Korzystając z lipofilowej techniki barwienia nadchloranem 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), Ambystoma mexicanum może ulegać perfuzji naczyniowej, co pozwala na łatwą wizualizację układu naczyniowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Perfuzja DiI jako metoda wizualizacji naczyń krwionośnych w Ambystoma mexicanum
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki perfuzji były używane od wieków do wizualizacji krążenia tkanek. Aksolotl (Ambystoma mexicanum) to gatunek salamandry, który stał się podstawowym modelem w badaniach nad regeneracją. Niewiele wiadomo na temat tego, jak zachodzi rewaskularyzacja w kontekście regeneracji u tych zwierząt. Tutaj przedstawiamy prostą metodę wizualizacji układu naczyniowego w aksolotlu poprzez perfuzję nadchloranu 1,1'-Dioctadecy-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI). DiI to lipofilowy barwnik karbocyjaninowy, który natychmiast wprowadza się do błony plazmatycznej komórek śródbłonka. Perfuzja odbywa się za pomocą pompy perystaltycznej, tak że DiI dostaje się do krążenia przez aortę. Podczas perfuzji barwnik przepływa przez naczynia krwionośne aksolotla i w kontakcie włącza się w dwuwarstwę lipidową komórek śródbłonka naczyń krwionośnych. Procedura perfuzji trwa około godziny w przypadku ośmiocalowego aksolotla. Bezpośrednio po perfuzji z DiI aksolotl można uwidocznić za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. DiI emituje światło w zakresie czerwono-pomarańczowym, gdy jest wzbudzony zielonym filtrem fluorescencyjnym. Ta procedura perfuzji DiI może być wykorzystana do wizualizacji struktury naczyniowej aksolotli lub do zademonstrowania wzorców rewaskularyzacji w regenerujących się tkankach.
Wprowadzenie
Wizualizacja unaczynienia odgrywa istotną rolę w zrozumieniu struktury i funkcji organizmów u wielu gatunków. Począwszy od XVI wieku od Leonarda da Vinci, modele i graficzne przedstawienia obiegu były badane 1. Za pomocą wosków i gumowych form tkanki poddano perfuzji w celu stworzenia trójwymiarowych modeli naczyń krwionośnych, co pozwoliło na badanie organogenezy i patogenezy1,2. Żywice i woski zostały zabarwione barwnikami, takimi jak India Ink lub karminowa czerwień, aby umożliwić ich łatwą wizualizację1,2. Jednak techniki te powodowały wiele problemów, ponieważ ich wysoka lepkość uniemożliwiała pełną perfuzję tkanki będącej przedmiotem zainteresowania1. W miarę jak dziedzina ta stawała się coraz bardziej wyrafinowana, w grę weszło użycie mikroskopów konfokalnych i elektronowych, przesuwając techniki perfuzji z form odlewniczych w kierunku płynnych perfuzji naczyń krwionośnych, z których niektóre pozwalały na perfuzję i obrazowanie naczyń krwionośnych bez niszczenia początkowej tkanki3. DiI, fluorescencyjny barwnik karbocyjaninowy, jest jednym z takich barwników, który pozwala na perfuzję zwierząt bez uszkodzenia tkanki naczyniowej.
Barwniki karbocyjaninowe to barwniki lipofilowe, które po kontakcie wbudowują się w błony komórkowe. Barwniki te pozwalają na łatwe i natychmiastowe barwienie komórek śródbłonka naczyń krwionośnych, które można następnie oglądać pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym. DiI porusza się poprzez dyfuzję boczną w błonie lipidowej komórek, jak pokazano w znakowaniu i śledzeniu neuronów4. Pod względem chemicznym dwa łańcuchy alkilowe DiI nadają barwnikowi wysokie powinowactwo do błon komórkowych, podczas gdy dwa sprzężone pierścienie z fluorochromu, który jest odpowiedzialny za emitowanie czerwonej długości fali, gdy jest wzbudzany przez zielone filtry światła fluorescencyjnego4. DiI zostało wykorzystane w wielu funkcjach, w tym do skutecznego znakowania błony plazmatycznej oraz znakowania wstecznego i wstecznego w neuronach5,6. DiI było wcześniej używane w protokołach perfuzji podczas wizualizacji unaczynienia myszy 7.
Aksolotle (Ambystoma mexicanum) to salamandry żyjące wyłącznie w słonawych jeziorach w pobliżu Mexico City, Meksyk. Zwierzęta te stały się ważnym modelem do zrozumienia procesów regeneracyjnych, ponieważ mogą regenerować pełne kończyny, ogon (w tym rdzeń nerwowy), części serca i innych narządów wewnętrznych oraz części oka jako dorosłe osobniki8,9. Dodatkowo, dzięki niedawnemu zastosowaniu narzędzi genetycznych u aksolotlów, możliwy jest bezprecedensowy wgląd w cząsteczki i komórki napędzające te procesy8. Skuteczna regeneracja całej kończyny wymaga rozległego procesu rewaskularyzacji, który może odgrywać znaczącą rolę w regeneracji, wykraczającą poza tradycyjne funkcje naczyń krwionośnych w dostarczaniu tlenu i składników odżywczych. Zrozumienie rewaskularyzacji w kontekście regeneracji tkanek jest konieczne. Naczynia krwionośne aksolotla były wcześniej wizualizowane przy użyciu India Ink i chociaż wyniki były intrygujące, proces ten nie został ponownie zbadany w kolejnych dziesięcioleciach10. Staraliśmy się zaadaptować protokół perfuzji DiI opracowany do stosowania u ssaków, aby umożliwić pełną perfuzję i wizualizację naczyń krwionośnych aksolotla 7. Protokół ten opisuje kroki podjęte w celu pomyślnej perfuzji, a następnie wizualizacji krążenia aksolotla za pomocą techniki barwienia DiI. Zabieg ten pozwoli na precyzyjną wizualizację opatentowanych naczyń krwionośnych w tkankach homeostatycznych, a także w tkankach regenerujących się, a także zapewni nowatorską metodę wizualizacji i analizy procesu rewaskularyzacji u aksolotla.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty z aksolotlami zostały przeprowadzone zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Brigham and Women's Hospital (BWH).
1. Konfiguracja eksperymentu perfuzji
- Umieść dorosłego aksolotla w plastikowym pojemniku wypełnionym 0,1% roztworem tricainy (MS222) na 15-20 minut lub do całkowitego znieczulenia. Upewnij się, że pojemnik jest wypełniony wystarczającą ilością roztworu tricainy, tak aby aksolotl był całkowicie zanurzony.
Uwaga: Wszystkie zabiegi muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami. W BWH aksolotl jest uważany za w pełni znieczulony, gdy nie przejdzie testu szczypania stopy, co oznacza, że nie ma ruchu odruchowego, gdy stopa jest delikatnie ściskana.
Uwaga: Chociaż trikaina jest środkiem znieczulającym stosowanym specjalnie dla organizmów wodnych, należy unikać bezpośredniego kontaktu skóry z roztworem tricainy. - Skonfiguruj stację perfuzyjną aksolotl.
- Umieść wkład chłonny na płaskiej, równej powierzchni stroną chłonną skierowaną do góry.
- Wytnij otwór w ramie z pianki polistyrenowej o odpowiednim rozmiarze i kształcie, aby znieczulony aksolotl mógł leżeć w pozycji leżącej. Umieść ramę na podkładce chłonnej.
Uwaga: Niektóre dodatkowe ręczniki papierowe można umieścić bezpośrednio pod ramą, aby uzyskać dodatkową chłonność. - Załaduj pompę perystaltyczną rurką perfuzyjną. Ustaw pompę na natężenie przepływu 0,7 ml/min, przepływające w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.
- Przygotować rozcieńczony roztwór z 0,7x PBS i 5% glukozy w mieszaninie 1:4.
- Zmieszać 10 ml roztworu rozcieńczalnika z 200 μl roztworu podstawowego DiI w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zakryj i wymieszaj przez odwrócenie. Przykryj tę probówkę papierem z folii aluminiowej, aby chronić roztwór roboczy przed wystawieniem na działanie światła.
Uwaga: Objętości należy zmieniać proporcjonalnie w zależności od wielkości aksolotl. Wartości te dotyczą aksolotla o długości około 15 cm (długość od pyska do ogona). Zwierzęta tej wielkości mogły nie osiągnąć pełnej dojrzałości płciowej, więc płeć zwierząt może nie być w tym momencie określona. - Napełnij stożkową probówkę o pojemności 50 ml 0,7 PBS.
Uwaga: PBS będzie używany do zagruntowania pętli i wykrwawienia aksolotl. - Przymocuj igłę motylkową o rozmiarze 27 do końca wyjściowego rurki perfuzyjnej. Złóż skrzydła motyla na siebie i umieść w clamp stojak.
- Umieść wolny koniec rurki perfuzyjnej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml wypełnionej 0,7x PBS i uruchom pompę perfuzyjną, aż cała rurka zostanie wypełniona roztworem. Wstrzymaj pompę, gdy cały przewód zostanie napełniony PBS.
Uwaga: Upewnij się, że rurka jest przez cały czas wolna od pęcherzyków powietrza, ponieważ spowodują one zator powietrzny w aksolotlu i uniemożliwią pełną perfuzję. - Umieść ręcznik papierowy w foremce w kształcie aksolotla w ramie z pianki polistyrenowej. Za pomocą pipety transferowej nasącz ręcznik roztworem tricainy.
Uwaga: Wytnij mały kwadrat na środku ręcznika papierowego, aby umożliwić odpływ płynów podczas procedury perfuzji. - Umieść znieczulonego aksolotla na wznak na ręczniku papierowym wewnątrz ramy z pianki polistyrenowej.
2. Otwieranie skrzyni aksolotla
- Użyj kleszczy chirurgicznych, aby uszczypnąć skórę wzdłuż centralnej osi klatki piersiowej aksolotl, tuż poniżej linii ramion. Zatrzymaj się.
- Użyj skalpela, aby wykonać małe nacięcie w miejscu, w którym została ściągnięta skóra.
- Usuń kwadratowy fragment skóry nad klatką piersiową, aby odsłonić dwie płytki chrzęstne.
- Usuń skórę, aby otworzyć okno nad jamą klatki piersiowej wystarczająco duże, aby wyraźnie zobaczyć serce i około 5 mm aorty odgałęziającej się od serca.
- Ostrożnie rozerwij tkankę łączną za pomocą kleszczy lub zamkniętych nożyczek, aby uniknąć przecięcia głównych naczyń krwionośnych.
- Podnieś każdą płytkę chrząstki indywidualnie za pomocą kleszczy i wytnij je nożyczkami chirurgicznymi.
- Ostrożnie ściśnij osierdzie kleszczami, podciągnij go i nakłuj nożyczkami chirurgicznymi; to nacięcie powinno być wystarczająco głębokie, aby przebić bardzo cienkie osierdzie i powinno być wystarczająco duże, aby umożliwić usunięcie osierdzia. Uważaj, aby nie przeciąć serca.
- Delikatnie usuń osierdzie, aby odsłonić serce i aortę.
Uwaga: Za pomocą pipety transferowej okresowo przepłukuj klatkę piersiową i skrzela roztworem tricainy, aby utrzymać obszar czysty i utrzymać aksolotl w stanie znieczulenia.
3. Perfuzja aksolotla
- Umieść stojak zaciskowy z załadowaną igłą motylkową obok ramy z pianki polistyrenowej, tak aby ramieniem zacisku można było łatwo manipulować w celu wożenia igły do aorty aksolotlowej. Podczas wprowadzania skieruj końcówkę igły w stronę rostralnej części zwierzęcia i trzymaj igłę równolegle do aorty, aby uniknąć przebicia jej przez przeciwną stronę.
- Włącz pompę perystaltyczną. 0,7x PBS powinno nadal przepływać przez rurki.
- Włóż igłę do aorty.
- Wsuń kleszcze pod łuk aorty i lekko pociągnij do góry, aby umożliwić łatwy dostęp.
- Manewruj kombinacją igły-zacisku tak, aby igła przebiegała wzdłuż aorty, skierowana w górę w kierunku głowy. Wbić igłę, używając kleszczyków do podparcia za aortą.
Uwaga: Igła powinna być wprowadzona wystarczająco głęboko do aorty, aby upewnić się, że nie wysunie się podczas perfuzji. Może to być około 5 mm w przypadku aksolotla o długości 15 cm. Upewnij się, że igła jest idealnie wyrównana z aortą, aby uniknąć całkowitego przebicia naczynia. Nakłucia na wskroś mogą powodować masywny krwotok i zmniejszać wskaźniki powodzenia perfuzji. Udane wprowadzenie może być potwierdzone widocznym powiększeniem przedsionków serca.
- Szybko rozerwij jeden przedsionek nożyczkami i pozwól krwi spłynąć.
- Przepłukać roztworem tricainy, aby zapobiec gromadzeniu się krwi i tworzeniu się skrzepów w klatce piersiowej.
- Perfuzjuj aksolotl za pomocą około 20-30 ml PBS. Zwierzę powinno zmienić kolor z jasnoróżowego na biały w udanej perfuzji.
- Wstrzymać pompę perystaltyczną i przesunąć wolny koniec rurki do probówki o pojemności 15 ml z roztworem DiI. Uruchom ponownie pompę, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków powietrza w przewodach.
- Perfuzja aksolotla z całym zapasem roboczym DiI.
Uwaga: W udanej perfuzji aksolotl zmienia kolor na jasnoróżowy DiI. Będzie to najbardziej zauważalne w skrzelach. - Wstrzymaj pompę po zakończeniu perfuzji z DiI i umieść wolny koniec rurki w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA), aby utrwalić tkankę. Uruchom ponownie pompę i przelej co najmniej 10 ml PFA.
Uwaga: PFA jest toksyczny i należy się z nim odpowiednio obchodzić i utylizować. Należy nosić rękawice i okulary ochronne, a roztwory należy sporządzać wewnątrz dygestorium. Perfuzja aksolotla z PFA w celu utrwalenia tkanki powoduje śmierć zwierzęcia.
4. Zakończenie przygotowania do perfuzji i wizualizacji
- Zatrzymać pompę perystaltyczną i usunąć igłę z aorty aksolotlowej.
- Umieść aksolotla na plastikowym talerzu.
Uwaga: Użycie jednej połowy dużej szalki Petriego działa dobrze i pozwala na wylanie niewielkiej ilości Tricaine lub PBS na aksolotl, aby utrzymać jego skórę mokrą i poprawić jakość wizualizacji. - Wszystkie zużyte materiały należy wyrzucić do odpowiednich pojemników na odpady. Wyczyść narzędzia chirurgiczne 70% etanolem, zdezynfekuj za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi między zwierzętami i sterylizuj w autoklawie po zabiegu. Przepłucz rurkę roztworem PBS, a następnie opróżnij, całkowicie wysusz i przechowuj do dalszego użycia.
5. Wizualizacja perfundowanego aksolotla
- Umieść aksolotla pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym.
- Wyłącz światła, ponieważ wizualizacja naczyń zabarwionych DiI jest utrudniona przez światło.
- Użyj kostki z zielonym filtrem emisji fluorescencji (np. ET-CY3) z mikroskopem konfokalnym, aby uwidocznić unaczynienie aksolotl. Użyj światła wzbudzającego o długości fali 545 nm.
Uwaga: Aby uzyskać obraz o wysokiej jakości, można użyć następujących parametrów: ekspozycja przez 1,1 s, wzmocnienie 1x, nasycenie 1,0, powiększenie 2x.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Dzięki barwieniu DiI można łatwo zwizualizować układ naczyniowy aksolotla. Naczynia krwionośne zwierząt poddanych perfuzji lipofilnym barwnikiem są natychmiast widoczne pod konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym. Rysunek 1.1-1.5 przedstawia schemat protokołu perfuzji. Po perfuzji intensywnie różowym barwnikiem poprawnie zabarwiony aksolotl będzie miał różowy kolor. Przy zastosowaniu zielonego filtra fluorescencyjnego w mikroskopie konfokaln...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wizualizację unaczynienia aksolotla można z powodzeniem przeprowadzić poprzez perfuzję z lipofilowym barwnikiem karbocyjaninowym, DiI. W tym badaniu opisujemy nowatorski protokół perfuzji aksolotla z DiI za pomocą pompy perystaltycznej. Pokazujemy również późniejszą wizualizację układu naczyniowego aksolotla za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. Protokół ten był adaptacją protokołu perfuzji DiI u gryzoni obserwowanego u Li i wsp.7, jednak duże różnice między gryzoniem a aks...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Brigham & Women's Hospital oraz March of Dimes. Autorzy pragną podziękować wszystkim członkom Whited Lab za wsparcie i rady.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pompa perystaltyczna | Marshall Naukowy | RD-RP1 | |
| Excelon Lab & Rurka próżniowa | 436901705 rozmiar S1A | ||
| 27g igła motylkowa | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| destylowana | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glukoza | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1&-Dioctadecyl-3,3,3′,3′,3′- Nadchloran tetrametyloindokarbocyjaniny | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Etanol (100% obj./obj.) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Foreceps chirurgiczny | Medline | MDG0748741 | |
| Rama | dowolny kwadrat z pianki polistyrenowej w kształcie aksolotla wycięte | ||
| Nożyczki chirurgiczne | Medline | DYND04025 | |
| Skalpel | Medline | MDS15210 | |
| Podkład chłonny | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Ręczniki | |||
| Standardowa jednorazowa pipeta transferowa | Fisherbrand | 50216954 | |
| Stojak zaciskowy | Adafruit | 291 | |
| 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian | Sigma | Aldrich E10521 | Trikaina proszek |
| Dorosły aksolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma | Aldrich S5761-500G | |
| Zbiorniki | plastikowe Różne rozmiary odpowiednie dla aksolotla | ||
| Paraformaldehyd | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Aksolotl | |||
| Mikroskop Leica | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
Bibliografia
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374(2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
