Artykuł metodologiczny

Perfuzja DiI jako metoda wizualizacji naczyń krwionośnych w Ambystoma mexicanum

DOI:

10.3791/55740

⸱

16 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital, 2Division of Graduate Medical Sciences, Boston University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z lipofilowej techniki barwienia nadchloranem 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), Ambystoma mexicanum może ulegać perfuzji naczyniowej, co pozwala na łatwą wizualizację układu naczyniowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki perfuzji były używane od wieków do wizualizacji krążenia tkanek. Aksolotl (Ambystoma mexicanum) to gatunek salamandry, który stał się podstawowym modelem w badaniach nad regeneracją. Niewiele wiadomo na temat tego, jak zachodzi rewaskularyzacja w kontekście regeneracji u tych zwierząt. Tutaj przedstawiamy prostą metodę wizualizacji układu naczyniowego w aksolotlu poprzez perfuzję nadchloranu 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI). DiI to lipofilowy barwnik karbocyjaninowy, który natychmiast wprowadza się do błony plazmatycznej komórek śródbłonka. Perfuzja odbywa się za pomocą pompy perystaltycznej, tak że DiI dostaje się do krążenia przez aortę. Podczas perfuzji barwnik przepływa przez naczynia krwionośne aksolotla i w kontakcie włącza się w dwuwarstwę lipidową komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Procedura perfuzji trwa około godziny w przypadku ośmiocalowego aksolotla. Bezpośrednio po perfuzji z DiI aksolotl można uwidocznić za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. DiI emituje światło w zakresie czerwono-pomarańczowym, gdy jest wzbudzony zielonym filtrem fluorescencyjnym. Ta procedura perfuzji DiI może być wykorzystana do wizualizacji struktury naczyniowej aksolotli lub do zademonstrowania wzorców rewaskularyzacji w regenerujących się tkankach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja unaczynienia odgrywa istotną rolę w zrozumieniu struktury i funkcji organizmów u wielu gatunków. Począwszy od XVI wieku od Leonarda da Vinci, modele i graficzne przedstawienia obiegu były badane 1. Za pomocą wosków i gumowych form tkanki poddano perfuzji w celu stworzenia trójwymiarowych modeli naczyń krwionośnych, co pozwoliło na badanie organogenezy i patogenezy1,2. Żywice i woski zostały zabarwione barwnikami, takimi jak India Ink lub karminowa czerwień, aby umożliwić ich łatwą wizualizację1,2. Jednak ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z aksolotlami zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Brigham and Women's Hospital (BWH).

1. Konfiguracja eksperymentu perfuzji

  1. Umieść dorosłego aksolotla w plastikowym pojemniku wypełnionym 0,1% roztworem tricainy (MS222) na 15-20 minut lub do całkowitego znieczulenia. Upewnij się, że pojemnik jest wypełniony wystarczającą ilością roztworu tricainy, tak aby aksolotl był całkowicie zanurzony.
    Uwaga: Wszystkie zabiegi muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami. W BWH aksolotl jest uważany za w pełni znieczulony, gd....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki barwieniu DiI, unaczynienie aksolotla można łatwo zwizualizować. Naczynia krwionośne zwierząt perfundowane barwnikiem lipofilowym są natychmiast widoczne pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym. Rysunek 1.1-1.5 to schematyczne przedstawienie protokołu perfuzji. Po perfuzji z jasnoróżowym barwnikiem pomyślnie perfundowany aksolotl będzie wyglądał na różowy. Za pomocą zielonego filtra fluorescencyjnego na mikroskopie konfokalnym poj.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizację unaczynienia aksolotla można z powodzeniem przeprowadzić poprzez perfuzję z lipofilowym barwnikiem karbocyjaninowym, DiI. W tym badaniu opisujemy nowatorski protokół perfuzji aksolotla z DiI za pomocą pompy perystaltycznej. Pokazujemy również późniejszą wizualizację układu naczyniowego aksolotla za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. Protokół ten był adaptacją protokołu perfuzji DiI u gryzoni obserwowanego u Li i wsp.7, jednak duże różnice między gryzoniem a aks.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Brigham & Women's Hospital oraz March of Dimes. Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom Whited Lab za wsparcie i rady.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa perystaltyczna Marshall Naukowy RD-RP1
Excelon Lab & Rurka próżniowa436901705 rozmiar S1A
27g igła motylkowaEXELint Medical Products26709
NaClAmericanBio7647-14-5
KClAmericanBio7747-40-7
Na2HPO4 AmericanBio7558-79-4
NaH2PO4AmericanBio10049-21-5
destylowana
HClAmericanBio7647-01-0
GlukozaThermoFischerA2494001
1,1&-Dioctadecyl-3,3,3′,3′,3′- Nadchloran tetrametyloindokarbocyjaninySigma Aldrich468495
Etanol (100% obj./obj.)Sigma Aldrich64-17-5
Foreceps chirurgiczny MedlineMDG0748741
Ramadowolny kwadrat z pianki polistyrenowej w kształcie aksolotla wycięte
Nożyczki chirurgiczneMedlineDYND04025
Skalpel MedlineMDS15210
Podkład chłonnyAvacare MedicalPKUFSx
Ręczniki
Standardowa jednorazowa pipeta transferowaFisherbrand50216954
Stojak zaciskowyAdafruit291
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonianSigmaAldrich E10521Trikaina proszek
Dorosły aksolotl
MgSO4AmericanBio10034-99-8
CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
NaHCO3SigmaAldrich S5761-500G
Zbiornikiplastikowe Różne rozmiary odpowiednie dla aksolotla
ParaformaldehydSigma Aldrich30525-89-4
Aksolotl
Mikroskop LeicaLeicaM165 FC
ET-CY3LeicaM205FA/M165FC
MS-222
Rurka perfuzyjna Woda z pianki polistyrenowej papierowe Filtr fluorescencyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
  2. Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uk ad naczyniowy axolotlapompa perystaltycznamikroskopia konfokalnakaniulacja aortybarwnik fluorescencyjnybarwienie r db onkaperfuzja tkanekbadania nad regeneracj

Powiązane artykuły