement N2	Thermo-Fisher	17502-048	(krok 2.3.1)
Penicylina / Streptomycyna	Thermo-Fisher	15140-122	50 U / ml stężenie końcowe (etap 2.3.1)
Heparyna klasa I-A, ≥ 180 jednostek USP/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 i mikro; g / ml końcowe stężenie (krok 2.3.1)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	20 ng / ml końcowe stężenie dodane przed użyciem (krok 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	1:100 (krok 2.2). Rozmrozić Matrigel na lodzie, przygotować 200 μ L i przechowywać je w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Do powlekania rozcieńczyć 200 μ L podwielokrotność w 20 ml zimnego podłoża DMEM/F12.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (krok 2.2). Rozcieńczyć w PBS 1x.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium	Thermo-Fisher	21103049	(Krok 2.4.11)
Suplementy B-27 (50x)	Thermo-Fisher	17504044	(Krok 2.4.11)
Suplement N2	Thermo-Fisher	17502-048	(Krok 2.4.11)
Penicylina/Streptomycyna	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/ml stężenie końcowe (Krok 2.4.11)
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	1 ng/ml stężenie końcowe. Dodano przed użyciem. (Krok 2.4.11)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	stężenie końcowe 2,5 ng/ml. Dodano przed użyciem. (Krok 2.4.11)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże do indukcji neuronów (NI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Krok 3.3)
Aminokwasy endogenne	Thermo-Fisher	11140-035	(Krok 3.3)
Suplement N2	Thermo-Fisher	17502-048	(Krok 3.3)
Penicylina / Streptomycyna	Thermo-Fisher	15140-122	50 U / ml Końcowe stężenie (Krok 3.3)
Heparyna Stopień I-A, ≥ 180 jednostek USP/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 i mikro; g / ml końcowe stężenie (krok 3.3)
Suplement B-27 (50 razy), bez witaminy A	Thermo-Fisher	12587010	(krok 3.3)
L-glutamina 200 mM roztwór	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM stężenie końcowe (krok 3.3)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	10 ng / ml stężenie końcowe. Dodano przed użyciem (krok 3.3)
EGF	Thermo-Fisher	PHG6045	stężeniu końcowym 10 ng/ml. Dodano przed użyciem (Krok 3.3)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	stężenie końcowe 2,5 ng/ml. Dodano przed użyciem (Krok 3.3)
Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)	Thermo-Fisher	R007-100	Wstępnie podgrzany w temperaturze 37 & stopni C. Dodaj równą ilość DTI do Trypsin-EDTA (Krok 3.10)
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej	Thermo-Fisher	15400054	1:10. Rozcieńczyć Trypsynę-EDTA w PBS 1x (bez wapnia i magnezu), wstępnie podgrzać roztwór w temperaturze 37 °; C (Krok 3.8)
Pożywka do kriokonserwacji komórek CryoStor	Sigma-Aldrich	C2874-100ML(	Krok 4.2)
Trypan Blue (0,4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	wielu producentów / dostawców
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
TaqMan Zestawy sond i odczynniki do analizy ekspresji genów:
RNAqueous-Micro kit	Thermo-Fisher	AM1931	(Step 5.1.6)
Zestawy do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	Thermo-Fisher	4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo-Fisher	4369016
GFAP	Thermo-Fisher	Hs00909233_m1
MAP2	Thermo-Fisher	Hs00258900_m1
NQO1	Thermo-Fisher	Hs02512143_s1
SRXN1	Thermo-Fisher	Hs00607800_m1
HMOX1	Thermo-Fisher	Hs01110250_m1
GSR	Thermo-Fisher	Hs00167317_m1
PAX6	Thermo-Fisher	Hs01088112_m1
NES	Thermo-Fisher	Hs00707120_s1
GRIA1	Thermo-Fisher	Hs00181348_m1
GAP43	Thermo-Fisher	Hs00967138_m1
GABRA3	Thermo-Fisher	Hs00968132_m1
GABRA1	Thermo-Fisher	Hs00168058_m1
NR4A2	Thermo-Fisher	Hs00428691_m1
TH	Thermo-Fisher	Hs00165941_m1
GAPDH	Thermo-Fisher	Hs02758991_g1
ACTB	Thermo-Fisher	Hs99999903_m1
MAPT	Thermo-Fisher	Hs00902194_m1
SYP	Thermo-Fisher	Hs00300531_m1
NANOG	Thermo-Fisher	Hs04260366_g1
POU5F1 (PAŹ 4)	Thermo-Fisher	Hs04195369_s1
SOX1	Thermo-Fisher	Hs01057642_s1
AFP	Thermo-Fisher	Hs00173490_m1
KRT18	Thermo-Fisher	Hs01941416_g1
NPPA	Thermo-Fisher	Hs00383230_g1
T	Thermo-Fisher	Hs00610080_m1
NCAM1	Thermo-Fisher	Hs00941821_m1
NR4A1	Thermo-Fisher	Hs00374226_m1
PHOX2A	Thermo-Fisher	Hs00605931_mH
PHOX2B	Thermo-Fisher	Hs00243679_m1
NARG2	Thermo-Fisher	Hs00973298_g1
SLC18A3	Thermo-Fisher	Hs00268179_s1
SLC5A7	Thermo-Fisher	Hs00222367_m1
ISL1	Thermo-Fisher	Hs00158126_m1
LHX3	Thermo-Fisher	Hs01033412_m1
TaqMan Matryca kinaz białkowych	Thermo-Fisher	4418721
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Uwagi
Przeciwciała i odczynniki do barwienia immunologicznego:
B-III-tubulina (Tuj1)	Covance	MMS-435P	1:500 (krok 5.2.5). Można również stosować inne przeciwciała.
MAP2	Sigma Aldrich	M4403	1:500
NF200	Sigma Aldrich	N4142	1:1000
GFAP	Acris Antibodies GmbH	AP02002SU-N	1:500
Nestin	Sigma-Aldrich	N5413	1:200
synaptofizyna (SYN)	Abcam	AB14692	1:200
Tau	Thermo-Fisher	MA5-12808	1:100
Nrf2	Abcam	AB62352	1:200
Keap1	Abcam	AB66620	1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1)	Abcam	AB92298	1:200
NAD(P)H oksydoreduktaza chinonowa 1 (NQO1)	Abcam	AB2346	1:200
OCT4	milipory	MAB4401	1:100
SSEA3	milipory	MAB4303	1:100
Tra1-60	Milipore	MAB4360	1:250
Hydroksylaza tyrozyny (TH)	Milipora	AB152	1:200
Kwas gamma-aminomasłowy (GABA)	Sigma-Aldrich	A0310	1:100
Pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (VGlut1)	Abcam	AB72311	1:500
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148-500G	4% (4% Można również stosować formaldehyd)
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo-Fisher	14190144
Triton-X-100 Roztwór	Sigma-Aldrich	93443-100ML	0,1%
BSA 35%	Sigma-Aldrich	A7979-50ML	3,5%
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko królikowi IgG (H + L), koniugat DyLight 594	Thermo-Fisher	SA5-10040	1:500. (Krok 5.2.7) Można również stosować inne przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorochromem. W takim przypadku odpowiednie rozcieńczenia powinny zostać przetestowane przez użytkownika końcowego.
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko myszemu IgG (H + L), koniugat DyLight 488	Thermo-Fisher	SA5-10166	1:500
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko kozom IgG (H + L), koniugat DyLight 488	Thermo-Fisher	SA5-10086	1:500
Roztwór DAPI (1 mg / ml)	Thermo-Fisher	62248	1:1000 (krok 5.2.7)
Nazwa	Company	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciała dla macierzy białek odwróconej fazy (RPPA):
4E-BP1 (S65)	Abcam	AB81297	1:250 (Uwaga po kroku 5.2.8)
Akt (T308)	Sygnalizacja komórkowa	9275	1:100
Akt (S473)	Sygnalizacja komórkowa	9271	1:100
AMPKalpha (T172)	Sygnalizacja komórkowa	2531	1:100
AMPKbeta1 (S108)	Sygnalizacja komórkowa	4181	1:100
ATF-2 (T71)	Sygnalizacja komórkowa	9221	1:100
C-JUN (S63)	Sygnalizacja komórkowa	9261	1:200
C-JUN (S73)	Sygnalizacja komórkowa	9164	1:200
c-Kit (Y719)	Sygnalizacja komórkowa	3391	1:250
CREB (S133)	Sygnalizacja komórkowa	9191	1:100
EGFR (Y1068)	Sygnalizacja komórkowa	2234	1:50
ErbB2/HER2 (Y1248)	Sygnalizacja komórkowa	2247	1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204)	Sygnalizacja komórkowa	9101	1:2000
GSK-3alpha (S21)	Sygnalizacja komórkowa	9337	1:50
Jak1 (Y1022/1023)	Sygnalizacja komórkowa	3331	1:100
Lck (Y505)	Sygnalizacja komórkowa	2751	1:500
LKB1 (S428)	Sygnalizacja komórkowa	3051	1:100
mTOR (S2448)	Sygnalizacja komórkowa	5536	1:100
NFkB p65 (S536)	Sygnalizacja komórkowa	3031	1:50
p70 Kinaza S6 (T389)	Sygnalizacja komórkowa	9205	1:200
PDK1 (S241)	Sygnalizacja komórkowa	3061	1:100
PKA C (T197)	Sygnalizacja komórkowa	4781	1:250
PRAS40 (T246)	BioSource	44-1100	1:2000
PTEN (S380)	Sygnalizacja komórkowa	9551	1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428)	Sygnalizacja komórkowa	9511	1:500
Src (Y527)	Sygnalizacja komórkowa	2105	1:500
Rodzina Src (Y416)	Sygnalizacja komórkowa	2101	1:200
Stat1 (Y701)	Sygnalizacja komórkowa	9171	1:200
Stat3 (S727)	Sygnalizacja komórkowa	9134	1:200
Zap-70 (Y319)	Enogene	E011159	1:100
β Katenina (S33/37/T41)	Sygnalizacja komórkowa	9561	1:250
CREB	Upstate Biotechnologies	06-863	1:100
Sygnalizacja komórkowa Fos B		2251	1:200
Sygnalizacja komórkowa	GRB2	3972	1:2000
HSP70	Stressgen	SPA-810	1:100
Sygnalizacja komórkowa	c-jun	9165	1:100
Kip1 / p27	BD	610241	1:100
Sygnalizacja komórkowa	Lck	2984	1:250
Sygnalizacja komórkowa	Mcl-1	4572	1:80
Sygnalizacja komórkowa	Musashi	2154	1:100
Sygnalizacja komórkowa	NOTCH1	3439	1:100
Sygnalizacja komórkowa	PTEN	9552	1:500
SGK1	Abnova	PAB4590	1:250
Sygnalizacja komórkowa	Zap-70	2705	1:250
β-Catenin	Abcam	AB32572	1:1000
Dll4	Abcam	AB7280	1:500
Shh	Abcam	AB53281	1:250
HIF-1&alfa;	BD	610958	1:50
NUMB PAN-ISO	Upstate Biotechnologies	07-207	1:400
NUMB-L	Chemicon	AB15145	1:750
Cyklina B	BD	610220	1:75
c-Myc	Calbiochem	OP-10	1:100
Zestaw BCIP/NBT	Thermo-Fisher	002209	(Uwaga po kroku 5.2.8). Zestaw służy do pomiaru aktywności fosfatazy alkalicznej, można stosować podobne zestawy.
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	>Komentarze
Przeciwciała do cytometrii przepływowej:
SSEA1 Przeciwciało, koniugat Pacific Blue	Thermo-Fisher	MHCD1528	1:100 (Uwaga po kroku 5.2.8)
Przeciwciało SSEA4 (MC813-70), Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	SSEA421	1:100
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Specyficzne instrumenty, narzędzia i oprogramowanie:
Można zastosować automatyczny licznik komórek Countess	Thermo-Fisher	C10227	Komora Neubauera lub inny odpowiedni hemocytometr szklany.
MEA1060-Inv-BC	Systemy wielokanałowe	MEA1060-Inv-BC	(krok 5.3)
MEA1060-BC oprogramowanie sterujące	Systemy wielokanałowe	MEA1060-BC(	krok 5.3)
Systemy wielokanałowe	NeuroExplorer (NE)	(krok 5.3) Do przetwarzania końcowego danych MEA
Matryce wieloelektrodowe (MEA)	Systemy wielokanałowe	60MEA100/10iR-Ti-gr	(krok 5.3) Jednodołkowy chip MEA
ArrayScan XTI High Content Platform	Thermo-Fisher	ASN00002P	(Krok 5.2.8) Średnią fluorescencję można określić ilościowo przy użyciu określonych algorytmów ArrayScan (np. Bioaplikacje Cytotoksyczność V.4 i NucTrans V.4). Zaleca się wykonanie co najmniej 20 zdjęć / studnię i wykonanie 7-8 wewnętrznych powtórzeń na warunek
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	Thermo-Fisher	4351405	(krok 5.1.6)
Strzykawka do insuliny BD ULTRA-THIN (z igłą 30G)	BD	328280	(kroki 1.3.1, 2.1.2 i 2.4.1)
StemPro EZPassage Jednorazowe narzędzie do pasowania komórek macierzystych	ThermoFisher	23181010	To narzędzie do cięcia kolonii może być używane jako alternatywa dla użycia strzykawek 30G z igłą 1 ml (Krok 1.3.1)
Szalka Petriego z ultra-niską nasadką (60 mm)	Corning	10010582	(Krok 2.1.8) Można również użyć innych marek.
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania	Sigma-Aldrich	C1562-1EA