Oczyszczanie biotynylowanych białek powierzchniowych komórek z nabłonkowych komórek jelitowych Rhipicephalus microplus

Podsumowanie

Metodologia wirowania o zmodyfikowanej gęstości oparta na gradimencie została wykorzystana do izolacji komórek nabłonkowych z tkanki jelitowej Rhipicephalus microplus. Białka związane z powierzchnią poddano biotynylacji i oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych streptawidyny w celu wykorzystania w dalszych zastosowaniach.

Streszczenie

Rhipicephalus microplus - kleszcz bydlęcy - jest najbardziej znaczącym ektopasożytem pod względem wpływu ekonomicznego na zwierzęta gospodarskie jako wektor kilku patogenów. Podjęto wysiłki w zakresie zwalczania kleszczy u bydła w celu zmniejszenia ich szkodliwych skutków, koncentrując się na odkryciu kandydatów na szczepionki, takich jak BM86, zlokalizowanych na powierzchni komórek nabłonka jelit kleszcza. Obecne badania koncentrują się na wykorzystaniu cDNA i bibliotek genomowych do badań przesiewowych w poszukiwaniu innych kandydatów na szczepionki. Izolacja komórek jelitowych kleszczy stanowi ważną zaletę w badaniu składu białek powierzchniowych na błonie komórek jelitowych kleszcza. Praca ta stanowi nowatorską i wykonalną metodę izolacji komórek nabłonkowych z zawartości jelita kleszcza częściowo nabrzmiałego R. microplus. Protokół ten wykorzystuje TCEP i EDTA do uwalniania komórek nabłonka z podnabłonkowych tkanek podporowych oraz gradientu wirowania o nieciągłej gęstości w celu oddzielenia komórek nabłonka od innych typów komórek. Białka powierzchniowe komórek poddano biotynylacji i wyizolowano z komórek nabłonka jelita kleszcza za pomocą kulek magnetycznych połączonych streptawidyną, co pozwoliło na dalsze zastosowania w analizie FACS lub LC-MS/MS.

Wprowadzenie

Rhipicephalus microplus, kleszcz bydlęcy, jest najbardziej znaczącym ektopasożytem pod względem wpływu ekonomicznego na przemysł hodowlany w regionach tropikalnych i subtropikalnych, ponieważ jest wektorem pomoru kleszczowego bydła (babeszjozy), anaplazmozy i piroplazmozy koni^1,2,3,4. Podjęto wysiłki w celu zwalczania kleszczy u bydła, aby zmniejszyć szkodliwy wpływ, jednak konwencjonalne metody, takie jak stosowanie chemicznych akarycydów, mają ukryte wady, takie jak obecność pozostałości chemicznych w mleku i mięsie oraz wzrost częstości występowania chemoodpornych kleszczy^5,6,7. W związku z tym zbadano rozwój alternatywnych metod zwalczania kleszczy, takich jak stosowanie bydła o naturalnej odporności, kontrola biologiczna (biopestycydy) i szczepionki^4,5,6,7,8,9.

W poszukiwaniu białek, które mogłyby być wykorzystane jako kandydaci na szczepionki, obecne badania koncentrują się na jelitach kleszczy. Ściana jelita środkowego jest zbudowana z pojedynczej warstwy komórek nabłonka spoczywających na cienkiej blaszce podstawnej, przy czym zewnętrzna strona blaszki podstawy tworzy sieć mięśni. Obserwacje pod mikroskopem świetlnym i elektronowym wskazują, że jelito środkowe składa się z trzech typów komórek: rezerwowych (niezróżnicowanych), wydzielniczych i trawiennych. Liczba typów komórek różni się znacznie w zależności od fazy fizjologicznej. Zarówno komórki wydzielnicze, jak i trawienne pochodzą z komórek rezerwowych^18,19,20.

Budowa bibliotek cDNA do badania składu jelita kleszcza doprowadziła do identyfikacji białek antygenowych, takich jak Bm86, jako potencjalnych kandydatów na szczepionki^2,3,4. Glikoproteina Bm86 jest zlokalizowana na powierzchni komórek jelitowych kleszcza i indukuje ochronną odpowiedź immunologiczną przeciwko kleszczowi bydlęcemu (R. microplus) u zaszczepionego bydła. IgG anty-Bm86 wytwarzane przez uodpornionego gospodarza są połykane przez kleszcza, rozpoznają ten antygen na powierzchni komórek jelitowych kleszcza, a następnie zaburzają funkcję i integralność tkanki jelitowej kleszcza. Szczepionki oparte na antygenach Bm86 wykazały skuteczną kontrolę R. microplus i Rhipicephalus annulatus, poprzez zmniejszenie liczby, masy i zdolności reprodukcyjnej nabrzmiałych samic, co skutkuje zmniejszoną inwazją larw w kolejnych pokoleniach kleszczy⁴. Jednak szczepionki oparte na Bm86 nie są skuteczne przeciwko wszystkim stadiom kleszcza i wykazały niezadowalającą skuteczność przeciwko niektórym geograficznym szczepom R. microplus, w związku z czym przemysł wołowy i mleczarski słabo przyjęły te szczepionki^2,4.

Zdolność do izolowania komórek nabłonkowych z jelita kleszcza jest znaczącą innowacją, która umożliwiłaby postęp badań w celu określenia składu błony białkowej, w tym morfologii i fizjologii w różnych warunkach środowiskowych. Opisana tutaj metoda wykorzystuje czynnik chelatujący kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i czynnik redukujący tris(2-karboksyetylo)fosfinę (TCEP) w celu uwolnienia nabłonka z jego podnabłonkowych tkanek podporowych¹⁰. Nabłonek jest odzyskiwany po mechanicznym rozerwaniu tkanek przez wstrząsanie, a następnie nieciągłe wirowanie gradientowe w Percoll. W artykule opisano wykonalną i nowatorską technikę izolacji komórek nabłonka jelitowego kleszcza. Biotynylowane białka powierzchniowe komórek, wyizolowane z powierzchni tych komórek nabłonkowych, mogą być następnie analizowane w dalszych zastosowaniach, takich jak analiza FACS i/lub LC-MS/MS.

Protokół

1. Wypreparowanie nabłonka jelitowego z R. microplus

1. Zbierz częściowo nabrzmiałe kleszcze od bydła w dniu eksperymentu. Wyciąć kleszcze w ciągu 24 godzin po usunięciu z żywiciela.
2. Przyklej pasek taśmy klejącej do dolnej części szalki Petriego o wymiarach 92 mm x 16 mm. Dodaj kroplę super kleju do taśmy. Umieść kleszcza brzuszną stroną do dołu na super kleju, pozostaw do wyschnięcia na 2 minuty.
3. Wlej 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do szalki Petriego lub do momentu, gdy kleszcz zostanie całkowicie zanurzony.
4. Za pomocą skalpela w rozmiarze 11, wyciętego od górnej części oczu do dolnych festonów, po obu stronach kleszcza.
5. Za pomocą sterylnych kleszczy całkowicie usuń scutum i alloscutum, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
6. Usuń cienkie, białe, nitkowate narządy (tchawicę) i inne błony, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
7. Usuń jelito za pomocą kleszczy, ściskając górną część i wyciągając z tuszy. Usuń wszelkie pozostałe tkanki jelitowe, upewniając się, że żadne inne tkanki nie zostały wycięte.
8. Przechowuj jelita w lodowatym roztworze soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) bez chlorku wapnia i siarczanu magnezu z koktajlem inhibitorów proteinazy (). Zamrozić wnętrzności w suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   Uwaga: Aby pomóc w sekcji jelit i szczegółach narządów wewnętrznych kleszczy, zapoznaj się z rozdziałem 3.1 D. Sonenshine, "Biologia kleszczy"¹⁹.

2. Dysocjacja komórek nabłonkowych

1. Wypreparowane jelito przelać na sitko o pojemności 70 μm w probówce o pojemności 50 ml.
2. Przepłucz tkankę jelitową 50 ml lodowatego HBSS za pomocą, aż roztwór będzie klarowny, a jelita nabiorą białego/przezroczystego wyglądu.
3. Ponownie zawiesić jelita w 30 ml lodowatego HBSS z, delikatnie wymieszać i odwirować w 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby ogranulować jelita. Usunąć supernatant i powtórzyć proces mycia trzy razy.
4. Aby usunąć nabłonkowe komórki jelitowe, należy ponownie zawiesić jelito w 10 ml pożywki do hodowli komórkowych Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM) firmy Dulbecco, 2% płodowa surowica cielęca (FCS), 0,5 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 1 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), i inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C przy wolnych obrotach przy użyciu wałka przy 6 obr./min.
5. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 250 μm, przetoczyć przepływ i przefiltrować przez sitko o średnicy 70 μm, zbierając pozostały przepływ.
6. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu osadzenia pojedynczych komórek.

3. Izolacja pojedynczych komórek nabłonkowych za pomocą gradientu wirowania gęstości

1. Przygotować gradient wirowania gęstości (np. Percoll), filtrując przez bibułę filtracyjną AP15. Przygotować 40% i 20% Percoll w mqH₂0 (v/v) i schłodzić w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę przed nałożeniem gradientu.
2. Używając pompy perystaltycznej ustawionej na najniższą prędkość, nałóż 3 ml gradientu wirowania o gęstości 40% do probówki ultrawirówki o pojemności 16 ml, pozwalając jej osiąść na lodzie przez 15 minut. Prędkość pompy powinna prowadzić do natężenia przepływu <1 ml na minutę.
3. Przechylając rurkę pod kątem 45°, użyj pompy perystaltycznej, aby nałożyć gradient wirowania o gęstości 20% na warstwę 40%. Prędkość pompy powinna prowadzić do natężenia przepływu <1 ml na minutę. Pozostaw warstwy na lodzie na 15 minut.
4. Użyj pompy perystaltycznej przy natężeniu przepływu <1 ml na minutę, aby nałożyć 3 ml pożywki DMEM zawierającej komórki jelitowe kleszczy na gradiacji wirowania o gęstości 20-40%.
5. Zaprogramuj wirówkę na maksymalne przyspieszenie i minimalne opóźnienie. Wirować przy 600 x g przez 10 min. Zbierz interfazy między gradientem wirowania DMEM: 20% gęstości a gradientami wirowania o gęstości 20%: 40%, aby wyizolować pojedyncze komórki nabłonka. Zebrane fazy składowe przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszych analiz.

4. Ocena izolacji komórek

1. Hemacytometr
   1. Wyczyść szkiełko hemacytometru alkoholem.
   2. . Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując komórki w górę i w dół. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   3. Dodaj 400 μl 0,4% błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj, przesuwając tubkę.
   4. Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek poddanej działaniu błękitu trypanowego, aby powoli napełnić obie komory hemocytometru.
   5. Umieść hemocytometr pod mikroskopem świetlnym, skupiając się na liniach siatki hemocytometru za pomocą obiektywu 10X.
   6. Korzystając z ręcznego licznika liczenia, policz żywe, niebarwione komórki w zestawie 16 kwadratów. W tym samym kwadracie policz niebieskie martwe komórki. Kontynuuj liczenie, aż zostaną policzone cztery zestawy po 16 kwadratów.
   7. Oblicz całkowitą liczbę komórek na ml, korzystając ze wzoru:
      
   8. Obliczanie procentowej żywotności komórki przy użyciu wzoru:
      
2. Wizualizacja izolacji komórek
   1. Rozcieńczyć 1 μl wyizolowanych komórek w 9 μl HBSS w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie przesuń probówkę mikrowirówki, aby wymieszać.
   2. Odpipetować 5 μl wyizolowanych komórek w HBSS do środka szklanego szkiełka. Nałóż trzy krople podłoża montażowego z 4', 6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI).
   3. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na preparat, unikając pęcherzyków powietrza.
   4. Wizualizuj komórki barwione DAPI przy wzbudzeniu 360 nm i emisji przy 460 nm pod mikroskopem fluorescencyjnym.

5. Biotynylacja białek powierzchniowych komórek

1. Biotynylan 100 μL jednokomórkowych komórek nabłonka przy użyciu zestawu do koniugacji biotyny (typ A), w stosunku molowym białka powierzchniowego 1:1 do koniugatu, zgodnie z instrukcjami producenta
2. Do lizy komórek dodaj 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% glicerolu, 100 μM utlenionego glutationu i do biotynylowanych komórek. Inkubować na lodzie przez 1 godzinę z delikatnym mieszaniem co 10 minut.
3. Odwirować biotynylowane komórki w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu uzyskania granulowanego materiału nierozpuszczalnego. Zebrać supernatant zawierający cytoplazmatyczne i biotynylowane białka błonowe.
4. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda.

6. Izolacja biotynylowanych białek powierzchniowych

1. Dodaj 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
2. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym, zbierając koraliki z boku tuby. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
3. Do probówki dodać 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20. Delikatnie wymieszaj i zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad.
4. Połącz 40 μg biotynylowanych białek powierzchniowych komórek, rozcieńczonych do 300 μl w 1x PBS z przemytymi kulkami magnetycznymi. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
5. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej, wyjmij i wyrzuć supernatant.
6. Dodaj 300 μl TBS, 0,1% Tween-20 do probówki, delikatnie mieszając, aby ponownie zawiesić kulki. Zebrać koraliki, usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok prania dwukrotnie.
7. Dodać 100 μl 0,1 M glicyny o pH 2,0 do kulek magnetycznych i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zebrać kulki i usunąć supernatant zawierający eluowane biotynylowane białka powierzchniowe.
8. Wizualizacja wyizolowanych białek powierzchniowych na 4-20% żelu Tris-MOPS SDS-PAGE.

7. Ocena biotynylowanego białka powierzchniowego

1. Plama punktowa
   1. Wytnij pasek membrany nitrocelulozowej o wymiarach 7 cm x 3 cm.
   2. Nałóż 10 μg całkowitej zawartości jelita kleszcza (od 1,8 powyżej) i 10 μg biotynylowanego białka powierzchniowego na błonę. Pozostaw do wyschnięcia na 15 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Przenieść do pojemnika i zanurzyć w 100 ml buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez godzinę. Odrzuć bufor blokujący.
   4. Przemyć membranę nitrocelulozową w 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 przez 5 minut z mieszaniem. Wyrzuć bufor do mycia i powtórz pranie trzy razy.
   5. Inkubować w 1/5000 Streptawidyny-peroksydazy chrzanowej (HRP) w 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 przez 2 godziny z mieszaniem w temperaturze pokojowej i wyrzucić pozostały roztwór.
   6. Przemyć membranę nitrocelulozową w 100 μL PBS, 0,05% Tween-20 przez 5 minut z mieszaniem. Wyrzuć bufor do mycia i powtórz pranie trzy razy.
   7. W celu wykrycia rozpuść 1 tabletkę 4-chloro-1-naptholu w 10 ml lodowatego metanolu. Dodaj 4 ml metanolu do 20 ml TBS. Dodaj 10 μl świeżego 30% nadtlenku wodoru i natychmiast nałóż na membranę nitrocelulozową.
   8. Inkubować z mieszaniem w temperaturze pokojowej, aż podłoże wytworzy nierozpuszczalny niebieski produkt końcowy. Może to potrwać od 2 do 15 minut.
   9. Wyrzucić roztwór detekcyjny i przemyć membranę trzykrotnie w 100 μl mqH₂O.
2. Test ELISA
   1. Rozcieńczyć 200 ng każdej próbki 400 μl 100 mM buforu do powlekania węglanowego i pokryć 2 pasy pierwszego rzędu (A#) płytki ELISA (studzienki z płaskim dnem)
   2. Dodać 100 μl 100 mM buforu do powlekania węglanowego do wszystkich innych odpowiednich studzienek w rzędach (B-H).
   3. Przygotować seryjne rozcieńczenia każdej próbki, pipetując 100 μl z każdej studzienki w rzędzie A i przenosząc do rzędu B. Delikatnie wymieszać pipetując i unikając wytwarzania pęcherzyków. Powtórzyć rozcieńczenia w każdym rzędzie, odrzucając ostatnie 100 μl z każdej studzienki w rzędzie H.
   4. Przykryć płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   5. Umyj płytkę trzykrotnie 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 na studzienkę.
   6. Dodać 200 μl buforu blokującego do pokrytych studzienek, przykryć Parafilmem i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   7. Rozcieńczyć 1/15 000 Streptawidyny-HRP w buforze blokującym i dodać 100 μl do każdego dołka płytki. Przykryć parafilmem i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
   8. Umyj płytkę w 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 na studzienkę pięć razy.
   9. Aby wykryć, dodaj 100 μl odczynnika TMB do dołka. Po wystarczającym rozwoju koloru, zwykle między 10-15 minutami, dodaj 100 μl 1 M kwasu fosforowego, aby zatrzymać reakcję.
   10. Odczytaj absorbancję każdej studzienki przy λ = 450 nm.

Wyniki

Komórki nabłonkowe zostały wyizolowane z tkanek jelitowych R. microplus zgodnie ze schematem przedstawionym w Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy mikroskopii fluorescencyjnej komórek nabłonka jelit kleszcza przygotowane przy użyciu tego protokołu są pokazane w Rysunek 2A i 2B. Ponieważ izolacja komórek jest przeprowadzana na częściowo nabrzmiałym R. microplus, ...

Dyskusja

Inwazje kleszczy u bydła stanowią poważny problem dla przemysłu hodowlanego w tropikalnych i subtropikalnych regionach świata, przy czym najpowszechniejsza metoda zwalczania opiera się na stosowaniu akarycydów ^1,4. Bm86 został wcześniej zidentyfikowany na powierzchni nabłonka jelita kleszcza jako antygen ochronny przeciwko inwazji R. microplus ¹⁰, z ograniczonym sukcesem jako strategia szczepionki ze względu na zmienność sekwencji...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific 15250061
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Eppendorf	3322
100mM Bufor			3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml wody destylowanej pH 9,6
16 mL probówki wirówkowe z nasadką uszczelniającą	Thermo Scientific	3138-0016	Schłodzić w lodzie przed gradientem
250 µ Filtr siatkowy komórek M	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna (TMB) System płynnego podłoża do ELISA	Sigma	T0440	przechowywany w 4C
30% nadtlenku wodoru	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-chloro-1-naftol tabletka	Sigma-Aldrich	C6788
50 ml Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115 mm. Rurka stożkowa z polipropylenu.
70 &mikro; Filtr siatkowy M	BD Falcon	352350
AP15 bibuła filtracyjna	Millipore	AO1504200
Biotyna (typ A) Zestaw do koniugacji Abcam	Ab102865
Mikroskop preparacyjny	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Oprogramowanie do obrazowania komórek
Taśma klejąca Domowa	złota rączka		48 mm x 25 mm Taśma klejąca
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - lodowaty dla protokołu
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	12003C
FCS Mikroskop fluorescencyjny	Olimpia	BX51
Fluoroshield z DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glicerol do biologii molekularnej >99%
Glycine	Sigma-Aldrich	410225
Lada ręczna	Prace biurowe	JA0376230
Hank' s Zrównoważony roztwór soli	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – lodowaty dla protokołu
Hemacytometr	Optik Lakor	-
-L-Glutation utleniony	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetyczny stojak separacyjny		Novagen-4-Tube	Magnetic Serate
Metanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Zintegrowany system oczyszczania wody do wody ultraczystej
Membrana nitrocelulozowa	Sciences	66485	30cm x 3M membrana z czystej nitrocelulozy
PageRuler Drabinka białkowa wstępnie barwiona	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml wody destylowanej) pH 7,4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Pompa perystaltyczna	Masterflex	7518-10
Kwas fosforowy	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Białkowy bufor blokujący T20 PBS	Thermo-Scientific	37573	przechowywany w temperaturze 4C. Blokujący koktajl inhibitorów
proteazy	buforowej Sigma-Aldrich	P8215-5ML	– przechowywany w temperaturze -20 ° C
Szybki start Odczynnik barwnikowy Bradford 1x	Biorad	500-0205	Do testu Bradford
Szybki start Standardy BSA Biorad		500-0207	Standardy BSA dla Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Rozmiar 11 Skalpel
SilverQuest TM Zestaw do barwienia	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Ultrawirówka Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+	Thermo Scientific	46910
Streptawidyna (HRP)	Abcam	AB7403
Streptawidyna Kulki magnetyczne	New England Biolabs	S1420S
Super Glue - Ultra szybki mini	klej UHU		UHU Super Glue 1mg. Ultra szybka mini
wirówka stołowa	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Mieszalnik wirowy	Ratek	VM1
Dotacja do kąpieli wodnej		GD100