Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej

Podsumowanie

Choroby związane z wiekiem są związane z wieloma defektami składników cytoplazmy. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania pęcherzyków błony komórkowej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana jako środek terapii zastępczej cytoplazmy w celu poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem.

Streszczenie

Wcześniej informowaliśmy o wytwarzaniu pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) poprzez mechaniczne wytłaczanie komórek ssaków. Fuzja PMV z mitochondrialnymi komórkami Rho0 z niedoborem mitochondriów przywróciła aktywność mitotyczną w normalnych warunkach hodowli. Miażdżyca, cukrzyca typu 2, choroba Alzheimera i rak to choroby związane z wiekiem, które, jak doniesiono, są związane z wieloma mechanicznymi i funkcjonalnymi defektami cytozolu i organelli różnych typów komórek. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) reprezentują unikalną populację komórek ze szpiku kostnego, które posiadają zdolności do samoodnawiania się przy zachowaniu swojej multipotencji. Suplementacja komórek starzenia młodą cytoplazmą z autologicznych BMSC poprzez fuzję PMV stanowi obiecujące podejście do poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować PMV z BMSC poprzez wytłaczanie przez membranę poliwęglanową z porami 3 μm, określić istnienie mitochondriów i zbadać utrzymanie potencjału błonowego w PMV za pomocą mikroskopu konfokalnego, zagęścić PMV przez odwirowanie i przeprowadzić wstrzyknięcie in vivo PMV do mięśnia brzuchatego łydki myszy.

Wprowadzenie

Ogromna ilość wysiłku została włożona w opracowanie metod terapii zastępowania genów, enzymów i komórek. Zaowocowało to wielkimi przełomami, a nawet zastosowaniami klinicznymi^1,2,3. Ostatnio kontrowersyjna terapia zastępcza mitochondriów oparta na technologii transferu jądra została zastosowana do zapłodnienia in vitro u kobiet w podeszłym wieku lub z letalną mutacją mitochondrialnego DNA⁴. Wady występujące w chorobach związanych z wiekiem, w tym miażdżycy, cukrzycy typu 2, chorobie Alzheimera i nowotworach, są zwykle wieloaspektowe. Udokumentowano, że gromadzenie się kropelek lipidów; odkładanie się białka amyloidowego; zatrzymywanie niesfałdowanych białek w retikulum endoplazmatycznym; a wadliwy proteasom, autofagosom i mitochondria przyczyniają się do rozwoju lub zaostrzenia tych chorób^{5,6,7,8,9,10,11}. Obecnie nie ma dostępnego mechanizmu mającego na celu bezpośrednie zaradzenie nieprawidłowemu działaniu cytozolu i organelli, które powoduje starzenie się i starzenie fenotypów.

Wcześniej informowaliśmy o wytwarzaniu pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) poprzez mechaniczne wytłaczanie komórek ssaków¹². Z wyjątkiem jądra, w PMV znaleziono składniki błony lub cytozolu, w tym białka i RNA, a także organelle, takie jak mitochondria. Zasadniczo PMV można uznać za miniaturową komórkę wyłuszczoną. Co ważniejsze, fuzja PMV z komórkami Rho0 z niedoborem mitochondriów przywróciła aktywność mitotyczną w normalnych warunkach hodowli. Jest to pierwszy raport dotyczący ustalenia potencjalnie skutecznego podejścia do cytoplazmowej terapii zastępczej.

Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) są multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi, które są rutynowo generowane ze szpiku kostnego i łatwo się namnażają w hodowli. Markery embrionalnych komórek macierzystych Oct4, Nanog i SOX2 zostały wykryte na niskich poziomach w MSCs¹³. Aktywność telomerazy jest również mierzalna. Ponadto brak cząsteczek kostymulujących i cząsteczek ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy II, a także niska ekspresja HLA klasy I na MSCs, sprawiają, że są to idealne komórki do allogenicznego lub "gotowego" zastosowania zarówno w medycynie regeneracyjnej, jak i immunomodulacji¹⁴.

Tutaj opisujemy, jak przygotować PMV z mysich BMSC poprzez ekstruzję przez membranę poliwęglanową z porami 3-μm, określić istnienie mitochondriów i zbadać utrzymanie potencjału błonowego w PMV za pomocą mikroskopii konfokalnej, przygotować skoncentrowane, ale nie zagregowane PMV przez wirowanie, i przeprowadzić in-vivo iniekcję PMV do mięśnia brzuchatego łydki myszy.

Protokół

8 do 12 tygodniowych myszy BALB/c zostały zakupione w Shanghai Experimental Animal Center (Szanghaj, Chiny) i hodowane w specyficznym, wolnym od patogenów i klimatyzowanym obiekcie dla zwierząt. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi ustanowionymi przez Uniwersytet Shantou.

1. Montaż aparatury

1. Aby zapewnić sterylność, przed użyciem włącz światło UV okapu do hodowli tkankowej na 30 minut.
2. Odkręć jednorazową jednostkę filtrującą 25 mm i zanurz nakrętkę i spód urządzenia w szklanym kubku o pojemności 200 ml wypełnionym 75% etanolem na 30 minut. Urządzenie wykonane jest z polipropylenu klasy medycznej.
3. Podnieś nasadkę i spód urządzenia za pomocą kleszczy, ręcznie strząśnij pozostały etanol i pozostaw części do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w masce.
4. Zwilż membranę poliwęglanową o grubości 19 mm w PBS i ostrożnie umieść ją na matrycy nośnej dolnej części urządzenia. Folia polimerowa ma gładką, płaską powierzchnię i wytrawione pory o wielkości 3 μm.
5. Zmontuj urządzenie, mocno dokręcając nakrętkę do spodu. Upewnij się, że membrana nie jest wysunięta ze środka.
6. Usunąć igłę ze strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i pobrać 1 ml PBS. Podłącz strzykawkę do jednostki filtrującej, a następnie przepchnij PBS przez jednostkę, aby zwilżyć zespół i sprawdzić, czy nie ma wycieków.

2. Wytwarzanie pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV)

1. Ustal kulturę BMSC, zgodnie z raportem Nemetha i wsp.¹⁵, w pożywce DMEM zawierającej 15% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki na 6-dołkowej płytce w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
2. Aby rozmnożyć komórki, usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz studzienkę 0,5 ml bezwapniowego PBS.
3. Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Postukaj płytką o dłoń kilka razy, aby ułatwić odklejanie komórek. Zatrzymaj trawienie, dodając 1 ml pożywki hodowlanej.
4. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 200 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki hodowlanej i podzielić komórki na dwie studzienki na płytce 6-dołkowej.
   UWAGA: Komórki zwykle osiągają konfluencję po około 24 godzinach.
5. Aby wytworzyć PMV, należy pobrać komórki z jednego dołka (około 5 x 10⁵ komórek) z 6-dołkowej płytki przez trawienie trypsyną i monodyspersować komórki w 0,5 ml pożywki hodowlanej.
6. Załaduj komórki do strzykawki insulinowej, przymocuj ją do jednostki filtrującej i szybko naciśnij tłok, aby przecisnąć komórki przez filtr. Wytłaczane medium należy wyrzucić, ponieważ powinno się w nim znajdować tylko kilka PMV.
7. Załaduj dodatkowe 0,5 ml pożywki do strzykawki i szybko przepchnij ją przez filtr. Zebrano pożywkę z drugiej ekstruzji, która zawiera PMV o różnej wielkości.
8. Załaduj 150 μl zebranego podłoża do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól PMV osiąść na dnie przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem z odwróconą fazą kontrastu wyposażonym w kamerę CCD przy użyciu soczewki obiektywu 20X.

3. Badanie zawartości w PMV za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Aby przeprowadzić transfekcję w BMSC, rozcieńczyć 2 μg superskręconego plazmidowego DNA i 6 μl odczynnika do transfekcji kationowej (np. PolyJet) w 50 μl DMEM bez surowicy. Wiruj, aby dobrze wymieszać i krótko odwiruj, aby zebrać cały płyn z boków rurki.
2. Dodawać rozcieńczony roztwór (z kroku 3.1) kroplami do rozcieńczonego roztworu DNA, mocno wirować przez 1 minutę, krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Zastąp starą pożywkę na BMSC, które zostały wysiane w ciągu około 30% zbiegu przez noc, 2 ml świeżej pożywki hodowlanej i dodawaj kroplami mieszaninę transfekcji DNA.
4. Zastąp 2 ml świeżej pożywki po 12 godzinach transfekcji.
5. Aby śledzić białka zlokalizowane cytoplazmatycznie, należy transfekować komórki plazmidem zawierającym kasetę ekspresji EGFP (pEGFP-N1), jak opisano powyżej. Zebrać komórki przez trawienie trypsyny 48 godzin po transfekcji w celu wytworzenia PMV, jak opisano powyżej.
6. Aby prześledzić mitochondria, należy wybarwić komórki barwnikiem mitochondrialnym (1 μM, MitoTracker) w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
7. Aby wykryć potencjał błonowy mitochondriów, należy wybarwić komórki barwnikiem cyjaninowym JC-1 (jodek 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimi-dazolylokarbocyjaniny) (10 μg/ml) w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   1. Umyj komórki trzykrotnie 0,5 ml PBS, a następnie zbierz komórki przez trawienie trypsyny w celu wytworzenia PMV, jak opisano powyżej.
   2. Załaduj 150 μl zebranego podłoża do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól PMV osiąść na dnie przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 100X.
8. Aby wykryć EGFP lub barwnik mitochondrialny, włącz laser 488 nm i zbierz sygnał o długości fali 505-530 nm. Aby wykryć JC-1, włącz lasery 488 nm i 543 nm i zbieraj sygnały o długości fali 505-530 nm i 560-615 nm. Ustaw wartość otworka na około 1,4.

4. Przygotowanie skoncentrowanych PMV przez wirowanie

1. Zbierz komórki przez trawienie trypsyny i wygeneruj PMV, jak opisano powyżej, w 0,5 ml pożywki hodowlanej.
2. Wirować PMV przy 1 200 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki hodowlanej, delikatnie obracając.
3. Załaduj 50 μl PMV do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól im osiąść w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 40X.
4. Dodać serię rozcieńczonego roztworu polietyleniniminy (PEI) do kultury BMSC na 1 godzinę i sprawdzić, czy nie ma oznak cytotoksyczności.
   UWAGA: W tym przypadku wybrano PEI na poziomie 2 μg/ml, ponieważ nie wykryto żadnych oznak toksyczności w BMSC.
5. Zbierz komórki przez trawienie trypsyny i dodaj PEI w ilości 2 μg/ml przez 1 godzinę, aby naładować błonę komórkową jako środek zapobiegający agregacji. Wygenerować PMV, jak opisano powyżej, w 0,5 ml pożywki hodowlanej. Skoncentruj PMV i zbadaj je pod mikroskopem konfokalnym, jak opisano powyżej.

5. Wstrzyknięcie PMV do mięśnia brzuchatego łydki

1. Aby zabarwić membranę, dodaj barwnik CM-DiI (chloromethyl dialkilo-indocarbocyanine) (10 μM) w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej do BMSC na 30 minut.
2. Zbierz komórki (około 5 x 10⁵) przez trawienie trypsyny i ponownie zawieś je w 0,5 ml pożywki hodowlanej. Dodaj PEI (2 μg/ml) na 1 godzinę. Wytworzyć i zagęścić PMV w 100 μl pożywki hodowlanej, jak opisano powyżej.
3. Znieczulij mysz BALB/c, wstrzykując barbital sodu (10 mg/kg) po 12 godzinach postu.
4. Oczyść zewnętrzną część mięśnia brzuchatego łydki 75% etanolem. Powoli wstrzyknąć PMV (100 μl) do mięśnia brzuchatego łydki za pomocą strzykawki insulinowej 30 G.
5. Po podaniu znieczulenia umieść mokrą gazę na oczach na czas eksperymentu i ogrzej mysz żarówką, aż się obudzi. Umieść mysz samą w indywidualnej klatce wentylacyjnej.
6. Aby zebrać mięsień brzuchaty łydki 12 godzin po operacji, zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
7. Posyp mięsień brzuchaty łydki 75% etanolem, otwórz skórę nożyczkami i wytnij cały mięsień brzuchaty łydki na obu końcach.
8. Przepłucz mięsień PBS i zbadaj go pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą soczewki obiektywowej 20X.
9. Przytnij mięsień ostrą żyletką, aby usunąć części bez fluorescencji. Części o silnej czerwonej fluorescencji pokroić w około 9 mm³ kostkę.
10. Zanurz każdą kostkę w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zanurz ją w ciekłym azocie na 5 minut i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu użycia.
11. Pokrój zamrożone kawałki na kawałki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu i przyklej każdą sekcję do szkiełka podstawowego. Przepłukać sekcję raz za pomocą PBS.
12. Narysuj okrąg wokół sekcji za pomocą pisaka do barwienia i dodaj 100 μl DAPI (1 μg/ml). Odessać roztwór DAPI po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności i przemyć trzykrotnie PBS.
13. Upuść olej montażowy na próbkę, przykryj ją szkiełkiem i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci. Zbadaj przekrój pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 100X.
14. Aby wykryć CM-DiI, włącz laser 543 nm i zbierz sygnał o długości fali 560-615 nm. Aby wykryć DAPI, włącz laser 405 nm i zbierz sygnał o długości fali 420-480 nm. Ustaw wartość otworka na około 1,4.

Wyniki

Kluczem do udanego przygotowania PMV jest w dużej mierze prawidłowe złożenie jednostki filtrującej (Rysunek 1), którą można przetestować, przepychając 1 ml PBS przez membranę. Jeśli wystąpi wyciek, zmontuj ponownie jednostkę filtrującą i przetestuj ponownie. Jednak nieszczelność można wiarygodnie sprawdzić tylko wtedy, gdy komórki są przepychane przez membranę. Jeśli tylko kilka PMV zostanie wykrytych pod zwykłym mikroskopem przy użyciu obiektywu 10X lub jeśli rozmiar PMV...

Dyskusja

Cytoplazmatyczna terapia zastępcza zaproponowana w tym manuskrypcie ma wyjątkowe zalety w porównaniu z innymi opisanymi podejściami, takimi jak terapia genowa, molekularna i komórkowa. PMV generowane przez BMSC zawierają w sobie nie tylko produkty genów macierzystych, ale także nienaruszone organelle komórkowe, które są niezbędne do przeciwdziałania fenotypom starzenia się związanym ze starzeniem się. Kiedy młoda cytoplazma jest dostarczana do komórek starczych, nieprawidłowo działające mechanizmy mogą uzyskać krótką ulg...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Membrany IsoporeTM	Milipore	TSTP04700	3 mm porów
Jednorazowa jednostka filtrująca	Xinya, Szanghaj, Chiny	25 mm	Polipropylen
medyczny Strzykawka insulinowa	BD	328446	1 ml
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
Sondy molekularne	MitoTracker	M7514	Zielony FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, Chiny	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, Chiny	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	Mn = 75 000 Mikroskop
fluorescencyjny	Nikon	Eclipse TE 2000	Z kamerą CCD
Mikroskop Confocol	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	Do transfekcji komórek