Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Streszczenie

W tym badaniu użyliśmy komórek krwi obwodowej (PBC) jako komórek nasiennych do produkcji chondrocytów za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sposób wolny od integracji. Po utworzeniu ciała zarodkowego (EB) i ekspansji komórek fibroblastycznych, iPSC są indukowane do różnicowania chondrogennego przez 21 dni w warunkach wolnych od surowicy i ksenoizolacji. Po indukcji chondrocytów fenotypy komórek są oceniane za pomocą analiz morfologicznych, immunohistochemicznych i biochemicznych, a także ilościowego badania PCR w czasie rzeczywistym markerów różnicowania chondrogennego. Granulki chondrogenne wykazują dodatnie zabarwienie błękitem alcyjnym i błękitem toluidynowym. Immunohistochemia barwienia kolagenem II i X jest również pozytywna. Zawartość siarczanowanych glikozaminoglikanu (sGAG) i chondrogenne markery różnicowania COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9 i AGGRECAN są znacznie podwyższone w granulkach chondrogennych w porównaniu z hiPSC i komórkami fibroblastycznymi. Wyniki te sugerują, że PBC mogą być wykorzystywane jako komórki nasienne do generowania iPSC do naprawy chrząstki, co jest specyficzne dla pacjenta i opłacalne.

Wprowadzenie

Tkanka chrzęstna ma bardzo słabą zdolność do samonaprawy i regeneracji. W celu przywrócenia funkcji chrząstki i stawów stosuje się różne interwencje chirurgiczne i zabiegi biologiczne, z niezadowalającymi wynikami. Niedawny rozwój technologii komórek macierzystych może zmienić całe pole naprawy chrząstki¹. Różne komórki macierzyste były badane jako komórki nasienne, ale ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) wydają się być najbardziej obiecującym wyborem, ponieważ mogą dostarczyć wiele typów komórek specyficznych dla pacjenta, nie powodując reakcji odrzucenia². Co więcej, mogą przezwyciężyć ograniczoną proliferacyjną naturę dorosłych komórek i utrzymać ich zdolności do samoodnawiania się i pluripotencjalne. Co więcej, celowanie genowe może być wykorzystane do zmiany genotypu w celu uzyskania określonych typów chondrocytów.

Fibroblasty były szeroko stosowane do generowania iPSC, ponieważ ich potencjał przeprogramowania również został dobrze zbadany. Jednak nadal istnieją pewne ograniczenia, które należy pokonać, takie jak bolesna biopsja od pacjentów i potrzeba ekspansji fibroblastów in vitro, co może skutkować mutacjami genów³. Ostatnio stwierdzono, że PBC są korzystne do przeprogramowania⁴; Co więcej, były one powszechnie wykorzystywane i obficie przechowywane. Możliwe, że mogą one przekierować uwagę badania ze skóry. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, istnieje niewiele doniesień na temat przeprogramowania PBC, a następnie różnicowania w chondrocyty.

W obecnym badaniu wykorzystujemy PBC jako alternatywne źródło, przeprogramowując je na iPSC, a następnie różnicując iPSC do linii chondrogenicznej poprzez system hodowli granulek, aby naśladować tworzenie chondrocytów.

Protokół

Protokół generowania hiPSC z PBC można znaleźć w naszym poprzednim badaniu⁵. Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną naszej instytucji.

1. Formacja ciała zarodkowego (EB)

1. Przygotuj 50 ml pożywki hiPSC: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 15% zamiennikiem surowicy nokautującej (KSR), 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1× aminokwasami endogennymi, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 8 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
2. Zrób 50 ml pożywki do tworzenia EB: DMEM uzupełniony 15% KSR, 5% FBS, 1x aminokwasy endogenne, 55 μM 2-merkaptoetanol i 2 mM L-glutamina.
3. Przygotuj 50 ml podstawowej pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 20% FBS, 1× nieistotnych aminokwasów, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy.
4. Przygotować 10 ml roztworu dypazy, 1 mg/ml w knockout DMEM.
5. Hodowla hiPSC na 60-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowej z komórkami zasilającymi (tj. monowarstwą napromieniowanych mysich embrionalnych komórek fibroblastów). Gdy komórki zlewają się w 80-90%, odłącz komórki od dyspazy i przechodź hiPSC 1:3 co 4-5 dni. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
6. Rozbioruj niezróżnicowane kolonie hiPSC na mniejsze kawałki (o średnicy około 50-100 μm) za pomocą igły szklanej ciągnionej ogniem, gdy iPSC są zlewające się w 80-90%. Ogólnie rzecz biorąc, użyj kolonii hiPSC w szalce o średnicy 60 mm, aby wygenerować EB na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
   1. Hodować mniej niż 100 małych kawałków kolonii na 100 mm, nieprzylegającej szalce Petriego zawierającej 10 ml pożywki do tworzenia EB. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
7. Zastąp około 25% początkowej pożywki równą ilością podstawowej pożywki co 2 dni. Przechyl naczynie, aby EB się uspokoiły. Ostrożnie usuń 3 ml górnej pożywki i dodaj 4 ml świeżej podstawowej pożywki hodowlanej. Nie przeszkadzaj EBs.
   UWAGA: EB są morfologicznie scharakteryzowane przez kawałki kolonii, które pod mikroskopem przybierają okrągły wygląd z gładkimi obwódkami.
8. Po 10 dniach hodowli na nieprzylegającej szalce Petriego, przed użyciem pokryć nową 100-milimetrową szalkę do hodowli tkankowej 4 ml 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
9. Przenieść pożywkę plus EBs z nieprzylegającej płytki Petriego o średnicy 100 mm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozwól EBs osiadać przez 4-5 minut. Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić mniej niż 0,5 ml pożywki plus EB
10. Wysiewać mniej niż 100 EB na 100 mm, pokrytym żelatyną naczyniu do hodowli tkankowych z 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}

2. Tworzenie osadów komórkowych i różnicowanie chondrocytów

1. Przygotuj 10 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Przygotuj 80 ml podstawowej pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 20% FBS, 1x aminokwasy endogenne, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy.
2. Przygotuj 10 ml pożywki do różnicowania chondrogennego: DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełniony 10% roztworem insuliny-transferyny-selenu (ITS), 0,1 μM deksametazonu, 1 mM kwasu askorbinowego, 1% pirogronianu sodu i 10 ng / ml transformującego czynnika wzrostu-beta 1 (TGF-β1).
3. Po 48 godzinach odświeżyć pożywkę za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odświeżaj pożywkę co trzy dni za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Po 10 dniach w hodowli wyrostki komórek fibroblastycznych powinny się rozszerzyć z EB.
   1. Przed użyciem pokryć szalki o średnicy 100 mm 4 ml 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Wyrzuć supernatant komórek i przemyj je jednokrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
   2. Trawić komórki 3 ml 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut i neutralizować 4 ml podstawowej pożywki hodowlanej.
4. Zdysocjuj komórki na pojedyncze komórki, pipetując w górę iw dół 5-10 razy i przepuszczając je przez nylonową siatkę o grubości 70 μm. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut. Ponownie zasiać komórki na nowym, pokrytym żelatyną naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm z 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej.
5. Po 48 godzinach odświeżyć pożywkę za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odświeżaj pożywkę co trzy dni za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej.
   UWAGA: Komórki uzyskują jednorodną, podobną do fibroblastów morfologię.
6. Po osiągnięciu ~90-100% konfluencji (tj. około 5-7 dni), zbierz komórki z 3 ml 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizuj 4 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Zdysocjuj komórki na pojedyncze komórki, pipetując w górę iw dół 5 razy. Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek.
   1. Umieść 3 x 10⁵ komórek w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do różnicowania chondrogennego.
7. Ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty i utrzymywać komórki w postaci małych granulek. Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 21 dni. Nie dokręcaj mocno pokrywy i nie pozwól, aby gaz się wymienił.
8. Zastąpić 3/4 pożywki hodowlanej co trzy dni świeżą pożywką do różnicowania chondrogennego.
   UWAGA: Po 21 dniach w hodowli powinny powstać pastylki chondrogenne hiPSC (hiPSC-Chon). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), jako kontrola pozytywna, są również pobierane i hodowane w pożywce różnicowania chondrogennego przez 21 dni w celu wytworzenia chondrogennych osadów (hMSC-Chon).

3. Analiza różnicowania chondrogennego

1. Przygotuj 10 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny.
2. Przygotować 50 ml 0,1% odczynnika błękitu alcyjnego i 50 ml 1% odczynnika błękitu toluidynowego.
3. Przygotuj 1 ml przeciwciał pierwszorzędowych: króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko kolagenowi II (1:50) lub mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko kolagenowi X (1:50). Przygotuj również przeciwciała drugorzędowe przeciwko królikom lub myszy.
4. Przygotuj 1 ml roztworu papainy: 10 U/ml w PBS z 0,1 M octanem sodu, 2,4 mM EDTA i 5 mM L-cysteiną.
5. Przygotować 100 ml roztworu barwnika błękitu dimetylometylenowego (DMMB): 100 μl 1,9 mg/l błękitu 1,9-dimetylometylenowego, 40 mM glicyny, 40 mM NaCl i 9,5 mM HCl; pH 3,0.
6. Ocenić różnicowanie chondrogenne za pomocą barwienia błękitem alcyjnym i błękitem toluidynowym w skrawkach osadu.
   1. Utrwal jedną pastylkę hiPSC-Chon lub pastylkę hMSC-Chon w 1 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny przez 24 godziny.
   2. Przenieść osad do 1 ml 70% etanolu w H_2O. Odwodnić osad 1 ml sortowanego etanolu (tj. 25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100%, po 3 minuty).
   3. Sklarować osad w 1 ml 100% ksylenu trzy razy. Osad naciekać parafiną przez 1 godzinę w piecu o temperaturze 65 °C. Osadź granulat w blokach parafinowych za pomocą formy bazowej 7 x 7 x 5 mm³, postępując zgodnie z rutynowymi procedurami histologicznymi⁶.
   4. Wykonaj sąsiednie sekcje za pomocą mikrotomu o grubości około 4 μm⁷. Przyklej sekcje do szkiełek szkiełkowych.
   5. Szkiełka suszyć przez 2 godziny w temperaturze 60 °C w piekarniku. Odparafinować skrawki w trzech cyklach (każdy po 3 minuty) przy użyciu 100% ksylenu.
   6. Do nawodnienia należy użyć serii zmniejszających się alkoholi (tj. 100, 100, 95, 95, 70, 50 i 25% w_H2O, po 3 minuty), a następnie wykonać końcowe płukanie wodą dejonizowaną przez 5 minut.
   7. Zabarwić skrawki 0,1% odczynnikiem błękitu alcyjnego lub 1% błękitem toluidynowym przez 4-5 godzin, a następnie spłukać je wodą destylowaną.
   8. Odwodnić za pomocą serii stopniowanych etanoli (tj. 25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100%, po 3 minuty każdy), a następnie wykonać trzy kolejne etapy klarowania w 100% ksylenie. Zamontuj szkiełka i zwizualizuj je pod mikroskopem.
7. Wykonaj immunohistochemię.
   UWAGA: Dodatkowe skrawki osadu są dalej oceniane za pomocą immunohistochemii.
   1. Po odparafinowaniu i ponownym nawodnieniu doprowadzić szkiełka do wrzenia w 1 mM EDTA, pH 8,0 (wodoodporne w wodzie zagotowanej w autoklawie). Pozostaw je na 8 minut w temperaturze poniżej wrzenia, a następnie pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
   2. Opłucz szkiełka 3 razy wodą dejonizowaną. Inkubować skrawki w 3% roztworze_H2O2w metanolu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy.
   3. Przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i zanurzyć je w DPBS na 5 min. Na skrawki na szkiełkach nanieść 50-100 μl odpowiednio rozcieńczonego (1:50) przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubować je w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   4. Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut) za pomocą DPBS. Próbki należy inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tj. przeciwciałami anty-króliczymi lub myszymi) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) za pomocą DPBS. Wykonaj detekcję DAB pod mikroskopem.
   6. Umyj szkiełka DPBS 3 razy (po 2 minuty). Przeciwbarwić jądra komórkowe, zanurzając szkiełka w hematoksylinie na 1-2 min. Odwodnić za pomocą serii stopniowanych etanoli (25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100% każdy; 3 minuty każdy), a następnie wykonać trzy kolejne etapy klarowania ksylenem. Na koniec zamontuj szkiełka i zwizualizuj je pod mikroskopem.
8. Wykrywanie zawartości sGAG.
   1. Trawić chondrogenne granulki w roztworze papainy w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.
   2. Określ zawartość DNA za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA i systemu fluorometru. Zmierz zawartość sGAG, mieszając ją z roztworem barwnika DMMB przy pomiarze absorbancji przy 525 nm⁸.
   3. Oblicz stężenie sGAG w stosunku do krzywej wzorcowej siarczanu chondroityny rekina.
9. Wykonaj analizę PCR w czasie rzeczywistym markerów różnicowania chondrogennego w granulkach hiPSC-Chon.
   1. Zbierz 3-4 takie same chondrogenne granulki, dodając 500 μl lodowatego odczynnika ekstrakcyjnego do jednej probówki. Dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 0,1 ml chloroformu. Wirować próbkę przez 15 s i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną (około 250 μl) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   3. Do próbki dodać 25 μl octanu sodu i 1 μl glikogenu. Wytrącić RNA, mieszając je z 250 μl alkoholu izopropylowego. Dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
   4. Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant. Przemyć osad RNA dwukrotnie 500 μl 75% etanolu.
   5. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć wszystkie resztki etanolu i wysuszyć granulkę RNA na powietrzu przez 5-10 minut. Rozpuść RNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz.
   6. Przekształć RNA w cDNA za pomocą systemu odwrotnej transkryptazy. Poddaj próbki cDNA PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zestawu qPCR master mix (2x) i systemu PCR w czasie rzeczywistym⁹.
      UWAGA: Sekwencje starterów to:
      hAGGRECAN-F:TCGAGGACAGCGAGGCC;
      hAGGRECAN-R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      hβ-ACTIN-F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      hβ-ACTIN-R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      hCOL2-F:TGGACGATCAGGCGAAACC;
      hCOL2-R:GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      hSOX9-F:AGCGAACGCACATCAAGAC;
      hSOX9-R:CTGTAGGCGATCTTGGGG;
      hCOL10-F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      hCOL10-R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Wyniki

Chondrogenne różnicowanie hiPSC:

Pożywka do tworzenia EB i podstawowa pożywka hodowlana zostały użyte do różnicowania hiPSC do linii mezenchymalnej. Zastosowano metodę hodowli wieloetapowej (Rysunek 1). Po pierwsze, hiPSC były spontanicznie różnicowane poprzez tworzenie EB przez 10 dni (D10; Rysunek 2A). Po drugie, komórki wyrastały z EB przez kolejne 10 dni (D10 + 10). Podczas tych...

Dyskusja

W tym miejscu udostępniamy protokół generowania chondrocytów z PBC za pośrednictwem iPSC. Ponieważ PBC są bardziej powszechne i szeroko stosowane w dziedzinie klinicznej, są one przedstawiane jako potencjalna alternatywa dla przeprogramowania. W tym badaniu wektory episomalne (EV) wykorzystano do przeprogramowania PBC na iPSC, zgodnie z metodą ustaloną przez Zhanga i wsp.¹¹. To podejście bez integracji nie obejmuje integracji genotoksyczności związanej z wirusem, która, jak się uważa, ma ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Pożywka bazowa stosowana do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB
Wymiana surowicy nokautującej (KSR)	Invitrogen	10828028	Bardziej zdefiniowany, wolny od FBS suplement diety stosowany do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyclon	sh30070.03	Stosowany do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB, oferuje doskonałą wartość dla komórek kultura
Aminokwasy endogenne	Chemicon	TMS-001-C	Stosowany jako suplement wzrostu we wszystkich pożywkach do hodowli komórkowych, w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek
L-glutamina	Invitrogen	TMS-002-C	Aminokwas niezbędny do hodowli komórkowej
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)	Peprotech	100-18B	Cytokina stosowana do podtrzymania pluripotencji i samoodnawiania hiPSC
Dispase	Invitrogen	17105041	Używany do dysocjacji hiPSC dla subkultury
DMEM	Gibco	C11960	Pożywka podstawowa używana do pożywki hodowlanej MSC
0,1% żelatyny	Milipore	ES-006-B	Używany do przyłączania komórek do szalek
0,25% trypsyna/EDTA	Gibco	25200072	Używany do dysocjacji komórek
DPBS	Gibco	14190250	Zbilansowany roztwór soli stosowany do przemywania komórek lub odczynnika do przygotowania
2-merkaptoetanolu	invitrogen	21985023	Stosowany jako suplement wzrostu we wszystkich pożywkach do hodowli komórkowych.
ITS	invitrogen	41400045	Insulina, Transferyna, Roztwór selenu.Służy do różnicowania chondrogennego.
Kwas askorbinowy	Sigma	4403	Znany jako witamina C. Pomaga w aktywnym wzroście i ma właściwości przeciwutleniające.
Pirogronian sodu	Gibco	11360070	Dodawany do pożywki do hodowli komórkowych jako źródło energii oprócz glukozy.
Transformujący czynnik wzrostu-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Cytokina, która reguluje proliferację, wzrost i różnicowanie chondrogenne komórek.
Królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko Collagen II	Abcam	ab34712	To przeciwciało reaguje z kolagenami typu II, które są specyficzne dla tkanek chrzęstnych.
Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko Collagen X	Abcam	ab49945	To przeciwciało reaguje z kolagenem typu X, który jest produktem hipertroficznych chondrotocytów.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Do montażu i długotrwałego przechowywania szkiełek
Toluidyna niebieska	Sigma	89640	Służy do wykrywania proteoglikanów.
Błękit alcyjski	Amresco	#0298	Służy do wykrywania glukozaminoglikanów.
Papaina	Sigma	P4762-25MG	Służy do trawienia granulek chondrogennych.
Błękit dimetylometylenowy	Sigma	341088-1G	Służy do ilościowego oznaczania glikozaminoglyanów
Sól sodowa siarczanu chondroityny z chrząstki rekina	Sigma	C4384-250MG	Służy do rysowania standardowej krzywej do pomiaru zawartości sGAG.
Zestaw do oznaczania zawartości DNA Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851 (100)	Służy do oznaczania zawartości DNA
TRIzol	Invitrogen	15596018	Służy do izolacji RNA z komórek
System odwrotnej transkryptazy	Promega	A3500	Służy do konwersji RNA do cDNA
SYBR FAST qPCR kit Master Mix	Kapa	KK4601	Używany do PCR w czasie rzeczywistym