Nowatorski test rozpoznawania obiektów do badania uczenia się i pamięci u myszy

Summary

Test rozpoznawania obiektów (ORT) to prosty i skuteczny test do oceny uczenia się i pamięci u myszy. Metodologia została opisana poniżej.

Abstract

Test rozpoznawania obiektów (ORT) jest powszechnie używanym testem behawioralnym do badania różnych aspektów uczenia się i pamięci u myszy. ORT jest dość prosty i można go ukończyć w ciągu 3 dni: dzień przyzwyczajenia, dzień treningu i dzień testu. Podczas treningu mysz może eksplorować 2 identyczne obiekty. W dniu testu jeden z obiektów treningowych jest zastępowany nowym obiektem. Ponieważ myszy mają wrodzoną preferencję do nowości, jeśli mysz rozpozna znajomy obiekt, spędzi większość czasu przy nowym obiekcie. Ze względu na tę wrodzoną preferencję nie ma potrzeby stosowania pozytywnego lub negatywnego wzmocnienia ani długich harmonogramów treningowych. Dodatkowo ORT może być również modyfikowany do wielu zastosowań. Interwał retencji można skrócić w celu zbadania pamięci krótkotrwałej lub wydłużyć w celu zbadania pamięci długotrwałej. Interwencja farmakologiczna może być stosowana w różnych momentach przed treningiem, po treningu lub przed przypomnieniem w celu zbadania różnych faz uczenia się (tj. przyswojenia, wczesnej lub późnej konsolidacji lub przypomnienia). Ogólnie rzecz biorąc, ORT jest stosunkowo mało stresującym, skutecznym testem pamięci u myszy i jest odpowiedni do wykrywania zmian neuropsychologicznych po manipulacjach farmakologicznych, biologicznych lub genetycznych.

Introduction

Test rozpoznawania obiektów (ORT), znany również jako test rozpoznawania nowych obiektów (NOR), jest stosunkowo szybkim i skutecznym sposobem testowania różnych faz uczenia się i pamięci u myszy. Został pierwotnie opisany przez Ennaceura i Delacoura w 1988 roku i używany głównie w szczurach¹; Jednak od tego czasu został z powodzeniem zaadaptowany do użytku w myszach^2,3,4,5,6,7. Test opiera się na zaledwie trzech sesjach: jednej sesji przyzwyczajenia, jednej sesji treningowej i jednej sesji testowej. Trening polega po prostu na wizualnej eksploracji dwóch identycznych obiektów, podczas gdy sesja testowa polega na zastąpieniu jednego z wcześniej eksplorowanych obiektów nowym obiektem. Ponieważ gryzonie mają wrodzoną preferencję do nowości, gryzoń, który zapamięta znajomy obiekt, spędzi więcej czasu na jego eksploracji^7,8,9.

Główną przewagą ORT nad innymi testami pamięci gryzoni jest to, że opiera się na naturalnej skłonności gryzoni do odkrywania nowości⁸. Dlatego nie ma potrzeby przeprowadzania licznych sesji treningowych ani żadnego pozytywnego lub negatywnego wzmocnienia, aby motywować do zachowania. Oznacza to, że ORT jest znacznie mniej stresujący w porównaniu z innymi testami^{10,11,12,13,14,15}, i wymaga znacznie mniej czasu na uruchomienie niż inne powszechnie używane testy pamięci, takie jak labirynt wodny Morrisa lub labirynt Barnesa, które mogą trwać do tygodnia lub dłużej. W związku z tym warunki ORT bardziej przypominają te stosowane w badaniu ludzkich funkcji poznawczych, co zwiększa ekologiczną ważność testu w porównaniu z wieloma innymi testami pamięci gryzoni. Podobnie, ponieważ ORT jest prostym zadaniem wizualnym, został z powodzeniem zaadaptowany do użytku u wielu gatunków, w tym ludzi i naczelnych, do oceny różnych międzygatunkowych aspektów pamięci deklaratywnej ^2,16,17. Wreszcie, ORT można łatwo zmodyfikować w celu zbadania różnych faz uczenia się i pamięci (tj. nabywania, konsolidacji lub przypominania), oceny różnych typów pamięci (np. pamięci przestrzennej) lub oceny różnych interwałów przechowywania (tj. pamięci krótkotrwałej i długotrwałej).

Wszechstronność ORT stanowi platformę dla niezliczonych zastosowań badawczych. W badaniach można wykorzystać środki farmakologiczne w celu zakłócenia lub poprawy pamięci. Zróżnicowanie czasu podawania leku przed lub po treningu lub przed badaniem może wskazywać na mechanizmy neuronalne, które prowadzą do zaburzeń lub wzmocnienia pamięci^6,18,19,20. W podobny sposób technologia optogenetyczna może być wykorzystywana w tych samych różnych punktach czasowych, aby przyjrzeć się aktywacji/hamowaniu neuronalnemu, które przyczynia się do różnych faz uczenia się i pamięci. ORT jest również odpowiedni do oceny różnic u zwierząt transgenicznych, w badaniach nad zmianami chorobowymi, w modelach neurodegeneracyjnych lub w badaniach starzenia się^{21,22,23,24,25,26,27,28}. Czas między treningiem a testowaniem, znany jako interwał przechowywania, może być zmieniony, aby ocenić dowolną z tych zmian w pamięci krótko- i długotrwałej²⁶. Ostatecznie ORT może być używany jako narzędzie do badania farmakologicznych, genetycznych i neurologicznych zmian w uczeniu się i pamięci, lub te narzędzia mogą być używane do badania podstaw uczenia się i pamięci w ORT.

Protocol

Wszystkie procedury przeprowadzone tutaj zostały przedłożone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH.

1. Wybór obiektów i konfiguracja eksperymentalna

1. Wybierz obiekty, które są na tyle różne, że mogą być łatwo rozróżniane przez myszy, ale mają podobny stopień złożoności (tekstura, kształt, wzór kolorów i jasność itp.), aby zminimalizować potencjalną preferencję obiektu, która może zniekształcić wyniki (zobacz Ennaceur 2010, aby uzyskać pełny opis wyboru obiektu⁷).
   1. Test na wrodzone preferencje i dyskryminację (patrz Kroki 2 i 3).
   2. Używaj obiektów, które są wielkości myszy lub tylko nieznacznie większe, aby zachęcić do eksploracji (Rysunek 1). Aby zmniejszyć indukowane preferencje, upewnij się, że myszy są w stanie wspinać się na oba obiekty lub na żaden z nich, chociaż zdolność do wspinania się na obiekt może zwiększyć zainteresowanie eksploracją (czas spędzony na samym siedzeniu na obiekcie nie jest wliczany do czasu eksploracji).
   3. Posiadaj co najmniej 2 kopie każdego obiektu. Jednak, aby zminimalizować potencjalne sygnały zapachowe podczas testowania, miej co najmniej 3 egzemplarze każdego obiektu, duplikaty do trenowania i jeden do testowania.
   4. Używaj przedmiotów wykonanych z nietłukącego się materiału, ponieważ utrata przedmiotu z powodu uszkodzenia podczas eksperymentów może zakłócić ciągłość badań i potencjalnie spowodować krzywdę lub obrażenia zwierzęcia.
   5. Dokładnie wyczyść przedmioty przed i między użyciem (odpowiedni jest etanol 70% obj.).
2. Aby zminimalizować stres związany z jasnym oświetleniem, używaj rozproszonego, słabego oświetlenia, z środkiem labiryntu oświetlonym około 20 luksów. Używaj temperatury i wilgotności zbliżonej do zwykłych warunków mieszkaniowych. Jeśli myszy są przenoszone z pomieszczenia do innego pomieszczenia na czas eksperymentu, należy zaaklimatyzować myszy w nowym pomieszczeniu przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem każdego dnia.
3. Dobrze obchodź się z myszami przed treningiem. Ponieważ test opiera się na naturalnej skłonności gryzoni do odkrywania nowości, zmniejsz stres lub niepokój związany z obchodzeniem się, który może zakłócać ich chęć eksploracji areny, a następnie obiektów. Najlepiej obchodzić się z myszami 1-2 razy dziennie przez co najmniej 1 minutę, 1 do 2 tygodni przed testem^15,29.
4. Na głównej arenie użyj kwadratowej komory (około 40 cm x 40 cm x 40 cm) wykonanej z białego lub czarnego, nieporowatego plastiku, skontrastowanego z kolorem myszy. Alternatywnie użyj okrągłej areny ed. W szczególności, w przypadku korzystania z niespokojnych myszy, które mogą siedzieć w rogach kwadratowej areny, okrągła arena może być preferowana, aby zachęcić do zachowań eksploracyjnych^18,30.
   1. W dniu treningu umieść 2 identyczne obiekty po przekątnej (tj. jeden w rogu NW i jeden w narożniku SE). Jeśli przedmioty są zbyt lekkie i mogą być przesuwane za pomocą myszy, przymocuj je do podłogi. Dobrze sprawdza się zdejmowana szpachlówka montażowa.
   W dniu testowym użyj 3. kopii każdego obiektu, aby umieścić jeden znajomy obiekt i jeden nowy obiekt na tej samej przekątnej, co dzień treningowy (Rysunek 2).
   3. Zrównoważ użycie każdego zestawu obiektów, tak aby każdy obiekt był używany zarówno jako znany obiekt, jak i jako nowy obiekt. Zrównoważ również lokalizację nowego obiektu w każdym z 4 rogów areny. Pamiętaj, aby zanotować, która przekątna jest używana dla którego zwierzęcia, aby przekątna używana w dniu treningu była taka sama, jak ta używana w dniu testu, dla każdej myszy.
   4. Dokładnie wyczyść aparat i przedmioty, aby usunąć oznaki zapachu przed i między użyciem (odpowiedni jest etanol 70% obj.).
5. Umieść kamerę bezpośrednio nad głową, aby uzyskać optymalny view eksploracji. Używaj wyłącznie oprogramowania z wykrywaniem punktu nosa w celu dokładnej analizy. Jeśli korzystasz z oprogramowania, przed rozpoczęciem uchwyć obraz tła z obiektami na miejscu. W oprogramowaniu ustaw obszar eksploracji tak, aby znajdował się w odległości około 2 - 3 cm wokół obiektu.
6. Aby zmniejszyć ingerencję eksperymentatora, nagraj próbę i oceń ją później. Nie zwracaj uwagi na warunki eksperymentalne. Jeśli ręcznie oceniasz podczas eksperymentu, upewnij się, że eksperymentator znajduje się w odległości większej niż 1 metr od areny i nie jest widoczny dla myszy.
   UWAGA: Każdy czas, w którym mysz siedzi na obiekcie bez aktywnego zamiatania lub wąchania wibrysów, nie liczy się jako czas eksploracji.
7. Zdefiniuj eksplorację jako sytuację, w której odgłos myszy jest skierowany w stronę obiektu i w odległości 2-3 cm od obiektu, z aktywnym zamiataniem wibrysami lub wąchaniem. Nie licz czasu na siedzenie na obiekcie bez oznak aktywnej eksploracji.

2. Niezbędne eksperymenty pilotażowe

1. Testowanie pod kątem preferencji indukowanej
   1. Aby się przyzwyczaić, wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją na środku otwartej areny. Pozwól myszy na swobodną eksplorację przez 5 minut.
   2. W Dniu Treningu (T1) umieść 2 różne obiekty w przeciwległych kwadrantach aparatury (tj. w rogach NW i SE). Wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją na środku otwartej areny. Pozwól na swobodną eksplorację przez 10 minut.
   3. Oblicz wskaźnik dyskryminacji. Jeśli nie ma wymuszonej preferencji, wskaźnik dyskryminacji powinien być równy zeru lub bliski zeru. Żadne obiekty, które wykazują preferencje, nie powinny być używane dla ORT.
2. Testy na zdolność do dyskryminacji
   1. Aby się przyzwyczaić, wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją na środku otwartej areny. Pozwól myszy na swobodną eksplorację przez 5 minut.
   2. Podczas sesji treningowej (T1) umieść 2 identyczne obiekty w przeciwległych kwadrantach. Umieść mysz na środku areny i pozwól jej eksplorować przez 10 minut.
   3. W sesji testowej (T2) umieść jeden z obiektów używanych podczas T1 i jeden nowy obiekt w przeciwległych kwadrantach (tj. narożnikach NW i SE). Sześćdziesiąt minut po T1 umieść mysz na środku areny i pozwól na swobodną eksplorację przez 10 minut.
   4. Oblicz wskaźnik dyskryminacji. Przy 60-minutowym interwale przechowywania wskaźnik dyskryminacji powinien wynosić powyżej 0,25.

3. Procedura eksperymentalna

1. Przyzwyczajenia
   1. Wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją na środku otwartej, pustej areny. Pozwól na swobodną eksplorację areny przez 5 minut. Gdy klatka domowa jest pusta, zachowaj ją do wykorzystania jako klatkę do przechowywania następnego dnia.
   2. Po upływie 5 minut wyjmij mysz i umieść ją w klatce. Nie należy umieszczać myszy w jej pierwotnej klatce, ponieważ może to wpłynąć na zachowanie pozostałych myszy, które mają być testowane.
   3. Dokładnie wyczyść aparat między myszami, używając 70% obj./obj. etanolu.
      UWAGA: Podczas habituacji, zachowanie podobne do lęku można ocenić, obliczając czas spędzony w centrum (patrz Prut & Belzung 2003³¹). Jest to przydatna metryka przy rozważaniu długości czasu T1. Myszy o wyższym poziomie lęku mogą wymagać 10-minutowej sesji, aby osiągnąć minimalne kryterium eksploracji.
2. Szkolenia (T1)
   1. Umieść dwa identyczne obiekty w przeciwległych ćwiartkach areny (tj. narożniku NE i narożniku SW).
   2. 24 godziny po przyzwyczajeniu wyjmij mysz z jej domowej klatki i umieść ją na środku areny, w równej odległości od 2 identycznych obiektów.
   3. Pozwól na swobodną eksplorację przez co najmniej 5 minut. W przypadku korzystania ze szczepu myszy, o których wiadomo, że mają niską aktywność lokomotoryczną lub eksploracyjną (tj. większość myszy nie osiąga minimum 20 sekund eksploracji obu obiektów przez 5 minut, jak zauważono w eksperymentach pilotażowych lub literaturze), przedłuż badanie do 10 minut dla wszystkich myszy w kohorcie.
   4. Po zakończeniu próby wyjmij mysz i umieść ją w klatce. Gdy klatka domowa jest pusta, zachowaj ją do użytku jako klatkę do przechowywania w dniu testu.
   5. Dokładnie wyczyść aparaturę i przedmioty między myszami, używając etanolu o stężeniu 70% obj.
3. Testowanie (T2)
   1. Umieść jeden obiekt używany podczas T1 (tj. znajomy obiekt) i jeden nowy obiekt w przeciwległych kwadrantach areny. Dla każdej myszy używaj tych samych lokalizacji, które były używane podczas T1.
   2. W odstępach od T1 do T2 wyjmij mysz z jej klatki domowej i umieść ją na środkowej arenie, w równej odległości od znanego obiektu i nowego obiektu.
      UWAGA: W odstępie czasu wynoszącym 24 godziny większość myszy nie będzie w stanie odróżnić znanego obiektu od nowego (zwykle -0,2 < d2 < 0,2, w porównaniu z kontrolą pozytywną³²). Jeśli testuje się efekty nootropowe, użyj tego punktu czasowego, aby sondować poprawę pamięci. Aby zbadać deficyty pamięci, użyj krótszego interwału przechowywania, wynoszącego od 20 minut do 4 godzin, w zależności od obciążenia myszy.
   3. Pozwól na swobodną eksplorację przez 10 minut. Po zakończeniu próby wyjmij mysz i umieść ją w klatce.
4. Zarówno w przypadku T1, jak i T2 zdobądź pierwsze 5 minut. Jeśli mysz nie osiągnie minimalnego czasu eksploracji wynoszącego 20 s dla obu obiektów, kontynuuj punktację po upływie 5 minut, aż całkowita eksploracja przekroczy 20 s.

4. Analiza danych

1. Kryteria wykluczenia
   1. Zarówno podczas treningu (T1), jak i testowania (T2) oblicz całkowity czas eksploracji dla obu obiektów dla każdej sesji (e1 i e2). Większość myszy powinna osiągnąć minimalną sumę eksploracji dla obu obiektów wynoszącą 20 s przez 5 minut.
   2. Wydłużenie czasu T1 i T2 do 10 minut dla szczepów myszy, które mają niską eksplorację i nie spełniają tego minimalnego kryterium o 5 minut, jak zaobserwowano podczas badań pilotażowych.
   3. Oceniaj zachowanie przez 5 minut lub dłużej niż 5 minut, aż osiągną kryterium minimum 20 s.
   4. Jeśli myszy nie osiągną minimum 20 s eksploracji dla obu obiektów dla T1 lub T2 po 10 minutach, należy je wykluczyć z analizy, ponieważ nie można potwierdzić, że spędziły wystarczająco dużo czasu na eksploracji, aby się uczyć/rozróżniać.
2. Analiza bezwzględna a względna
   UWAGA: Różne wzory analizy i ich wzajemne powiązania można zobaczyć w tabeli 1.
   1. Oblicz e1 jako całkowity czas eksploracji podczas treningu dla 2 identycznych obiektów, gdzie a1 i a2 są identycznymi obiektami.
      E1 = A1 + A2
   2. Oblicz e2 jako całkowity czas eksploracji podczas testowania dla znanego obiektu (a) i nowego obiektu (b).
      e2 = a+b
   3. Oblicz d1 jako po prostu czas spędzony na eksploracji nowego obiektu minus czas spędzony na eksploracji znanego obiektu. Miara dyskryminacji bezwzględnej (d1) nie uwzględnia różnic w czasie eksploracji między myszami lub grupami leczonymi, chociaż w pewnych okolicznościach może to być bardziej czuła miara².
      d1 = b-a
   4. Oblicz d2 jako czas spędzony na eksploracji nowego obiektu pomniejszony o czas spędzony na eksploracji znanego obiektu podzielony przez całkowity czas eksploracji. Najczęściej stosowaną miarą jest względna wartość dyskryminacji, często określana jako wskaźnik dyskryminacji (d2), na którą nie mają wpływu różnice w czasie eksploracji. Oznacza to, że wszystkie wartości będą mieścić się w przedziale od -1 do +1,
      d2 = d1/e2
   5. Alternatywnie oblicz indeks rozpoznawania lub preferencji (d3)³. Jest to czas spędzony na zwiedzaniu nowego obiektu podzielony przez czas całkowity. Oznacza to, że wszystkie wartości będą mieścić się w przedziale od 0 do 1. Często mnoży się ją przez 100 i używa jako wartości procentowej.
      d3 = b/e2*100
3. analiza statystyczna
   1. Korzystając ze średnich wartości dyskryminacji dla każdej grupy, określ wydajność pamięci przy użyciu jednokierunkowej analizy ANOVA. W celu dalszej analizy należy dokonać dwukierunkowych porównań post hoc z grupami leczonymi w porównaniu ze stanem nośnika i pozytywnymi/ujemnymi grupami kontrolnymi.

Results

Ogólna konfiguracja eksperymentalna dla ORT jest pokazana w Rysunek 2. W dniu habituacji (T0) myszy umieszcza się na pustej arenie na 5 minut. Dwadzieścia cztery godziny później myszy umieszcza się z powrotem w komorze z 2 identycznymi obiektami i pozwala im swobodnie eksplorować przez maksymalnie 10 minut (T1). W dniu testu (T2) myszy są ponownie umieszczane na arenie, ale z jednym znajomym obiektem i jednym nowym obiektem, i mogą eksplorować teren przez mak...

Discussion

ORT jest wydajną i elastyczną metodą badania uczenia się i pamięci u myszy. Podczas przygotowywania eksperymentu należy wziąć pod uwagę szereg zmiennych, które mogą mieć wpływ na wynik. Jak omówiono w reprezentatywnych wynikach, obciążenie myszy będzie miało wpływ zarówno na czas eksploracji, jak i na interwał retencji. Skrócenie czasu eksploracji może zniekształcić lub zamaskować wyniki w analizie dyskryminacji bezwzględnej 2,3,5,30,32.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aparat Open Field Box	Panlab/Harvard	LE800SC	Dostępny w kolorze szarym, białym lub czarnym
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	System śledzenia zachowań
EthoVisionXT 12	Noldus		; wymaga 3-punktowego śledzenia
Kamera wideo	Każda		kamera wideo powinna być zamontowana bezpośrednio nad głową urządzenia
70% etanolu	Fisher Scientific	BP2818-4	Przed rozpoczęciem testów i pomiędzy próbami każdy obiekt powinien być dokładnie oczyszczony. Podłoga i ściany urządzenia również powinny być czyszczone.