Artykuł metodologiczny

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

25.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55702

⸱

9 czerwca 2017

 ,  ,  , 
1Directorate F - Health, Consumers and Reference Materials, Joint Research Centre

W tym artykule

Podsumowanie

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek, które mogą być stosowane do testów toksyczności in vitro na ludziach. Jedną z głównych zalet jest to, że przeprogramowanie komórek somatycznych w celu wytworzenia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pozwala uniknąć problemów etycznych i legislacyjnych związanych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Komórki HiPSC mogą być namnażane i skutecznie różnicowane w różne typy komórek nerwowych i glejowych, służąc jako systemy testowe do badania toksyczności, a w szczególności do oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność. W pracy opisano protokół różnicowania hiPSC w mieszane kultury komórek neuronalnych i glejowych. Zdefiniowano szlaki sygnałowe, które są regulowane i/lub aktywowane przez różnicowanie neuronów. Informacje te mają kluczowe znaczenie dla zastosowania modelu komórkowego do nowego paradygmatu badania toksyczności, w którym substancje chemiczne są oceniane na podstawie ich zdolności do zakłócania szlaków biologicznych. Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon, inhibitor mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, został wykorzystany do oceny aktywacji szlaku sygnałowego Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmu obrony komórkowej przed stresem oksydacyjnym napędzanego przez element odpowiedzi przeciwutleniającej (ARE).

Wprowadzenie

Raport Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Stanów Zjednoczonych1 przewidział nowy paradygmat testowania toksyczności, w którym regulacyjne testy toksyczności zostałyby zmienione z podejścia polegającego na zmianach fenotypowych obserwowanych u zwierząt na podejście skupiające się na mechanistycznych testach in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek. Pochodne pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) mogą stanowić alternatywę dla modeli komórek nowotworowych, ponieważ uzyskane komórki mogą bardziej przypominać warunki fizjologiczne tkanek ludzkich i dostarczać bardziej odpowiednich narzędzi do badania niepożądanych skutków wywołanych chemikaliami. Dwa główne typy kultur PSC, które są najbardziej obiecujące do badań toksyczności, to ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które są obecnie szeroko stosowane w obszarach badań podstawowych i medycyny regeneracyjnej2,3. Wiedza ta może być teraz wykorzystana do opracowania nowej klasy badań toksykologicznych in vitro, których celem jest identyfikacja zaburzonych szlaków fizjologicznych związanych z rozwojem niekorzystnych skutków in vivo. Jest jednak mało prawdopodobne, aby metody badawcze do regulacyjnej oceny bezpieczeństwa oparte na hESC były akceptowane przez wszystkie państwa członkowskie UE i kraje na całym świecie ze względu na możliwe obawy etyczne i zróżnicowane krajowe polityki legislacyjne regulujące wykorzystanie komórek pochodzących z zarodków.

hiPSCs mają cechy podobne do hESCs4,5 i mają duży potencjał dla metod in vitro, zarówno do identyfikacji celów terapeutycznych, jak i do oceny bezpieczeństwa. Ponadto technologia hiPSC łagodzi ograniczenia związane z ograniczoną pulą dawców oraz obawy etyczne związane z komórkami pochodzącymi z zarodków. Głównym wyzwaniem dla hiPSC jest wykazanie, że komórki te mogą w sposób powtarzalny wytwarzać znaczny zakres istotnych z toksykologicznego punktu widzenia pochodnych komórkowych, o cechach i reakcjach typowych dla tkanek ludzkich. Predefiniowane poziomy wybranych markerów są zazwyczaj wykorzystywane do charakteryzowania populacji komórek po procesie różnicowania oraz do zapewnienia wglądu w stabilność procesu różnicowania.

Poprzednie prace oceniały przydatność hiPSC do generowania mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych oraz do oceny wpływu rotenonu, inhibitora mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, na aktywację szlaku Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmów obrony przed antyoksydantami w wielu typach komórek6,7.

Ta praca opisuje protokół używany do różnicowania hiPSC na mieszane kultury neuronalne i glejowe, dostarczając szczegółów na temat szlaków sygnałowych (poziom genów i białek), które są aktywowane podczas różnicowania neuronalnego/glejowego. Ponadto praca przedstawia reprezentatywne wyniki pokazujące, w jaki sposób ten model komórek neuronalnych i glejowych pochodzący z hiPSC może być wykorzystany do oceny aktywacji sygnalizacji Nrf2 indukowanej ostrym (24-godzinnym) leczeniem rotenonem, co pozwala na ocenę indukcji stresu oksydacyjnego.

IMR90 fibroblasty zostały przeprogramowane na hiPSC w I-Stem (Francja) przez wirusową transdukcję 2 czynników transkrypcyjnych (Oct4 i Sox2) przy użyciu wektorów pMIG6. Można również zastosować analogiczne modele hiPSC. Opisane poniżej protokoły podsumowują wszystkie etapy różnicowania się hiPSC w nerwowe komórki macierzyste (NSC), a następnie w mieszane hodowle postmitotycznych neuronów i komórek glejowych (kroki 1 i 2, szczegółowy opis protokołu można znaleźć również na stronie internetowej EURL ECVAM DBALM)8.

Dodatkowy protokół do izolacji, ekspansji, krioprezerwacji i dalszego różnicowania NSC na mieszane neurony i komórki glejowe jest szczegółowo opisany w krokach 3 i 4 (zobacz również na stronie EURL ECVAM DBALM w celu szczegółowego opisu tego protokołu)9. Krok 5 opisuje analizy, które można przeprowadzić, aby ocenić tożsamość fenotypową komórek podczas kilku etapów zaangażowania i różnicowania.

Protokół

1. Ekspansja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)

UWAGA: hiPSC można hodować na odpowiednim podłożu z mieszanki białek w obecności pożywki mTeSR1 zawierającej suplementy mTeSR1 5x (przygotowane zgodnie z instrukcjami producenta; wysiewać ok. 10 fragmentów kolonii na szalkę Petriego 60 mm). Gdy kolonie hiPSC osiągną odpowiednią wielkość (przykład kolonii przedstawiono na Rysunku 2A), należy przeprowadzić pasażowanie komórek zgodnie z poniższym opisem (raz w tygodniu).

  1. Pokrycie naczyń macierzą błony podstawnej zakwalifikowaną dla hESC (dalej nazywaną „macierzą zakwalifikowaną”) lub innym odpowiednim podłożem białkowym.
    1. Przechowywać macierz zakwalifikowaną (patrz Tabela materiałów) w temperaturze -80 °C w alikwotach po 200 µL w schłodzonych probówkach 1,5 mL oraz schłodzonych pipetach 5 lub 10 mL.
    2. Przed pasażowaniem rozmrozić 20 µL macierzy zakwalifikowanej na lodzie.
    3. Rozcieńczyć 20 µL macierzy zakwalifikowanej w 20 mL pożywki DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:10).
    4. Pokryć szalki Petriego o średnicy 60 mm tym roztworem (5 mL/szalka).
    5. Inkubować pokryte naczynia w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h.
  2. Kriokonserwacja i rozmrażanie fragmentów kolonii hiPSC
    1. Po pocięciu kolonii hiPSC (patrz krok 1.3 w celu poznania procedury cięcia kolonii hiPSC), delikatnie i powoli resuspendować fragmenty kolonii hiPSC w pożywce do zamrażania komórek macierzystych, ok. 10 fragmentów/250 µL (patrz Tabela materiałów).
    2. Rozdzielić fragmenty kolonii do odpowiednich fiolek do kriokonserwacji (250 µL/fiolka).
    3. Umieścić fiolki w pojemniku wypełnionym 2-propanolem i pozostawić pojemnik w temperaturze -80 °C przez minimum 2 h, maksymalnie do 2 tygodni.
    4. Przenieść fiolki do fazy parowej zbiornika z ciekłym azotem.
    5. Aby wznowić hodowlę, rozmrozić 1 zamrożoną fiolkę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
    6. Delikatnie zebrać fragmenty kolonii hiPSC w 7 mL uprzednio ogrzanej pełnej pożywki dla hiPSC (patrz Tabela materiałów) do probówki 15 mL, używając pipety 1, 2 lub 5 mL.
    7. Wirować fragmenty kolonii hiPSC przy 130 x g przez 3 min.
    8. Usunąć supernatant i delikatnie resuspendować fragmenty kolonii hiPSC w 1 mL pełnej pożywki dla hiPSC, używając pipety 1, 2 lub 5 mL.
    9. Dalej rozcieńczyć zawiesinę komórkową w 3 lub 4 mL pełnej pożywki dla hiPSC.
    10. Wysiać fragmenty kolonii hiPSC do szalki Petriego o średnicy 60 mm pokrytej macierzą zakwalifikowaną (~10 fragmentów/szalka; pokryć naczynia zgodnie z opisem w kroku 1.1).
    11. Inkubować hiPSC w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    12. Codziennie przeprowadzać całkowitą wymianę pożywki.
  3. Pasażowanie kolonii hiPSC
    UWAGA: Niezróżnicowane hiPSC powinny mieć okrągły kształt, duże jąderka i mało cytoplazmy. Kolonie niezróżnicowane powinny charakteryzować się płaską i ciasno upakowaną morfologią. Do dalszego pasażowania należy wycinać tylko kolonie niezróżnicowane (o średnicy ok. 1 mm).
    1. Pociąć kolonie komórek macierzystych na kwadraty o wymiarach ok. 20 µm x 20 µm, używając strzykawki 1 mL z igłą 30G lub innych dostępnych handlowo narzędzi (patrz Tabela materiałów). Użyć mikroskopu stereoskopowego z powiększeniem 4x w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.
    2. Odczepić fragmenty kolonii z powierzchni naczynia za pomocą pipety 20-µL, delikatnie pipetując pożywkę pod fragmentami, aby je unieść.
    3. Przenieść fragmenty kolonii (~10 sztuk) na płytkę pokrytą macierzą zakwalifikowaną-DMEM/F12, wypełnioną 4 mL pełnej pożywki dla hiPSC (patrz Tabela materiałów; pokryć naczynia zgodnie z opisem w kroku 1.1).
    4. Inkubować nową płytkę (płytki) w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    5. Codziennie przeprowadzać całkowitą wymianę pożywki i kontrolować morfologię kolonii za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego przy powiększeniach 4X i 10X.

2. Różnicowanie hiPSC w mieszane neurony i glej

UWAGA: Procedura trwa około 28 dni, a jej główne etapy przedstawiono na Rysunku 1 (część górna).

różnicowanie hiPSC w neurony/glej; schemat; mikroskopia procesu różnicowania IMR90-hiPSC w neurony.
Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie protokołu różnicowania neuronalnego. (Górna część) Kolonie IMR90-hiPSC można pociąć na fragmenty w celu utworzenia ciała embrioidalnego (EB). Po 2 dniach in vitro (DIV), ciałka inkluzyjne (EBs) można wysiać na płytki pokryte lamininą lub standardową macierzą i hodować w obecności medium do indukcji neuroepithelialnej (NRI), aby uzyskać pochodne neuroektodermalne (rozetki, tutaj zabarwione na nestynę (zielony) i β-III-tubulinę (czerwony)). Rozetki można zdysocjować, zebrać, ponownie wysiać na płytki pokryte lamininą lub standardową macierzą i dalej różnicować w dojrzałe komórki neuronalne (NF20, czerwony) i glejowe (GFAP, zielony) w obecności medium do różnicowania neuronalnego (ND). (Dolna część) NSCs pochodzące z rozetek (nestyna, czerwony) mogą być namnażane w obecności medium do indukcji neuronalnej (NI), kriokonserwowane lub dalej różnicowane w obecności medium ND w celu utworzenia mieszanych kultur neuronalnych (NF20, zielony) i glejowych (GFAP, czerwony). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Generowanie ciałek zarodkowych (EBs) (Dzień 0 → 1)
    UWAGA: Procedura ta wymaga dużej sprawności manualnej i precyzji. Fragmenty kolonii hiPSC powinny być równej wielkości, aby w kolejnych krokach uzyskać jednorodne ciałka zarodkowe (EBs). Kolonie zróżnicowane morfologicznie (z dużymi frakcjami cytoplazmatycznymi i małymi jąderkami) należy odrzucić.
    1. Odświeżyć medium hiPSC (3 mL/60-mm szalka Petriego) przed pocięciem niezdiferencjowanych kolonii hiPSC (o średnicy około 1 mm, patrz Rysunek 2A) w warunkach sterylnych (zgodnie z opisem w kroku 1).
    2. Pociąć niezdiferencjowane kolonie (jak pokazano na Rysunku 2A i Rysunku 2B) na fragmenty o wymiarach około 20 µm x 20 µm, używając strzykawki 1-mL z igłą 30G. Użyć mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 4X w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.
    3. Oddzielić fragmenty kolonii od powierzchni szalki za pomocą pipety 20-µL, delikatnie pipetując medium pod spód, aby unieść fragmenty.
    4. Przenieść wszystkie oddzielone fragmenty wraz z medium do probówki 15-mL za pomocą pipety 1, 2 lub 5 mL.
    5. Przepłukać szalkę 2 mL kompletnego medium hiPSC, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
    6. Wirować przy 12 x g przez 1 min.
    7. Odssać supernatant i delikatnie resuspendować fragmenty w 5 mL kompletnego medium hiPSC EB (patrz Tabela Materiałów).
    8. Przenieść fragmenty kolonii na 60-mm szalkę Petriego o ultra-niskiej adhezji (5 mL/60-mm szalka Petriego).
    9. Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    10. Następnego dnia (Dzień 1) zebrać EBs wraz z medium do probówki 15 mL za pomocą pipety 1, 2 lub 5 mL.
    11. Wirować EBs przy 112 x g przez 1 min.
    12. Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie resuspendować EBs w 5 mL kompletnego medium hiPSC EB za pomocą pipety 1, 2 lub 5 mL.
    13. Ponownie przenieść EBs na nową 60-mm szalkę Petriego o ultra-niskiej adhezji (5 mL/60 mm szalka Petriego).
    14. Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. W Dniu 1 pokryć szalki macierzą błony podstawnej (np. matrigel, dalej określaną jako „macierz standardowa”) lub innym odpowiednim podłożem białkowym (np. lamininą).
    1. Przechowywać macierz standardową (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze -80 °C w alikwotach 20-µL, używając schłodzonych probówek 1,5 mL oraz schłodzonych pipet 5 lub 10 mL.
    2. Rozmrozić 20 µL macierzy standardowej na lodzie.
    3. Rozcieńczyć 20 µL macierzy standardowej w 20 mL medium DMEM/F12 (rozcieńczenie 1:10).
    4. Pokryć 60-mm szalki Petriego tym roztworem (5 mL/szalka).
    5. Inkubować pokryte szalki w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Szalki te zostaną użyte do wysiania EBs (około 50 EBs/szalka) i generowania agregatów neuroepithelialnych (rozet); patrz krok 2.3.
  3. Generowanie agregatów neuroepithelialnych (rozet) (Dni 2 → 7)
    1. W Dniu 2 usunąć roztwór pokrywający z macierzy standardowej z 60-mm szalek Petriego (nie ma potrzeby płukania płytek) i wypełnić je 5 mL/szalka kompletnego medium do indukcji neuroepithelialnej (NRI); patrz Tabela Materiałów.
    2. Przenieść pływające EBs (z kroku 2.1.14) na pokryte szalki (~50 EBs/szalka) za pomocą pipety 20 µL pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 4x, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      UWAGA: Kluczowe jest wybranie jednorodnych EBs o średniej wielkości (~20-30 µm średnicy). Zbyt małe EBs mogą nie przetrwać prawidłowo podczas różnicowania neuroektodermalnego, natomiast zbyt duże EBs mają tendencję do przechodzenia w nekrozę rdzenia.
    3. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    4. Dzień później (Dzień 3) sprawdzić szalki pod mikroskopem przy powiększeniu 10x, aby upewnić się, że wszystkie EBs przywarły do powierzchni.
    5. Przeprowadzić delikatną całkowitą wymianę medium na kompletne medium NRI.
    6. Wymieniać medium NRI co drugi dzień aż do dnia 7, kiedy powinny stać się widoczne agregaty neuroepithelialne (rozety).
    7. W Dniu 7 nanieść macierz standardową (lub lamininę), zgodnie z opisem w kroku 2.2, na wymagany format płytek lub szalek: płytki 96-dołkowe (10 µL/dołek), płytki 24-dołkowe (250 µL/dołek), płytki 12-dołkowe (50 µL/dołek), chipy MEA (do pomiaru aktywności elektrycznej, 1 mL/chip jednodołkowy) lub 60-mm szalki Petriego (4 mL/szalka).
    8. Inkubować pokryte płytki/szalki przez co najmniej 2 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  4. Dysocjacja rozet i różnicowanie neuronalne (Dni 8 → 28)
    UWAGA: Procedura ta wymaga dużej sprawności manualnej i precyzji. Aby uniknąć zebrania komórek mezodermalnych i endodermalnych, należy dysocjować i zbierać wyłącznie ektodermalne struktury przypominające rozety.
    1. W Dniu 8 pociąć struktury przypominające rozety na fragmenty pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 10X w warunkach sterylnych. Użyć strzykawki 1 mL z igłą 30G. Należy zauważyć, że rozety mają tendencję do łatwego odrywania się od szalki przy dotknięciu igłą.
    2. Dopełnić oddzielanie fragmentów rozet za pomocą pipety 20-µL.
    3. Przenieść szalkę pod wyciąg z laminarnym przepływem powietrza i zebrać fragmenty rozet wraz z medium do stożkowatej probówki 15 mL za pomocą pipety 1, 2 lub 5 mL. Przepłukać szalkę 2 mL medium NRI, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
    4. Odwirować fragmenty rozet przy 12 x g przez 2 min.
    5. Odssać supernatant.
    6. Delikatnie resuspendować osad w 1 mL 1x DPBS (bez wapnia i magnezu) i delikatnie pipetować fragmenty rozet w górę i w dół za pomocą pipety 10-µL, aby częściowo je zdysocjować.
    7. Dodać 4 mL kompletnego medium NRI i policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu oraz automatycznego licznika komórek (patrz Tabela Materiałów)
      UWAGA: Rozcieńczyć 20 µL zawiesiny komórkowej w 20 µL błękitu trypanu. Ten krok można pominąć, jeśli nie uda się uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek. Jeśli fragmenty rozet nie wyglądają na całkowicie zdysocjowane, fragmenty pochodzące z około 50 EBs/szalka 60-mm można resuspendować w 50 mL kompletnego medium NRI i wysiać, zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 1.
    8. Odssać roztwór pokrywający z macierzy standardowej (lub lamininy) z szalek Petriego, płytek i/lub chipów MEA (z kroku 2.3.7). Nie dopuścić do ich wyschnięcia.
    9. Wysiać komórki w kompletnym medium NRI zgodnie z planem badania (około 15 0 komórek/cm2; patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji o objętościach wysiewu).
    10. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    11. W Dniu 10 przeprowadzić całkowitą wymianę medium na kompletne medium do różnicowania neuronalnego (ND); patrz Tabela Materiałów.
    12. Odświeżać kompletne medium ND dwa razy w tygodniu aż do Dnia 28.
    13. Przeprowadzić charakterystykę pochodnych komórek neuronalnych/glejowych, zgodnie z opisem w kroku 5 (patrz Tabela 2 w celu sprawdzenia ogólnych kryteriów akceptacji).

3. Ekspansja neuronalnych komórek macierzystych (NSC) pochodzących z HiPSC oraz ich różnicowanie w mieszane neurony i glej

UWAGA: NSC pochodzące z fragmentów rozet mogą być namnażane i utrzymywane zgodnie z procedurą opisaną poniżej (Rysunek 1, część dolna). Pozwala to na zwiększenie liczby komórek do celów różnicowania i testów chemicznych.

  1. Poczekaj 60-mm czarenkę Petriego (lub kolbę T-25) 5 mL standardowym roztworem powlekającym DMEM/F12 i inkubuj przez co najmniej 2 h w 37 °C i 5% CO2 (zgodnie z opisem w kroku 2.2).
  2. Odwiruj fragmenty rozet uzyskane w krokach 1-2 (patrz krok 2.4.) w stożkowej probówce 15 mL przy 12 x g przez 2 min.
  3. Kawałkami resuspenduj osad w 5 mL pożywki do indukcji neuronalnej (NI); patrz Tabelę Materiałów.
  4. Przenieś komórki na standardową czarenkę Petriego 60 mm (lub do kolby T-25) powleczoną macierzą.
  5. Hoduj NSCs pochodne z rozet w obecności pożywki NI, wymieniając pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną konfluencję.
  6. Po osiągnięciu konfluencji pasażuj NSCs zgodnie z opisem w poniższych krokach.
    UWAGA: Pasażuj NSCs około raz w tygodniu; rozważ użycie świeżo powlekanych czarenek, kolb lub płytek, w zależności od planu badania.
  7. Usuń kompletną pożywkę NI i delikatnie wypłucz NSCs za pomocą DPBS (bez wapnia i magnezu).
  8. Dodaj 1,5 mL 0,05% trypsyny-EDTA uprzednio ogrzanej do 37 °C do 60-mm czarenki Petriego (lub kolby T-25) zawierającej komórki i umieść ją w inkubatorze na 1 min.
  9. Delikatnie opukaj czarenkę (lub kolbę), aby odkleić komórki.
  10. Dodaj 1,5 mL inhibitora trypsyny uprzednio ogrzanego do 37 °C i przenieś komórki do probówki 15 mL.
  11. Wypłucz czarenkę Petriego (lub kolbę T-25) równą objętością pożywki NI (1,5 mL) i zbierz tę objętość do tej samej probówki 15 mL.
  12. Odwiruj komórki przy 130 x g przez 3 min.
  13. Usuń supernatant i delikatnie resuspenduj komórki w 1 mL kompletnej pożywki NI za pomocą pipety 1 0-µL.
  14. Dalej rozcieńcz zawiesinę komórkową w 3 lub 4 mL kompletnej pożywki NI i policz komórki przy użyciu błękitu trypanu oraz automatycznego licznika komórek.
  15. Wysiej NSCs na 60-mm czarenkę Petriego (lub do kolby T-25) z kroku 3.1 z gęstością około 50 0 komórek/cm2.
  16. Wykonuj całkowitą wymianę pożywki na kompletną pożywkę NI co drugi dzień.
  17. Zcharakteryzuj komórki pod kątem obecności pochodnych komórek neuronalnych/glejowych, zgodnie z opisem w kroku 5.
    UWAGA: NSCs mogą być różnicowane w mieszane kultury neuronów i gleju w kompletnej pożywce ND (zgodnie z opisem w krokach 2.4.1-2.4.13), odświeżając kompletną pożywkę ND dwa razy w tygodniu przez 21 dni.

4. Kriokonserwacja i rozmrażanie NSC pochodzących z HiPSC

UWAGA: Po pasażowaniu NSCs można zamrozić i ponownie rozmrozić zgodnie z poniższą procedurą.

  1. Odwiruj pasażowane NSC (z kroku 3.12) przy 130 x g przez 3 min.
    UWAGA: Komórki należy policzyć w kroku 3.14.
  2. Ostrożnie i powoli resuspenduj komórki NSC w stężeniu 3 x 106/ml medium do zamrażania (patrz w Tabela materiałów).
  3. Przenieś komórki w odpowiednich dawkach (alikvotach) do probówek przystosowanych do kriokonserwacji (około 0,5 ml = 1,5 x 106/fiolka).
  4. Umieść fiolki w naczyniu wypełnionym 2-propanolem i umieść naczynie w temperaturze -80 °C przez minimum 2 h i do 2 tygodni.
  5. Przenieść probówki do fazy gazowej zbiornika z ciekłym azotem.
  6. Aby wznowić hodowlę komórkową, rozmrozić jedną zamrożoną fiolkę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.
  7. Ostrożnie przenieś komórki do probówki 15-ml zawierającej 7 ml uprzednio ogrzanego kompletnego medium NI, używając pipety o objętości 100-µL pipeta
  8. Wirować komórki przy 130 x g przez 3 min.
  9. Usunąć supernatant i delikatnie resuspendować komórki w 1 ml pełnej pożywki NI, używając końcówki 10-µL pipeta
  10. Dalsze rozcieńczenie zawiesiny komórkowej należy przeprowadzić w 3 lub 4 ml kompletnej pożywki NI, a następnie policzyć komórki z użyciem błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek (uwaga: rozcieńczenie 20 µL zawiesiny komórkowej w 20 µL błękitu trypanowego; żywotność po rozmrożeniu powinna wynosić ≥ 80%).
  11. Wysiać NSC w pokrytej szalkę Petriego o średnicy 60 mm (lub do kolby T25) z gęstością około 50 00 komórek/cm²2.

5. Charakterystyka neuronów i komórek glejowych pochodzących z hiPSC

UWAGA: Po różnicowaniu pochodne neuronalne i glejowe można scharakteryzować przy użyciu różnych technik, takich jak te opisane w następnych sekcjach.

  1. Analizy ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)10
    1. Odwiruj fragmenty kolonii hiPSC, ciała embryoidalne (EB) i/lub komórki macierzyste neuronów (NSC) przy 130 x g przez 3 min.
    2. Resuspenduj osad komórkowy w 10 µL zimnego buforu do lizy RNA dostarczonego w odpowiednim zestawie do ekstrakcji RNA.
    3. Alternatywnie, pobierz pochodne neuronalne/glejowe bezpośrednio z płytek poprzez odessanie medium i dodanie zimnego buforu do lizy RNA do studni w celu zebrania komórek.
    4. Wyizoluj RNA zgodnie z instrukcją producenta.
    5. Przeprowadź odwrotną transkrypcję 50 ng całkowitego RNA za pomocą odpowiedniego zestawu do retrotranskrypcji RNA na cDNA.
    6. Wykonaj reakcje qPCR w duplikacie, używając odpowiedniego master mixu i zestawów starterów (patrz Tabela materiałów).
    7. Rejestruj emisję fluorescencji w czasie rzeczywistym: 45 cykli z przyłączaniem starterów w temperaturze 60 °C.
    8. Znormalizuj względne ilości RNA względem genów referencyjnych GAPDH i β-actin i użyj niezróżnicowanych hiPSC lub komórek niepoddanych działaniu czynników w celu kalibracji warunków (metoda ΔΔCt). Alternatywnie, zastosuj inną odpowiednią metodę.
  2. Immunocytochemia i obrazowanie wysokotreściowe (HCI)6,1
    1. Utrwal kolonie hiPSC, NSC i/lub pochodne neuronalne/glejowe w zimnej 4% parafomaldehydzie przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Delikatnie przemyj komórki w 1X PBS i przechowuj płytki w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.
    3. Przed barwieniem przeprowadź permeabilizację komórek w buforze do permeabilizacji (1x DPBS zawierający 0,1% triton-X-10 i 3% BSA) przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    4. Usuń bufor do permeabilizacji i inkubuj komórki w buforze blokującym (3% BSA/1X DPBS) przez 15 min w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.
    5. Usuń bufor blokujący i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym zawierającym odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe (patrz Tabela materiałów).
    6. Przemyj komórki 3 razy 1x PBS.
    7. Inkubuj komórki przez 45 min w temperaturze pokojowej w buforze blokującym zawierającym przeciwciała wtórne sprzężone z fluorochromem (patrz Tabela materiałów), barwiąc przeciwbarwą jądra za pomocą barwnika DAPI.
    8. Ilościowo określ średnią intensywność fluorescencji i względne procenty typów komórek, korzystając z odpowiedniej platformy do obrazowania wysokotreściowego, jeśli jest dostępna (patrz Tabela materiałów).
      UWAGI: Aby określić poziom intensywności tła fluorescencyjnego, inkubuj część komórek/studni z samymi przeciwciałami wtórnymi. Analizę cytometryczną przepływową żywych (nieutrwalonych), niezróżnicowanych hiPSC można przeprowadzić w celu oceny ekspresji markerów specyficznych dla PSC, takich jak SSEA4 (patrz Tabela materiałów). Kolonie niezróżnicowanych hiPSC można analizować pod kątem aktywności fosfatazy alkalicznej przy użyciu komercyjnie dostępnych zestawów BCIP/NBT, zgodnie z instrukcjami producentów (patrz Tabela materiałów). Dodatkowo można przeprowadzić analizy i testy metodą macierzy białek w odwróconej fazie (RPPA), jak opisano w punkcie 12 (listę przetestowanych przeciwciał można znaleźć w Tabela materiałów).
  3. Pomiary elektrofizjologiczne13
    1. Wysiej dysocjowane fragmenty rozetek (po 7 DIV) lub NSC pochodzące z rozetek na powlekane matryce wieloelektrodowe (MEA; patrz Tabela materiałów) w kompletnym medium ND (~1 x 105 komórek/pojedynczy chip MEA).
    2. Różnicuj komórki przez 3 tygodnie w kompletnym medium ND, odświeżając medium dwa razy w tygodniu.
    3. Pod koniec różnicowania uszczelnij chipy MEA półprzepuszczalną membraną pod laminarnym dyfuzorem, aby zachować sterylność kultur podczas powtarzanych pomiarów.
    4. Zastąp jedną z elektrod elektrodą odniesienia (masą), co umożliwi rejestrację z pozostałych elektrod.
    5. Zarejestruj średnią częstotliwość wyładowań (MFR; liczba impulsów/min) za pomocą wzmacniacza MEA zintegrowaną kontrolą temperatury ustawioną na 37 °C i 5% CO2.
    6. Wykrywaj piki z surowych danych MEA, stosując próg limitu -4,7σ (σ oznacza odchylenie standardowe szumu bazowego).
    7. Przetwórz dane po rejestracji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Wyniki

Charakteryzacja niezróżnicowanych hiPSC

Aby ocenić fenotyp hiPSC, należy przeprowadzić analizę morfologii kolonii/komórek, oznaczenie markerów specyficznych dla PSC oraz badanie ekspresji genów i aktywności fosfatazy alkalicznej. Nieróżnicowane hiPSC powinny być okrągłe, z dużymi jąderkami i bez obfitej cytoplazmy. Większość kolonii powinna charakteryzować się płaską i gęstą morfologią, co świadczy o nieróżnicowanym fenotypie (Rycyna 2A i Rycyna 2B). Ponadto ponad 80% kolonii powinno być pozytywnych w barwieniu na aktywność fosfatazy alkalicznej (Rycyna 2C).

Około 80% komórek powinno być pozytywnych pod kątem klasycznych markerów związanych z pluripotencją, takich jak Oct4, SSEA3, SSEA4 i Tra1-60 (Ryc. 2D-H), co wykazano w badaniu immunocytochemicznym i cytometrycznym, podczas gdy odsetek komórek nestin+ i β-III-Tubulin+ powinien być znacząco niski (odpowiednio około 8% i 3%, jak pokazano na Ryc. 2H). Wyniki te powinny być powtarzalne w kolejnych pasażach.

Charakterystyka komórek macierzystych; obrazy mikroskopowe z barwieniem Oct4, SSEA3, Tra1-60; wykres cytometrii przepływowej i DAPI.
Rysunek 2. Charakterystyka niezróżnicowanych iPSCs z linii IMR90. (A i B) Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym (powiększenia 10X i 20X) niezróżnicowanych kolonii IMR90-hiPSC. (C) reprezentatywne obrazy kolonii barwionych na fosfatazę alkaliczną (powiększenie 4X). (D-F) Reprezentatywne obrazy immunocytochemiczne przedstawiające (D) Oct4 (czerwony), (E) SSEA3 (zielony), oraz (F) Tra1-60 (zielony). (G) Reprezentatywny wykres kropkowy barwienia SSEA1 (CD15) i SSEA4, analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. (H) Wykres słupkowy przedstawia wartości procentowe Oct4+ (~75 - 80%), Tra1-60+ (~75 - 80%), SSEA3+ (~75 - 80%), nestyna+ (~10 - 15%) oraz β-III-tubulina+ (~3 - 7%) komórek, poddanych barwieniu kontrastowym DAPI i ilościowo określonych za pomocą HCI, ze średnią z 3 do 5 powtórzeń biologicznych ± S.E.M. (wykres zmodyfikowany na podstawie publikacji 6). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ocena pluripotencji poprzez tworzenie ciał embrynoidalnych (EB)

hiPSC są pluripotencjalne, co oznacza, że w odpowiednich warunkach wykazują ekspresję genów związanych z trzema warstwami zarodkowymi. W celu oceny pluripotencji hiPSC można zastosować powszechną metodę opartą na spontanicznym tworzeniu ciałek zarodkowych (EB), co indukuje powstanie trzech warstw zarodkowych.14Analizy genów specyficznych dla poszczególnych warstw zarodkowych muszą wykazywać zależny od czasu wzrost ekspresji genów związanych z endodermą (α-fetoproteina (AFP) i cytokeratyna 18 (KRT18)), ektodermą (nestyna, SRY-box 1 (Sox1) i paired box 6 (Pax6)) oraz mezodermą (natriuretyczny peptyd A (NPPA) i Brachyury-T) (Rycina 3A i Rysunek 3B); patrz na Tabela materiałów.

Obraz mikroskopowy tworzenia ciałek zarodkowych oraz wykres słupkowy ekspresji mRNA przedstawiający etapy różnicowania.
Rysunek 3. Ocena pluripotencji poprzez tworzenie ciał embrioidalnych (EB). (A) Reprezentatywny obraz w kontraście fazowym ciał embrioidalnych (EB) w 1. dniu. (B) Wykres słupkowy przedstawia analizy qPCR genów mezodermalnych (NPPA i brachyury), ektodermalnych (Pax6, Sox1 i nestina) oraz endodermalnych (AFP i KRT18), znormalizowane względem genów referencyjnych, β-aktyny i GAPDH, i skalibrowane do niezdiferencjonowanych komórek (dzień 0). Zastosowano metodę ΔΔCt, przyjmując średnią z 5 niezależnych analiz ± błąd standardowy średniej (S.E.M.). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,01; wykres zmodyfikowany na podstawie źródła 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Indukcja różnicowania neuronalnego i glejowego

Komórki IMR90-iPSCs można zróżnicować do mieszanych kultur postmitotycznych neuronów i komórek glejowych zgodnie z krokami przedstawionymi na Rysunku 1 oraz w sekcjach protokołu. Od 5 do 8 dni po wysianiu ciałek zarodkowych (EB) na standardowe płytki pokryte macierzą lub lamininą w obecności kompletnego medium NRI powinny zacząć pojawiać się widoczne struktury przypominające rozetki (Rysunek 4A). Rozetki charakteryzują się obecnością komórek nestin+ (prekursory neuronalne, ~90%) oraz niewielką liczbą komórek β-III-tubulin+ (zróżnicowane komórki neuronalne, ~5 - 10%), przy czym te ostatnie są zazwyczaj zlokalizowane głównie na obwodzie rozetek (Rysunek 4B, rozetki w 12. dniu).

Po dysocjacji rozet i ponownym wysianiu na naczyniach lub płytkach powlekanych lamininą lub standardową macierzą w obecności kompletnego medium ND, komórki zaczynają różnicować się w mieszane kultury neuronów i glii, stopniowo tworząc skupiska ciał komórek neuronalnych połączonych pęczkami neurytów (Rysunek 4C i Rysunek 4D). Podobne wyniki należy uzyskać podczas analizy populacji neuronalnych otrzymanych poprzez ekspansję NSC pochodzących z rozet i ich różnicowanie w neurony oraz glię. NSC wyhodowane z rozet powinny być nestin+ (Rysunek 4E, wstawka przedstawiająca komórki nestin+).

Po 21 dniach różnicowania komórki powinny być pozytywne pod kątem β-III-tubuliny, NF20, Tau oraz MAP2, który jest późnym markerem dendrytów (Rysunek 4D, 4F i Rysunek 4H), przy czym co najmniej 10 - 15% komórek powinno być pozytywnych pod kątem kwaśnego białka włókienistego glii (GFAP), będącego markerem astroglialnym (Rysunek 4G i Rysunek 4H). Ponadto około 20 - 30% komórek powinno zachować ekspresję nestyny po różnicowaniu (Rysunek 4H). Należy wziąć pod uwagę, że odsetek każdego typu komórek (t.j. neuronów, astrocytów, komórek nestin+) może różnić się w zależności od pasażu, a obserwowana może być zmienność zależna od użytkownika.

Analiza specyficznych subpopulacji neuronalnych wykazuje, że neurony GABAergiczne stanowią ~15 - 20% wszystkich komórek, neurony dopaminergiczne ~13 - 20%, a neurony glutamatergiczne ~35 - 42%, co potwierdzono odpowiednio poprzez barwienie immunocytochemiczne na kwas gamma-aminomaślanowy (GABA), tyrozynową hydroksylazę (TH) oraz pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (VGlut1) (reprezentatywną analizę ilościową przedstawiono na Ryc. 4H). Indukcję różnicowania można również ocenić poprzez analizę markerów związanych z pluripotencją (np. Oct4, Tra1-60 i SSEA3), których ekspresja powinna być znacznie obniżona w komórkach zróżnicowanych w porównaniu z niezróżnicowanymi hiPSC (nie pokazano, patrz Odnośnik 6). Można to również potwierdzić poprzez analizę ekspresji genów metodą qPCR, która powinna wskazywać na spadek poziomu Oct4 i Nanog oraz zwiększenie ekspresji genów neuronalnych, takich jak cząsteczka adhezyjna komórek neuronalnych 1 (NCAM1) i białko 2 związany z mikrotubulami (MAP2); genu presynaptycznego, synaptofizyny (SYP); oraz genu postsynaptycznego, białka tau związanego z mikrotubulami (MAPT), jak pokazano na Ryc. 4I. Ponadto geny związane z neuronami dopaminergicznymi (TH i NR4A1), noradrenergicznymi (PHOX2A i PHOX2B), glutamatergicznymi (NARG2, GRIA1 i GAP43), GABAergicznymi (GABRA1 i GABRA3), motorycznymi (ISL1 i LHX3) oraz cholinergicznymi (SLC5A7 i SLC18A13) wykazują zwiększoną ekspresję w komórkach neuronalnych w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi (Ryc. 4J).

Analiza spontanicznej aktywności elektrycznej za pomocą MEA stanowi cenny odczyt pozwalający ocenić funkcjonalność sieci neuronalnej w zróżnicowanych hiPSC. Pod koniec okresu różnicowania pochodne neuronalne charakteryzują się zazwyczaj średnią częstotliwością wyładowań (MFR) na poziomie co najmniej 60 spikes/min (patrz reprezentacyjny wykres rastrowy na Rysunku 4K). Nie obserwuje się jednak obecności serii wyładowań (bursts).

Schemat różnicowania neuronalnego, immunofluorescencja wykazująca markery komórkowe, wykresy słupkowe, analiza danych.
Rycina 4. Różnicowanie hiPSC linii IMR90 w mieszane hodowle neuronów i gleju. (A i B) Reprezentatywne obrazy rozetek po 7 dniach in vitro (DIV) (A) i po 12 dniach in vitro (DIV) (B), barwionych pod kątem nestyny (zielony) i β-III-tubuliny (czerwony)). (C i D) Reprezentatywne obrazy zróżnicowanych komórek po 2 dniach od in vitro (DIV) (C) oraz 28 DIV (D), barwionych przeciwciałami przeciwko β-III-tubulinie (czerwony) oraz NF200 (zielony)). (E) Reprezentatywny obraz komórek NSC pochodzących z dysocjacji i ekspansji rozetek (wstawka przedstawia nestynę)+ komórki, czerwone). (F i G) Reprezentatywne obrazy komórek neuronalnych (F, barwionych pod kątem NF20 (czerwony) i Tau (zielony)) oraz komórki glejowe (G, barwione na GFAP (czerwone)) zróżnicowane z NSC (po 21 DIV). (H) Ilościowe oznaczenie komórek wykazujących ekspresję nestyny, MAP2, GFAP, kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), pęcherzykowego transportera glutaminianu 1 (VGlut1) oraz hydroksylazy tyrozynowej (TH) za pomocą HCI, z porównaniem pochodnych IMR90-hiPSC oraz komórek zróżnicowanych z NSC pochodnych IMR90-hiPSC (wykres zmodyfikowany z odniesienia 7). (I i J) Wykresy słupkowe przedstawiające analizy qPCR genów pluripotencji (Oct4 i Nanog) oraz genów neuronalnych (NCAM1, MAP2, SYP i MAPT) (I) oraz genów związanych z systemem dopaminergicznym (TH i NR4A1), noradrenergicznym (PHOX2A i PHOX2B), glutaminergicznym (NARG2, GRIA1 i GAP43), GABAergicznym (GABRA1 i GABRA3), neuronami ruchowymi (ISL1 i LHX3) oraz cholinergicznym (SLC5A7 i SLC18A13) (J)Wszystkie analizy znormalizowano względem genów referencyjnych, β-actin i GAPDH, i skalibrowano do komórek niezróżnicowanych (zielone słupki). Zastosowano metodę ΔΔCt, przyjmując średnią z 5 niezależnych analiz ± błąd standardowy średniej (S.E.M.). * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0.01. Wykresy w częściach I i J zostały zmodyfikowane na podstawie źródła 6. (K) Reprezentatywny wykres rastrowy neuronów pochodnych z linii IMR90-NSC (rejestracja trwała minimum 60 s; pionowe słupki reprezentują pojedyncze impulsy). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Specyficzny zestaw markerów neuronalnych ulega nadekspresji w zróżnicowanych IMR90-hiPSCs

W nowym paradygmacie badań toksyczności kluczowe jest zdefiniowanie zdarzeń molekularnych i komórkowych zachodzących w komórce po ekspozycji na dany toksykant. W związku z tym istotne jest określenie, które szlaki sygnalizacyjne zostają aktywowane i/lub wykazują zwiększoną ekspresję w badanym modelu komórkowym.

Do porównania niezróżnicowanych hiPSC z komórkami zróżnicowanymi można wykorzystać dostępne komercyjnie macierze do analizy ekspresji genów kinaz białkowych. Zróżnicowane IMR90-hiPSC wykazują zwiększoną ekspresję genów zaangażowanych w kontrolę receptorów neurotrofin, regulację prowadzenia aksonów, modulację wzrostu neurytów, receptory czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF), szlak białka morfogenetycznego kości (BMP)/TGF-beta oraz receptory czynnika wzrostu pochodzenia płytek krwi (PDGF) (Rycina 5A oraz Rycina 5B).

Analiza RPPA wykazuje nadekspresję specyficznej sygnatury neuronalnej w zróżnicowanych IMR90-hiPSCs. W szczególności, szlaki sygnałowe Erk/CREB, Akt/PDK1/mTOR oraz Notch1 ulegają aktywacji podczas różnicowania (Rycina 5C).

wykres macierzy kinaz białkowych i białek fosforylowanych dla komórek neuronalnych IMR90; ekspresja mRNA, analiza szlaków, różnicowanie.
Rycina 5. Zróżnicowane komórki neuronalne i glejowe wykazują aktywację szlaków związanych z neuronami. (A i B) Wykresy słupkowe przedstawiają wyniki analiz qPCR kinaz związanych z neuronami (A) or inne geny związane z kinazami (B)Dane dotyczące ekspresji genów znormalizowano względem genów referencyjnych 18S i GAPDH (dołączonych do macierzy) i skalibrowano do niezróżnicowanych komórek. W tych analizach gen uznano za istotnie nadmiernie eksprimowany, gdy jego ekspresja była co najmniej 2-krotnie wyższa niż w niezróżnicowanych komórkach (2-ΔCt≥ 2); średnia z 3 niezależnych analiz ± błąd standardowy średniej (S.E.M.)). (C) Wykres słupkowy przedstawia absolutną kwantyfikację białek za pomocą analizy RPPA, porównując komórki zróżnicowane (słupki czerwone) i niezróżnicowane (słupki zielone). Białka należące do tych samych kaskad szlaków sygnałowych zostały zgrupowane w następujący sposób: CREB/Erk/Akt, PDK1/mTOR/Erk/Akt, Notch1, Shh i Wnt, SAPK/JNK oraz BMP/SMAD. Średnia ± BŁ.S. z 4 niezależnych analiz. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,01; wykres zmodyfikowany na podstawie źródła 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Kultury neuronalne i glejowe pochodne od IMR90-hiPSC mogą być wykorzystane do oceny efektów działania rotenonu

Rotenon, inhibitor kompleksu I mitochondrialnego łańcucha oddechowego, jest znany z wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez aktywację ścieżki Nrf2. W warunkach spoczynku Nrf2 jest zakotwiczony w cytoplazmie przez Keap1 (białko 1 podobne do Kelch powiązane z ECH), represor Nrf2, który ułatwia ubikwitynację i proteolizę Nrf215. Po indukcji stresu oksydacyjnego Nrf2 przemieszcza się do jądra komórkowego i aktywuje ekspresję genów docelowych Nrf2-ARE16.

Neurony i komórki glejowe pochodzące z linii IMR90-hiPSC mogą być wykorzystane do oceny wpływu rotenonu na aktywację Nrf2 poprzez poddanie komórek działaniu różnych stężeń rotenonu (np. 1, 10 i 100 nM) przez 24 h. Stężenia te ustalono na podstawie wcześniejszych badań17,18.

Przy tych stężeniach i czasach ekspozycji rotenon nie wywołał cytotoksyczności, co potwierdzono poprzez kwantyfikację żywych jąder komórkowych DAPI+ (Rysunek 6A). Rotenon indukował translokację jądrową Nrf2, szczególnie po poddaniu komórek działaniu 10 nM rotenonu (Rysunek 6B oraz Rysunek 6E). Przy tym samym stężeniu zaobserwowano znaczący spadek poziomu cytoplazmatycznego Keap1 (Rysunek 6C), wraz ze wzrostem poziomu zarówno reduktazy chinonowej 1 NAD(P)H (NQO1), jak i sulfiredoksyny 1 (SRXN1), dwóch enzymów będących celami Nrf219,20 (Rysunek 6D).

Wpływ rotenonu na szlak Nrf2/Keap1 w komórkach; wyniki wykresu słupkowego i mikroskopii fluorescencyjnej.
Rysunek 6. Wpływ rotenonu na translokację jądrową Nrf2 oraz poziomy białek Keap1, SRXN1 i NQO1. (A) Ilościowe oznaczenie żywych komórek barwionych DAPI+ komórki (tj. jąder niepiknotycznych) po 24-godzinnej ekspozycji na rotenon w stężeniach 1, 10, 10 nM i znormalizowano do komórek nieleczonych (Kontrola, Ctr). (B) translokacja jądrowa białka Nrf2 (t. j. stosunki jądrowe/cytoplazmatyczne) po 24 h ekspozycji na rotenon, oceniane poprzez pomiary intensywności fluorescencji z wykorzystaniem analizy HCI. (C) Ilościowe oznaczenie poziomu białka Keap1 w cytoplazmie po zastosowaniu rotenonu, ocenione za pomocą analizy HCI. (D) Ilościowe oznaczenie dehydrogenazy chinonowej 1 (NQO1) oraz sulfiredoksyny 1 (SRXN1) za pomocą immunofluorescencji i HCI po 24 h traktowania rotenonem. (E) Reprezentatywne obrazy lokalizacji białka Nrf2 (kolor zielony). Wszystkie wartości przedstawiono jako średnią ± S.E.M. z 3 powtórzeń biologicznych. * p < 0,05, ** p < 0,01; rysunek zmodyfikowany na podstawie literatury 7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przy tych stężeniach i czasie traktowania rotenon wywołał również zależny od stężenia wzrost odsetka komórek astroglialnych (GFAP+) (Rycina 7A i Rycina 7B), nie wpływając na proporcje NSC (nestin+) i neuronów (MAP2+) (Rycina 7B). Analiza proporcji specyficznych podtypów neuronów wykazała, że traktowanie rotenonem (10 nM i 10 nM) znacząco zmniejszyło liczbę neuronów dopaminergicznych (TH+) (Rycina 7C i D), podczas gdy odsetki neuronów GABAergicznych (GABA+) i glutamatergicznych (VGlut1+) nie uległy zmianie (Rycina 7D). Analogicznie, wcześniejsze badania in vivo i in vitro opisały selektywną śmierć komórek neuronów dopaminergicznych zależną od rotenonu21,2,23.

Wpływ toksyczności rotenonu na komórki nerwowe; mikroskopia (GFAP, TH); wykresy słupkowe (analiza markerów komórkowych).
Rysunek 7. Wpływ rotenonu na komórki glejne i neurony dopaminergiczne. (A) Reprezentatywne obrazy GFAP+ komórki (czerwone), z powiększeniem 40X na wstawkach, niepoddane działaniu czynnika lub traktowane 10 nM rotenonu przez 24 h. (B) Oznaczanie ilościowe nestyny+, MAP2+, oraz GFAP+ komórki, znormalizowane względem komórek niepoddanych działaniu czynnika (kontrolnych, Ctr). (C) Reprezentacyjne zdjęcia dopaminergicznych neuronów TH++ neurony (zielone), z powiększeniem 40X na wstawkach, niepoddane działaniu czynnika lub poddane działaniu 10 nM rotenonu przez 24 h. (D) Oznaczanie ilościowe GABA+, VGlut1+, oraz TH+ komórki neuronalne, znormalizowane względem komórek niepoddanych działaniu czynnika (Ctr). Wszystkie wartości przedstawiono jako średnią ± S.E.M. z 3 powtórzeń biologicznych. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,01; rysunek zmodyfikowany na podstawie źródła 7. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Istotność statystyczną oceniano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem Dunnetta dla porównań wielokrotnych jako testu post-hoc (porównując wszystkie kolumny z kolumną kontrolną)24 lub za pomocą obustronnego nieparzystego lub parzystego testu t, w zależności od rodzaju analizy. Wszystkie dane przedstawiają średnią z co najmniej trzech powtórzeń biologicznych ± błąd standardowy średniej (S.E.M.). Gwiazdka nad słupkiem oznacza istotną różnicę w stosunku do grupy kontrolnej. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001.

Tabela 1.
Uwaga dotycząca gęstości wysiewu dysocjowanych rozet: jeśli fragmenty rozet nie wydają się całkowicie dysocjowane, aby osiągnąć gęstość wysiewu komórek na poziomie około 15.0 cells/cm2, fragmenty dysocjowanych rozet pochodzące z około 50 EBs/1 x 60mm-dish można resuspenderować w 50 mL pełnego medium NRI i wysiać w następujący sposób (w zależności od formatu płytki):

Płytki wielodołkowe / MEAPowierzchnia wzrostu (cm²)2/dołek)Objętość zawiesiny komórkowej do naniesienia na studnię (lub chip MEA)Maksymalna liczba płytek, które można wysiać (przy użyciu 50 ml zawiesiny komórkowej)
96 dołków0.310 μl5
48 dołków0.720 µl4
24 dołki2625 $\mu$l3
12 dołków41,25 ml3
6 studzienek103,125 ml2
Chip MEA z jedną studzienką3.51,1 ml45

Tabela 2: Kryteria akceptacji

Marker / PrzeciwciałoProcent (w komórkach DAPI+ (żywych)) po 28 DIV
β-III-tubulina (Tuj1)35-45%
MAP250-60%
NF2045-55%
GFAP10-25%
Nestyna15-25%

Dyskusja

W niniejszej pracy opisano solidny i stosunkowo szybki protokół różnicowania IMR90-hiPSC w neurony postmitotyczne i komórki glejowe. Wcześniej opublikowane protokoły różnicowania neuronów oparte na hESC i hiPSC zwykle dają wysoki odsetek prekursorów neuronalnych25,26 i znaczną liczbę neuronalnych komórek docelowych 27,28,29,30,31,32,33. Analogicznie, opisany tutaj protokół różnicowania jest odpowiedni do generowania heterogenicznych kultur komórek neuronalnych GABA-ergicznych, glutaminergicznych i dopaminergicznych, wraz z glejem i dyskretną proporcją komórek nestin+. Obecność komórek nerwowych glutaminergicznego (~35-42%) i GABAergicznego (~15-20%) sugeruje, że kultura ta posiada przodomózgowie, cechy podobne do kory mózgowiowej, a obecność dyskretnej liczby neuronów dopaminergicznych (~13-20%) może również wskazywać na specyficzność śródmózgowia. Dodatkowo, trwałość skromnej proporcji komórek nestin+ może okazać się odpowiednia do badania neurogenezy i możliwego wpływu substancji chemicznych na NSC, które są głównie ograniczone zarówno do hipokampa, jak i strefy podkomorowej (SVZ) przodomózgowia34. Dalsze analizy immunocytochemiczne i ekspresji genów pomogłyby lepiej określić regionalną specyficzność zróżnicowanych pochodnych komórek.

Dwa najbardziej krytyczne etapy w protokole różnicowania opisanym w niniejszym dokumencie to: (i) cięcie kolonii hiPSC na jednorodne fragmenty (co ma kluczowe znaczenie dla wytwarzania EB o jednorodnych rozmiarach) oraz (ii) cięcie struktur neuroektodermalnych (rozet) w celu różnicowania NSC, co wymaga znacznych umiejętności manualnych i precyzji, aby uniknąć pobierania komórek mezodermalnych i endodermalnych, które mogą zmniejszyć proporcje neuronów i komórek glejowych uzyskanych po różniczkowanie.

Kluczowe znaczenie ma scharakteryzowanie fenotypów komórek podczas ekspansji (jako niezróżnicowanych kolonii lub NSC) oraz podczas wszystkich etapów różnicowania. W szczególności profile ekspresji genów i białek pochodnych komórek neuronalnych/glejowych powinny wykazywać regulację w górę i aktywację szlaków sygnałowych związanych z neuronami, podczas gdy ekspresja markerów pluripotencji powinna być zmniejszona.

Generowanie EB i pochodnych neuroektodermalnych (rozet) może być trudne manualnie i podatne na zmienność. Z tego powodu opracowaliśmy protokół ekspansji NSC pochodzących z rozety i ich dalszego różnicowania w komórki neuronalne/glejowe.

Możliwymi ograniczeniami tego protokołu różnicowania są głównie (i) stosunkowo niski odsetek zróżnicowanych pochodnych gleju oraz (ii) brak dojrzałych funkcji sieci neuronalnej (na co wskazuje brak impulsów). Co więcej, określone subpopulacje astrocytów mogą funkcjonować jako pierwotni pregentorzy lub NSC35. Chociaż w tej zróżnicowanej hodowli komórkowej nie zaobserwowano podwójnie dodatnich komórek nestyny/GFAP (dane nie pokazane), przypuszcza się, że komórki GFAP + w tych mieszanych kulturach są astrocytami progenitorowymi i astrocytami. Jest prawdopodobne, że wydłużając czas różnicowania, liczba astrocytów może wzrosnąć, a ich morfologia może stać się bardziej dojrzała, na co wskazują już wcześniejsze prace z grupyZhanga 36,37.

W nowym paradygmacie badania toksyczności wiedza na temat wywołanych chemikaliami zaburzeń szlaków biologicznych ma ogromne znaczenie przy ocenie przeciwności chemicznych. W związku z tym systemy badań in vitro powinny być w stanie powiązać niekorzystne skutki z zakłóceniami szlaków sygnałowych, zgodnie z koncepcją ścieżki niepożądanych skutków (AOP). Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon może być wykorzystany do oceny aktywacji szlaku Nrf2, który bierze udział w obronie komórkowej przed stresem oksydacyjnym lub elektrofilowym38, a stres oksydacyjny jest ważnym i powszechnym kluczowym zdarzeniem w różnych AOP istotnych dla neurotoksyczności rozwojowej i dorosłej39.

Rotenon powinien wywołać aktywację szlaku Nrf2, co można wykazać poprzez translokację jądrową białka Nrf2 i zwiększoną ekspresję enzymów docelowych Nrf2, w tym NQO1 i SRXN1. Stwierdzono, że rotenon indukuje zależny od dawki wzrost poziomu białka GFAP, co wskazuje na aktywację astrocytów40,41. Rotenon zmniejsza również liczbę komórek dopaminergicznych (TH+), co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami in vitro i in vivo wykazującymi zależną od rotenonu śmierć komórek dopaminergicznych, ponieważ ten typ neuronów jest szczególnie wrażliwy na stres oksydacyjny 21,22,23.

Podsumowując, ten model hodowli neuronów i komórek glejowych pochodzący z hiPSC jest cennym narzędziem do oceny neurotoksycznych skutków substancji chemicznych, które wywołują stres oksydacyjny powodujący aktywację szlaku Nrf2. Ponieważ ten protokół różnicowania pozwala na generowanie mieszanych kultur komórek neuronalnych (neuronów GABA-ergicznych, dopaminergicznych i glutaminergicznych) i astrocytów, może okazać się odpowiedni do badania przesłuchów między neuronami a glejem w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne (np . Choroba Parkinsona). Co więcej, obecność znacznej części NSC może pomóc w ocenie możliwego wpływu substancji chemicznych na progenitory nerwowe, o których wiadomo, że są głównym celem mutacji indukowanych chemicznie lub infekcji wirusowych42.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Francja) za dostarczenie IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari i Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Włochy); Dr. Simone Haupt (Uniwersytet w Bonn, Niemcy); Dr. Tiziana Santini (Włoski Instytut Technologii, Rzym), za udzielenie porad dotyczących oceny barwienia immunofluorescencyjnego; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo, oraz dr Luca Persano (Uniwersytet w Padwie, Włochy) za wkład w analizę RPPA i walidację przeciwciał. Finansowanie: prace te były wspierane przez finansowany ze środków UE projekt "SCR&Tox" (Grant Agreement No. 266753).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium StemCell Technologies05851(krok 1.2.6). Kompletny mTeSR1 jest stabilny, gdy jest przechowywany w temperaturze 2 - 8 stopni; C do 2 tygodni. 5x Suplementy mogą być dozowane do porcji roboczych i przechowywane w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Zamrożone porcje należy zużyć w ciągu 3 miesięcy.
mTeSR1 5x SuplementyStem Cell Technologies05852
Matrigel z kwalifikacją hESC MatrixCorning3542771:100 (krok 1.1). Rozmrozić Matrigel na lodzie, przygotować 200 μ L i przechowywać je w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Do powlekania rozcieńczyć 200 μ L podwielokrotność w 20 ml pożywki DMEM/F12.
CryoStem Freezing MediumStemgent01-0013-50Zamrażanie ~ 100 fragmentów/250 μ L / fiolka (krok 1.2.1)
< silny> Nazwa< / silny>Firma< / silny>Numer katalogowyKomentarze< / silny>
hiPSC EB średni:< / silny>
Knockout DMEMThermo-Fisher10829-018(Krok 2.1.7)
Zamiennik surowicy do nokautowania ( KOSR)Thermo-Fisher10828-02820% stężenie końcowe (krok 2.1.7)
Aminokwasy endogenneThermo-Fisher11140-035(Krok 2.1.7)
Penicylina/StreptomycynaThermo-Fisher15140-12250 U/ml stężenie końcowe (krok 2.1.7)
L-glutamina 200 mM roztwórThermo-Fisher25030-0812 mM stężenie końcowe (krok 2.1.7)
β-MerkaptoetanolThermo-Fisher31350-01050 &mikro; Końcowe stężenie M (krok 2.1.7)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kompletny środek do indukcji neuroepitelialnej (NRI):
DMEM/F12Thermo-Fisher3133-038(Krok 2.3.1)
Aminokwasy endogenneThermo-Fisher11140-035(krok 2.3.1)
Suplement N2Thermo-Fisher17502-048(krok 2.3.1)
Penicylina / StreptomycynaThermo-Fisher15140-12250 U / ml stężenie końcowe (etap 2.3.1)
Heparyna klasa I-A, ≥ 180 jednostek USP/mgSigma-AldrichH3149-100KU2 i mikro; g / ml końcowe stężenie (krok 2.3.1)
bFGFThermo-Fisher13256-02920 ng / ml końcowe stężenie dodane przed użyciem (krok 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane MatrixCorning3542341:100 (krok 2.2). Rozmrozić Matrigel na lodzie, przygotować 200 μ L i przechowywać je w temperaturze -80 stopni Celsjusza. Do powlekania rozcieńczyć 200 μ L podwielokrotność w 20 ml zimnego podłoża DMEM/F12.
LamininSigma-AldrichL20201:100 (krok 2.2). Rozcieńczyć w PBS 1x.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal MediumThermo-Fisher21103049(Krok 2.4.11)
Suplementy B-27 (50x)Thermo-Fisher17504044(Krok 2.4.11)
Suplement N2Thermo-Fisher17502-048(Krok 2.4.11)
Penicylina/StreptomycynaThermo-Fisher15140-12250 U/ml stężenie końcowe (Krok 2.4.11)
GDNFThermo-FisherPHC70451 ng/ml stężenie końcowe. Dodano przed użyciem. (Krok 2.4.11)
BDNFThermo-FisherPHC7074stężenie końcowe 2,5 ng/ml. Dodano przed użyciem. (Krok 2.4.11)
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podłoże do indukcji neuronów (NI):
DMEM/F12Thermo-Fisher3133-038(Krok 3.3)
Aminokwasy endogenneThermo-Fisher11140-035(Krok 3.3)
Suplement N2Thermo-Fisher17502-048(Krok 3.3)
Penicylina / StreptomycynaThermo-Fisher15140-12250 U / ml Końcowe stężenie (Krok 3.3)
Heparyna Stopień I-A, ≥ 180 jednostek USP/mgSigma-AldrichH3149-100KU2 i mikro; g / ml końcowe stężenie (krok 3.3)
Suplement B-27 (50 razy), bez witaminy AThermo-Fisher12587010(krok 3.3)
L-glutamina 200 mM roztwórThermo-Fisher25030-0812 mM stężenie końcowe (krok 3.3)
bFGFThermo-Fisher13256-02910 ng / ml stężenie końcowe. Dodano przed użyciem (krok 3.3)
EGFThermo-FisherPHG6045stężeniu końcowym 10 ng/ml. Dodano przed użyciem (Krok 3.3)
BDNFThermo-FisherPHC7074stężenie końcowe 2,5 ng/ml. Dodano przed użyciem (Krok 3.3)
Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)Thermo-FisherR007-100Wstępnie podgrzany w temperaturze 37 & stopni C. Dodaj równą ilość DTI do Trypsin-EDTA (Krok 3.10)
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejThermo-Fisher154000541:10. Rozcieńczyć Trypsynę-EDTA w PBS 1x (bez wapnia i magnezu), wstępnie podgrzać roztwór w temperaturze 37 °; C (Krok 3.8)
Pożywka do kriokonserwacji komórek CryoStorSigma-AldrichC2874-100ML(Krok 4.2)
Trypan Blue (0,4%)Sigma-AldrichT8154-100MLwielu producentów / dostawców
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
TaqMan Zestawy sond i odczynniki do analizy ekspresji genów:
RNAqueous-Micro kitThermo-FisherAM1931(Step 5.1.6)
Zestawy do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo-Fisher4368814
TaqMan Gene Expression Master MixThermo-Fisher4369016
GFAPThermo-FisherHs00909233_m1
MAP2Thermo-FisherHs00258900_m1
NQO1Thermo-FisherHs02512143_s1
SRXN1Thermo-FisherHs00607800_m1
HMOX1Thermo-FisherHs01110250_m1
GSRThermo-FisherHs00167317_m1
PAX6Thermo-FisherHs01088112_m1
NESThermo-FisherHs00707120_s1
GRIA1Thermo-FisherHs00181348_m1
GAP43Thermo-FisherHs00967138_m1
GABRA3Thermo-FisherHs00968132_m1
GABRA1Thermo-FisherHs00168058_m1
NR4A2Thermo-FisherHs00428691_m1
THThermo-FisherHs00165941_m1
GAPDHThermo-FisherHs02758991_g1
ACTBThermo-FisherHs99999903_m1
MAPTThermo-FisherHs00902194_m1
SYPThermo-FisherHs00300531_m1
NANOGThermo-FisherHs04260366_g1
POU5F1 (PAŹ 4)Thermo-FisherHs04195369_s1
SOX1Thermo-FisherHs01057642_s1
AFPThermo-FisherHs00173490_m1
KRT18Thermo-FisherHs01941416_g1
NPPAThermo-FisherHs00383230_g1
TThermo-FisherHs00610080_m1
NCAM1Thermo-FisherHs00941821_m1
NR4A1Thermo-FisherHs00374226_m1
PHOX2AThermo-FisherHs00605931_mH
PHOX2BThermo-FisherHs00243679_m1
NARG2Thermo-FisherHs00973298_g1
SLC18A3Thermo-FisherHs00268179_s1
SLC5A7Thermo-FisherHs00222367_m1
ISL1Thermo-FisherHs00158126_m1
LHX3Thermo-FisherHs01033412_m1
TaqMan Matryca kinaz białkowychThermo-Fisher4418721
Nazwa CompanyNumer katalogowyUwagi
Przeciwciała i odczynniki do barwienia immunologicznego:
B-III-tubulina (Tuj1)CovanceMMS-435P1:500 (krok 5.2.5). Można również stosować inne przeciwciała.
MAP2Sigma AldrichM44031:500
NF200Sigma AldrichN41421:1000
GFAPAcris Antibodies GmbHAP02002SU-N1:500
NestinSigma-AldrichN54131:200
synaptofizyna (SYN)AbcamAB146921:200
TauThermo-FisherMA5-128081:100
Nrf2AbcamAB623521:200
Keap1AbcamAB666201:200
sulfiredoxin1 (SRXN1)AbcamAB922981:200
NAD(P)H oksydoreduktaza chinonowa 1 (NQO1)AbcamAB23461:200
OCT4miliporyMAB44011:100
SSEA3miliporyMAB43031:100
Tra1-60MiliporeMAB43601:250
Hydroksylaza tyrozyny (TH)MiliporaAB1521:200
Kwas gamma-aminomasłowy (GABA)Sigma-AldrichA03101:100
Pęcherzykowy transporter glutaminianu 1 (VGlut1)AbcamAB723111:500
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148-500G4% (4% Można również stosować formaldehyd)
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo-Fisher14190144
Triton-X-100 RoztwórSigma-Aldrich93443-100ML0,1%
BSA 35%Sigma-AldrichA7979-50ML3,5%
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko królikowi IgG (H + L), koniugat DyLight 594Thermo-FisherSA5-100401:500. (Krok 5.2.7) Można również stosować inne przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluorochromem. W takim przypadku odpowiednie rozcieńczenia powinny zostać przetestowane przez użytkownika końcowego.
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko myszemu IgG (H + L), koniugat DyLight 488Thermo-FisherSA5-101661:500
Przeciwciało wtórne adsorbowane krzyżowo przeciwko kozom IgG (H + L), koniugat DyLight 488Thermo-FisherSA5-100861:500
Roztwór DAPI (1 mg / ml)Thermo-Fisher622481:1000 (krok 5.2.7)
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciała dla macierzy białek odwróconej fazy (RPPA):
4E-BP1 (S65)AbcamAB812971:250 (Uwaga po kroku 5.2.8)
Akt (T308)Sygnalizacja komórkowa92751:100
Akt (S473)Sygnalizacja komórkowa92711:100
AMPKalpha (T172)Sygnalizacja komórkowa25311:100
AMPKbeta1 (S108)Sygnalizacja komórkowa41811:100
ATF-2 (T71)Sygnalizacja komórkowa92211:100
C-JUN (S63)Sygnalizacja komórkowa92611:200
C-JUN (S73)Sygnalizacja komórkowa91641:200
c-Kit (Y719)Sygnalizacja komórkowa33911:250
CREB (S133)Sygnalizacja komórkowa91911:100
EGFR (Y1068)Sygnalizacja komórkowa22341:50
ErbB2/HER2 (Y1248)Sygnalizacja komórkowa22471:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204)Sygnalizacja komórkowa91011:2000
GSK-3alpha (S21)Sygnalizacja komórkowa93371:50
Jak1 (Y1022/1023)Sygnalizacja komórkowa33311:100
Lck (Y505)Sygnalizacja komórkowa27511:500
LKB1 (S428)Sygnalizacja komórkowa30511:100
mTOR (S2448)Sygnalizacja komórkowa55361:100
NFkB p65 (S536)Sygnalizacja komórkowa30311:50
p70 Kinaza S6 (T389)Sygnalizacja komórkowa92051:200
PDK1 (S241)Sygnalizacja komórkowa30611:100
PKA C (T197)Sygnalizacja komórkowa47811:250
PRAS40 (T246)BioSource44-11001:2000
PTEN (S380)Sygnalizacja komórkowa95511:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428)Sygnalizacja komórkowa95111:500
Src (Y527)Sygnalizacja komórkowa21051:500
Rodzina Src (Y416)Sygnalizacja komórkowa21011:200
Stat1 (Y701)Sygnalizacja komórkowa91711:200
Stat3 (S727)Sygnalizacja komórkowa91341:200
Zap-70 (Y319)EnogeneE0111591:100
β Katenina (S33/37/T41)Sygnalizacja komórkowa95611:250
CREBUpstate Biotechnologies06-8631:100
Sygnalizacja komórkowa Fos B22511:200
Sygnalizacja komórkowaGRB239721:2000
HSP70StressgenSPA-8101:100
Sygnalizacja komórkowac-jun91651:100
Kip1 / p27BD6102411:100
Sygnalizacja komórkowaLck29841:250
Sygnalizacja komórkowaMcl-145721:80
Sygnalizacja komórkowaMusashi21541:100
Sygnalizacja komórkowaNOTCH134391:100
Sygnalizacja komórkowaPTEN95521:500
SGK1AbnovaPAB45901:250
Sygnalizacja komórkowaZap-7027051:250
β-CateninAbcamAB325721:1000
Dll4AbcamAB72801:500
ShhAbcamAB532811:250
HIF-1&alfa;BD6109581:50
NUMB PAN-ISOUpstate Biotechnologies07-2071:400
NUMB-LChemiconAB151451:750
Cyklina BBD6102201:75
c-MycCalbiochemOP-101:100
Zestaw BCIP/NBTThermo-Fisher002209(Uwaga po kroku 5.2.8). Zestaw służy do pomiaru aktywności fosfatazy alkalicznej, można stosować podobne zestawy.
NazwaFirmaNumer katalogowy>Komentarze
Przeciwciała do cytometrii przepływowej:
SSEA1 Przeciwciało, koniugat Pacific BlueThermo-FisherMHCD15281:100 (Uwaga po kroku 5.2.8)
Przeciwciało SSEA4 (MC813-70), Alexa Fluor 647Thermo-FisherSSEA4211:100
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Specyficzne instrumenty, narzędzia i oprogramowanie:
Można zastosować automatyczny licznik komórek CountessThermo-FisherC10227Komora Neubauera lub inny odpowiedni hemocytometr szklany.
MEA1060-Inv-BCSystemy wielokanałoweMEA1060-Inv-BC(krok 5.3)
MEA1060-BC oprogramowanie sterująceSystemy wielokanałoweMEA1060-BC(krok 5.3)
Systemy wielokanałoweNeuroExplorer (NE)(krok 5.3) Do przetwarzania końcowego danych MEA
Matryce wieloelektrodowe (MEA)Systemy wielokanałowe60MEA100/10iR-Ti-gr(krok 5.3) Jednodołkowy chip MEA
ArrayScan XTI High Content PlatformThermo-FisherASN00002P(Krok 5.2.8) Średnią fluorescencję można określić ilościowo przy użyciu określonych algorytmów ArrayScan (np. Bioaplikacje Cytotoksyczność V.4 i NucTrans V.4). Zaleca się wykonanie co najmniej 20 zdjęć / studnię i wykonanie 7-8 wewnętrznych powtórzeń na warunek
7900HT Szybki system PCR w czasie rzeczywistymThermo-Fisher4351405(krok 5.1.6)
Strzykawka do insuliny BD ULTRA-THIN (z igłą 30G)BD328280(kroki 1.3.1, 2.1.2 i 2.4.1)
StemPro EZPassage Jednorazowe narzędzie do pasowania komórek macierzystychThermoFisher23181010To narzędzie do cięcia kolonii może być używane jako alternatywa dla użycia strzykawek 30G z igłą 1 ml (Krok 1.3.1)
Szalka Petriego z ultra-niską nasadką (60 mm)Corning10010582(Krok 2.1.8) Można również użyć innych marek.
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażaniaSigma-AldrichC1562-1EA

Bibliografia

  1. NRC. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).
  2. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  3. Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges. Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).
  4. Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. Natural and artificial routes to pluripotency. Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).
  5. Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
  6. Pistollato, F., et al. Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition. Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).
  7. Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells. Neurochem Int. , (2016).
  8. Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570 (2016).
  9. Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571 (2016).
  10. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  11. Brien, P. J., et al. High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening. Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).
  12. Accordi, B., et al. Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL. PLoS One. 5 (10), e13552(2010).
  13. Vassallo, A., et al. A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing. Neurotoxicology. , (2016).
  14. Shamblott, M. J., et al. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).
  15. Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation. Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).
  16. Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease. Parkinsons Dis. , 314082(2011).
  17. Kovac, S., et al. Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase. Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).
  18. Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons. J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).
  19. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).
  20. Li, L., et al. Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling. Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).
  21. Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).
  22. Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation. Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).
  23. Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures. Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).
  24. Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm (2017).
  25. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).
  26. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J Vis Exp. (96), e52495(2015).
  27. Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells. Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).
  28. Parsons, X. H., et al. Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction. J Vis Exp. (56), e3273(2011).
  29. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  30. Zeng, H., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5 (7), e11853(2010).
  31. Zeng, X., et al. An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).
  32. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  33. Almeida, S., et al. Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons. Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).
  34. Urbán, N., Guillemot, F. Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles. Front Cell Neurosci. 8, 396(2014).
  35. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  36. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).
  37. Krencik, R., Zhang, S. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  38. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  39. Bal-Price, A., et al. Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).
  40. Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone. Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).
  41. Swarnkar, S., et al. Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage. Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).
  42. Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie neuronalno-glejowetworzenie ciał embrionalnychagregaty przypominające rozetkipożywka do różnicowania neuronalnegomarkery komórek glejowychanaliza cytometrycznailościowy PCR w czasie rzeczywistymprzesiew toksyczności chemicznej
Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.