Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55715

⸱

17 maja 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje metodę izolowania i hodowli podstaw metanefrycznych z embrionów myszy.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest opisanie metody preparacji, izolacji i hodowli podstaw metanefrycznych myszy.

Podczas rozwoju nerek u ssaków, dwie struktury progenitorowe, pączek moczowodu i mezenchyma metanefrycznego, komunikują się i wzajemnie indukują mechanizmy komórkowe, aby ostatecznie utworzyć system zbierania i nefrony nerki. Ponieważ zarodki ssaków rosną wewnątrzmacicznie i dlatego są niedostępne dla obserwatora, opracowano hodowlę narządów. Dzięki tej metodzie możliwe jest badanie oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych i zachowania komórkowego podczas organogenezy nerek. Ponadto można zbadać pochodzenie wrodzonych wad rozwojowych nerek i dróg moczowo-płciowych. Po dokładnym rozbiorzeniu zaczątki śródnercza przenosi się do filtra, który unosi się na pożywce hodowlanej i może być trzymany w inkubatorze do hodowli komórkowych przez kilka dni. Należy jednak mieć świadomość, że warunki te są sztuczne i mogą wpływać na metabolizm w tkance. Również przenikanie badanych substancji może być ograniczone ze względu na macierz zewnątrzkomórkową i błonę podstawną obecne w eksplantacie.

Jedną z głównych zalet hodowli organów jest to, że eksperymentator może uzyskać bezpośredni dostęp do organu. Technologia ta jest tania, prosta i pozwala na wiele modyfikacji, takich jak dodawanie substancji biologicznie czynnych, badanie wariantów genetycznych i stosowanie zaawansowanych technik obrazowania.

Wprowadzenie

Nerka ssaków wywodzi się z dwóch pierwotnych struktur o mezodermalnym pochodzeniu: kanalikowatego nabłonka moczowodu i mezenchymii metanefrycznych. Podczas nefrostenezy pączek moczowodu atakuje mezenchymę śródnerczą i rozgałęzia się, tworząc system zbiorczy. Mezenchyma śródnerczyca powoduje powstanie elementów nabłonkowych nefronów. Procesy te zachodzą w ściśle określonym czasie i przestrzennie skoordynowany sposób i są inicjowane przez wzajemne mechanizmy indukcyjne. Oba składniki tkanki komunikują się i wpływają na morfogenezę komórek drugiego.

W latach 20. to Boyden przeprowadził in vivo niedrożność przewodu śródnerkowego u kurcząt, dostarczając pierwszej oznaki oddziaływań indukcyjnych, ponieważ oddzielona blastema nerkowa nie jest w stanie się rozróżnić1. Mniej więcej w tym samym czasie opublikowano pierwsze udane próby hodowli zaczątków nerki kurczaka w wiszącej kropli. Następnie opracowano hodowlę narządów w celu zbadania interakcji tkankowych w organogenezie ssaków. W latach pięćdziesiątych XX wieku Grobstein opracował technikę, w której podstawy metanefryczne można było hodować na filtrze. Technika ta została zmodyfikowana przez Saxéna, który umieścił filtr na ekranie typu Trowell w naczyniu hodowlanym1. Na przestrzeni lat pojawiło się wiele modyfikacji i zastosowań w hodowli organów. Opisana tutaj metoda opiera się na technice Saxéna, ale jest uproszczona, ponieważ filtry swobodnie unoszą się na pożywce, a średnica kultury tylko nieznacznie przekracza średnicę filtra, co ogranicza niepożądane ruchy filtra.

Hodowla całego narządu to klasyczne, tanie i proste, ale potężne narzędzie do badania procesów komórkowych i komunikacji międzykomórkowej podczas organogenezy. Posiew narządowy pozwala na leczenie czynnikami biologicznymi, takimi jak czynniki wzrostu, przeciwciała, oligonukleotydy antysensowne, wirusy i peptydy, a także związkami farmaceutycznymi i innymi chemikaliami. Funkcję genów można również badać przy użyciu eksplantatów pochodzących od genetycznie zmodyfikowanych myszy lub przy użyciu technologii indukowalnej inaktywacji genów, takiej jak system Cre-loxP. Pozwala to na badanie mutacji genetycznych, które powodują śmiertelność zarodka przed rozwojem nerki. Hodowla narządów może być również połączona ze znakowaniem fluorescencyjnym w celu śledzenia funkcji genów lub linii oraz nowoczesnymi technikami obrazowania, które umożliwiają monitorowanie zachowania komórek w czasie rzeczywistym2.

W konkretnym przykładzie tutaj podanym badano wpływ sygnalizacji receptora Eph aktywowanego przez EphrinB2 na morfologię rozgałęzień pączka moczowodu. Morfologia myszy z podwójnym nokautem EphA4/EphB2 sugerowała kilka poważnych wad w rozwoju nerek, które były wykrywalne już w 11 dniu embrionalnym (E11) i obejmowały pączek moczowodu, moczowód i wspólny przewód nerkowy3. Sygnalizacja za pośrednictwem receptorów Eph wymaga grupowania receptora liganda dimer4. Aby nadmiernie aktywować sygnalizację Eph, zalążki nerek z zarodków myszy E11.5 hodowano w obecności zgrupowanego rekombinowanego EphrinB2-Fc. EphrinB2 jest znanym ligandem receptora EphA4, który ulega ekspresji w wierzchołkach pączków moczowodu 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy były utrzymywane zgodnie ze szwedzkimi przepisami i prawodawstwem Unii Europejskiej (2010/63/UE). Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Szwedzkiej Komisji Etyki (zezwolenia C79/9, C248/11 i C135/14). Procedury na Uniwersytecie w Heidelbergu z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Regierungspräsidium Karlsruhe i Inspektorów ds. Dobrostanu Zwierząt na Uniwersytecie w Heidelbergu.

1. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli

UWAGA : Użyj okapu z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

  1. W dniu sekcji, wstępnie zgrupowane ludzkie białko Fc samo lub rekombinowane chimeryczne białko efryny połączone z ludzkim Fc przez zmieszanie go z przeciwciałami kozi anty-ludzkimi Fc w stosunku molowym 1:5 w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C5.
  2. Przygotuj pożywkę, uzupełniając zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Modified Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) z 1% penicyliny/streptomycyny (v/v), 1% glutaminy (v/v), 1% insuliny-transferyny-selenu (v/v), 50 μg/ml ludzkiej holotransferyny i 1,5 μg/ml amfoterycyny.
    UWAGA: 10 ml pożywki wystarcza na 16 zarodków.
  3. Dodać zgrupowany rekombinowany roztwór efryny o końcowym stężeniu 20 μg/ml do pożywki hodowlanej. Użyj klastrowanego ludzkiego Fc jako formantu.
  4. Przygotować płytki hodowlane, dodając 500 μl pożywki do każdego dołka sterylnej, niepowlekanej, 4-dołkowej płytki z płaskiego dnem polistyrenu.
  5. Za pomocą sterylnych kleszczyków ostrożnie umieść jeden filtr membranowy z poliwęglanu o wielkości porów 5 μm na studzienkę na wierzchu podłoża. Przenieść przygotowaną płytkę do inkubatora (37 °C/5% CO2 ). Upewnij się, że filtr pozostaje suchy na górnej powierzchni i unosi się.
    UWAGA: Jeden filtr wystarcza na dwa anlageny nerkowe.
  6. Za pomocą żyletki odetnij około 30 końcówek pipet (objętość: 100 μl) około 1 mm od końcówki, aby uzyskać szerszy otwór. Umieść końcówki z powrotem w stojaku na końcówki do pipet.

2. Analiza podstaw metanefrycznych w E11.5

  1. Uśmierc mysz w ciąży w czasie w E11.5 przez zwichnięcie szyjki macicy (lub przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną komisję etyczną).
  2. Usuń macicę i zarodki, zgodnie z opisem Browna i wsp. 6. Od tego momentu pracuj pod mikroskopem preparacyjnym.
  3. Za pomocą kleszczy zegarmistrzowskich nr 5 przeciąć zarodek bezpośrednio pod przednimi kończynami. Użyj świeżej szalki Petriegodla każdego zarodka. Usuń nogi i ogon zarodka. Aby to zrobić, chwyć tkankę do usunięcia jedną parą kleszczy zegarmistrzowskich nr 5 i użyj końcówek drugiej pary do cięcia.
  4. Aby usunąć masę narządu brzusznego, użyj końcówek kleszczy, aby bocznie otworzyć ścianę ciała zarodka w kierunku rostralnym do ogonowego.
    1. Przeciąć powierzchownie, równolegle do aorty grzbietowej. Do orientacji użyj wypełnionej krwią, a zatem widocznej aorty grzbietowej. Ostrożnie oddziel brzuszną część ściany ciała od części grzbietowej za pomocą końcówek zamkniętych kleszczy i odwróć zarodek. Przetnij ścianę ciała bocznie w kierunku rostralno-ogonowym i używając aorty grzbietowej do orientacji, tak jak po poprzedniej stronie.
  5. Gdy brzuszna ściana ciała zostanie oddzielona od grzbietu, chwyć ją jedną parą kleszczy i ostrożnie pociągnij, aby ją usunąć wraz z masą narządu.
    UWAGA: Anlagen śródnerczycy zwykle pozostaje przyczepiony do grzbietowej ściany ciała. Są to owalne struktury o długości ~ 200 μm znajdujące się na poziomie kończyn tylnych.
  6. Przytrzymaj grzbietową ścianę ciała jedną parą kleszczy, stroną brzuszną skierowaną do góry. Używając drugiej pary kleszczy, chwyć aortę grzbietową na jej końcu rostralnym i ostrożnie oderwij aortę grzbietową od ściany grzbietowej ciała.
    UWAGA: Obie nerki śródnercze zwykle pozostają przyczepione do aorty grzbietowej.
  7. Za pomocą jednej pary kleszczy przyciąć rostralnie do nerki anlagen, aby usunąć aortę. Następnie ostrożnie oddziel dwa anlagen nerkowe za pomocą końcówek kleszczy.
  8. Ostrożnie oderwij niechcianą tkankę z anlagenu nerkowego za pomocą końcówek kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić mezenchymy, ponieważ uszkodzenie może skutkować słabym wzrostem i wykluczeniem eksplantatu z dalszej analizy.
  9. Przenieść anlagen nerkowy oddzielnie za pomocą pipety mikrolitrowej i szeroko otwartej końcówki pipety w 10 μl PBS do poliwęglanowego filtra membranowego w płytce 4-dołkowej.
    UWAGA: Ze względu na napięcie powierzchniowe eksplant zostanie pokryty cienką warstwą podłoża. Jeden filtr wystarcza na dwa anlageny nerkowe.
    1. Umieść każdy z dwóch anlagenów nerkowych na środku każdej odpowiedniej połowy filtra. Przenieść płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C/5% CO2 . Pozostawić płytkę w inkubatorze do czasu, gdy zaczątki śródnercza z następnego zarodka będą gotowe do umieszczenia na filtrze.
  10. Powtórzyć kroki 2.3-2.9.1 dla każdego zarodka.
    UWAGA: Przy odrobinie wprawy procedura preparacji zajmie około 5 minut na zarodek.
  11. Inkubować anlagen nerkowy przez 3 dni w temperaturze 37 °C/5% CO2 .

3. Przygotowanie odczynników do utrwalania i barwienia

  1. Aby przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS bez wapnia i magnezu (w/v), należy rozpuścić PFA w temperaturze 60 °C w PBS, ciągle mieszając. Schłodzić do temperatury pokojowej i użyć papierowego filtra, aby usunąć pozostałe cząstki. Porcjować i przechowywać w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia lub zamrozić w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: PFA jest toksyczny. Nosić środki ochrony osobistej określone w lokalnych normach bezpieczeństwa i pracować pod wyciągiem. Odpady należy wyrzucać zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i korzystać z wyznaczonych pojemników na odpady.
  2. Aby przygotować roztwór przepuszczalny, należy rozcieńczyć Triton X-100 w PBS bez wapnia i magnezu do 0,3% (v/v).
  3. Aby przygotować roztwór blokujący, dodaj 5% (v/v) surowicy koziej i 0,1% Triton X-100 do PBS bez wapnia i magnezu. Dodać azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Z azydkiem sodu należy obchodzić się zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa i ochrony środowiska.
    UWAGA: Używając przeciwciał do barwienia, użyj 5% surowicy z gatunku, z którego pochodzi przeciwciało drugorzędowe, aby uzyskać roztwór blokujący.
  4. Rozcieńczyć biotynylowaną aglutyninę Dolichorus biflorus w stosunku 1:200 w roztworze blokującym. Rozcieńczyć streptawidynę sprzężoną z Alexa488 w stosunku 1:200 w roztworze blokującym.
  5. Aby przygotować gotowe do użycia podłoże do zatapiania (patrz tabela materiałów), dodać 0,1 g rozpuszczalnego w wodzie mukoadhezji na bazie alkoholu winylowego/ml do 25% (w/v) glicerolu w 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5). Ogrzewać do 50 °C w ciągłym mieszaniu przez 1 godzinę, schłodzić i dostosować pH do 8,0-8,5 za pomocą 1 M NaOH. Unikaj wyższych stężeń NaOH. Dodać 100 μg/ml N-propylallanu i tiomersalu do końcowego stężenia 0,02% (w/v). Mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Tiomersal jest toksyczny. Obchodzić się z nim zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa i ochrony środowiska.
    1. Napełnić pożywkę do zatapiania w probówkach o pojemności 50 ml, zrównoważyć rotor i odwirować przy 3 200 x g i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zdekantować klarowny roztwór do probówek o pojemności 15 ml i wyrzucić osad. Porcjować i przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni. Po rozmrożeniu roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem rozgrzać do temperatury ~30 °C.
  6. Przygotuj tyle szkiełek szkiełkowych, ile mają być zamontowane filtry z eksplantatami. W tym celu przyklej dwa małe szkiełka nakrywkowe, 18 x 18 mm, po obu stronach szkiełka za pomocą kleju błyskawicznego, Pozostaw ~15 mm przestrzeni na filtr pomiędzy.

4. Utrwalanie i barwienie

  1. Po 3-dniowym okresie hodowli in vitro (div) wyjąć płytki z inkubatora i ostrożnie odessać pożywkę z każdej studzienki za pomocą mikropipety. Uważaj, aby nie dotykać filtra i trzymać końcówkę otwierającą się w kierunku ściany studni.
  2. Dodaj 500 μl 4% PFA/PBS do każdej studzienki. Filtry będą unosić się na utrwalaczu. Za pomocą mikropipety ostrożnie dodaj kroplami utrwalacz PFA, aby zanurzyć filtry. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: We wszystkich kolejnych krokach należy uważać, aby nie zmyć eksplantatów z filtra. Otwór końcówki pipety powinien być skierowany w stronę ściany studzienki.
  3. Usuń PFA i przepłucz dwukrotnie 500 μl PBS, zanurzając filtr. Dodać 500 μl roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Przepłukać dwukrotnie 500 μl PBS i dodać 500 μl roztworu blokującego do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Zastąpić roztwór blokujący 250 μl biotynylowanej aglutyniny Dolichorus biflorus rozcieńczonej w stosunku 1:200 w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  6. Usunąć roztwór aglutyniny Dolichorus biflorus i spłukać dwukrotnie 500 μl PBS na studzienkę.
  7. Dodać 250 μl streptawidyny sprzężonej z Alexa488 rozcieńczonej w stosunku 1:200 w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Alternatywnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: Lepszy stosunek sygnału do szumu uzyskuje się podczas inkubacji w temperaturze 4 °C.
  8. Przepłukać dwukrotnie 500 μl PBS na studzienkę. Za pomocą kleszczy przenieś filtry na przygotowane szkiełka podstawowe, eksplantatami skierowanymi do góry. Zamontuj z ~50-100 μL medium do zatapiania. Okładka z szkiełkami nakrywkowymi nr 1,5 o długości 60 mm. Pozostawić roztwór pożywki do zastygnięcia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności. Przystąpić do obrazowania lub przechowywać szkiełka, owinięte w folię, w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do obrazowania.
  9. Obraz za pomocą szerokokątnego mikroskopu epifluorescencyjnego7 sprzężonego z lampą Hg i przy użyciu jednostki lustra do wzbudzenia niebieskiego (pasmo wzbudzenia wzbudzenia, 460 - 495 nm; zwierciadło dichromatyczne 505 nm; i pasmo emisyjne 510 - 550 nm) oraz soczewek planapochromatycznych 20x, apertura numeryczna 0,75.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zraziki nerki metanefrycznej pobrano od ciężarnych myszy inbredowych szczepu Black-6 w dniu E11.5 i poddano hodowli. Po 3 dniach pączek moczowodowy podzielił się do 5 razy, co doprowadziło do rozgałęzienia początkowo T-kształtnego pączka moczowodowego. Wykonano zdjęcia każdego eksplantu, a następnie policzono liczbę segmentów i punktów końcowych, aby określić generacje rozgałęzień oraz obliczyć liczbę punktów końcowych na pojedynczą gałązkę (Rysunek 1). ImageJ (rd

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W manuskrypcie opisano metodę izolowania rozwijającego się anlagenu metanefrycznego z zarodka myszy i hodowli zaczątków narządów. Metoda ta jest techniką standardową, opracowaną przez Grobsteina8 i Saxéna 9,10, a następnie została zaadaptowana i zmodyfikowana przez wielu innych11,12. Powodzenie metody zależy głównie od czasu trwania sekcji, ponieważ przeżywalność eksplantatów i pot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Leifowi Oxburghowi i Derekowi Adamsowi za hojne podzielenie się swoją wiedzą, Leifowi Oxburghowi za pomocne komentarze do manuskryptu, a także Stefanowi Wölflowi i Ulrike Müller za wsparcie techniczne oraz Saskii Schmitteckert, Julii Gobbert, Sascha Weyer i Violi Mayer za pomoc w laboratorium. Prace te były wspierane przez Development, The Company of Biologists (do CP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific 21331020
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140148
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
DPBS, wapń, magnezThermo Fisher Scientific14040117zastosowanie do sekcji
holo-transferyny ludzkiejSigma-AldrichT0665
Insulina-Transferyna-Selen (ITS -G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Amfoterycyna B roztwórSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Azydek soduSigma-AldrichS8032
TiomersalSigma-AldrichT5125
Galusan propyluSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GlicerolSigma-AldrichG5516
Biotynylowany Dolichorus Biflorus Wektor aglutyninyLaboratoriaB-1035
Alexa488 sprzężona StreptawidynaJackson Immuno Research016-540-084
Rekombinowane białko chimery efryny-B2 Fc u myszy, CFR& D Systems496-EB
Rekombinowany ludzki IgG1 Fc, CFR& D Systems110-HG-100
Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG FcR& D SystemsG-102-C
Tabletki soli fizjologicznej buforowane fosforanamiSigma-AldrichP4417zastosowanie do utrwalania i barwienia immunologicznego
Dumont #5, końcówki biologie
, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PSPotrzebne są 2 pary kleszczyków
Nożyczki do tęczówki, proste, 12 cmagnthos.se03-320-120
Kleszcze opatrunkowe,
proste, delikatne, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Szalki Petriego ThermoFisher Scientific150679
TMTP01300 Filtr membranowy Isopore z powłoką Delta Thermo Fisher Scientific , poliwęglanowy, hydrofilowy, 5.0 i mikro; m, 13 mm, biały, gładkiMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidish
4 dołki, płaskie dno		Sigma-AldrichD6789-1CS
Szkło pokrywowe mikroskopu o grubości 24 x 50 mm. Nr 1.5H 0,17+/-0,005 mmnordicbiolabs107222
Szkła nakrywkowe Nr 1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Slajdy ~76 x 26 x 1, 1/2-w. szlifowane zwykłeNordicbiolabs1030418
Żyletki VWR VWR55411-055
50 ml ProbówkiSigma-AldrichCLS430828
15 mlSigma-AldrichCLS430055
Whatman, klasa 113V, krepowanaSigma-AldrichWHA1213125
Mirkoskop badawczyOlympusBX61WI
Black 6 myszy wsobne, samiec, C57BL/6NTacTaconicB6-M Czarne
6 myszy wsobne, samica, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Mikroskop stereoskopowyGreenough LeicaLeica S6 E
wirówkowe Wysokiej jakości bibuła filtracyjna

Bibliografia

  1. Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
  2. Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
  3. Peuckert, C., et al. Multimodal Eph/Ephrin signaling controls several phases of urogenital development. Kidney Int. 90 (2), 373-388 (2016).
  4. Pasquale, E. B. Eph receptor signalling casts a wide net on cell behaviour. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 462-475 (2005).
  5. Bonanomi, D., et al. Ret Is a Multifunctional Coreceptor that Integrates Diffusible- and Contact-Axon Guidance Signals. Cell. 148 (2), 568-582 (2012).
  6. Brown, A. C., et al. Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney. J Vis Exp. (50), e2555(2011).
  7. Olympus Support. , Available from: http://www.olympusamerica.com/cpg_section/cpg_archived_product_details.asp?id=817 (2016).
  8. Grobstein, C. Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool. 130, 319-340 (1955).
  9. Saxén, L., Toivonen, S. Primary Embryonic Induction. , Academic Press. London. (1962).
  10. Saxén, L., Koskimies, O., Lahti, A., Miettinen, H., Rapola, J., Wartiovaara, J. Differentiation of kidney mesenchyme in an experimental model system. Adv Morphog. 7, 251-293 (1968).
  11. Dudley, A. T., Godin, R. E., Robertson, E. J. Interaction between FGF and BMP signaling pathways regulates development of metanephric mesenchyme. Genes Dev. 13, 1601-1613 (1999).
  12. Perälä, N., et al. Sema4C-Plexin B2 signalling modulates ureteric branching in developing kidney. Differentiation. 81 (2), 81-91 (2011).
  13. Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. J Embryol exp Morph. 82, 147-161 (1984).
  14. Watanabe, T., Costantini, F. Real-time analysis of ureteric bud branching morphogenesis. Dev Biol. 271, 98-108 (2004).
  15. Sebinger, D. D. R., Unbekandt, M., Ganeva, V. V., Ofenbauer, A., Werner, C., Davies, J. A. A Novel, Low-Volume Method for Organ Culture of Embryonic Kidneys That Allows Development of Cortico-Medullary Anatomical Organization. PLoS One. 5 (5), e10550(2010).
  16. Ekblom, P., Miettinen, A., Virtanen, I., Wahlström, T., Dawnay, A., Saxén, L. In vitro segregation of the metanephric nephron. Dev Biol. 84 (1), 88-95 (1981).
  17. Davies, J. A., Unbekandt, M. siRNA-mediated RNA interference in embryonic kidney organ culture. Methods Mol Biol. 886, 295-303 (2012).
  18. Saxén, L., Lehtonen, E. Embryonic kidney in organ culture. Differentiation. 36 (1), 2-11 (1987).
  19. Bard, J. B. L. The development of the mouse kidney embryogenesis writ small. Curr Opin Genet Dev. 2, 589-595 (1992).
  20. Davies, J. A. A method for cold storage and transport of viable embryonic kidney rudiments. Kidney Int. 70 (11), 2031-2034 (2006).
  21. Batourina, E., et al. Distal ureter morphogenesis depends on epithelial cell remodeling mediated by vitamin A and Ret. Nat Genet. 32 (1), 109-115 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zalążki metanefrycznerozgałęzianie pączka moczowodowegotechnika hodowli organów115 dzień embrionalnyfiltr z błony poliwęglanowejinkubator do hodowli komórkowychbarwienie immunofluorescencyjneobrazowanie konfokalneorganogeneza nerek
Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.