Artykuł metodologiczny

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55731

⸱

24 sierpnia 2017

 ,  , 
1Department of Health Care Sciences, Physical Therapy Program, College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Streszczenie

Mięśnie szkieletowe posiadają zdolność regeneracyjną dzięki rezydującym w tkance, generującym włókna mięśniowe (miogenicznym) komórkom satelitarnym (SC), które mogą tworzyć nowe włókna mięśniowe w odpowiednich warunkach. Chociaż SC można pobrać z tkanki mięśniowej i hodować in vitro, powstałe komórki mioblastów nie są zbyt skuteczne w promowaniu miogenezy po przeszczepieniu do mięśnia gospodarza. Chirurgiczne odsłonięcie mięśnia gospodarza i przeszczepienie segmentów tkanki mięśniowej dawcy lub izolowanych włókien mięśniowych z ich SC na mięsień gospodarza sprzyja lepszej miogenezie w porównaniu z przeszczepem mioblastów. Opracowaliśmy nowatorską technikę, którą nazywamy Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME). MIME polega na przeprowadzeniu igły chirurgicznej przez mięsień gospodarza, przeciągnięciu fragmentu tkanki mięśniowej dawcy przez ścieżkę igły, a następnie pozostawieniu tkanki dawcy osadzonej w mięśniu gospodarza, aby mogła działać jako źródło SC dla mięśnia gospodarza. Tutaj szczegółowo opisujemy kroki związane z wykonywaniem MIME w modelu myszy z niedoborem odporności, który wyraża zielone białko fluorescencyjne (GFP) we wszystkich swoich komórkach. Niedobór odporności u myszy gospodarza zmniejsza ryzyko odrzucenia immunologicznego tkanki dawcy, a ekspresja GFP umożliwia łatwą identyfikację włókien mięśniowych gospodarza (GFP+) i włókien mięśniowych pochodzących z komórek dawcy (GFP-). Nasze dane pilotażowe sugerują, że MIME można wykorzystać do wszczepienia mięśnia prostownika długiego palca (EDL) od myszy dawcy do mięśnia piszczelowego przedniego (TA) myszy gospodarza. Nasze dane sugerują również, że gdy miotoksyna (chlorek baru, BaCl2) jest wstrzykiwana do mięśnia gospodarza po MIME, istnieją dowody na miogenezę pochodzącą z komórek dawcy w mięśniu gospodarza, przy czym około 5%, 26%, 26% i 43% włókien w pojedynczym mięśniu TA gospodarza nie wykazuje udziału gospodarza, minimalny wkład gospodarza, umiarkowany wkład gospodarza, i maksymalny udział gospodarza.

Wprowadzenie

Zdrowe mięśnie szkieletowe, mimo że postmitotyczne, mają doskonałą zdolność regeneracyjną dzięki obecności rezydujących w tkankach komórek miogennych znanych jako komórki satelitarne (SCs)1,2; i przejrzane w3,4. Jednak w stanach patologicznych spowodowanych dystrofiami mięśniowymi, urazami lub przyspieszonym starzeniem się, regeneracja mięśni może nie nadążać za rozpadem mięśni, a zatem dochodzi do postępującej utraty włókien mięśniowych5. Chociaż opracowano skuteczne metody izolowania SC od mięśni i namnażania ich w kulturze w celu wygenerowania dużej liczby mioblastów (a następnie miotub), próby wygenerowania fizjologicznie istotnej liczby włókien mięśniowych w mięśniach gospodarza przyniosły tylko minimalny sukces6. Podobnie jak w przypadku wielu innych typów komórek, gdy mioblasty są wstrzykiwane samodzielnie do tkanki gospodarza, większość komórek nie jest wszczepiana7,8. Wykazaliśmy, że stymulacja elektryczna nerwowo-mięśniowa (NMES) ułatwia miogenezę pochodzącą z komórek dawcy w mięśniu myszy gospodarza z niedoborem regeneracji, któremu wstrzyknięto ludzkie mioblasty8. Inni wykazali, że chirurgiczne przeszczepianie biopsji mięśni lub pojedynczych włókien mięśniowych z dołączonymi SC ułatwia umiarkowaną miogenezę nawet bez NMES, co sugeruje, że wszczepianie całych włókien mięśniowych za pomocą SC może być bardziej korzystne niż wszczepianie samych komórek miogennych9,10. Ponieważ dawca lub zmodyfikowana tkanka mięśniowa przeszczepiona do mięśnia gospodarza daje lepsze wyniki niż samo przeszczepienie komórek, możliwe jest, że tkanka lub struktury podobne do tkanek mogą dostarczyć kluczowych wskazówek do wszczepienia komórek dawcy; Koncepcja, która staje się coraz bardziej widoczna w badaniach nad terapią komórkową obejmującą różne typy komórek10,11,12.

Ostatnie dane sugerują, że SC uzyskane od ludzi ponad 2 tygodnie po uśmierceniu generują miotubes w culture13. W związku z tym zamierzamy ocenić, czy wszczepienie tkanki mięśniowej pobranej pośmiertnie żywemu gospodarzowi odwróci utratę włókien mięśniowych. Opracowaliśmy nowatorską technikę zwaną MIME do wszczepiania tkanki mięśniowej dawcy do tkanki mięśni szkieletowych żywego gospodarza w celu promowania miogenezy pochodzącej z komórek dawcy. MIME polega na przeprowadzeniu igły chirurgicznej przez mięsień gospodarza w celu wytworzenia ścieżki igły; przeciągnięcie małego odcinka tkanki mięśniowej dawcy przez tor igły; pozostawienie tkanki dawcy osadzonej w mięśniu gospodarza; i zamykanie otworów po igłach klejem tkankowym. Po przećwiczeniu techniki na uśpionych myszach badanych w innych eksperymentach, przeprowadziliśmy teraz MIME na żywych myszach, które mają niedobór odporności i wszechobecnie eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP), a następnie przeprowadziliśmy obserwację po 3 i 14 dniach od MIME. Po 3 dniach od MIME potwierdzamy, że mięsień EDL myszy dawcy (GFP-) wszczepiony do mięśnia TA myszy gospodarza (GFP+) pozostaje osadzony w mięśniu gospodarza. Po 14 dniach od MIME, po uszkodzeniu miotoksyny BaCl2 w celu wywołania uszkodzenia i miogenezy, potwierdzamy, że około 5%, 26%, 26% i 43% włókien w mięśniu TA pojedynczego gospodarza nie wykazuje odpowiednio żadnego wkładu gospodarza, minimalny wkład gospodarza, umiarkowany wkład gospodarza i maksymalny wkład gospodarza. Centralne zarodkowanie (marker zwyrodnienia i późniejszej regeneracji) obserwuje się w około 95% włókien mięśniowych TA po wstrzyknięciu MIME i miotoksyny.

Badamy mięśnie TA 14 dni po MIME+BaCl2, ponieważ ten punkt czasowy ujmuje pośredni etap regeneracji, kiedy większość zregenerowanych włókien jest centralnie jądrkowana. Badamy myszy GFP+ jako gospodarzy dla MIME, więc kiedy w końcu przeszczepimy ludzkie mięśnie zwłok myszom-gospodarzom, będziemy w stanie łatwo odróżnić włókna mięśniowe pochodzące od gospodarza i dawcy. Używamy mysiego mięśnia EDL jako eksperymentalnej tkanki dawcy, ponieważ pojedyncze włókna z tego mięśnia wykazały większy potencjał miogenny niż mięśnie TA9. Mięsień EDL jest również synergistyczny z mięśniem TA i ma podobny skład typu włókien. Nasze wstępne dane sugerują, że MIME jest w stanie ułatwić miogenezę pochodzącą z komórek dawcy w mięśniu gospodarza.

Protokół

Wszystkie badania z udziałem żywych zwierząt są zatwierdzone przez Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) na Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, i są zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (8th Edition, 2011, opublikowane przez National Academies Press, 500 Fifth Street, NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IACUC, zabiegi związane z bólem i/lub dystresem były wykonywane w znieczuleniu ogólnym, które jest wywoływane i utrzymywane przez inhalację izofluranu (1,5 - 5% do skutku). Znieczulenie weryfikowano poprzez brak odstawienia z powodu uszczypnięcia palców u nóg oraz brak odpowiedzi powiekowej lub wibrysowej (procent izofluranu zwiększano w zależności od potrzeb, aby utrzymać efekt). Ze względu na minimalnie inwazyjny charakter protokołów, zastosowano technikę "sterylnych końcówek". Podczas gdy zwierzęta były pod narkozą, wazelinę nakładano na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Nie było wymagane żadne specjalne leczenie; Jednak żel dietetyczny podawano zwierzętom przez 24 godziny po zabiegach, które obejmowały znieczulenie ogólne. Badacz jest zatwierdzony przez IACUC do wstrzymania analgezji po MIME, ponieważ procedura nie obejmuje chirurgicznego odsłaniania mięśnia gospodarza, ponieważ jest on ograniczony do jednej kończyny tylnej i nie wpływa na normalne funkcjonowanie, a także dlatego, że wiadomo, że wiele popularnych leków przeciwbólowych wpływa na normalną regenerację mięśni.  

1. Modele zwierząt

  1. Myszy hosta dla MIME
    1. Użyj myszy NSG-GFP (8 - 10 tygodni, samce) jako gospodarzy w badaniach nad przeszczepami mięśni.
      UWAGA: Myszy te są idealnymi gospodarzami dla allogenicznych przeszczepów mięśni, ponieważ brakuje im dojrzałych limfocytów T i B oraz funkcjonalnych komórek NK, mają niedobór sygnalizacji cytokin i były używane przez innych do allofilacji lub ksenoprzeszczepu komórek niemięśniowych14. Wszechobecna ekspresja GFP pozwala na łatwą identyfikację włókien mięśniowych gospodarza (GFP+) i komórek dawcy (GFP-).
  2. Myszy dawcy do MIME
    1. Użyj myszy C57BL/6J (12 - 16 tygodni) jako myszy dawcy.
      UWAGA: Myszy te są odpowiednimi myszami dawcami, ponieważ mają w pełni zmapowany genom, nie wiadomo, czy mają jakąkolwiek patologię mięśni szkieletowych, są łatwo dostępne i ekonomiczne oraz nie wykazują ekspresji GFP.

2. Przygotowanie tkanki mięśniowej dawcy

  1. Wiązanie, szwy prowadzące i pobieranie mięśni EDL dawcy
    1. Eutanazja myszy dawców przez zwichnięcie szyjki macicy i torakotomię wykonane w znieczuleniu ogólnym podawanym przez stołowy parownik izofluranu napędzany tlenem medycznym (wziewny izofluran; 2 - 5% do skutku).
    2. Aby uzyskać dostęp do mięśni EDL, użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć skórę na przedniej powierzchni nogi. Zlokalizuj mięsień TA w przedniej nodze i usuń go, aby uwidocznić mięsień EDL, który znajduje się za mięśniem TA. Wsuń końcówkę kleszczy za mięsień EDL i delikatnie zastosuj trakcję, aby sprawdzić, czy palce u nóg się rozciągają (potwierdza to, że mięsień jest EDL).                                                                            
      UWAGA: Obszar tkanki dawcy powinien być chirurgicznie, aseptycznie przygotowany przed pobraniem.
    3. Użyj ~ 10 cm segmentów jedwabnego, plecionego, niewchłanialnego, sterylnego szwu 4-0 i wykonaj dwa podwójne węzły, aby założyć szwy prowadzące na ścięgna bliższe i dalsze mięśnia EDL. (Rysunek 1A).
    4. Przeciąć dystalne ścięgno EDL, odbić mięsień EDL i przeciąć ścięgno proksymalne.
    5. Umieść mięśnie EDL dawcy na szalce Petriego wypełnionej mysim roztworem Ringera.

3. Przygotowanie myszy hosta do MIME

  1. znieczulenie
    1. Umieść mysz gospodarza w znieczuleniu ogólnym (wziewny izofluran; 1,5 - 5% do skutku) podawanym przez stołowy waporyzator izofluranu napędzany tlenem medycznym.
    2. Wywołaj znieczulenie w komorze indukcyjnej, a następnie przenieś mysz do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie podczas wykonywania innych zabiegów na zwierzęciu. Zapewnij wsparcie termiczne za pomocą izotermicznej żelowej poduszki grzewczej, gdy zwierzę jest pod narkozą.
  2. Przygotowanie skóry
    1. Aby usunąć sierść zwierzęcia, nałóż krem do depilacji na przednią część lewej tylnej nogi. Prawa noga służy jako noga kontrolna do kolejnych zabiegów.
    2. Pozostaw krem do depilacji na 2 minuty. Usuń krem do depilacji wraz z oderwaną sierścią chusteczkami nasączonymi solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Po usunięciu sierści należy wyszorować skórę trzema naprzemiennymi chusteczkami z roztworem do szorowania powidonem i jodem oraz 70 % etanolem.
  3. Tworzenie ścieżki igły w mięśniu TA gospodarza
    1. Przełóż igłę chirurgiczną o rozmiarze 18 (1 cal) przez środek mięśnia TA gospodarza wzdłuż długiej osi mięśnia (Rysunek 1B). Przełóż igłę w kierunku głowowo-ogonowym, wzdłuż mięśnia TA i przez środek mięśnia brzucha (Rysunek 1B).
      UWAGA: Celem tego kroku jest stworzenie ścieżki igły, w której można osadzić kawałek mięśnia dawcy. Osadzenie tkanki dawcy w środku mięśnia TA potencjalnie umożliwiłoby migrację SC z tkanki dawcy i ułatwiłoby miogenezę w całym mięśniu TA gospodarza.
  4. Osadzanie tkanki dawcy w ścieżce igły mięśnia TA gospodarza
    1. Gdy igła chirurgiczna znajdzie się w mięśniu TA gospodarza, przełóż szwy prowadzące na jednym końcu tkanki dawcy przez światło igły chirurgicznej w kierunku ogonowo-głowowym (Rysunek 1C).
    2. Przeciągnąć tkankę dawcy przez tor igły, gdy igła jest wycofywana z mięśnia TA gospodarza w kierunku ogonowo-głowowym.
    3. Użyj szwów prowadzących na ogonowym i głowowym końcu tkanki dawcy, aby dostosować umiejscowienie tkanki dawcy. Upewnij się, że tkanka dawcy jest osadzona w mięśniu TA gospodarza (Rysunek 1D).
    4. Po zoptymalizowaniu rozmieszczenia tkanki dawcy odetnij szwy prowadzące, dokonaj ostatecznych korekt w umieszczeniu tkanki dawcy za pomocą kleszczy z cienką końcówką.
    5. Uszczelnij rany igłami skóry (Rysunek 1E - F) poprzez przybliżenie krawędzi rany za pomocą kleszczy i nałożenie kleju do tkanek weterynaryjnych za pomocą końcówki igły chirurgicznej o rozmiarze 27.

4. Domięśniowe wstrzyknięcie miotoksyny w celu wywołania skoordynowanego zwyrodnienia i regeneracji mięśni

  1. Po MIME wstrzyknij 50 - 60 μl 1,2% BaCl2 (miotoksyny) do mięśnia TA gospodarza, aby wywołać rozległe uszkodzenie włókien mięśniowych w mięśniu gospodarza i tkance dawcy w nim osadzonej15.
    1. Wstrzyknąć BaCl2 w 3 miejscach wzdłuż mięśnia TA gospodarza (proksymalne, środkowe i dystalne jedna trzecia mięśnia brzucha).
      UWAGA: Wstrzykiwanie miotoksyn, takich jak BaCl2, kardiotoksyny i noteksyna do mięśni szkieletowych, powoduje skoordynowane uszkodzenie włókien mięśniowych, po którym następuje regeneracja16.

5. Opieka nad zwierzętami po zabiegu

  1. Po wstrzyknięciu MIME i BaCl2 oczyść lewą tylną nogę myszy gospodarza etanolem i nałóż cienką warstwę wazeliny, aby chronić skórę.
  2. Po zabiegowej pielęgnacji skóry usuń mysz gospodarza ze stożka nosowego.
  3. Umieść mysz w samotnej klatce regeneracyjnej bez ściółki. Zapewnić wsparcie termiczne powracającemu do zdrowia zwierzęciu poprzez izotermiczną żelową poduszkę grzewczą umieszczoną pod połową klatki rekonwalescencji.
    UWAGA: Jedna połowa nie jest podgrzewana, więc w razie potrzeby zwierzę może odsunąć się od poduszki grzewczej.
  4. Po tym, jak mysz gospodarz całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia, przywróć zwierzę do jego pierwotnej klatki. Umieść zwierzę z powrotem w pomieszczeniu dla zwierząt do czasu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Monitoruj mysz hosta codziennie, aż będzie gotowa do kontynuacji – na przykład: po 3 lub 14 dniach od MIME. Zgodnie z MIME zwierzęta są monitorowane przez personel laboratoryjny, a także przez personel weterynaryjny – obejmuje to głównie ocenę, czy zwierzęta są bystre, czujne i reagujące; a także ocena, czy zwierzęta wykazują wyraźne oznaki bólu lub mają trudności z poruszaniem się, karmieniem, piciem i pielęgnacją.

6. Pobieranie tkanek

  1. Zbieranie mięśni gospodarza
    1. Eutanazja myszy gospodarzy poprzez zwichnięcie szyjki macicy i torakotomię wykonaną w znieczuleniu ogólnym podawanym przez stołowy parownik izofluranu napędzany tlenem medycznym (wziewny izofluran; 2 - 5% do skutku). Badacz posiada również zgodę IACUC na pobieranie mięśni TA w znieczuleniu ogólnym przed eutanazją.
    2. Aby uzyskać dostęp do mięśni TA gospodarza, użyj nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć skórę nad przednią powierzchnią nogi. Zlokalizuj mięsień TA w przedniej części nogi, przetnij dystalne ścięgno, odbij mięsień i przetnij przyczepy mięśni proksymalnych (patrz punkt 2.1).
    3. Zbierz zarówno lewe (eksperymentalne), jak i prawe (kontrolne) mięśnie TA.
  2. Zamrożenie pobranych mięśni
    1. Zważ pobrane mięśnie, umieszczając je na papierze wagowym i wadze.
    2. Krótko zanurz mięśnie w oleju mineralnym w celu krioprotekcji. Zetrzyj nadmiar oleju.
    3. Umieść mięśnie na folii aluminiowej i zamroź mięśnie, szybko zanurzając je w ciekłym azocie wypełnionym Dewarem. Przenieś próbki do oznakowanych kriowiali i przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do późniejszych badań.

7. Badania histologiczne

  1. Kriosekcja tkanki mięśniowej w celu pobrania seryjnych przekrojów poprzecznych
    1. Przenieść próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu, umieszczając je w urządzeniu Dewara zawierającym ciekły azot.
    2. W kriostacie należy obchodzić się z jedną próbką na raz. Za pomocą zimnej żyletki (ostrza przechowywanego w kriostacie) przeciąć próbkę dwukrotnie w środkowej części brzucha mięśnia TA, aby wytworzyć segment mięśnia o grubości około 1 - 2 mm. Zachowaj ten segment do wykonania sekcji kriostatu i włóż pozostałe części mięśni do kriowalu.
    3. Za pomocą środka zamrażającego o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) przymocuj gruby segment tkanki do krążka z próbką kriostatu. Umieść krążek z próbką na uchwycie próbki.
    4. Próbkę należy poddać próbce z powierzchni zgrubnej, wycinając odcinki o grubości 20 μm. Zebrać kilka skrawków o grubości 20 μm na szkiełkach podstawowych dla sekcji kriostatu.
    5. Jeśli jakość odcinków 20 μm jest zadowalająca, zmień grubość cięcia na 5 μm i zbierz kilka sekcji, aby ocenić jakość. Jeśli sekcje 5 μm są zadowalającej jakości, należy zebrać sekcje seryjne. Zbierz od 2 do 3 sekcji na slajd i zbierz wystarczającą ilość sekcji na 3 slajdy.
    6. Zbierz skrawki zarówno z doświadczalnych (po lewej), jak i kontrolnych (po prawej) mięśni TA każdego zwierzęcia.
  2. Badanie wyrażenia GFP
    UWAGA: Wyznacz jeden zestaw przygotowanych preparatów (sekcja 7.1) do badania ekspresji GFP we włóknach mięśniowych.
    1. Nałóż ~50 μl środka zapobiegającego blaknięciu na sekcje i nałóż szklane szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
    2. Za pomocą mikroskopu świetlnego i fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) należy przestudiować skrawki z obiektywem 10X i odpowiednim filtrem do wizualizacji GFP.
      1. Zbierz cyfrowe obrazy (~15) nakładających się pól widzenia, aby pokryć cały przekrój mięśnia TA. Zbierz obrazy kontrastu fazowego dla każdego z pól widzenia, przełączając się z trybu fluorescencji na tryb kontrastu fazowego w mikroskopie.
    3. Otwieranie obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, które może łączyć poszczególne obrazy w celu utworzenia pojedynczego obrazu kompozytowego; Na przykład należy użyć opcji "photomerge" w menu Plik w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu wymienionym w Tabeli materiałów.
    4. Otwórz obrazy fluorescencji GFP za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (np. ImageJ). Okrąż poszczególne włókna mięśniowe za pomocą "narzędzia ROI" i zapisz średnią intensywność fluorescencji dla każdego włókna.
      1. Oblicz maksymalną intensywność GFP (fluorescencji), biorąc średnią ze średniej intensywności fluorescencji 10 włókien, które wykazują wysoką ekspresję GFP i mają normalną morfologię. Obliczyć % maksymalnej intensywności GFP dla każdego włókna, dzieląc średnią intensywność kwitnienia dla każdego włókna przez maksymalną intensywność GFP i mnożąc przez 100. Tabelaryczne zestawienie wyników analizy GFP dla każdego mięśnia TA, jak pokazano na rysunku Rysunek 3E.
  3. Badanie integralności włókien mięśniowych i lokalizacji mięśniowo-jądrowej za pomocą immunofluorescencyjnego znakowania odpowiednio desminy i 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI).
    UWAGA: Wyznacz jeden zestaw szkiełek przygotowanych, jak wyżej, do zbadania znakowania desminy we włóknach mięśniowych.
    1. Utrwalić skrawki 2% paraformaldehydem w PBS przez 10 min. Umyć skrawki trzykrotnie za pomocą PBS.
      UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas obchodzenia się z paraformaldehydem.
    2. Blokuj skrawki z 3% albuminą surowicy bydlęcej rozcieńczoną w PBS zawierającym 0,01% Triton-X100 przez 30 min. Ten roztwór blokujący jest dalej określany jako rozcieńczalnik podstawowy.
    3. Rozcieńczyć króliczą immunoglobulinę anty-desminową G (IgG) w głównym rozcieńczalniku (1:200).
    4. Po zakończeniu blokowania nanieść rozcieńczone przeciwciała pierwszorzędowe na skrawki i inkubować przez noc w lodówce w temperaturze ~4 °C. Umyć skrawki raz (5 min) PBS zawierającym 0,1% Triton X-100. Roztwór ten określany jest dalej jako pierwszy bufor do płukania.
    5. Umyj sekcje 3 razy (5 minut na pranie) za pomocą PBS.
    6. Przygotować przeciwciało drugorzędowe przez rozcieńczenie koziej anty króliczej IgG (sprzężonej z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym) w PBS zawierającym 0,01% Triton X-100.
    7. Nałożyć rozcieńczone przeciwciało drugorzędowe na skrawki i inkubować w temperaturze pokojowej (~23 °C) przez 60 minut.
    8. Umyj sekcje raz (5 min) pierwszym buforem do mycia. Umyj sekcje 3 razy (5 minut na pranie) za pomocą PBS.
    9. Nakładaj DAPI przez 3 min. Umyj sekcje 3 razy (1 min na mycie) PBS. Na sekcje nanieść ~ 50 μL środka zapobiegającego blaknięciu i nałożyć szklane szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
    10. Za pomocą mikroskopu świetlnego i fluorescencyjnego (patrz tabela materiałów) należy zbadać przekroje seryjne za pomocą obiektywu 10X i odpowiedniego filtra do wizualizacji czerwonego barwnika fluorescencyjnego.
    11. Zbierz cyfrowe obrazy (~15) nakładających się na siebie pól widzenia, aby pokryć cały przekrój mięśnia TA. Zbierz obrazy fluorescencyjne etykietowania DAPI dla każdego z pól widzenia, przełączając się na odpowiednie ustawienie filtra.
    12. Otwórz i przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, jak opisano w krokach 7.2.3 - 7.2.4.
      UWAGA: Badaj obrazy, aby określić, które włókna mięśniowe są uszkodzone (desmin ujemne), które włókna mięśniowe mają centralne zarodkowanie (włókna desminy dodatnie, które mają jądra znakowane DAPI zlokalizowane wewnętrznie, a nie obwodowo) oraz które obszary sekcji mają stan zapalny i / lub zwłóknienie (obszary, które mają wiele jąder znakowanych DAPI zgrupowanych razem, ale są pozbawione włókien mięśniowych).

Wyniki

W 3. dniu po MIME, donorski mięsień EDL wszczepiony za pomocą MIME znajduje się w obrębie przedziału mięśnia TA gospodarza (Rycina 2A-C). Zgodnie z oczekiwaniami, przekroje poprzeczne mięśnia TA myszy donora, badane przy użyciu optyki fluorescencyjnej, nie wykazują zielonej fluorescencji, ponieważ nie wykazują one ekspresji GFP (Rycina 2D). W przeciwieństwie do nich, przekroje poprzeczne mięśnia TA myszy gospodarza, w których nie wszczepiono tkanki donora, wykazują jednolitą zieloną fluorescencję w włóknach mięśnia TA, ponieważ włókna te wykazują ekspresję GFP (Rycina 2E). W przekrojach poprzecznych mięśni, w których za pomocą MIME wszczepiono donorską tkankę mięśniową, widoczna jest linia demarkacyjna między włóknami mięśniowymi gospodarza (GFP+) a włóknami mięśniowymi donora (GFP-). Obrazy w kontraście fazowym pól widzenia pokazanych na Rycini 2D-F przedstawiono na Rycini 2E'-F', co sugeruje, że w obszarach pozbawionych sygnału GFP rzeczywiście obecne są włókna mięśniowe.

W 14. dniu po wstrzyknięciu MIME i BaCl2, badając seryjne przekroje poprzeczne mięśnia TA, które pozostały nieoznakowane lub zostały oznakowane przeciwciałami przeciwko desminie (Rysunek 3), stwierdzono, że sygnał GFP jest wyrażany przez wszystkie włókna mięśniowe w nieleczonym mięśniu myszy gospodarza, ale nie w mięśniu traktowanym MIME (czerwone oznakowanie desminy wykrywa żywe włókna mięśniowe). W mięśniu TA gospodarza po wstrzyknięciu MIME i BaCl2 miogeneza pochodząca z komórek donora jest widoczna dzięki obecności wielu włókien mięśniowych desmin(+), które nie wykazują wykrywalnego sygnału GFP (Rysunek 3C-D, 3 C'-D'). Chimeryczne włókna mięśniowe, powstałe prawdopodobnie w wyniku fuzji miogennych komórek gospodarza i donora, można wykryć dzięki niskiemu lub umiarkowanemu poziomowi fluorescencji GFP wykazywanemu przez te włókna. Liczne włókna chimeryczne pojawiają się w całym przekroju mięśnia TA, co sugeruje, że komórki satelitarne (SC) donora są zdolne do migracji na odległość kilkuset mikronów w obrębie epimysium mięśnia gospodarza. Ilościowe oznaczenie włókien GFP+ przedstawiono na Rysunku 3E. Rysunek 4 przedstawia zdjęcia przy dużym powiększeniu seryjnych przekrojów poprzecznych całego mięśnia TA traktowanego MIME+BaCl2.

Procedura chirurgiczna na kończynie szczura; kroki B-F; użycie instrumentów; tkanka, igła, szew, znieczulenie.
Rycina 1. Etapy procesu małoinwazyjnego osadzania mięśnia (MIME).
Procedurę MIME wykonuje się w znieczuleniu ogólnym. Polega ona na umieszczeniu ~10 mg mięśnia dawcy (mięsień EDL myszy dawcy) w roztworze Ringera i przywiązaniu nici prowadzących do jego końców (A). Igłę o rozmiarze 18G wprowadza się wzdłuż osi długiej mięśnia biorcy (B) , a następnie przez kanał po igle przeciąga tkankę dawcy (C). Tkanka dawcy zostaje osadzona w mięśniu biorcy (D), nici prowadzące są odcinane, a otwory po igle uszczelnia się klejem tkankowym (E). Uszczelnione miejsca po nakłuciach igłą wskazano strzałkami (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura transplantacji u myszy. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i histologii pokazujące integrację tkanki.
Rysunek 2. Badania mięśnia TA 3 dni po MIME.
Mięsień biorcy pobrany 3 dni po MIME; widoczne ślady po igle w mięśniu TA biorcy (strzałki; A-B). Dane dodatkowo potwierdzają, że wszczepiony mięsień EDL myszy dawcy znajduje się w obrębie przedziału mięśnia TA (B-C). Obrazy fluorescencyjne przekrojów poprzecznych mięśnia TA wykazują brak zielonej fluorescencji w mięśniu TA typu dzikiego (D), jasną zieloną fluorescencję w mięśniu TA myszy NSG-GFP (E) oraz rozróżnienie między mięśniem biorcy a dawcy w mięśniu TA myszy NSG-GFP 3 dni po MIME (F). Obrazy w kontraście fazowym dla pól widzenia z paneli D-F przedstawiono odpowiednio w D'-F'. Czerwona linia w panelach F i F' oznacza linię demarkacyjną między tkanką biorcy a dawcy. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Regeneracja włókien mięśniowych, analiza intensywności GFP w mikroskopii, obrazowanie fluorescencyjne, badanie komórkowe.
Rycina 3. Badania mięśnia TA 14 dni po MIME.
Przedstawiono dane zebrane 14 dni po MIME. Sygnał czerwony pochodzi z immunofluorescencyjnego znakowania desminy (sygnał dodatni dla desminy oznacza, że włókna mięśniowe są żywotne), sygnał niebieski pochodzi z DAPI (barwi jądra), a sygnał zielony pochodzi z GFP. W kontrolnym mięśniu TA (prawa kończyna tylna) pobranym od myszy gospodarza, zgodnie z oczekiwaniami, prawie wszystkie włókna mięśniowe są dodatnie w kierunku desminy, co sugeruje, że włókna te są żywotne (A; sygnał czerwony). Ponadto, na podstawie barwienia DAPI widoczne jest, że jądra mięśniowe prawie wszystkich włókien mięśniowych są zlokalizowane obwodowo, co jest typowe dla zdrowego mięśnia (A; sygnał niebieski). Przekroje seryjne kontrolnego mięśnia TA pokazują, że prawie wszystkie włókna mięśniowe są jasnozielone, co oznacza, że są one dodatnie w kierunku GFP. W mięśniu TA traktowanym MIME+BaCl2 (lewa kończyna tylna) miogeneza oparta na komórkach donora jest widoczna dzięki obecności wielu włókien mięśniowych desmin(+), które nie wykazują wykrywalnej fluorescencji GFP (C-D, C'-D'). Włókna mięśniowe desmin(+) o niskiej do umiarkowanej fluorescencji GFP (chimeryczne włókna mięśniowe) występują w całym przekroju mięśnia TA, co sugeruje, że MIME dostarcza donorowych SC, które mogą migrować w obrębie epimysium mięśnia TA i promować miogenezę pochodzącą z komórek donora. A'-D' to zdjęcia o dużym powiększeniu obszarów zaznaczonych niebieskimi ramkami na A-D. Ilościowe oznaczenie włókien GFP(+) oraz włókien z centralnie położonymi jądrami przedstawiono w E. Paski skali = 100 µm (A-D) i 50 µm (A'-D'). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej tkanki z kontrastowymi barwieniami; sekcje A-F; analiza struktury komórkowej.
Rysunek 4. Dowody na rozległe uszkodzenia i regenerację 14 dni po wstrzyknięciu MIME i BaCl2.
Przedstawiono seryjne przekroje poprzeczne całego mięśnia TA traktowanego MIME+BaCl2 w dużym powiększeniu. Dane wykazują, że wiele włókien mięśniowych, które są umiarkowanie lub silnie GFP+, posiada centralnie położone jądra (A-B; sygnał czerwony w A pochodzi od desminy, sygnał niebieski w A od DAPI, a sygnał zielony w B od GFP). Dane te sugerują, że degeneracja i regeneracja po wstrzyknięciu BaCl2 nie wpływa na ekspresję GFP. W tym kontekście obecność włókien mięśniowych z centralnie położonymi jądrami w mięśniu TA traktowanym MIME+BaCl2, przy niewielkiej lub braku ekspresji GFP, sugeruje, że włókna te są prawdopodobnym wynikiem miogenezy (lub regeneracji) z istotnym udziałem komórek miogennych GFP-. Obserwacje te można dodatkowo zweryfikować na obrazach wybranych pól w dużym powiększeniu (C-F; odpowiednio C i D oraz E i F są obszarami nakładającymi się z seryjnych przekrojów poprzecznych; kolorowe obramowania obrazów oznaczają położenie tych obszarów w A i B). Paski skali = 100 µm (A-B) i 50 µm (C-F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół nowatorskiej techniki eksperymentalnej znanej jako MIME, opracowanej w naszym laboratorium, polegającej na wszczepianiu tkanki mięśniowej dawcy do tkanki mięśniowej gospodarza. Jest to adaptacja techniki otwartego przeszczepu mięśni, która już okazała się skuteczna w promowaniu miogenezy za pośrednictwem komórek dawcy w mięśniu gospodarza 9,10,17.

Celem MIME nie jest umożliwienie wszczepienia samej tkanki mięśniowej dawcy do mięśnia gospodarza (obecnie nie wiemy, czy tak się dzieje), ale raczej zapewnienie źródła SC dawcy, które mogą przyczyniać się do miogenezy w mięśniu gospodarza w warunkach stymulujących regenerację mięśni. Mamy nadzieję, że po tym, jak MIME zostanie zoptymalizowany i przetestowany w badaniach podstawowych i przedklinicznych, może dostarczyć cennych informacji do kierowania terapiami klinicznymi mającymi na celu zwiększenie regeneracji mięśni w mięśniach szkieletowych, które uległy miogennej utracie mięśni.

Istnieje wiele pytań, na które nie ma jeszcze odpowiedzi, dotyczących tego, w jaki sposób MIME można przełożyć na terapię kliniczną, na przykład: W jaki sposób możemy kontrolować jakość tkanek dawcy? W jaki sposób możemy kontrolować odrzucanie immunologiczne tkanek i komórek dawcy? Czy tkanka dawcy jest oczyszczana po dostarczeniu komórek do miogenezy, czy też pozostawia bliznę zwłóknieniową? Czy rodzaj błonnika w mięśniu dawcy i/lub gospodarza wpływa na miogenezę, w której pośredniczy komórka dawcy? Które mięśnie mogą w praktyce skorzystać z MIME? Obecnie rozszerzamy nasze badania, aby ocenić, czy MIME jest bezpieczny i skuteczny, zidentyfikować leczenie wspomagające, które może zwiększyć miogenezę pochodzącą od dawcy i odpowiedzieć na wiele pytań wymienionych powyżej.

Po zakończeniu naszych testów allogenicznego przeszczepu myszy na mysz za pomocą MIME, naszym następnym krokiem jest wykonanie MIME z człowieka na mysz z tkanką ludzką w celu oceny potencjału miogennego tkanki mięśniowej zwłok. Przewidujemy, że eksperymenty te doprowadzą do nowej linii badań podstawowych i translacyjnych, która obejmuje tkankę mięśniową od dawców, którzy są zarejestrowani w inicjatywach takich jak Program Body Bequest na edukację i Program Dar Życia na rzecz dawstwa narządów.

Reprezentatywne dane przedstawione w tym manuskrypcie sugerują, że po 14 dniach od MIME istnieje kilka żywotnych włókien mięśniowych, które albo nie mają GFP, albo mają niski poziom GFP. Nasza interpretacja tych danych jest taka, że komórki satelitarne dawcy GFP przyczyniły się do miogenezy w mięśniu gospodarza. Przeprowadziliśmy ten eksperyment w ramach przygotowań do wszczepienia tkanki zwłok ludzkich do mięśnia myszy gospodarza. Aby jednoznacznie wykazać, że komórki satelitarne dawcy przyczyniają się do miogenezy w mięśniu gospodarza po MIME, przydatne byłoby wszczepienie tkanki dawcy, która wyraża fluorescencyjny reporter, który można łatwo odróżnić od GFP (np. czerwone białko fluorescencyjne wyrażające tkankę dawcy wszczepioną do mięśnia gospodarza GFP+).

Technika ta jest ograniczona głównie ze względu na charakter SC obecnych w tkance dawcy. Jeśli SC w tkance dawcy są żywotne, technika ta prawdopodobnie ułatwi miogenezę, w której pośredniczy komórka dawcy, podczas gdy jeśli nie są żywotne, miogeneza nie może wystąpić. Ponieważ jednak SC są bardzo odporne i są zdolne do życia przez około 2 tygodnie po uśmiertnie, jest wysoce prawdopodobne, że do celów eksperymentalnych tkanka dawcy, która zostanie wszczepiona w ciągu kilku minut po pobraniu, ułatwi miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy13. Dodatkowo, jak wspomniano powyżej, możliwe jest, że ponieważ cała tkanka mięśniowa (która zawiera SC, dojrzałe włókna mięśniowe, a także fibroblasty rezydujące w mięśniach) jest osadzona w mięśniu gospodarza, może dojść do zwłóknienia. Założenie to wymaga jednak empirycznego zbadania. Literatura na temat uszkodzeń mięśni wynikających z urazów, kriourazów i eksperymentalnych miotoksyn sugeruje, że komórki odpornościowe (głównie makrofagi) są zdolne do skutecznego usuwania zanieczyszczeń komórkowych z uszkodzonych włókien i przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej18. Dlatego możliwe jest, że po wstrzyknięciu MIME i BaCl2 , o ile komórki odpornościowe gospodarza mają dostęp do degenerujących się włókien mięśniowych dawcy, mogą usunąć zanieczyszczenia, pozostawiając tylko SC dawcy. Wreszcie, zakres miogenezy pochodzącej od dawcy zależy od ilości tkanki mięśniowej dawcy, która jest osadzona w mięśniu gospodarza. Aby przedział mięśniowy gospodarza został całkowicie ponownie zasiedlony przez włókna mięśniowe pochodzące z komórek dawcy, wymagałoby to metody takiej jak napromienianie X lub gamma w celu ablacji SC mięśni gospodarza, a także wymagałoby powtarzających się procedur MIME.

Wykazano, że chirurgiczne odsłonięcie mięśnia gospodarza i zszycie kawałka tkanki dawcy do mięśnia gospodarza może ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy 9,10,17. To otwarte podejście chirurgiczne było stosowane w przeszłości do śledzenia postępu miogenezy i generowania mysich modeli chorób mięśni u ludzi. Innowacyjnym aspektem techniki MIME jest to, że jest ona minimalnie inwazyjna i nie wymaga chirurgicznego odsłaniania mięśnia gospodarza. Zmniejsza to ryzyko infekcji jatrogennej i stopień dyskomfortu u zwierzęcia gospodarza, dzięki czemu w razie potrzeby bardziej realne jest wielokrotne wykonywanie MIME na tym samym mięśniu gospodarza.

Przewidujemy, że technika MIME może być odpowiednim udoskonaleniem otwartego podejścia chirurgicznego, które jest obecnie stosowane w celu wszczepienia tkanki mięśniowej dawcy myszy gospodarzowi. Może to przyspieszyć generowanie humanizowanych modeli myszy poprzez osadzenie biopsji ludzkiego mięśnia w mięśniu myszy gospodarza. Dodatkowo, opierając się na naszych wstępnych danych z przeszczepu myszy na mysz, przewidujemy, że MIME będzie skuteczny w osiąganiu miogenezy za pośrednictwem komórek dawcy z ludzkiej tkanki dawcy zwłok, o ile SC dawcy będą zdolne do życia. Wreszcie, dzięki dodatkowym testom i walidacji, mamy nadzieję, że technika MIME pomoże w opracowaniu nowych terapii ułatwiających miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy u ludzi z chorobami mięśni.

Powodzenie techniki MIME zależy w decydującym stopniu od precyzyjnego osadzenia tkanki dawcy w przedziale powięziowym (epimysium) mięśnia gospodarza. Tylko wtedy, gdy tkanka dawcy zostanie umieszczona w przedziale mięśniowym gospodarza, będzie w stanie dostarczyć SC do mięśnia gospodarza w precyzyjny sposób. Jeśli tkanka dawcy zostanie umieszczona poza mięśniem gospodarza, nie jest jasne, jaki byłby jej los. W naszym eksperymentalnym modelu MIME używamy mięśnia TA jako mięśnia gospodarza, ponieważ jest on widoczny i powierzchownie umieszczony w przednio-bocznej części nogi. Rozmiar, orientacja i anatomiczne położenie mięśnia TA ułatwia potwierdzenie, że tkanka dawcy jest prawidłowo umieszczona w mięśniu TA gospodarza po MIME. W tym artykule przedstawiliśmy dowody eksperymentalne, że tkanka dawcy pozostaje osadzona w mięśniu TA gospodarza po 3 dniach po MIME i że w mięśniu gospodarza występuje miogeneza za pośrednictwem komórki dawcy po 14 dniach po MIME.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była możliwa dzięki grantowi pilotażowemu od Alliance for Regenerative Rehabilitation Research and Training (AR3T) oraz pakietowi dla startupów wydziałowych od Wayne State University do JAR. AR3T jest wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer P2CHD086843. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy NSG-GFPLaboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME)Stock #021937Myszy gospodarzy z niedoborem odporności, które powszechnie wykazują ekspresję białka zielonej fluorescencji
C57BL / 6Jmyszy Laboratorium Jacksona (Bar Harbor, ME) Stan #000664Kontroluj myszy dawcy
Waporyzator stołowy z izofluranem VetEquip (Livermore, CA)Pozycja #901801System znieczulenia wziewnego
Magiczny krem do depilacjiSoftsheen Carson (Nowy Jork, NY)Nie dotyczyKrem do depilacji bez brzytwy
4-0 Jedwabne, czarne, plecione, niewchłanialne szwyRoboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD)SUT106631Szwy prowadzące do tkanek dawcy
Klej do tkanek weterynaryjnych VetBond3M (Maplewood, MN)Katalog #1469SbWeterynaryjny klej tkankowy do bezszwowego zamykania skóry
Chlorek baru Ricca Chemical Company (Arlington, Teksas)Produkt #R0854000-500A 854-16 Miotoksyna indukująca uszkodzenia mięśni i stymulująca regenerację
Poduszka grzewcza z żelu izotermicznego Deltaphase Braintree Scientific (Braintree, MA)  Pozycja #39DPPoduszka grzewcza zapewniająca wsparcie termiczne zwierzętom pod narkozą
HM525NX kriostatu   ThermoFisher (Waltham, MA)Katalog #HM525NX Kriostat do wytwarzania zamrożonych odcinków mięśni
Vectashield Anti fade MediumVector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA)Numer katalogowy: H-1000Pożywka zapobiegająca blaknięciu do zachowania fluorescencji w próbkach znakowanych immunofluorescencyjnie
Królicze przeciwciało anty DesminLabvision Thermo Scientific (Fremont, CA)RB9014PKrólicze przeciwciało anty desminowe do znakowania immunofluorescencyjnego desminy
Koza anty Rabbit Alexa 568 PrzeciwciałoThermoFisher (Waltham, MA)Katalog#: A-21069Kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi do znakowania immunofluorescencyjnego desminy
4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) Seracare (Milford, MA)Katalog #5930-0006 lub 71-03-01Odczynnik do fluorescencyjnego znakowania jąder
Axio Scope.A1 mikroskopCarl Zeiss (Peabody, MA) świetlny i fluorescencyjny#Axio A1
Photoshop CS4Adobe Systems (San Jose, Kalifornia)Photoshop CS4do kafelkowania obrazów
Obraz JNational Institutes of Health (Bethesda, MD)Obraz J dla 64-bitowego systemu operacyjnego WindowsOprogramowanie do obrazowania do ilościowej analizy fluorescencji
Mikroskop Oprogramowanie do obrazowania

Bibliografia

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  2. Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
  3. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
  4. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
  5. Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31(2011).
  6. Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
  7. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  8. Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4(2015).
  9. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  10. Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
  11. Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
  12. Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
  13. Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903(2012).
  14. Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
  15. Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
  16. Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).
  17. Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
  18. Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja mi ni szkieletowychtransplantacja kom rek satelitarnychimmunodeficyjny model mysiledzenie ekspresji GFPwstrzykiwanie chlorku barumi sie prostownik d ugi palc wmi sie piszczelowy przednikana po igle chirurgicznej
Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.