Method Article

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Program ekspresji genów w cyklu komórkowym stanowi kluczowy krok do zrozumienia procesów zależnych od cyklu komórkowego i ich roli w chorobach takich jak rak. Analiza ekspresji genów regulowanej przez cykl komórkowy zależy od synchronizacji komórki w określone fazy. Tutaj opisujemy metodę wykorzystującą dwa komplementarne protokoły synchronizacji, która jest powszechnie stosowana do badania okresowych zmian ekspresji genów podczas cyklu komórkowego. Obie procedury polegają na przejściowym zablokowaniu cyklu komórkowego w jednym zdefiniowanym punkcie. Protokół synchronizacji przez leczenie hydroksymocznikiem (HU) prowadzi do zatrzymania komórek w późnej fazie G1 / wczesnej S, a uwolnienie z zatrzymania za pośrednictwem HU zapewnia populację komórkową równomiernie postępującą przez S i G2 / M. Protokół synchronizacji przez leczenie tymidyną i nokodazolem (Thy-Noc) blokuje komórki we wczesnej mitozie, a uwolnienie z zatrzymania za pośrednictwem Thy-Noc zapewnia zsynchronizowaną populację komórkową odpowiednią do badań fazy G1 i S wchodzącej w fazę. Zastosowanie obu procedur wymaga monitorowania profili dystrybucji cyklu komórkowego, które zwykle wykonuje się po barwieniu komórek jodkiem propidyny (PI) i analizie zawartości DNA za pośrednictwem cytometrii przepływowej. Pokazujemy, że połączone zastosowanie dwóch protokołów synchronizacji jest solidnym podejściem do jasnego określenia profili transkrypcyjnych genów, które są różnie regulowane w cyklu komórkowym (tj. E2F1 i E2F7), a w konsekwencji do lepszego zrozumienia ich roli w procesach cyklu komórkowego. Ponadto wykazaliśmy, że podejście to jest przydatne w badaniu mechanizmów leżących u podstaw terapii opartych na lekach (np. mitomycynie C, leku przeciwnowotworowym), ponieważ pozwala odróżnić geny, które reagują na czynnik genotoksyczny, od tych, które są dotknięte wyłącznie zaburzeniami cyklu komórkowego narzuconymi przez ten środek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejście przez wszystkie fazy cyklu komórkowego jest sprzężone ze ściśle regulowanym programem ekspresji genów. Uważa się, że to skoordynowane "włączanie i wyłączanie" transkrypcji genów w całym cyklu komórkowym jest pod kontrolą złożonych transkrypcyjnych systemów regulacyjnych, regulujących nie tylko czas, ale także poziomy ekspresji genów. Wiadomo, że deregulacja kluczowych składników cyklu komórkowego przyczynia się do rozwoju wielu chorób i jest dobrze znaną cechą charakterystyczną nowotworzenia1,2. Analizy transkryptomiczne całego genomu przeprowadzone w komórkach drożdży i ssaków wykazały, że duża licz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronizacja, uwalnianie i monitorowanie postępu cyklu komórkowego

  1. Synchronizacja i uwalnianie komórek U2OS z mitozy (Thy-Noc) na bazie tymidyny i nokodazolu
    1. Przygotuj wymaganą pożywkę do hodowli komórkowych. Komórki U2OS są rutynowo hodowane w pożywce DMEM-Glutamina uzupełniona 10% (vol/vol) FBS (opcjonalnie: 1% penicyliny/streptomycyny). Przygotowanie i manipulację pożywki należy przeprowadzić w sterylnych warunkach, a przed użyciem rozgrzać uzupełnioną pożywkę (zwaną dalej "kompletną pożywką") do temperatury 37 °C.
    2. Wysiew 2 x 106 komórek U2OS na 100 mm szalka w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie protokołów opartych na Thy-Noc i HU do synchronizacji komórek.

Rysunek 1 podsumowuje kroki wymagane do synchronizacji komórek U2OS i późniejszego pobierania próbek w celu sprawdzenia postępu przez cykl komórkowy i przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Barwienie fosfo-H3 i PI są dobrymi parametrami oceny do wyboru metod synchroni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza precyzyjnie regulowanych genów zaangażowanych w przejściowe i specyficzne role w cyklu komórkowym wymaga jednolitej populacji komórek. Wielu badaczy rutynowo wykorzystuje do tych celów dawno ustalone linie komórek nowotworowych i opracowano różne metody w celu uzyskania synchronicznych (lub częściowo synchronicznych) populacji komórek, w celu zgromadzenia jak największej liczby komórek w określonych fazach cyklu komórkowego. Ponadto podjęto zdecydowane wysiłki w celu ulepszenia i optymalizacji dobrze znanych pode.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratoriów Zubiaga i Altmeyer za pomocne dyskusje i wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty hiszpańskiego Ministerstwa (SAF2015-67562-R, MINECO/FEDER, UE), rządu baskijskiego (IT634-13 i KK-2015/89) oraz Uniwersytetu Kraju Basków UPV/EHU (UFI11/20).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, kwalifikowany, zatwierdzony przez UE, pochodzenie z Ameryki PołudniowejThermo Fisher Scientific10270-106
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200-072
TymidynaSIGMAT1895-5GŚwieżo przygotowany. Lekkie ocieplenie może pomóc w rozpuszczeniu tymidyny.
NokodazolSIGMAM-1404Roztwór podstawowy w DMSO przechowywany w temperaturze -20 º C w małych podwielokrotnościach
HydroksymocznikSIGMAH8627Świeżo przygotowana
mitomycyna C ze Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM roztwór podstawowy w sterylnym H2O chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze 4 º C
DimetylosulfotlenekSIGMAD2650
Jodek propidynySIGMAP4170Roztwór podstawowy w sterylnym PBS w stężeniu 5 mg/ml, przechowywany w temperaturze 4 μ; C chroniony przed światłem.
PBS pH 7,6Domowy
etanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Cytrynian soduPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAzywa Odczynnik
TRIzolLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific4368814
Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała antycyklinowego E14129:1000 rozcieńczenie w 5% mleku, o / n, 4 i ordm; C
Przeciwciało antycyklinowe B1Sygnalizacja komórkowa41351:1000 rozcieńczenie w 5% mleku, o / n, 4 i ordm; C
Anty-&beta-aktynaSIGMAA-5441Rozcieńczenie 1:3000 w 5 % mleku, 1 godz., RT
Anty-pH3 (Ser 10) antybotyMillipore06-570Określone w protokole
Wtórne przeciwciało anty-królicze AlexaFluor 488InvitrogenR37116Określone w protokole
Drugorzędowe przeciwciało anty-mysie HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697Rozcieńczenie 1:3000 w 5 % mleku, 1 godz.,
przeciwciało RT Forward E2F1 (ludzkie)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało odwrócone E2F1 (ludzkie)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało Forward E2F7 (człowiek)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało przeciwne E2F7 (ludzkie)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 przeciwciało (ludzkie)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Odwrócone p21Cip1 przeciwciało (ludzkie)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioZaprojektowany przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP przeciwciało przeciwciało (ludzkie) gen odniesienia                                       BiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało odwrócone TBP (ludzkie)                                       BiolegioZaprojektowany przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L przeciwciało (ludzkie) gen referencyjny    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   przeciwciało (ludzkie)      CACAGGAATGAGAGGTTTATAG                               BiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
Probówki FACS Sarstedt551578
MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo Fisher ScientificN8010560
Naczynie hodowlane Corning 100 mm z powłoką TCPłytki
Corning Costar 6-dołkowamikrowirówka3506
Eppendorf5415 R
Wirówka stołowa z chłodzeniem Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
BD Cytometr przepływowy FACSCaliburBD Bioscience
QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher ScientificA28567
Thermo Fisher Scientific EN0531 1 do hodowli komórkowych Corning stołowa z chłodzeniem Corning Spektrofotometr

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles