Method Article

Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłaszamy dwa protokoły synchronizacji komórek, które dostarczają kontekstu do badania zdarzeń związanych z określonymi fazami cyklu komórkowego. Pokazujemy, że to podejście jest przydatne do analizy regulacji określonych genów w niezakłóconym cyklu komórkowym lub po ekspozycji na czynniki wpływające na cykl komórkowy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Program ekspresji genów w cyklu komórkowym stanowi kluczowy krok do zrozumienia procesów zależnych od cyklu komórkowego i ich roli w chorobach takich jak rak. Analiza ekspresji genów regulowanej przez cykl komórkowy zależy od synchronizacji komórki w określone fazy. Tutaj opisujemy metodę wykorzystującą dwa komplementarne protokoły synchronizacji, która jest powszechnie stosowana do badania okresowych zmian ekspresji genów podczas cyklu komórkowego. Obie procedury polegają na przejściowym zablokowaniu cyklu komórkowego w jednym zdefiniowanym punkcie. Protokół synchronizacji przez leczenie hydroksymocznikiem (HU) prowadzi do zatrzymania komórek w późnej fazie G1 / wczesnej S, a uwolnienie z zatrzymania za pośrednictwem HU zapewnia populację komórkową równomiernie postępującą przez S i G2 / M. Protokół synchronizacji przez leczenie tymidyną i nokodazolem (Thy-Noc) blokuje komórki we wczesnej mitozie, a uwolnienie z zatrzymania za pośrednictwem Thy-Noc zapewnia zsynchronizowaną populację komórkową odpowiednią do badań fazy G1 i S wchodzącej w fazę. Zastosowanie obu procedur wymaga monitorowania profili dystrybucji cyklu komórkowego, które zwykle wykonuje się po barwieniu komórek jodkiem propidyny (PI) i analizie zawartości DNA za pośrednictwem cytometrii przepływowej. Pokazujemy, że połączone zastosowanie dwóch protokołów synchronizacji jest solidnym podejściem do jasnego określenia profili transkrypcyjnych genów, które są różnie regulowane w cyklu komórkowym (tj. E2F1 i E2F7), a w konsekwencji do lepszego zrozumienia ich roli w procesach cyklu komórkowego. Ponadto wykazaliśmy, że podejście to jest przydatne w badaniu mechanizmów leżących u podstaw terapii opartych na lekach (np. mitomycynie C, leku przeciwnowotworowym), ponieważ pozwala odróżnić geny, które reagują na czynnik genotoksyczny, od tych, które są dotknięte wyłącznie zaburzeniami cyklu komórkowego narzuconymi przez ten środek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejście przez wszystkie fazy cyklu komórkowego jest sprzężone ze ściśle regulowanym programem ekspresji genów. Uważa się, że to skoordynowane "włączanie i wyłączanie" transkrypcji genów w całym cyklu komórkowym jest pod kontrolą złożonych transkrypcyjnych systemów regulacyjnych, regulujących nie tylko czas, ale także poziomy ekspresji genów. Wiadomo, że deregulacja kluczowych składników cyklu komórkowego przyczynia się do rozwoju wielu chorób i jest dobrze znaną cechą charakterystyczną nowotworzenia1,2. Analizy transkryptomiczne całego genomu przeprowadzone w komórkach drożdży i ssaków wykazały, że duża liczba genów wykazuje okresowe wzorce ekspresji genów w cyklu komórkowym, co sugeruje, że fluktuacja transkrypcji podczas cyklu komórkowego jest odzwierciedleniem czasowego zapotrzebowania danego produktu genu w precyzyjnej fazie3,4,5.

Głównym zadaniem w badaniu ekspresji genów regulowanych przez cykl komórkowy jest synchronizacja komórek w określonych fazach cyklu komórkowego. Synchronizacja komórek pomaga interpretować powiązanie wzorca ekspresji genów z określonym przejściem fazowym cyklu komórkowego i doprowadziła do lepszego zrozumienia regulacji i funkcji wielu genów. Synchronizacja komórek jest również ważna dla badania mechanizmu działania leków przeciwnowotworowych, ponieważ wiadomo, że chemioterapeutyki wpływają zarówno na ekspresję genów, jak i kinetykę cyklu komórkowego6,7. Niemniej jednak często trudno jest określić, czy różnice w ekspresji genów wynikające z leczenia tymi środkami są bezpośrednią reakcją na leczenie, czy też są jedynie konsekwencją zmian w profilach cyklu komórkowego. Aby rozróżnić te możliwości, należy przeanalizować ekspresję genów w komórkach, które zostały zsynchronizowane przed dodaniem leku chemioterapeutycznego.

Z wyjątkiem niektórych komórek pierwotnych, takich jak świeżo izolowane komórki limfoidalne -które stanowią jednorodną populację komórek zsynchronizowaną w G08-, in vitro ustalone linie komórkowe rosną asynchronicznie w hodowli. W normalnych warunkach wzrostu te asynchronicznie cykliczne komórki znajdują się we wszystkich fazach cyklu komórkowego, ale preferencyjnie w G19. W związku z tym kontekst ten nie zapewnia optymalnego scenariusza dla analiz funkcjonalnych lub analiz ekspresji genów w określonej fazie cyklu komórkowego (np. G1, S itp.). Nieprzekształcone, unieśmiertelnione linie komórkowe (np. fibroblasty) mogą być synchronizowane za pomocą tzw. metod fizjologicznych10. Metody te opierają się na zachowanych pierwotnych cechach komórek nieprzekształconych, takich jak hamowanie kontaktu komórkowego i zależność od czynnika wzrostu w celu kontynuowania cyklu. Usunięcie surowicy w połączeniu z inhibicją, powoduje zatrzymanie nieprzekształconych komórek w G0/G1. Jednak zsynchronizowane wejście i progresja cyklu komórkowego często wymaga subhodowli, która obejmuje również sztuczne odrywanie komórek i ponowne powlekanie10. Co najważniejsze, metoda ta nie nadaje się do synchronizacji transformowanych linii komórkowych, zdecydowanej większości obecnie używanych linii komórkowych, charakteryzujących się brakiem zahamowania wzrostu za pośrednictwem kontaktu komórkowego lub odpowiedzi na wycofanie czynnika wzrostu. W związku z tym jasne jest, że do efektywnej synchronizacji komórek w określonych fazach cyklu komórkowego potrzebne są alternatywne metody. Ogólnie rzecz biorąc, najczęściej stosowane metody synchronizacji opierają się na przejściowym chemicznym lub farmakologicznym hamowaniu jednego zdefiniowanego punktu cyklu komórkowego, zwykle syntezie DNA lub tworzeniu wrzeciona mitotycznego. Hamowanie syntezy DNA synchronizuje komórki poprzez zatrzymanie ich w późnej fazie G1 lub wczesnej fazie S. Można to osiągnąć poprzez dodanie związków takich jak mimozyna, inhibitor biosyntezy nukleotydów11,12, afidikolina, inhibitor polimeraz DNA13,14, hydroksymocznik, inhibitor reduktazy rybonukleotydowej15,16 lub przez nadmiar tymidyny17,18. Z drugiej strony, inhibitory polimeryzacji mikrotubul, takie jak kolchicyna czy nokodazol, są w stanie blokować tworzenie wrzeciona mitotycznego, prowadząc do synchronizacji komórek we wczesnej fazie M19,20,21.

W tej pracy opisujemy metodę obejmującą dwa komplementarne protokoły synchronizacji oparte na przejściowym hamowaniu chemicznym do badania ekspresji genów regulowanych cyklem komórkowym na poziomie mRNA. Metoda ta ma fundamentalne znaczenie dla określenia roli genów cyklu komórkowego w określonych procesach cyklu komórkowego. Co więcej, zapewnia ogólne ramy do badania wpływu terapii przeciwnowotworowych w celu dokładnego wykrywania genów reagujących na leki i zminimalizowania błędnych interpretacji wynikających z zaburzeń w progresji cyklu komórkowego generowanych przez te leki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synchronizacja, uwalnianie i monitorowanie postępu cyklu komórkowego

  1. Synchronizacja i uwalnianie komórek U2OS z mitozy (Thy-Noc) na bazie tymidyny i nokodazolu
    1. Przygotuj wymaganą pożywkę do hodowli komórkowych. Komórki U2OS są rutynowo hodowane w pożywce DMEM-Glutamina uzupełniona 10% (vol/vol) FBS (opcjonalnie: 1% penicyliny/streptomycyny). Przygotowanie i manipulację pożywki należy przeprowadzić w sterylnych warunkach, a przed użyciem rozgrzać uzupełnioną pożywkę (zwaną dalej "kompletną pożywką") do temperatury 37 °C.
    2. Wysiew 2 x 106 komórek U2OS na 100 mm szalka w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Aby obliczyć liczbę potrzebnych szalek, należy wziąć pod uwagę, że każda szalka o średnicy 100 mm zazwyczaj dostarcza wystarczającą ilość komórek mitotycznych do ponownego nawarstwienia około 5 dołków płytki 6-dołkowej (0,2 - 0,25 x 106 komórek / studzienkę) (patrz rysunek 1B). W eksperymencie wymagane są dwie studzienki na wybrany punkt czasowy (1 studzienka do ekstrakcji RNA i 1 studzienka do monitorowania cyklu komórkowego). Dodatkowo, trzeci studzienek może być pobrany na punkt czasowy do analizy białka.
      UWAGA: Komórki płytkowe w godzinach wieczornych (około godziny 19), aby kolejne kroki można było przeprowadzić w godzinach pracy w kolejnych dniach. Dołącz 2 dodatkowe studzienki asynchronicznie rosnących komórek, aby zdefiniować ustawienia kompensacji analizy FACS.
    3. Pozwól komórkom przyłączyć się poprzez inkubację szalek o średnicy 100 mm w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 24 godziny.
    4. W przypadku bloku tymidyny należy przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 200 mM tymidyny, rozpuszczając 145,2 mg proszku tymidyny w 3 mlH2O(lub równoważnych ilościach) i wysterylizować roztwór przez filtrację przez filtr o wielkości porów 0,2 μm. Lekkie ocieplenie może pomóc w rozpuszczeniu tymidyny. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego 200 mM bulionu do każdego 100 mm naczynia hodowlanego (końcowe stężenie 2 mM). Inkubować komórki z tymidyną przez 20 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2,
      UWAGA: Leczenie komórek odbywa się wieczorem (około godziny 19), aby mieć czas na wykonanie zarówno uwalniania tymidyny, jak i bloku nokodazolu następnego dnia.
    5. Aby uwolnić się z bloku tymidyny, usuń pożywkę zawierającą tymidynę po południu następnego dnia (15:00); umyj komórki dwukrotnie wstępnie podgrzanym 1x PBS i dodaj 10 ml kompletnej pożywki do każdego naczynia o średnicy 100 mm. Inkubować komórki przez 5 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .
    6. W celu zatrzymania komórek mitotycznych dodać nokodazol do końcowego stężenia 50 ng/ml (8 pm). Przygotować roztwór podstawowy, rozpuszczając nokodazol w proszku w DMSO (np. 5 mg/ml) i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C. Inkubować komórki z nokodazolem nie dłużej niż 10-11 godzin w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
    7. Uwolnienie z zatrzymania za pośrednictwem nokodazolu we wczesnej fazie M (mitotyczne wytrząsanie) i pobieranie próbek w kilku punktach czasowych (począwszy od 6-7 rano).
      1. Odłączyć zaokrąglone (mitotyczne) komórki, potrząsając każdą płytką i delikatnie pipetując pożywkę wzrostową zawierającą nokodazol. Zebrać pożywkę z oderwanymi komórkami z każdej płytki o średnicy 100 mm do sterylnych probówek o pojemności 50 ml, odwirować (300 x g, 5 min, temperatura pokojowa (RT)) i dwukrotnie przepłukać komórki, dodając 1 x PBS, a następnie odwirować. Zaleca się stosowanie zimnego PBS lub PBS z nokodazolem w celu uniknięcia poślizgu mitotycznego (patrz punkt Dyskusja).
      2. Zawiesić komórki mitotyczne zebrane z każdej płytki o średnicy 100 mm w 10 ml kompletnej pożywki. Zaoszczędź 2 ml na ekstrakcję RNA i 2 ml na analizę FACS na punkt czasowy 0 h (około 0,2-0,25 x 106 komórek na próbkę).
      3. Ponownie płytkować pozostałe komórki mitotyczne dla kolejnych punktów czasowych na płytkach 6-dołkowych (2 ml / dołek; 0,2-0,25 x 106 komórek / dołek).
        UWAGA: Pamiętaj, że wymagane są 2 dołki na wybrany punkt czasowy (1 dla RNA i 1 dla analizy FACS).
    8. Zbierz próbki w wybranych punktach czasowych. Zaleca się wykonywanie czynności co 1,5 do 3 godzin w celu uzyskania odpowiedniego profilu przebiegu cyklu komórkowego.
      1. W przypadku ekstrakcji RNA należy usunąć pożywkę, dobrze przepłukać 2 ml wstępnie ogrzanego 1x PBS i dodać 1 ml odpowiedniego odczynnika do izolacji RNA (np. TRIzolu) do studzienki (ten ostatni krok należy wykonać w komorze bezpieczeństwa dla chemikaliów). Pipetować w górę i w dół, aby odłączyć i poddać lizie komórki, przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej i przechowywać probówkę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      2. Do analizy FACS dobrze spłukać 2 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS, dodać wstępnie podgrzany roztwór trypsyny-EDTA (0,3 ml / studzienkę) w celu odłączenia komórek, zablokować Trypsynę-EDTA, dodając 1 ml kompletnej pożywki i zebrać każdą próbkę w oddzielnej probówce o pojemności 15 ml.
        1. Odwiruj komórki (300 x g, 5 min, RT), oszczędzaj osad komórkowy i odrzuć supernatant. W celu utrwalenia komórek, należy ponownie zawiesić komórki w 1 ml schłodzonego etanolu o stężeniu 70% (v/v) w 1x PBS poprzez delikatne wirowanie probówek i umieścić je na lodzie na około 15 minut przed przechowywaniem w temperaturze 4 °C lub barwieniem w celu dalszej analizy przez FACS (opisane w krokach 1.4 - 1.5).
  2. Synchronizacja oparta na HU i uwalnianie komórek U2OS od granicy G1/S
    1. Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórkowych zgodnie z opisem w kroku 1.1.
    2. Wysiew 0,25 x 106 komórek U2OS na studzienkę w 6 dołkach (2 ml kompletnej pożywki hodowlanej na dołek). Aby obliczyć liczbę studzienek potrzebnych do eksperymentu, należy wziąć pod uwagę, że wymagane będą 2 dołki na wybrany punkt czasowy (1 studzienka do ekstrakcji RNA i 1 studnia do monitorowania cyklu komórkowego) oraz że potrzebne są 2 dodatkowe studzienki asynchronicznie rosnących komórek do zdefiniowania ustawień kompensacji analizy FACS.
    3. Pozwól komórkom połączyć się przez inkubację 6-dołkowych płytek przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
    4. Następnego ranka usuń całe podłoże z dołków i dodaj 2 ml wstępnie podgrzanego, wolnego od FBS podłoża DMEM-Glutamine do dołka. Inkubować komórki przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2,
      UWAGA: Wykonaj ten krok we wszystkich studzienkach z wyjątkiem 2 (zapisanych w celu zdefiniowania ustawień FACS). Etap pobierania surowicy można pominąć, jeśli efektywną synchronizację osiąga się po prostu przez inkubację komórek z HU.
    5. Zatrzymanie cyklu komórkowego G1/S za pomocą HU.
      1. Przygotować świeży roztwór podstawowy HU (500 mM) przed każdym użyciem. Dodać 2 ml H2O do 76,06 mg proszku HU i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia. Wysterylizuj roztwór przez filtrację przez filtr o wielkości porów 0,2 μm. Zmieszać 50 ml kompletnej pożywki z 400 μl wysterylizowanego filtrem roztworu podstawowego HU, aby uzyskać końcowe stężenie HU 4 mM.
      2. Usuń pożywkę ze wszystkich dołków z wyjątkiem 2 dołków potrzebnych do zdefiniowania ustawień FACS i zastąp świeżo przygotowaną kompletną pożywką zawierającą 4 mM HU (2 ml / studzienkę).
      3. Inkubować komórki przez 24 godziny w pożywce zawierającej HU w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 .
    6. Uwolnienie komórek z zatrzymania za pośrednictwem HU. Usunąć pożywkę zawierającą HU ze studzienek i dwukrotnie przepłukać studzienki wstępnie podgrzanym 1x PBS (za każdym razem 2 ml). Dodać 2 ml kompletnego podłoża do dołka. Zbierz 2 próbki dla punktu czasowego 0 godzin (1 do ekstrakcji RNA i 1 do weryfikacji zatrzymania cyklu komórkowego przez FACS), a także 2 próbki zapisane do ustawień FACS. Umieść pozostałe studzienki w inkubatorze.
    7. Próbki pobierać co 1,5 do 3 godzin w celu uzyskania odpowiedniego rozkładu progresji cyklu komórkowego. W każdym punkcie czasowym należy przeprowadzić przetwarzanie próbki (w celu ekstrakcji RNA i analizy FACS) zgodnie z opisem w 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. Leczenie czynnikami uszkadzającymi DNA
    UWAGA: Zawsze, gdy celem jest wyjaśnienie wpływu związku (np. czynników uszkadzających DNA) na zdarzenia cyklu komórkowego, każda z wcześniej opisanych metod synchronizacji może być połączona z traktowaniem komórek czynnikiem genotoksycznym. Aby wybrać metodę synchronizacji, ważne jest, aby wziąć pod uwagę fazę cyklu komórkowego, którą chcielibyśmy przeanalizować. Ogólnie rzecz biorąc, procedura Thy-Noc może być odpowiednia do badania wpływu związku w fazie G1 lub wejściu w fazę S, podczas gdy synchronizacja za pośrednictwem HU może być bardziej odpowiednia do badania wpływu w fazach S do G2 lub w wejściu do mitozy.
    1. Analiza wpływu czynników genotoksycznych w fazie G1 lub wejściu w fazę S
      1. Synchronizuj komórki zgodnie z opisem w 1.1.2. do 1.1.6.
      2. Uwolnić komórki z nokodazolu i ponownie je pokryć, jak opisano w ppkt 1.1.7. Inkubować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 3 godziny, aby mogły się związać przed dodaniem środka (wymagany okres inkubacji może się różnić w zależności od linii komórkowej).
      3. Dodać czynnik i pobrać próbki, jak opisano wcześniej w ppkt 1.1.8.
    2. Analiza wpływu czynników genotoksycznych w fazach S-G2 lub wejściu M
      1. Zsynchronizuj komórki zgodnie z opisem w 1.2.2 do 1.2.5.
      2. Uwolnić komórki z HU zgodnie z opisem w 1.2.6. i natychmiast dodać agenta.
      3. Pobrać próbki w sposób opisany wcześniej w ppkt 1.8.
  4. Monitorowanie synchronizacji komórek i progresji przez cykl komórkowy za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI) i analizy FACS
    UWAGA: Próbki pobrane we wszystkich punktach czasowych wraz z próbkami wymaganymi do zdefiniowania ustawień FACS mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C po ich ustaleniu (jak wspomniano w ppkt 1.1.8.2). Wykonaj barwienie roztworem PI, a następnie analizę FACS dla wszystkich próbek eksperymentu jednocześnie. PI interkaluje się w główny rowek dwuniciowego DNA, wytwarzając silnie fluorescencyjny sygnał po wzbudzeniu przy 535 nm z szerokim szczytem emisji około 600 nm. Ponieważ PI może również wiązać się z dwuniciowym RNA, konieczne jest traktowanie komórek RNazą w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości DNA.
    1. Przygotuj świeżo przygotowany roztwór do barwienia PI. Roztwór podstawowy PI można przygotować, rozpuszczając proszek PI w PBS (np. 5 mg/ml). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C (w ciemności). Roztwór barwiący składa się z PI (140 μM), cytrynianu sodu (38 mM) i Triton X-100 (0,01% v/v).
    2. Rozgrzej odpowiednią powierzchnię (np. piekarnik) do temperatury 37 °C.
    3. Odwirować stałe komórki (450 x g, 5 min, RT), zdekantować supernatant (etanol) i przemyć raz 1x PBS.
    4. Ponownie odwirować komórki, usunąć PBS i dodać 300 μl roztworu barwiącego PI na próbkę (z wyjątkiem jednej z próbek dla ustawień FACS; zamiast tego dodać PBS do tej próbki).
    5. Przenieś komórki do probówek FACS (probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem).
    6. Dodać 1 μl RNazy A do każdej próbki, wymieszać i inkubować próbki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 37 °C. Próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C w temperaturze 4 °C w sposób chroniony przed światłem przez maksymalnie 2-3 dni.
    7. Analizuj zawartość DNA w próbkach za pomocą cytometrii przepływowej. Zdefiniuj ustawienia kompensacji analizy FACS z próbką asynchroniczną barwioną PI. Użyj ślepej próbki (bez roztworu barwiącego PI), aby sprawdzić autofluorescencję. Podstawy analizy zawartości DNA za pośrednictwem barwienia PI za pomocą cytometrii przepływowej zostały wcześniej opisane9.
  5. Oznaczanie indeksu mitotycznego metodą podwójnego barwienia fosfo-H3 (Ser 10)/PI
    UWAGA: Komórki przechodzące mitozę można łatwo wykryć za pomocą cytometrii przepływowej z przeciwciałami specyficznymi dla fosfohistonu H3 w serynie 10 (pH3). Jednoczesne barwienie PI jest przydatne do określenia rozmieszczenia populacji komórek na podstawie zawartości DNA. Do optymalnych konfiguracji ustawień FACS wymaganych jest 5 próbek: ślepa próba, tylko PI, tylko pH3, tylko przeciwciała wtórne i podwójne barwienie.
    1. Odwirować stałe komórki (450 x g, 5 min, 4 °C) i odrzucić supernatant. Opisano następujące kroki, aby wykonać barwienie w probówkach o pojemności 15 ml.
    2. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) do osadu i odwirować (450 x g, 5 min, 4 °C). Usunąć supernatant.
    3. Dodać przeciwciało anty-pH3 rozcieńczone (1:500) w 100-200 μl PBS-T + 3% BSA i inkubować z kołysaniem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (lub O/N w temperaturze 4 °C).
    4. Dodać 2 ml PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) i odwirować (450 x g, 5 min, 4 °C). Usunąć supernatant.
    5. Przemyć jeszcze raz, dodając 2 ml PBS-T do osadu, odwirować i wyrzucić supernatant.
    6. Dodać przeciwciało drugorzędowe (anty-królicze AlexaFluor 488 w przypadku wybranego przeciwciała o pH 3) rozcieńczone (1:500) w 100-200 μL PBS-T + 3% BSA i inkubować z kołysaniem przez 1 godzinę w temperaturze RT (lub O/N w temperaturze 4 °C). Chronić próbki przed światłem.
    7. Przemyć dwukrotnie PBS-T (2 ml) przez odwirowanie, jak opisano w kroku 1.5.4.
    8. Wykonaj barwienie PI zgodnie z opisem (kroki od 1.4.1 do 1.4.6).

2. Pobieranie i przetwarzanie próbek do analizy ekspresji genów

  1. Pobrać z zamrażarki 1,5 ml próbek z mikrowirówki w odczynniku do izolacji RNA i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej w komorze bezpieczeństwa dla chemikaliów.
  2. Dodać 400 μl chloroformu do każdej próbki i energicznie wstrząsać (ale nie wirować) aż do całkowitego wymieszania. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Probówki wirowe przez 15 minut (≥8 000 x g, 4 °C) w mikrowirówce stołowej.
  4. Przenieść fazę wodną (górną) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i zarejestrować przeniesioną objętość (w celu uproszczenia procedury zaleca się pobranie równych objętości we wszystkich próbkach eksperymentu).
  5. Powoli (kropla po kropli) dodawać 1 objętość 100% etanolu do fazy wodnej podczas mieszania. Nie odwirowywać.
  6. Wykonaj kolejne kroki za pomocą komercyjnego zestawu do przygotowania RNA mini. Odpipetować do 700 μl każdej próbki, łącznie z osadem, który mógł się uformować, do kolumny wirowej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml (dostarczonej przez producenta).
  7. Zamknij pokrywę i odwiruj (≥ 8 000 g, RT) przez 15 s. Wyrzuć przepływ. Powtórzyć poprzedni krok z pozostałą próbką (jeśli występuje).
  8. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi płukania i elucji RNA (wymyj każdą próbkę w 30 - 40 μl H2O wolnych od nukleaz w celu uzyskania odpowiedniego stężenia RNA do następnego etapu).
  9. Określić stężenie i czystość RNA próbek za pomocą pomiarów absorbancji (stosunek A260/280 wynoszący 2,0-2,1 wskazuje na dobrą czystość próbki RNA). Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia do analizy RT-qPCR.
  10. W celu konwersji RNA do cDNA, a następnie ilościowego PCR, należy pobrać 1 μg RNA na próbkę i przygotować reakcję retrotranskryptazy zgodnie z instrukcjami producenta. Uzyskane próbki cDNA mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C (przez kilka dni) lub w temperaturze -20 °C (przez dłuższy czas).
    UWAGA: Przygotowanie próbki, projekt startera i inne zagadnienia dotyczące PCR w czasie rzeczywistym zostały obszernie opisane w literaturze22,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie protokołów opartych na Thy-Noc i HU do synchronizacji komórek.

Rysunek 1 podsumowuje kroki wymagane do synchronizacji komórek U2OS i późniejszego pobierania próbek w celu sprawdzenia postępu przez cykl komórkowy i przeprowadzenia analiz ekspresji genów.

Barwienie fosfo-H3 i PI są dobrymi parametrami oceny do wyboru metod synchroni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza precyzyjnie regulowanych genów zaangażowanych w przejściowe i specyficzne role w cyklu komórkowym wymaga jednolitej populacji komórek. Wielu badaczy rutynowo wykorzystuje do tych celów dawno ustalone linie komórek nowotworowych i opracowano różne metody w celu uzyskania synchronicznych (lub częściowo synchronicznych) populacji komórek, w celu zgromadzenia jak największej liczby komórek w określonych fazach cyklu komórkowego. Ponadto podjęto zdecydowane wysiłki w celu ulepszenia i optymalizacji dobrze znanych pode...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratoriów Zubiaga i Altmeyer za pomocne dyskusje i wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty hiszpańskiego Ministerstwa (SAF2015-67562-R, MINECO/FEDER, UE), rządu baskijskiego (IT634-13 i KK-2015/89) oraz Uniwersytetu Kraju Basków UPV/EHU (UFI11/20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, kwalifikowany, zatwierdzony przez UE, pochodzenie z Ameryki PołudniowejThermo Fisher Scientific10270-106
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% Trypsyna-EDTA (1x), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200-072
TymidynaSIGMAT1895-5GŚwieżo przygotowany. Lekkie ocieplenie może pomóc w rozpuszczeniu tymidyny.
NokodazolSIGMAM-1404Roztwór podstawowy w DMSO przechowywany w temperaturze -20 º C w małych podwielokrotnościach
HydroksymocznikSIGMAH8627Świeżo przygotowana
mitomycyna C ze Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM roztwór podstawowy w sterylnym H2O chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze 4 º C
DimetylosulfotlenekSIGMAD2650
Jodek propidynySIGMAP4170Roztwór podstawowy w sterylnym PBS w stężeniu 5 mg/ml, przechowywany w temperaturze 4 μ; C chroniony przed światłem.
PBS pH 7,6Domowy
etanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
Cytrynian soduPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAzywa Odczynnik
TRIzolLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermo Fisher Scientific4368814
Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała antycyklinowego E14129:1000 rozcieńczenie w 5% mleku, o / n, 4 i ordm; C
Przeciwciało antycyklinowe B1Sygnalizacja komórkowa41351:1000 rozcieńczenie w 5% mleku, o / n, 4 i ordm; C
Anty-&beta-aktynaSIGMAA-5441Rozcieńczenie 1:3000 w 5 % mleku, 1 godz., RT
Anty-pH3 (Ser 10) antybotyMillipore06-570Określone w protokole
Wtórne przeciwciało anty-królicze AlexaFluor 488InvitrogenR37116Określone w protokole
Drugorzędowe przeciwciało anty-mysie HRPSanta Cruz Biotechnologysc-3697Rozcieńczenie 1:3000 w 5 % mleku, 1 godz.,
przeciwciało RT Forward E2F1 (ludzkie)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało odwrócone E2F1 (ludzkie)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało Forward E2F7 (człowiek)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało przeciwne E2F7 (ludzkie)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 przeciwciało (ludzkie)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Odwrócone p21Cip1 przeciwciało (ludzkie)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioZaprojektowany przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP przeciwciało przeciwciało (ludzkie) gen odniesienia                                       BiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Przeciwciało odwrócone TBP (ludzkie)                                       BiolegioZaprojektowany przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L przeciwciało (ludzkie) gen referencyjny    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   przeciwciało (ludzkie)      CACAGGAATGAGAGGTTTATAG                               BiolegioZaprojektowane przez narzędzie PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
Probówki FACS Sarstedt551578
MicroAmp Opyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo Fisher ScientificN8010560
Naczynie hodowlane Corning 100 mm z powłoką TCPłytki
Corning Costar 6-dołkowamikrowirówka3506
Eppendorf5415 R
Wirówka stołowa z chłodzeniem Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
BD Cytometr przepływowy FACSCaliburBD Bioscience
QuantStudio 3 System PCR w czasie rzeczywistymThermo Fisher ScientificA28567
Thermo Fisher Scientific EN0531 1 do hodowli komórkowych Corning stołowa z chłodzeniem Corning Spektrofotometr

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles