Artykuł metodologiczny

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 czerwca 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC) przekształca energię pochodzącą z rozkładu różnych paliw w bioenergetyczną walutę komórki, ATP. ETC składa się z 5 masywnych kompleksów białkowych, które również łączą się w superkompleksy zwane respirasomami (C-I, C-III i C-IV) i syntasomami (C-V), które zwiększają wydajność transportu elektronów i produkcji ATP. Od ponad 50 lat stosuje się różne metody pomiaru funkcji ETC, ale protokoły te nie dostarczają informacji na temat składania poszczególnych kompleksów i superkompleksów. Protokół ten opisuje technikę natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), metody, która została zmodyfikowana ponad 20 lat temu w celu zbadania złożonej struktury ETC. Natywna elektroforeza pozwala na rozdzielenie kompleksów ETC na ich aktywne formy, a kompleksy te można następnie badać za pomocą immunoblottingu, testów w żelu (IGA) i oczyszczania przez elektroelucję. Łącząc wyniki natywnego żelu PAGE z wynikami innych testów mitochondrialnych, możliwe jest uzyskanie pełniejszego obrazu aktywności ETC, jej dynamicznego składania i demontażu oraz tego, jak reguluje to strukturę i funkcję mitochondriów. W niniejszej pracy omówione zostaną również ograniczenia tych technik. Podsumowując, przedstawiona poniżej technika natywnego PAGE, a następnie immunoblottingu, IGA i elektroelucji, jest potężnym sposobem badania funkcjonalności i składu mitochondrialnych superkompleksów ETC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Energia mitochondrialna w postaci ATP jest nie tylko niezbędna do przetrwania komórki, ale także do regulacji śmierci komórki. Wytwarzanie ATP przez fosforylację oksydacyjną wymaga funkcjonalnego łańcucha transportu elektronów (ETC; Cx-I do IV) i mitochondrialnej syntazy ATP (Cx-V). Ostatnie badania wykazały, że te duże kompleksy białkowe są zorganizowane w superkompleksy, zwane respirasomami i syntasomami1,2. Wyzwaniem jest analiza składania, dynamiki i regulacji aktywności tych masywnych kompleksów i superkompleksów. Podczas gdy pomiary zużycia tlenu wykonane za pomocą elektrody tlenowej i testy enzymatyczne przeprowadzone za pomocą spektrofotometru mogą dostarczyć cennych informacji na temat aktywności kompleksu ETC, testy te nie mogą dostarczyć informacji na temat obecności, wielkości i składu podjednostek zaangażowanego kompleksu białkowego lub superkompleksów. Jednak rozwój niebieskiego i przezroczystego natywnego (odpowiednio BN i CN) PAGE3 stworzył potężne narzędzie do ujawniania ważnych informacji o złożonym składzie i składaniu/demontażu oraz o dynamicznej regulacji supramolekularnej organizacji tych ważnych kompleksów oddechowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych4.

Łączenie tych kompleksów w superkompleksy wyższego rzędu wydaje się regulować strukturę i funkcję mitochondriów5. Na przykład, montaż respirasomu zwiększa efektywność transferu elektronów i generowanie siły napędowej protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną5. Ponadto składanie syntasomów nie tylko zwiększa wydajność produkcji ATP i transfer ekwiwalentów energii do cytoplazmy2, ale także formuje wewnętrzną błonę mitochondriów w rurkowe cristae6,7. Badania nad składaniem nadkompleksów podczas rozwoju serca w zarodkach myszy pokazują, że wytwarzanie superkompleksów zawierających Cx-I w sercu rozpoczyna się około 13,5 dnia embrionalnego8. Inni wykazali, że ilość superkompleksów zawierających Cx-I zmniejsza się w sercu z powodu starzenia się lub urazów niedokrwiennych/reperfuzyjnych9,10 lub może odgrywać rolę w postępie chorób neurodegeneracyjnych11.

Ten protokół opisuje metody dla natywnej strony żelowej, które mogą być użyte do badania montażu i aktywności kompleksów i superkompleksów ETC. Przybliżoną masę cząsteczkową superkompleksów mitochondrialnych można ocenić, rozdzielając kompleksy białkowe w żelach poliakrylamidowych CN lub BN. CN PAGE pozwala również na wizualizację aktywności enzymatycznej wszystkich kompleksów mitochondrialnych bezpośrednio w żelu (testy w żelu; IGA)12. Praca ta wykazuje aktywność respirasomów, podkreślając zdolność Cx-I do utleniania NADH przez IGA oraz obecność syntasomów ze względu na aktywność hydrolizującą ATP Cx-V przez IGA. Istnienie wielu kompleksów i superkompleksów zawierających Cx-I i Cx-V można również wykazać poprzez przeniesienie białek na błony nitrocelulozowe i przeprowadzenie immunoblottingu. Zaletą tego podejścia jest to, że BN lub CN PAGE na ogół rozdzielają kompleksy białkowe na podstawie ich fizjologicznej wielkości i składu; Przeniesienie na membranę zachowuje ten wzór pasm. Analiza kompleksów białkowych w BN lub CN PAGE może być również wykonana za pomocą 2D-PAGE (patrz Fiala i wsp.13 dla demonstracji) lub przez wirowanie gęstości sacharozy14,15. Aby dalej analizować określone prążki, można je wyciąć z BN PAGE, a białka z tego kompleksu białkowego można oczyścić przez elektroelucję w warunkach natywnych. Natywną elektroelucję można przeprowadzić w ciągu kilku godzin, co może mieć znaczący wpływ na bierną dyfuzję (jak zastosowano w Reference 16) białek z żelu do otaczającego buforu.

Podsumowując, te metody opisują kilka podejść, które pozwalają na dalszą charakterystykę superkompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej z błon mitochondrialnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu serc myszy C57BL/6N (typu dzikiego). Myszy zostały znieczulone CO2 przed zwichnięciem szyjki macicy, a wszystkie procedury zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z Wydziałem Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie w Rochester oraz zgodnie z prawem stanowym, ustawą federalną i polityką NIH. Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Rochester (Uniwersytecki Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych).

1. STRONA CN i BN

UWAGA: Wszystkie urządzenia używane do BN i CN PAGE muszą być wolne od detergentów. Aby to zapewnić, umyj wszystkie urządzenia 0,1 M kwasem solnym, a następnie dokładnie spłucz dejonizowanymH2O.

  1. preparat
    1. Przygotować bufor anodowy składający się z 25 mM imidazolu o pH 7,0 w temperaturze 4 °C; przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj bufor katodowy dla CN lub BN PAGE.
      1. Dla CN PAGE należy użyć 7,5 mM imidazolu i 50 mM trycyny; dodać 0,5 g deoksycholanu sodu i 0,2 g maltozydu laurylowego na litr buforu. Doprowadzić pH do 7,0 w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      2. W przypadku BN PAGE należy użyć 7,5 mM imidazolu i 50 mM trycyny i dostosować pH do 7,0 w temperaturze 4 °C. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      3. W przypadku jasnoniebieskiego bufora katodowego BN należy użyć imidazolu 7,5 mM i trycyny 50 mM. Doprowadzić pH do 7,0 w temperaturze 4 °C i dodać 20 mg Coomassie na litr buforu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotować bufor ekstrakcyjny (EB) z 50 mM NaCl, 50 mM imidazolem, 2 mM kwasem aminokapronowym i 1 mM EDTA. Doprowadzić pH do 7,0 w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować 3x bufor żelowy (stosowany do żeli BN i CN) z 75 mM imidazolem i 1,5 M kwasem aminokapronowym. Doprowadzić pH do 7,0 w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotować bufor ładujący (LB) składający się z 0,01 g Pąsa S, 5 g glicerolu i 5 mlH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotuj Coomassie blue, dodając 50 mg Coomassie do 1 ml 500 mM kwasu 6-aminoheksanowego. Doprowadzić pH do 7,0 w temperaturze 4 °C i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Przygotować 20 mM i 200 mM maltozydu laurylowego w H2O. Przygotować porcje po 200 μl i przechowywać je w stanie zamrożonym. Rozmrozić detergent przed użyciem.
pkt. pkt. pkt. Rozdział Rozdział
3 % do 8 % (mini)4 % do 10 % (maks.)
0,5 żelu (lekki)0,5 żelu (ciężkiego)0,5 żelu (lekki)0,5 żelu (ciężkiego)
AAB (ml)0,421.3Rozdział 2.57,7
Bufor CN/BN (ml)1.61.68,58,5
H2O (ml)2.71.4146,3
Glicerol (g)00,470Rozdział 2.5
Objętość (ml)Z dnia 4,72Godzina 4,772525
APS (μL)27 Rozdział 2727 Rozdział 276565
TEMED (μl)441010

Tabela 1: Ilości składników potrzebne do nalania 1 mini- lub maxi-PAGE. Objętości użyte w tej tabeli są obliczone dla 1 mini- lub 1 maxi-żelu o grubości 1,5 mm. Objętość AAB jest oparta na 40% roztworze podstawowym. Lekki i ciężki odnoszą się do stężenia AAB. APS i TEMED dodaje się po napełnieniu każdej kolumny mieszalnika gradientowego roztworem AAB.

  1. Żele do nalewania i biegania
    UWAGA: Użyj gradientu 3-8% lub 4-10% akrylamidu/bisakryloamidu (AAB) odpowiednio dla żeli CN lub BN. Tabela 1 zawiera zestawienie ilości buforu, AAB,H2O, glicerolu, amuniopasiarczanu (APS) i tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) stosowanych w miniżelu (85 mm szerokości x 73 mm wysokości x 1,5 mm grubości) lub maxiżelu (160 mm szerokości x 200 mm wysokości x 1,5 mm grubości). Zestawy szklanych płytek z żelami CN lub BN można przechowywać w lodówce w torbie z kilkoma ml 1x buforu żelowego lub zawinąć w ręcznik papierowy zwilżony 1x buforem żelowym do przechowywania. Żele są stabilne do stosowania do tygodnia.
    1. Aby wlać żel, umieść mikser gradientowy na podwyższonej płycie mieszającej, aby upewnić się, że żel spłynie grawitacyjnie do przygotowanej komory żelowej.
    2. Napełnij komorę odpływową mieszalnika gradientowego 4,77/25 ml (mini/maxi) ciężkiego roztworu (o wyższym stężeniu AAB).
    3. Delikatnie otwórz połączenie kurka między ciężką i lekką komorą i pozwól, aby kropla roztworu przepłynęła na drugą stronę.
      UWAGA: Powoduje to wypychanie pęcherzyków powietrza z rurki łączącej i kurka, co uniemożliwi przepływ między dwiema komorami. Nie można tego zrobić, jeśli obie strony zostały już napełnione, ponieważ równe ciśnienie uniemożliwi przejście pęcherzyka.
    4. Napełnij drugą komorę mieszalnika gradientowego 4,72/25 ml (mini/maxi) roztworu światła.
    5. Umieść mieszadło w komorze odpływowej z ciężkim roztworem i rozpocznij mieszanie. Użyj prędkości mieszadła, która nie powoduje bulgotania.
    6. Szybko dodaj APS i TEMED do każdej komory, aby zainicjować polimeryzację.
    7. Otwórz połączenie między dwiema komorami mieszalnika gradientowego i pozostaw na kilka sekund mieszanie przed otwarciem komory odpływowej w celu nalania żelu.
      UWAGA: Grawitacja osuszy obie komory równomiernie, a mieszanie światła z ciężkim roztworem powoli zmniejszy gęstość akrylamidu od dołu do góry żelu. Użyj całej zawartości, która znajduje się w mikserze gradientowym, aby wlać żel.
      1. Na koniec ostrożnie zamontuj grzebień, z dołkami wewnątrz żelu, aby uniknąć pęcherzyków i mieszania się warstw.
    8. Natychmiast umyj mikser gradientowy etanolem, aby wypłukać żel. Spłucz wodą i wlej drugi żel. Pozwól żelom spolimeryzować (zwykle w przypadku mini-żeli potrzeba mniej niż 20 minut).
    9. Aby uruchomić żele, zamontuj je w zacisku zespołu elektrody i napełnij środkową/górną komorę buforem katodowym CN lub jasnoniebieskim BN. Odczekaj kilka minut, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, zanim dodasz bufor anodowy do zewnętrznej/dolnej komory.
      1. Delikatnie wyciągnij grzebienie studzienki i umyj studzienki buforem katodowym za pomocą strzykawki lub pipety.
      2. Żele należy przechowywać w chłodni (4 °C) lub całkowicie zapakowane w lód.
        1. W przypadku CN mini-PAGE należy użyć 100 V przez pierwszą godzinę i 200 V do zakończenia, zwykle dodatkowe 1-1,5 godziny. Alternatywnie, uruchom CN mini-PAGE przy 30-40 V przez noc.
          UWAGA: Nacisk kładziony jest tutaj na kompleksy białkowe o dużej masie cząsteczkowej, więc kompleksy białkowe o masie cząsteczkowej mniejszej niż 140 kDa skończą się z żelu. Krótsze czasy trwania elektroforezy mogą być stosowane do zatrzymywania kompleksów o niskiej masie cząsteczkowej.
        2. W przypadku BN maxi-PAGE należy użyć 100 V i uruchomić żele przez noc (około 18 godzin).
          UWAGA: Prąd będzie bardzo niski (< 15 mA), dlatego potrzebny jest zasilacz, który poradzi sobie z takimi warunkami. W tym momencie żele mogą być używane do IGA lub immunoblottingu. W niektórych przypadkach opaski lub pasy można wyciąć z żeli za pomocą żyletki na szklanej płytce do elektroelucji.
  2. Przygotowanie próbki
    UWAGA: Superkompleksy mitochondrialne związane z błoną muszą być ekstrahowane z wewnętrznej błony mitochondrialnej. Aby zachować superkompleksy mitochondrialne, należy użyć świeżo wyizolowanych mitochondriów lub próbek, które zostały zamrożone i rozmrożone tylko raz. Poniższe obliczenia/objętości są podane dla mini-żeli (studzienka 10-dołkowego grzebienia w żelu o grubości 1,5 mm mieści do 35-40 μl) i maxi-żeli (studzienka 15-dołkowego grzebienia mieści do 200 μl). Ponadto należy zachować podwielokrotność każdej próbki (zwykle 10 μl), która ma być przeprowadzona na denaturującym żelu SDS w celu wykrycia kanału anionowego zależnego od napięcia (VDAC), jako kontroli obciążenia.
    1. Umieścić odpowiednią ilość (np. 10-50 μg białka w przypadku miniżeli i 50 - 200 μg w przypadku maxi-żeli) wyizolowanych mitochondriów lub homogenatu tkankowego w mikroprobówkach i odwirować przy 17 000 x g przez 10-15 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ten krok usuwa część rozpuszczalnej macierzy mitochondrialnej i/lub białek cytozolowych.
    2. Odessać i wyrzucić supernatant i dodać bufor ekstrakcyjny do ilości, która ma być załadowana do żelu. Delikatnie zawiesić osad na lodzie. W razie potrzeby dodaj w tym momencie ogólną mieszankę inhibitorów proteazy.
      UWAGA: W oparciu o zastosowany tutaj sprzęt, 30 μl użyto na mini-żel i 100 μl na maxi-żel, ograniczając stosunek białka do buforu do nie więcej niż 2 μg białka na 1 μl buforu.
    3. Dodać detergent (np. 2 μg maltozydu laurylu / 1 μg białka; więcej informacji można znaleźć w Reprezentatywnych wynikach i dyskusji).
      UWAGA: Generalnie stosuje się maltozyd laurylowy, ale można również stosować digitoninę.
    4. Inkubować na lodzie przez 20 minut. Delikatnie mieszać na początku inkubacji i czasami w trakcie inkubacji, rozcierając i/lub mieszając probówkę.
    5. Wirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia wszelkich fragmentów błony i tkanki.
    6. Przenieść supernatant do nowej probówki. W przypadku próbek CN dodać 1 μl LB na każde 10 μl objętości próbki; całkowita objętość próbki powinna wynosić około 40 μl w przypadku miniżelu i 130 μl w przypadku maxi-żelu. W przypadku próbek BN należy dodać Coomassie do próbek tak, aby stosunek barwnika do detergentu wynosił 1:4 (w/w).
    7. Załadować 30 i 120 μl próbek do studzienek odpowiednio mini- lub maxi-żelu. Użyj pozostałych 10 μl z każdej próbki jako denaturującego żelu SDS, aby wykryć VDAC jako kontrolę obciążenia.
    8. Aby przygotować markery masy cząsteczkowej, rozpuścić 1 fiolkę mieszanki kalibracyjnej o wysokiej masie cząsteczkowej (więcej informacji znajduje się w Tabeli Materiałów) w 60 μl buforu żelowego BN/CN i dodać 120 μL H20 i 20 μL LB. Załadować 15 μL na linię.
    9. Uruchom żele zgodnie z opisem w kroku 1.2.9.2.

2. Testy w żelu dla Cx-I i Cx-V

UWAGA: Testy są wykonywane w temperaturze pokojowej. Rób zdjęcia, skany lub obrazy rozwijających się pasm do dokumentacji. (Ważne) Białka nie mogą być przenoszone na błony nitrocelulozowe po zakończeniu IGA.

  1. Test Cx-I
    1. preparat.
      1. Przygotować bufor do oznaczania 5 mM Tris wH2O, o pH 7,4; przechowywać w temperaturze pokojowej.
      2. Rozpuścić 10 mg NADH w 1 ml buforu do oznaczania. Przechowywać w porcjach po 100 μl w temperaturze -20 °C do czasu użycia; Unikaj zamrażania i rozmrażania.
      3. Odważyć 25 mg tetrazolu Nitroblue do mikroprobówki.
      4. Przygotować utrwalacz rozcieńczając 5 ml kwasu octowego w 95 mlH2O; przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przeprowadzanie testu.
      1. Połączyć 10 ml buforu do oznaczania z 25 mg tetrazolu Nitroblue (końcowe stężenie: 2,5 mg/ml) i 100 μl 10 mg/ml NADH (0,1 mg/ml). Dodaj to do całego żelu, pasa lub obszaru zainteresowania wyciętego z żelu CN.
        UWAGA: Można to zrobić w przezroczystym plastikowym lub szklanym pojemniku. Należy pamiętać, że tego testu nie można wykonać po BN PAGE.
      2. Śledź rozwój niebieskich pasków po delikatnym poruszeniu (rocker) przez > 3 min.
      3. Utrwal żel w 10 - 20 ml roztworu kwasu octowego lub przemyj w 5 mM Tris, pH 7,4, aby zatrzymać reakcję. Zrób zdjęcia do dokumentacji (patrz Tabela Materiałów).
  2. Test Cx-V
    UWAGA: Test Cx-V należy wykonać przy użyciu zduplikowanych żeli CN lub BN, z których jeden jest inkubowany z oligomycyną 5 μg/ml (inhibitorem Cx-V) w celu wykazania aktywności niezależnej od Cx-V.
    1. preparat.
      1. Przygotować bufor do oznaczania z 35 mM Tris i 270 mM glicyny; dostosować pH do 8,3 w temperaturze pokojowej. Przechowywać bufor zamrożony w 50 ml porcji, ale po zamrożeniu i rozmrożeniu należy sprawdzić pH.
      2. Przygotować 1 MMgSO4 wH2O; przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      3. Odważyć 27,28 mg Pb(NO3)2 do mikroprobówki.
      4. Odważyć 60 mg ATP do mikroprobówki.
      5. Rozpuścić 1 mg oligomycyny w 1 ml etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      6. Przygotować utrwalacz przez zmieszanie 50 ml metanolu z 50 mlH2O; przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przeprowadzanie testu.
      1. Inkubować żel, tor lub obszar zainteresowania z żelu BN lub CN przez 2 godziny z delikatnym mieszaniem (kołyską) w 10-20 ml buforu do oznaczania ± 5 μg/ml oligomycyny (50-100 μl z 1 mg/ml w etanolu) w temperaturze pokojowej.
      2. Po inkubacji zastąpić bufor 14 ml świeżego buforu do oznaczania i dodać kolejno 190 μl 1 M MgSO4 (14 mM), 27,28 mg Pb(NO3)2 (5 mM), 60 mg ATP (8 mM) i 75 μl oligomycyny (w razie potrzeby).
      3. Inkubować z delikatnym mieszaniem (rocker) i obserwować biały osad, ponieważ pasma na żelach traktowanych oligomycyną dadzą prążki niezależne od Cx-V.
        UWAGA: Pojawienie się osadu może potrwać kilka godzin.
      4. Utrwal żel w utrwalaczu na bazie metanolu (np. 50% metanolu), ponieważ kwaśne roztwory rozpuszczą osad ołowiu. Sfotografuj wyniki.
        UWAGA: Osad ołowiu nie zakłóca barwienia żeli Coomassie.

3. Transfer białka do membran nitrocelulozowych lub polifluorku winylidenu (PVDF)

  1. Przygotować bufor transferowy składający się z 25 mM Tris i 200 mM glicyny. Dostosuj pH do 8,3 i dodaj 0,0005 g/l SDS i 200 mL/l metanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    1. Przyciąć membranę nitrocelulozową lub PVDF (wielkość porów: 0,45 μm) żyletką lub nożyczkami do rozmiaru nieco większego niż rozmiar żelu.
      UWAGA: Membrany nitrocelulozowe pozwalają na barwienie Pąskiem w celu oceny obciążenia białkami, podczas gdy membrany PVDF dają ostrzej zdefiniowane pasma.
  2. protokół.
    1. Namoczyć membranę nitrocelulozową, bibułę filtracyjną i gąbki przez co najmniej 10 minut w buforze transferowym. Umieść membranę PVDF w 100% metanolu na 15 s lub zgodnie z zaleceniem producenta przed umieszczeniem jej w buforze transferowym. Umieść otwartą kasetę zestawu transferowego w płaskiej misce z buforem transferowym.
    2. Umieść gąbkę i 1-2 warstwy bibuły filtracyjnej na tylnej stronie kasety. Usuń bąbelki.
    3. Umieść żel na bibule filtracyjnej. Wskaż orientację żelu, przycinając róg żelu i/lub membrany.
    4. Umieść membranę na wierzchu żelu. Usuń wszystkie bąbelki.
    5. Umieść bibułę filtracyjną i gąbkę na membranie. Usuń wszystkie bąbelki z tej kanapki.
    6. Zamknij kasetę i umieść ją w uchwycie kasety zestawu transferowego.
    7. Przenoszenie białek pod napięciem 25 V przez około 12-18 godzin.

4. Immunoblotting

  1. preparat.
    1. Przygotować barwnik Pąsowy (500 ml), dodając 25 ml kwasu octowego i 0,5 g Pąsek do 475 mlH2O; przechowywać w temperaturze pokojowej (można użyć ponownie).
    2. Przygotuj sól fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) z 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base i 2,7 mM KCl. Dostosuj pH do 8,0 i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj TBS-tween (TBST), dodając 0,5 mL/L Tween 20 do TBS; przechowuj w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotować suchą masę mleczną/TBST, rozpuszczając 5 g suchej masy mlecznej w 100 ml TBST. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
    5. Przygotować BSA/TBST rozpuszczając 3 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA, frakcja V) w 100 ml TBST. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
  2. protokół.
    1. Po zakończeniu transferu umieść błonę w roztworze Puceau S, aby uwidocznić wszystkie przeniesione białka. Oznacz położenie znaczników na membranie ołówkiem i udokumentuj membranę zabarwioną Ponceau-S za pomocą zdjęcia lub skanu.
    2. Umyj membranę 3 razy przez 10 minut za pomocą TBS pod delikatnym mieszaniem.
    3. Zablokować membranę suchą masą mleczną/TBST na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w chłodnym pomieszczeniu z delikatnym mieszaniem.
    4. Myć membranę przez 10 minut za pomocą TBST pod delikatnym mieszaniem.
    5. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w chłodni pod delikatnym mieszaniem. Rozcieńczyć przeciwciało (np. 1:1,000 dla anty-ATP5A i -NDUFB6) w BSA/TBST.
      UWAGA: Większość przeciwciał daje lepszy sygnał na błonach z natywnych żeli podczas inkubacji przez noc.
    6. Myć membranę przez 10 minut za pomocą TBST pod delikatnym mieszaniem.
    7. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej bez delikatnego mieszania. Rozcieńczyć przeciwciało (1:5 000 do 1: 50 000) w suchej masie mleka/TBST.
    8. Umyj membranę 3 razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej z TBST i delikatnym mieszaniem.
    9. Podczas ostatniego prania przygotuj podłoże o wzmocnionej chemoluminescencji (ECL) zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Inkubować membranę z substratem ECL, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta.
    11. Wykryj sygnał na folii, korzystając z instrukcji dostarczonych przez producenta podłoża ECL.

5. Elektroelucja

  1. preparat.
    1. Przygotować bufor elucyjny składający się z 25 mM trycyny, 3,75 mM imidazolu (pH 7,0 w 4 °C) i 5 mM kwasu 6-aminoheksanowego.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z elektroeluterem i nasadkami membranowymi należy nosić rękawice, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami zewnętrznymi.
  2. W dniu poprzedzającym użycie elektroelutera do elektroelucji natywnej należy wykonać następujące czynności:
    1. Zanurzyć nasadki membranowe (punkt odcięcia: 3,5 kDa) w buforze elucyjnym na 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Przenieść nasadki do świeżego buforu elucyjnego i moczyć je przez 12 godzin lub dłużej w lodówce.
      UWAGA: Odcięta masa cząsteczkowa wynosząca 3,5 kDa zapobiega utracie małych białek, które mogą łatwo oddzielić się od kompleksu białkowego będącego przedmiotem zainteresowania.
    2. Dokładnie umyj moduł elektroelutera, szklane rurki, zbiornik i pokrywę etanolem. Spłucz wodą i pozostaw sprzęt do wyschnięcia.
  3. W dniu elektroelucji natywnej wykonaj następujące czynności.
    1. Umieść frytę na dnie (matowej) każdej szklanej tubki, która ma być użyta. W razie potrzeby umieścić szklaną probówkę w buforze elucyjnym i wepchnąć frytę od wewnątrz do dna probówki.
    2. Wsuń szklaną rurkę z frytą do modułu elektroelutera. Zwilżyć przelotkę buforem elucyjnym i wsunąć szklaną rurkę na miejsce. Upewnij się, że górne części szklanych rurek są równe z przelotką.
    3. Zamknij puste przelotki korkami.
    4. Umieść mokrą nasadkę membranową na dnie silikonowego adaptera i napełnij adapter buforem elucyjnym. Powoli pipetować bufor w adapterze w górę i w dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza wokół membrany dializy.
    5. Wsuń adapter wypełniony buforem na spód szklanej rurki. Usuń wszystkie bąbelki, które pojawiają się na frycie wewnątrz szklanej rurki.
    6. Napełnij każdą szklaną probówkę buforem elucyjnym.
    7. Umieść wycięte pasma BN PAGE w szklanych rurkach (patrz krok 1.2.9.3). Pokrój duże kawałki na mniejsze kawałki. Upewnij się, że wysokość napełnienia w szklanej rurce wynosi około 1 cm.
    8. Umieść cały moduł w zbiorniku.
    9. Dodać około 600 ml zimnego buforu elucyjnego do zbiornika. Upewnij się, że silikonowe nasadki adaptera znajdują się w buforze, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków na membranie dializy.
    10. Umieść mieszadło na dnie zbiornika.
      UWAGA: Mieszanie zapobiegnie przywieraniu pęcherzyków do dna membrany dializy.
    11. Eluować białka przez 4 godziny przy napięciu 350 V w chłodni.
    12. Po zakończeniu elucji wyjmij moduł elektroelucji ze zbiornika buforowego i umieść go w zlewie lub misce.
    13. Jeśli użyto korka, wyjmij go, aby opróżnić górną komorę buforową. W przeciwnym razie użyj dużej pipety, aby usunąć bufor.
    14. Usunąć bufor z każdej szklanej probówki i wyrzucić. Upewnij się, że silikonowy adapter pozostaje na swoim miejscu, a płyn pod frytą nie jest naruszony ani wstrząśnięty.
    15. Ostrożnie wyjmij silikonowy adapter wraz z nasadką membrany z dolnej części szklanej rurki. Odpipetować zawartość (około 400 μl) silikonowej nasadki do mikroprobówki. Za pomocą kolejnych 200 μl buforu elucyjnego przepłukać silikonową nasadkę i dodać do mikroprobówki. Powtórz tę czynność dla wszystkich szklanych probówek.
    16. Ponieważ nasadki membranowe mogą być ponownie użyte, należy je zakonserwować, umieszczając je w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 mg/ml azydku sodu. Przechowuj je w lodówce.
      UWAGA: Eluat ma niskie stężenie białka i może być zagęszczany za pomocą odśrodkowych urządzeń filtrujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do wizualizacji superkompleksów mitochondrialnych wykorzystano świeżo wyizolowane mitochondria od myszy17,18. Superkompleksy mitochondrialne są wrażliwe na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, co prowadzi do ich rozpadu, chociaż może to być tolerowane przez niektórych badaczy. Jeżeli do przechowywania konieczne jest zamrożenie, w celu zapewnienia najlepszych wyników, próbki nie powinny być poddawane więcej niż jednemu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalny ETC jest niezbędny do generowania mitochondrialnego ATP. Kompleksy ETC są zdolne do tworzenia dwóch typów superkompleksów: respirasomy (Cx-I, -III i -IV)1 oraz syntasomy (Cx-V)2. Montaż każdego kompleksu jest wymagany dla nienaruszonego ETC, podczas gdy organizacja ETC w superkompleksy uważa się za zwiększające ogólną wydajność ETC 5,22. Sposób, w jaki te superkompleksy łączą się i demontują, nie jest d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty od American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] oraz Strong Children's Research Center na Uniwersytecie w Rochester.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora do mini-żelu Protean IIBiorad1658004Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy mini-żelowej
Protean XL maxi-gelBiorad1653189Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy maxi-gel
Maszyna do gradientów, Hoefer SG15VWR95044-704Wylewanie gradientów mini-żelu
Maszyna do gradientów, maxi-gelVWRGM-100Nalewanie maxi-żelu gradienty
Zestaw transferowyBiorad1703930Kompletny zestaw do mokrego transferu białek na błony
Elektroeluter model 422Biorad1652976Elektroelucja białek ze stron natywnych lub SDS
Płytki szklaneBiorad1653308Płytki krótkie
Płytki szklaneBiorad1653312Płytki dystansowe
PłytkiszklaneBiorad1651823Płyty wewnętrzne
Płytki szklaneBiorad1651824Płyty zewnętrzne
ZasilaczBiorad1645070Zasilacz odpowiedni do elektroforezy natywnej
ECL-Western Thermo Scientific32209Podłoże chemolumniscense
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Ulepszone podłoże chemolumniscencyjne
Film/film autoradiograficznyGE Opieka zdrowotna28906845Dokumentacja Western blot
Procesor filmowy CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonPLRobienie zdjęć w celu udokumentowania żeli, membran i plam.
Osłona przeciwsłoneczna Canon Power Shot 640 Canondo zdjęć robionych na stole podświetlanym
Akrylamid/bisakryloamidBiorad161014840% wstępnie zmieszany roztwór
GlicynaSigmaG7403
SDS (dodecylosiarczan sodu)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Bufor
TricineSigmaT0377
Deoksychelat soduSigmaD66750Detergent
EDTASigmaE5134
SacharozaSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Bufor
ImidazolSigmaI15513Bufor
Lauryl MaltosideSigmaD4641Detergent
Coomassie G250Biorad161-0406
Kwas aminoheksanowySigmaO7260
Rodzimy  zestaw do masy cząsteczkowejGE Opieka zdrowotna 17-0445-01Zestaw do kalibracji wysokocząsteczkowej do elektroforezy natywnej.
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Azotan ołowiu(II) (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycynaSigmaO4876
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ponceau SSigmaP3504
anty-ATP5AAbcamab14748przeciwciało przeciwko podjednostce syntazy ATP ATP5A
anty-NDUFB6Abcamab110244przeciwciało przeciwko podjednostce Cx-1 NDUFB6
anty-VDACPrzeciwciało Calbiochem529534przeciwko przeciwciału połączonemu z VDAC
ECL HRP GEHealth CareNA931Vwtórne przeciwko ATP5A, NDUFB6 i VDAC
Odczynnik blokującyBiorad170-6404
BSA
chlorek soduSigmaS9888
chlorek potasuSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Zestaw do barwienia srebraInvitrogenLC6070
Aparat ekranujący przeciwciało

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mitochondrial SupercomplexesBlue Native PAGEImmunoblottingProtein Complex AssemblyMitochondrial BiologyMitochondrial Isolation

Powiązane artykuły