Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ekran estrogenowy drożdży (YES) jest używany do wykrywania ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych i jest szeroko stosowany w badaniach zaburzeń endokrynologicznych. Ligandy estrogenowe obejmują zarówno naturalne, jak i sztuczne "estrogeny środowiskowe" (EE) znajdujące się w wielu towarach konsumpcyjnych, w tym produktach higieny osobistej (PCP), tworzywach sztucznych, pestycydach i żywności. EE zakłócają sygnalizację hormonalną u ludzi i innych zwierząt, potencjalnie zmniejszając płodność i zwiększając ryzyko choroby. Pomimo znaczenia EE i innych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) dla zdrowia publicznego, zaburzenia endokrynologiczne nie są zazwyczaj uwzględniane w programach studiów licencjackich. Niedociągnięcie to wynika częściowo z braku odpowiednich działań laboratoryjnych, które ilustrują stosowane zasady, a jednocześnie są dostępne dla studentów studiów licencjackich. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowane TAK do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej, które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje jeden z dwóch substratów kolorymetrycznych (orto-nitrofenylo-β-D-galaktopyranozyd (ONPG) lub chlorofenol czerwony-β-D-galaktopyranozyd (CPRG)), które są rozszczepiane przez β-galaktozydazę, 6-dniowy etap inkubacji w chłodzeniu w celu ułatwienia stosowania na studiach laboratoryjnych, zautomatyzowaną aplikację do obliczeń LacZ oraz kod R do powiązanej 4-parametrowej analizy regresji logistycznej. Protokół został zaprojektowany, aby umożliwić studentom studiów licencjackich opracowywanie i przeprowadzanie eksperymentów, w których badają wybrane przez siebie produkty pod kątem naśladownictwa estrogenu. W trakcie tego procesu dowiadują się o zaburzeniach endokrynologicznych, hodowli komórek, wiązaniu receptorów, aktywności enzymów, inżynierii genetycznej, statystyce i projektowaniu eksperymentalnym. Równolegle ćwiczą również podstawowe i szeroko stosowane umiejętności laboratoryjne, takie jak: obliczanie stężeń; tworzenie rozwiązań; demonstrowanie sterylnej techniki; wzorce seryjnego rozcieńczania; konstruowanie i interpolowanie krzywych standardowych; identyfikowanie zmiennych i kontroli; gromadzenie, organizowanie i analizowanie danych; konstruowanie i interpretacja wykresów; oraz przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikropipety i spektrofotometry. W ten sposób wdrożenie tego testu zachęca uczniów do angażowania się w uczenie się oparte na dociekaniu podczas odkrywania pojawiających się problemów w naukach o środowisku i zdrowiu.
Wprowadzenie
Ekran estrogenowy drożdży (YES) jest szeroko stosowany do ilościowego oznaczania ligandów, które naśladują estradiol (E2 lub 17β-estradiol) w różnych matrycach, w tym w wodzie, tkankach roślinnych, produktach konsumenckich i żywności1,2,3,4. Zbiorczo takie ligandy są określane jako "estrogeny środowiskowe (EE)". YES został pierwotnie opracowany jako tania alternatywa in vitro dla testów in vivo, takich jak test uterotroficzny gryzoni5,6 i test karmienia pstrąga tęczowego7. Celem tych testów jest ustalenie, czy produkt zawiera substancje chemiczne, które stymulują lub blokują mechanizmy zależne od estrogenów. Wykrywanie EE ma kluczowe znaczenie, ponieważ mogą one zakłócać normalną endogenną sygnalizację estrogenową, szczególnie podczas rozwoju płodu. Ta ingerencja zagraża zdrowiu, zwiększając ryzyko otyłości, bezpłodności, raka i utraty funkcji poznawczych8.
Pomimo znaczenia EE i innych EDC dla zdrowia publicznego, zaburzenia endokrynologiczne nie są często uwzględniane w programach studiów licencjackich. Niedobór ten wynika częściowo z braku zajęć, które ilustrują związane z tym zasady, a jednocześnie są dostępne dla studentów studiów licencjackich. Ponadto istnieje kilka odmian protokołu YES9,10,11,12,13, a ta różnorodność sprawia, że optymalizacja testów jest czasochłonna dla koordynatorów laboratoriów, którzy nie są specjalnie przeszkoleni w zakresie odpowiednich technik. Wreszcie, testy TAK są zwykle wykonywane przez 1 długi dzień lub 2 kolejne dni z inkubacją O/N. Termin ten nie jest zgodny z formatem stacjonarnych kursów laboratoryjnych, które zazwyczaj odbywają się raz w tygodniu przez kilka godzin.
W odpowiedzi na te potrzeby, ten manuskrypt informuje o zoptymalizowanym 96-dołkowym protokole YES, który obejmuje metody ekstrakcji etanolowej dla produktów higieny osobistej (PCP)3 oraz 6-dniowy etap chłodzenia, aby dostosować się do cotygodniowych spotkań laboratoryjnych. Etanol absolutny jest wszechstronnym rozpuszczalnikiem organicznym, który może rozpuszczać różne polarne i niepolarne substancje rozpuszczone. Co więcej, nadaje się na studia licencjackie, ponieważ jest łatwo dostępny, stosunkowo nietoksyczny, niedrogi i miesza się z wodą; Łatwo odparowuje również bez specjalnego sprzętu. Jednak etanol nie jest idealny do ekstrakcji silnie hydrofobowych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub wielu olejów i wosków, przy czym te dwa ostatnie są powszechnymi składnikami PCP. Niska wydajność ekstrakcji zwiększa ryzyko wyników fałszywie ujemnych. Mając na uwadze to ograniczenie, badacze powinni wybrać procedury ekstrakcji (np. ekstrakcja etanolowa lub ekstrakcja do fazy stałej), które uwzględniają charakterystykę próbki i spełniają cele badania (badania w porównaniu z instrukcjami licencjackimi).
Tak opiera się na rekombinowanych Saccharomyces cerevisiae, pierwotnie stworzonych przez dr Charlesa Millera z Tulane University. Zobacz Miller i wsp. (2010) dla kompletnej mapy zmodyfikowanego plazmidu14. Drożdże przekształcone za pomocą tych plazmidów konstytutywnie wyrażają ludzkie jądrowe ERα lub ERβ (zwane również odpowiednio ESR1 i ESR2), gdy są hodowane w pożywkach zawierających galaktozę (dla ERα) lub glukozę lub galaktozę (dla ERβ). Jeśli estrogenowe substancje chemiczne są obecne w pożywce, wiążą się z receptorami, tworząc kompleksy ligand-receptor, które aktywują ekspresję β-galaktozydazy (lacZ) na poziomie proporcjonalnym do stężenia estrogenowych substancji chemicznych. Komórki drożdży są następnie poddawane lizie w celu uwolnienia nagromadzonej β-galaktozydazy. Bufor do lizy zawiera ONPG lub CPRG, które są rozszczepiane przez β-galaktozydazę w celu uzyskania odpowiednio żółtych lub czerwonych produktów. Produkty kolorymetryczne można określić ilościowo, mierząc absorbancję za pomocą spektrofotometru z płytką mikrodołkową. Stopień zmiany koloru jest proporcjonalny do stężenia ligandów estrogenowych, na które narażone były drożdże.
Wybór substratu (CPRG lub ONPG) zależy od potencjału absorbancji tła wynikającej z badanych próbek. Na przykład ekstrakty roślinne często dodają żółty odcień do pożywki, która sztucznie zawyża miary estrogenności, jeśli ONPG (określany ilościowo przy 405 nm) jest używany jako substrat dla β-galaktozydazy. W przypadku ekstraktów roślinnych CPRG (oznaczany ilościowo przy 574 nm) może być bardziej odpowiednim substratem kolorymetrycznym. CPRG jest droższa niż ONPG, ale stosuje się ją w jednej dziesiątej molowości. W artykule przedstawiono estrogenność ekstraktów PCP oznaczoną ilościowo zarówno przy użyciu ONPG, jak i CPRG.
Kwantyfikacja estrogenności próbek środowiskowych przy użyciu zarówno ERα, jak i ERβ jest bardziej wszechstronnym podejściem niż użycie tylko jednego z tych receptorów. U zwierząt receptory te wykazują zróżnicowane rozmieszczenie w tkankach, działania regulacyjne i powinowactwo do ligandów estrogenowych i antyestrogenowych15. Na przykład fitoestrogeny pochodzenia roślinnego zazwyczaj wiążą ERβ silniej2, podczas gdy syntetyczne substancje chemiczne mogą preferować ERα lub ERβ lub mogą równie dobrze wiązać oba receptory15. W związku z tym, wiązanie się z jednym receptorem estrogenowym niekoniecznie przewiduje wiązanie się z drugim.
Chociaż EE znajdują się w wielu produktach konsumenckich (np. pestycydach, detergentach, klejach, smarach, tworzywach sztucznych, żywności i farmaceutykach), a także w roślinach, przedstawione dane zostały uzyskane przy użyciu wybranych PCP. PCP są atrakcyjne, łatwo dostępne, przyjazne dla budżetu i istotne dla środowiska dla studentów studiów licencjackich. Studenci mogą zostać zaproszeni do przyniesienia swoich ulubionych PCP z domu w celu przetestowania w laboratorium. Mogą również przeszukiwać bazę danych Skin Deep opracowaną przez Environmental Working Group16 w celu wygenerowania opartych na hipotezach porównań PCP o wysokich i niskich wynikach toksyczności. W ten sposób studenci mogą jednocześnie rozwijać zaawansowane umiejętności laboratoryjne; angażować się w samodzielne uczenie się oparte na dociekaniu; i badać pojawiające się problemy w naukach o środowisku i zdrowiu.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników
- Przygotować pożywki z glukozą i galaktozą, mieszając 6,7 g azotowej bazy dla drożdży (yeast nitrogen base), 20 g dekstrozy lub galaktozy, 20 mg siarczanu adeniny (dodanego jako 10 mL wodnego roztworu stokowego o stężeniu 200 mg/100 mL), 20 mg uracylu (dodanego jako 10 mL wodnego roztworu stokowego o stężeniu 200 mg/100 mL), 60 mg leucyny (dodanej jako 6 mL wodnego roztworu stokowego o stężeniu 1 g/100 mL) oraz 20 mg histydyny (dodanej jako 2 mL wodnego roztworu stokowego o stężeniu 1 g/100 mL) w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 L. Sterylizować poprzez filtrację (filtr 0,2 µm). Pożywki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
- Przygotować standardy estradiolu (E2), rozpuszczając sproszkowany E2 w bezwodnym etanolu i rozcieńczając do odpowiednich stężeń roboczych (227,5 nM i 9,75 nM) w 50% etanolu.
Uwaga: Jeśli estradiol został zakupiony w fiolce 1 mg, dodać 1 mL etanolu bezpośrednio do fiolki, aby rozpuścić proszek estradiolu. Otrzyma się w ten sposób roztwór stokowy nr 1 o stężeniu 3,67 mM. Rozcieńczyć 10 μL roztworu stokowego nr 1 w 990 μL etanolu, aby otrzymać 1 mL roztworu stokowego nr 2 o stężeniu 36,71 μM. Następnie rozcieńczyć 10 μL roztworu stokowego nr 2 w 990 μL 50% etanolu, aby otrzymać 1 mL roztworu stokowego nr 3 o stężeniu 367,13 nM. Aby przygotować roztwory robocze, rozcieńczyć 619,7 μL roztworu stokowego nr 3 w 380,3 μL 50% etanolu, aby otrzymać 1 mL roztworu roboczego o stężeniu 227,5 nM, używanego do tworzenia krzywych wzorcowych dla drożdży wykazujących ekspresję ERα. Rozcieńczyć 26,56 μL roztworu stokowego nr 3 w 973,44 μL 50% etanolu, aby otrzymać 1 mL roztworu roboczego o stężeniu 9,75 nM, używanego do tworzenia krzywych wzorcowych dla drożdży wykazujących ekspresję ERβ. Standardy zabezpieczyć parafilmem i przechowywać w temperaturze -20 lub -70 °C.
OSTROŻNIE: E2 jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i toksyczne dla rozrodu. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, połknięcia lub wchłaniania przez skórę. E2 może być szkodliwy dla dzieci karmionych piersią i płodów. E2 jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestorium, maseczkę przeciwpyłową) i unikać ekspozycji podczas ciąży i laktacji. E2 utylizować jako odpad niebezpieczny i nie uwalniać do środowiska. - Przygotować bufor LacZ, mieszając 8,52 g Na2HPO4, 5,52 g NaH2PO4•H2O, 95,21 mg MgCl2, 745,5 mg KCl, 2 g soli sodowej N-lauroylosarkozyny oraz ONPG (400 mg) lub CPRG (77,7 mg) w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 L. Przechowywać bufor LacZ w alikwotach po 20 mL w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Alikwot 20 mL jest wystarczający dla jednej płytki 96-dołkowej. - Przygotować węglan sodu, mieszając 105,9 g węglanu sodu w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 1 M ditiotreitol (DTT) w wodzie. Zamrozić alikwoty DTT po 25 µL w temperaturze -20 °C.
OSTROŻNIE: DTT jest silnie drażniący dla skóry i oczu. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestorium, maseczkę przeciwpyłową), aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami, wdychania oraz połknięcia.
UWAGA: Każdy alikwot jest wystarczający dla jednej płytki 96-dołkowej.
2. Przygotowanie próbek i kontroli ekstrakcji
- Wybrać próbki do badania.
UWAGA: Niniejszy artykuł przedstawia dane dla piętnastu produktów kosmetycznych (PCP), w tym mydła, kremu do włosów, szamponu, kremu z filtrem przeciwsłonecznym, pomadki do ust, podkładu, kremu do golenia, lakieru do paznokci oraz balsamu. - W 15 mL probówce stożkowej połączyć 1 g próbki z 10 mL bezwodnego etanolu. Przygotować ujemną kontrolę ekstrakcji składającą się z 11 mL etanolu w 15 mL probówce stożkowej. Przygotować powtórzenia zgodnie z potrzebami.
UWAGA: Dla przedstawionego projektu eksperymentalnego przygotowano trzy alikwoty wszystkich 15 PCP oraz trzy powtórzenia roztworów kontroli ekstrakcji, co dało łącznie 48 próbek, z których każda została przeanalizowana w trzech powtórzeniach zgodnie z protokołem w sekcji 4. Jedna płytka może pomieścić do 23 próbek w trzech powtórzeniach. W tym kroku stosuje się bezwodny etanol, ponieważ łatwo odparowuje. Należy użyć ujemnych kontroli ekstrakcji, aby zweryfikować, czy estrogeny nie przenikają do próbek z probówek stożkowych. - Homogenizować zawartość probówek przez 30 min, łącząc potrząsanie ręczne z wiertłowaniem (vortexing) lub potrząsając probówkami na wirówce wielomiejscowej.
- Wirować probówki stożkowe z maksymalną dopuszczalną prędkością w wirówce koszykowej przez 10 min. Zlać nadsącz z każdej probówki przez sitko komórkowe 40 µm do 50 mL probówki stożkowej. Przenieść zawartość każdej 50 mL probówki do szklanej fiolki scyntylacyjnej.
- Pozostawić otwarte fiolki w dygestorium przez jeden tydzień, aby etanol całkowicie odparował. Alternatywnie próbki można suszyć w dygestorium w strumieniu azotu lub za pomocą wirówki rotacyjnej. Aby uniknąć degradacji składników światłoczułych, należy chronić suszące się próbki przed światłem (np. przykryć drzwi dygestorium nieprzezroczystym materiałem).
- Rekonstytuować próbki w 1,0 mL 50% etanolu i homogenizować za pomocą wiertłowca.
3. Hodowla i pasażowanie drożdży14
- Utrzymywać aktywne kultury drożdży (rekombinowany szczep W303a S. cerevisiae14), inkubując je w sterylizowanym filtracyjnie podłożu glukozowym w temperaturze 30 °C. Przesiewać drożdże co tydzień do świeżego, sterylizowanego filtracyjnie podłoża glukozowego.
- Na dwie noce (około 42 h) przed przygotowaniem płytek YES, przesiewać drożdże, dodając 0,1 mL aktywnych kultur drożdży do 10 mL sterylizowanego filtracyjnie podłoża glukozowego, stosując techniki aseptyczne. Inkubować w temperaturze 30 °C przez dwie noce. Wstrząsanie nie jest wymagane, jeśli drożdże są hodowane jako kultury płytkie w sterylnych kolbach Erlenmeyera o pojemności 250 mL.
UWAGA: Drożdże można również przechowywać na schłodzonych płytkach z agarem przez kilka miesięcy. Do przechowywania długoterminowego (latami), połączyć kultury nocne z 15 - 50% sterylnym glicerolem, wymieszać w wortexie i zamrozić w temperaturze -70 °C. Aby przygotować sterylni glicerol, za pomocą strzykawki przenieść 300 µL glicerolu do probówki kriogenicznej i wysterylizować w autoklawie z poluzowaną zakrętką. Następnie, stosując techniki aseptyczne, dodać 1 200 µL nocnej kultury drożdży.
4. Przygotowanie szalek z pożywką YES (Dzień 1 testu)
- W sterylnym zlewce i stosując technikę sterylną, rozcieńcz drożdże z kroku 3.2 do gęstości optycznej 0,065 ±0,005 przy 610 nm (OD610) w sterylizowanym przez filtr medium z galaktozą.
- Potwierdź gęstość optyczną, pipetując 120 μL każdej próbki drożdży w trzech powtórzeniach oraz trzy powtórzenia ślepych prób medium z galaktozą do przejrzystej płytki polistyrenowej (płytka nie musi być sterylna). Użyj spektrofotometru do płytek, aby zweryfikować, że rozcieńczona kultura drożdży ma wypadkową wartość OD610 równą 0,065 ±0,005. Odejmij odczyty OD610 ślepych prób medium z galaktozą od odczytów OD610 drożdży, aby wyznaczyć wypadkową wartość OD610 drożdży. Przygotuj końcową objętość co najmniej 30 mL rozcieńczonych drożdży dla każdej płytki 96-dołkowej.
UWAGA: Do tego pomiaru można używać filtrów spektrofotometru mierzących absorbancję w zakresie od 595 do 610 nm. Przybliżony stosunek objętościowy drożdże:medium 1:6 zazwyczaj daje OD610 bliską 0,065, więc zacznij od dodania 4,5 mL drożdży do 30 mL medium i dodawaj więcej drożdży lub medium w zależności od potrzeb, aby uzyskać wypadkową wartość OD610 między 0,060 a 0,070.
- Potwierdź gęstość optyczną, pipetując 120 μL każdej próbki drożdży w trzech powtórzeniach oraz trzy powtórzenia ślepych prób medium z galaktozą do przejrzystej płytki polistyrenowej (płytka nie musi być sterylna). Użyj spektrofotometru do płytek, aby zweryfikować, że rozcieńczona kultura drożdży ma wypadkową wartość OD610 równą 0,065 ±0,005. Odejmij odczyty OD610 ślepych prób medium z galaktozą od odczytów OD610 drożdży, aby wyznaczyć wypadkową wartość OD610 drożdży. Przygotuj końcową objętość co najmniej 30 mL rozcieńczonych drożdży dla każdej płytki 96-dołkowej.
- Stosując technikę sterylną, dodaj tę zawiesinę rozcieńczonych drożdży do dołków sterylnej, polipropylenowej mikropłytki 96-dołkowej zgodnie z układem płytki (Rysunek 1). Podczas pipetowania utrzymuj drożdże w zawiesinie poprzez ciągłe potrząsanie pojemnikiem lub mieszanie pipetą. W tym kroku pomocne jest użycie pipety wielokrotnej z końcówką w postaci sterylnej strzykawki.
Uwaga: Płytki polipropylenowe sterylizuje się w autoklawie, układając dwie płytki jedna na drugiej i owijając je folią. Górna płytka służy jako pokrywa dla płytki z próbkami i może być myta, ponownie autoklawowana i używana wielokrotnie. - Dodaj 120 µL sterylizowanego przez filtr medium z galaktozą do 3 dodatkowych dołków (H10 - 12) zgodnie z układem płytki (Rysunek 1). Dołki te służą jako kontrole medium w celu uwzględnienia absorbancji pochodzącej z samego medium.
- Stwórz krzywą wzorcową na każdej płytce poprzez seryjne rozcieńczanie trójek wzorców roboczych E2 (227,5 nM dla ERα, 9,75 nM dla ERβ) w dołkach zawierających zawiesinę drożdży (A1 - G3) zgodnie z układem płytki (Rysunek 1). Zacznij od dodania 5 µL wzorców E2 do dołków od A1 do A3. Wymieszaj zawartość mikrodołków poprzez pipetowanie, a następnie rozcieńcz seryjnie tę zawiesinę, przenosząc 205 µL z dołków A1 - 3 do dołków B1 - 3. Powtarzaj mieszanie i przenoszenie 205 µL aż do rzędu G.
Uwaga: Po zakończeniu rozcieńczania seryjnego odrzuć 205 μL z dołków G1 - 3. Na koniec tego kroku wszystkie dołki wzorcowe powinny zawierać 120 μL. Rozcieńczanie seryjne pozwoli uzyskać końcowe stężenia E2 wymienione w Tabeli 1. W krokach rozcieńczania seryjnego pomocne jest użycie pipety wielokanałowej ze sterylnymi końcówkami. - Dodaj 5 µL nośnika (50% etanol) do dołków kontroli nośnika zawierających zawiesinę drożdży (H1 - 3) zgodnie z układem płytki (Rysunek 1).
UWAGA: Dołki kontroli nośnika są używane do ilościowego określenia absorbancji tła związanej z komórkami drożdży i medium. Dodatkowo, cytotoksyczność lub efekty stymulujące wzrost próbek testowych można wykryć poprzez porównanie wartości OD610 dołków testowych z wartościami dołków kontroli nośnika. - Dodaj 5 µL trójek próbek oraz negatywnych kontroli ekstrakcji do dołków zawierających zawiesinę drożdży zgodnie z układem płytki (Rysunek 1).
Uwaga: Zanotuj, które próbki lub negatywne kontrole ekstrakcji zostały dodane do każdego dołka. Aby śledzić, które dołki zawierają próbki, a które nie, zacznij od nowego pudełka z końcówkami i używaj końcówek z tych samych pozycji w pudełku, co odpowiadające im pozycje dołków na płytce. Jedna płytka 96-dołkowa może pomieścić do 23 próbek w trzech powtórzeniach. - Wymieszaj zawartość dołków z próbkami, kontrolą ekstrakcji i kontrolą nośnika poprzez pipetowanie. Dostosuj objętość w tych dołkach do 120 µL, usuwając 205 µL z każdego z nich, jak opisano w legendzie do Rysunku 1.
- Uszczelnij płytkę(i) sterylną, adhezyjną, porowatą folią. Opisz płytki i inkubuj przez 17 h w temperaturze 30 °C. Płytka nie wymaga wytrząsania podczas inkubacji.
5. Przetwarzanie płytek YES (dzień 2 analizy)
- Po 17 h inkubacji w 30 °C wyjmij płytki z inkubatora. Jeśli płytki będą przetwarzane natychmiast, przejdź do kroku 5.1.1. Jeśli płytki będą przetwarzane w późniejszym terminie, przejdź do kroku 5.1.2.
- Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdego rzędu dołków, a następnie przenieś 50 µL zawiesiny drożdży z każdego dołka do odpowiadającego mu dołka w przezroczystej, polistyrenowej mikropłytce 96-dołkowej.
Uwaga: Płytki polistyrenowe nie muszą być sterylne, ale powinny posiadać pokrywkę. Używaj nowych końcówek do pipet dla każdego rzędu dołków, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych między dołkami; jednak w przypadku pipetowania powtórzeń technicznych (triplikaty) za pomocą 8-kanałowej pipety, końcówki należy zmieniać jedynie pomiędzy zestawami powtórzeń.- Oznacz nową płytkę. Przejdź do kroku 5.2.
- Aby przechować płytki przed przetwarzaniem, owiń je folią spożywczą. Przechowuj owinięte płytki w lodówce w 4 °C przez 6 d. Następnie wyjmij płytki z lodówki, rozwiń je i przenieś zawartość wszystkich dołków metodą pipetowania, zgodnie z krokiem 5.1.1. Przejdź do kroku 5.2.
- Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszaj zawartość każdego rzędu dołków, a następnie przenieś 50 µL zawiesiny drożdży z każdego dołka do odpowiadającego mu dołka w przezroczystej, polistyrenowej mikropłytce 96-dołkowej.
- Dodaj 20 µL 1 M DTT do 20 mL rozmrożonego, pokojowego buforu LacZ, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM DTT. Dokładnie wymieszaj bufor LacZ. W przypadku użycia pipety wielokanałowej, przelej roztwór do zbiornika na odczynniki.
OSTROŻNIE: Należy nosić rękawiczki i w miarę możliwości pracować z DTT w dygestorium. - Używając pipety wielokanałowej lub pipety powtarzalnej, dodaj 200 µL buforu LacZ zawierającego DTT oraz ONPG lub CPRG do wszystkich dołków płytki polistyrenowej, a następnie niezwłocznie zmierz i zapisz wartość OD610 wszystkich dołków za pomocą spektrofotometru do płytek. Powtórz procedurę w razie potrzeby dla kolejnych płytek.
Uwaga: Odczyty OD610 są wykorzystywane w mianowniku obliczeń LacZ (krok 6.1). Z tego powodu odczyty należy wykonać natychmiast po pipetowaniu, zanim komórki opadną lub zostaną zlizowane przez bufor LacZ. Jeśli wartości OD610 dla dołków z próbką są wyraźnie wyższe lub niższe niż wartości OD610 dla dołków kontroli nośnika, oznacza to odpowiednio, że ekstrakty z próbek stymulują wzrost lub wykazują działanie cytotoksyczne wobec drożdży. Obliczenia LacZ skorygują niewielkie różnice w gęstości komórek między dołkami, jednak jeśli różnice przekraczają 30% w dowolnym kierunku, należy rozcieńczyć zrekonstytuowaną próbkę (z kroku 2.6) w dodatkowym 50% etanolu i ponownie przetestować próbkę, wracając do kroku 3.212. - Przykryj płytki pokrywką. Inkubuj płytki zawierające drożdże wykazujące ekspresję ERα14 w 30 °C przez 40 min (dla ONPG) lub 3 h (dla CPRG). Inkubuj płytki zawierające drożdże wykazujące ekspresję ERβ14 w 30 °C przez 70 min (dla ONPG) lub 4 h (dla CPRG).
Uwaga: W przypadku pracy z CPRG czasy inkubacji są elastyczne; inkubacja przez 2–4 h daje odpowiednie wyniki dla obu receptorów, a dłuższa inkubacja zwiększa czułość testu. - Po inkubacji płytek użyj pipety wielokanałowej lub pipety powtarzalnej, aby dodać 100 µL węglanu sodu do każdego dołka. Węglan sodu podnosi pH i zatrzymuje reakcję β-galaktozydazy.
- Zmierz i zapisz wartość OD405 (dla ONPG) lub OD574 (dla CPRG) wszystkich dołków za pomocą spektrofotometru do płytek.
6. Obliczanie wartości LacZ
UWAGA: Wartości LacZ określają stopień zmiany barwy dla każdej próbki i stanowią znormalizowaną metodę porównywania wyników między oddzielnymi analizami poprzez uwzględnienie kilku zmiennych (np. gęstości optycznej drożdży, gęstości optycznej pożywki oraz czasu inkubacji, jeśli różni się on pomiędzy dołkami na tej samej płytce)12.
- Oblicz średnie wartości potrójnych pomiarów OD610 dla studni kontrolnych z pożywką (galaktozą) (H10-12) oraz średnie wartości potrójnych pomiarów OD405 lub OD574 dla kontroli nośnika (50% etanolu) (H1-3). Wykorzystaj te średnie oraz czas inkubacji (t) w godzinach potrzebny do zmiany barwy płytki (krok 5.5), aby obliczyć wartości LacZ (odpowiadające stopniu zmiany barwy w każdej studni) dla wszystkich studni ze standardami i próbkami, korzystając z następujących równań:
- Alternatywnie, użyj zautomatyzowanej aplikacji w Załączniku 1, aby obliczyć wartości LacZ dla standardów i próbek.
Uwaga: Układ płytki używany w aplikacji musi być identyczny z układem płytki przedstawionym na Rysunku 1. Jeśli niektóre studnie z próbkami nie zostały wykorzystane, zachowaj odczyty absorbancji z pustych studni jako znaczniki w zbiorze danych absorbancji wklejanym do aplikacji LacZ w Załączniku 1. Pozwala to zachować przestrzenny układ płytki w aplikacji i zapewnia, że studnie kontrolne z pożywką znajdują się w wymaganych miejscach. Ponadto aplikacja nie uruchomi się, jeśli w arkuszu będą znajdować się puste komórki.
- Alternatywnie, użyj zautomatyzowanej aplikacji w Załączniku 1, aby obliczyć wartości LacZ dla standardów i próbek.
- Oblicz średnie wartości potrójnych pomiarów LacZ dla każdego standardu E2 i każdej próbki. Wyniki średnich wartości LacZ podaj w µL-1h-1. Przekształć logarytmicznie stężenia każdego standardu E2 i utwórz arkusz kalkulacyjny sformatowany zgodnie z plikiem template.csv (Załącznik 2).
7. Interpolacja równoważników estradiolu w próbkach (EEQ) z wykorzystaniem 4-parametrowej regresji logistycznej
UWAGA: EEQs odnoszą wartości LacZ próbki (zmiana barwy) do wartości LacZ krzywej wzorcowej utworzonej z E2. EEQs określają zatem, jaka ilość próbki jest wymagana do wywołania takiej samej odpowiedzi w postaci zmiany barwy, jak w przypadku znanego stężenia E2.
- Aby obliczyć EEQs dla próbek testowych, należy najpierw wykreślić krzywą wzorcową. Dopasować średnie wartości LacZ dla wzorców E2 (oś y) oraz odpowiadające im logarytmowane stężenia E2 (oś x) do modelu regresji logistycznej czteroparametrowej.
- Wykorzystać model do interpolacji EEQs dla wartości LacZ w próbkach testowych. Obliczenia EEQs metodą regresji logistycznej przeprowadzić przy użyciu oprogramowania statystycznego zgodnie z opisem w Załączniku 2.
8. Standaryzacja EEQ (ng/mL) do masy próbki PCP
- Aby odnieść EEQ do ilości próbki PCP dodanej do każdej studzienki w kroku 4.5, pomnóż EEQ (ng/mL) przez całkowitą objętość naniesioną do studzienek z próbką (325 µL), a następnie podziel przez objętość ekstraktu z próbki dodaną do każdej studzienki (5 µL).
UWAGA: Wartości te reprezentują EEQ na mL ekstraktu z próbki. Jeśli próbki zostały przygotowane z użyciem 1 g PCP, wartości te reprezentują również EEQ na gram PCP (ng/g). Przedstawione w ten sposób wartości EEQ (ng/g) mogą być porównywane pomiędzy różnymi produktami PCP. Wartości EEQ (ng/g) dla produktów do pielęgnacji osobistej przebadanych w niniejszym badaniu przedstawiono w Tabeli 2, a dane z próbek zebrane podczas całego protokołu zawarto w Załączniku 3.
Wyniki
Aktywność estrogenna powtórzonych trzykrotnie próbek 15 produktów kosmetycznych (PCP) została oceniona przy użyciu niniejszego protokołu YES. Jak zauważyli Miller et al. (2010), testy z użyciem drożdży wykazujących ekspresję ERβ były o więcej niż rząd wielkości bardziej czułe niż testy z użyciem drożdży wykazujących ekspresję ERα (Rycina 2)14. W związku z tym aktywność estrogenna była częściej wykrywana w drożdżach wykazujących ekspresję ERβ (Tabela 2). Osiem produktów PCP wykazało aktywność estrogenną w przypadku ERβ, a 5 produktów PCP wykazało aktywność estrogenną w przypadku ERα. Próbki kremu do włosów, kremu z filtrem przeciwsłonecznym, balsamu oraz pomadki do ust wykazały aktywność estrogenną dla obu receptorów, natomiast podkład do skóry, krem do golenia i lakier do paznokci wykazały aktywność estrogenną tylko dla ERβ w przetestowanych stężeniach. Siedem pozostałych produktów PCP (4 szampony, 2 mydła i 1 pomadka do ust) nie wykazało aktywności estrogennej dla żadnego z receptorów w przetestowanych stężeniach.
Oprócz różnic w czułości receptorów, wartości EEQ dla każdej próbki różniły się w zależności od substratu kolorymetrycznego (ONPG lub CPRG) zastosowanego w analizie (Tabela 2). we wszystkich próbkach z wyjątkiem jednej, wartości EEQ wyznaczone przy użyciu ONPG były wyższe niż wartości wyznaczone przy użyciu CPRG. Ponadto zmienność między powtórzeniami ekstrakcji była najniższa dla EEQ mierzonych z użyciem ERβ i CPRG, a najwyższa dla EEQ wyznaczonych przy użyciu ERα i ONPG (Tabela 2).
Oprócz porównania substratów kolorymetrycznych, jednym z celów niniejszego badania było przetestowanie czasów inkubacji zgodnych z harmonogramem studiów laboratoryjnych dla studentów studiów licencjackich. Typowy test YES wymaga 17 h inkubacji, po której następuje natychmiastowa inkubacja w buforze LacZ przez okres od 40 min do 4 h; taki harmonogram jest niemożliwy do wdrożenia w laboratorium dydaktycznym ograniczonym do jednej sesji tygodniowo. Aby ułatwić zastosowanie tego testu w nauczaniu, zmodyfikowano go poprzez wprowadzenie 6-dniowego okresu chłodzenia (krok 5.1.2) po 17-godzinnej inkubacji. Krzywe wzorcowe z płytek chłodzonych były porównywalne z krzywymi z płytek niechłodzonych (Rycina 2 & 3>), z wyjątkiem tego, że błędy standardowe parametrów oszacowanych przy użyciu czteroparametrowych modeli regresji logistycznej były we wszystkich przypadkach mniejsze dla płytek chłodzonych niż dla niechłodzonych (Tabela 3). Zatem chłodzenie płytek przez 6 d zmniejsza błąd i poprawia dokładność szacunków EEQ.
Rysunek 1. Układ płytki mikrodofkowej i przygotowanie standardowej krzywej rozcieńczeń dla testu YES. Standardy E2 (dołki jasnoszare), próbki i negatywne kontrole ekstrakcji (dołki białe) oraz kontrole nośnika (H1 - 3) i pożywki galaktozowej (H10 - 12) (dołki ciemnoszare) były badane w trzech powtórzeniach. Krzywą standardową E2 (dołki jasnoszare) wykonano poprzez naniesienie 320 µL drożdży do dołków od A1 do A3 oraz 120 µL drożdży do dołków od B1 do G3. Następnie do drożdży w dołkach od A1 do A3 dodano 5 µL E2 (227,5 nM dla drożdży wykazujących ekspresję ERα; 9,75 nM dla drożdży wykazujących ekspresję ERβ). Zawiesinę drożdży + E2 rozcieńczano seryjnie poprzez przenoszenie 205 µL z każdego dołka do dołka poniżej, co pozwoliło uzyskać końcowe stężenia E2 wymienione w Tabeli 1. Należy pamiętać, że na koniec procesu rozcieńczeń seryjnych z dołków od G1 do G3 należy odrzucić 205 µL, aby uzyskać końcową objętość 120 µL w każdym dołku. Dołki dla próbek i negatywnych kontroli ekstrakcji przygotowano poprzez dodanie 5 µL każdego ekstraktu (rozpuszczonego w 50% etanolu) do 320 µL drożdży. Dołki kontroli nośnika (H1 - 3) przygotowano poprzez dodanie 5 µL 50% etanolu do 320 µL drożdży. Wszystkie dołki z próbkami i kontrolami wymieszano poprzez pipetowanie, a następnie pobrano i odrzucono 205 µL, aby dostosować objętość w każdym dołku do 120 µL. Na koniec przygotowano kontrole pożywki poprzez naniesienie 120 µL pożywki galaktozowej do dołków H10 - 12. Aby skorzystać z kalkulatora LacZ w Załączniku 1 oraz aplikacji opartej na języku R opisanej w Załączniku 2, krzywa standardowa E2 oraz kontrole nośnika i pożywki galaktozowej muszą zostać naniesione zgodnie z przedstawionym schematem. Próbki i negatywne kontrole ekstrakcji można nanosić w dowolnych białych dołkach, pod warunkiem odnotowania kolejności nanoszenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2. Krzywe wzorcowe dla płytek YES wygenerowane za pomocą 4-parametrycznej regresji logistycznej. Przebadano dwa substraty (ONPG i CPRG) przy użyciu drożdży wykazujących ekspresję jednego z dwóch ludzkich receptorów estrogenowych (ERα lub ERβ), zarówno bez (A), jak i z (B) 6-dniowym okresem chłodzenia po 17-godzinnej inkubacji z 17β-estradiolami i ekstraktami z próbek. Wszystkie wzorce E2 oraz kontrole medium i nośnika badano w trzech powtórzeniach. Punkty reprezentują średnie wartości LacZ z trzech powtórzeń, gdzie wartości LacZ odzwierciedlają stopień zmiany barwy indukowanej przez β-galaktozydazę. Parametry modelu regresji logistycznej wymieniono w Tabeli 3. ONPG = ortho-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd; CPRG = chlorofenolowy czerwony-β-D-galaktopiranozyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3. Przykłady opracowanych płytek YES. Przetestowano dwa substraty (ONPG i CPRG) z użyciem drożdży wykazujących ekspresję ludzkich receptorów estrogenowych (ERα lub ERβ), albo bez (lewa strona), albo z (prawa strona) sześciodniowym okresem chłodzenia po 17 h inkubacji z 17β-estradiolem lub ekstraktami z próbek. Wszystkie standardy E2, pożywki i kontrole nośnika badano w trzech powtórzeniach. Płytki ułożono tak, aby najwyższe stężenie E2 znajdowało się w górnym rzędzie każdej płytki, a kontrole (50% etanol + drożdże po lewej stronie i pożywka galaktozowa po prawej stronie) w dolnym rzędzie każdej płytki, zgodnie z Rycina 1. ONPG = ortho-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd; CPRG = chlorofenolowo-czerwony-β-D-galaktopiranozyd. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Numer standardu | [E2] dla drożdży ERα (pM) | [E2] dla drożdży ERβ (pM) |
| 1 | 3500 | 150 |
| 2 | 2208 | 94.6 |
| 3 | 1393 | 59.7 |
| 4 | 878 | 37.6 |
| 5 | 554 | 23.7 |
| 6 | 349 | 15 |
| 7 | 220 | 9.45 |
Tabela 1. Końcowe stężenia standardów E2 użytych w teście YES.
E2 w proszku rozpuszczono w bezwodnym etanolu, a następnie rozcieńczono do stężeń roztworów roboczych 227.5 nM (dla drożdży wykazujących ekspresję ERα) oraz 9.75 nM (dla drożdży wykazujących ekspresję ERβ) w 50% etanolu. Roztwory robocze dodano następnie do dołków mikropłytki zawierających drożdże w pożywce z galaktozą i rozcieńczano seryjnie do stężeń przedstawionych w tabeli.
| Badane próbki | Warunki analizy | Ekwiwalenty estrogenowe (EEQs) produktów kosmetycznych (PCPs) | |||||
| Nr PCP | Rodzaj próbki | Receptor | Substrat | EEQ 1 (ng/g) | EEQ 2 (ng/g) | EEQ 3 (ng/g) | Średnie EEQ (ng/g) |
| 1 | Krem do włosów | ERα | ONPG | ND | 0.379 | ND | <0.379 |
| 1 | Krem do włosów | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 1 | Krem do włosów | ERβ | ONPG | 0.528 | 0.338 | 0.363 | 0.410 |
| 1 | Krem do włosów | ERβ | CPRG | ND | 0.215 | ND | <0.215 |
| 4 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERα | ONPG | 6.803 | 1.390 | ND | <4.097 |
| 4 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 4 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERβ | ONPG | 1.321 | 0.838 | 0.818 | 0.992 |
| 4 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERβ | CPRG | 0.651 | 0.591 | 0.725 | 0.656 |
| 7 | Podkład | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Podkład | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 7 | Podkład | ERβ | ONPG | ND | 0.158 | ND | <0.158 |
| 7 | Podkład | ERβ | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Krem do golenia | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Krem do golenia | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 9 | Krem do golenia | ERβ | ONPG | ND | 0.256 | 0.295 | <0.276 |
| 9 | Krem do golenia | ERβ | CPRG | 0.507 | 0.392 | 0.560 | 0.486 |
| 10 | Lakier do paznokci | ERα | ONPG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Lakier do paznokci | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 10 | Lakier do paznokci | ERβ | ONPG | 0.916 | 0.503 | 0.554 | 0.658 |
| 10 | Lakier do paznokci | ERβ | CPRG | 0.532 | 0.628 | 0.594 | 0.585 |
| 11 | Lotcja | ERα | ONPG | ND | ND | 2.327 | <2.327 |
| 11 | Lotcja | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 11 | Lotcja | ERβ | ONPG | Przekracza zakres | 2.599 | 1.845 | >2.222 |
| 11 | Lotcja | ERβ | CPRG | -- | 1.986 | 1.236 | 1.611 |
| 13 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERα | ONPG | 14.069 | 11.494 | 10.189 | 11.917 |
| 13 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERα | CPRG | 4.773 | 5.790 | 5.850 | 5.471 |
| 13 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERβ | ONPG | Przekracza zakres | 2.580 | Przekracza zakres | >2.580 |
| 13 | Krem z filtrem przeciwsłonecznym | ERβ | CPRG | 0.292 | 0.240 | ND | <0.266 |
| 15 | Pomadka do ust | ERα | ONPG | ND | ND | 0.431 | <0.431 |
| 15 | Pomadka do ust | ERα | CPRG | ND | ND | ND | ND |
| 15 | Pomadka do ust | ERβ | ONPG | 1.202 | 1.060 | 0.887 | 1.050 |
| 15 | Pomadka do ust | ERβ | CPRG | 0.820 | 0.871 | 0.851 | 0.847 |
Tabela 2. Wartości EEQ dla PCP o niezerowych EEQ. Trzy aliquoty 15 PCP oraz trzy kontrole ekstrakcji homogenizowano w bezwodnym etanolu, odparowano i rozpuszczono ponownie w 50% etanolu, co dało łącznie 48 próbek, z których każda została przeanalizowana w trzech powtórzeniach przy użyciu testu YES. Osiem PCP wykazało co najmniej jedną niezerową wartość EEQ, natomiast w przypadku 7 PCP nie stwierdzono działania estrogennego w testowanych stężeniach. EEQ 1, EEQ 2 i EEQ 3 odnoszą się do trzech aliquotów każdego PCP, z których każdy był testowany w trzech powtórzeniach na oddzielnej płytce. Wartości dla EEQ 1, EEQ 2 i EEQ 3 są średnimi z powtórzeń dla każdego aliquotu. Drożdże użyte w teście wykazują ekspresję jednej z dwóch izoform ludzkich receptorów estrogenowych (ERα lub ERβ). Przetestowano dwa substraty kolorymetryczne, ONPG i CPRG, stosując protokół bez chłodzenia. Wartości EEQ wyznaczono za pomocą czteroparametrowej regresji logistycznej (z wartościami R2 ≥ 0,98) dla wartości LacZ przy każdym z 7 stężeń E2. ND = poniżej granicy wykrywalności testu. -- = utracone powtórzenie.
| Warunki analizy | Parametry modelu | ||||||
| Receptor | Podłoże | Zatrzymać w 4 °C przez 6 dni | Model R2 | Szybkość wzrostu (jednostki LacZ/ng/ml) | Punkt przegięcia (ng/mL) | Dolna asymptota (jednostki LacZ) | Górna asymptota (jednostki LacZ) |
| ERα | ONPG | Tlenek azotu | >0.99 | 8.548 ±1.633 | -0.512 ±0.025 | -1.623 ±4.408 | 128.11 ±6.31 |
| ERα | ONPG | TAK | >0.99 | 7.618 ±0.758 | -0.587 ±0.014 | -8.378 ±2.223 | 99.53 ±2.528 |
| ERα | CPRG | Tlenek azotu | >0.99 | 8.256 ±2.182 | -0.610 ±0.033 | 0.853 ±3.333 | 62.52 ±3.473 |
| ERα | CPRG | TAK | >0.99 | 5.068 ±0.616 | -0.523 ±0.022 | -3.147 ±1.946 | 68.06 ±3.069 |
| ERβ | ONPG | NIE | >0.99 | 1.041 ±2.004 | -0.898 ±4.410 | -32.98 ±86.62 | 248.6 ±778.9 |
| ERβ | ONPG | TAK | >0.99 | 4.327 ±1.289 | -1.736 ±0.087 | 4.654 ±3.087 | 66.37 ±10.75 |
| ERβ | CPRG | NIE | = 0.99 | 5.673 ±1.764 | -1.914 ±0.052 | 3.925 ±1.679 | 28.05 ±2.334 |
| ERβ | CPRG | TAK | >0.99 | 4.412 ±1.142 | -1.894 ±0.051 | 2.052 ±1.303 | 22.64 ±2.047 |
Tabela 3. Parametry modelu regresji logistycznej 4-parametrycznej dla krzywych wzorcowych w Rycina 2. Przetestowano dwa substraty, ONPG i CPRG, z wykorzystaniem drożdży wykazujących ekspresję jednego z dwóch ludzkich receptorów estrogenowych (ERα lub ERβ), zarówno bez, jak i z sześciodniowym okresem przechowywania w warunkach chłodniczych po 17-godzinnej inkubacji. Parametry przedstawiono jako wartości szacunkowe ± błędy standardowe.
Załącznik 1. Aplikacja do obliczania wartości LacZ. Aby korzystać z aplikacji, należy najpierw pobrać bezpłatne oprogramowanie Java (zgodnie z informacją w Tabela materiałów). Następnie otwórz aplikację LacZ. Układ płytki stosowany w aplikacji musi być identyczny z układem płytki przedstawionym w Rysunek 1Jeśli niektóre dołki z próbkami nie zostały wykorzystane, należy zachować odczyty absorbancji z pustych dołków jako wartości zastępcze w zbiorze danych absorbancji wklejanym do aplikacji LacZ. Pozwala to zachować układ przestrzenny płytki w aplikacji i gwarantuje, że dołki kontrolne z medium znajdują się w wymaganych miejscach. Ponadto aplikacja nie uruchomi się, jeśli w arkuszu będą znajdować się puste komórki. Wklej wartości OD405 odczyty (dla ONPG) lub OD574 odczyty (dla CPRG) ze wszystkich dołków, używając polecenia klawiatury „control (ctrl) + v” lub „command + v”, w zależności od używanej platformy komputerowej. Wprowadź czas inkubacji w godziny aby test wybarwił się (z kroku 5.4; na przykład 0,66667 h dla 40 min). Kliknij Dalej. Wklej wartość OD610 odczyty z kroku 5.3. Kliknij przycisk submit. Wyniki LacZ zostaną wyświetlone i można je skopiować, naciskając „control (ctrl) + c” lub „command + c”, w zależności od używanej platformy komputerowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatek 2. Opcje oprogramowania statystycznego do obliczania EEQs. Wartości EEQs można obliczyć, korzystając z jednej z trzech przedstawionych opcji. Instrukcje dotyczące korzystania z 1. oprogramowania JMP lub 2. kodu R znajdują się w Dodatku 2. Kod R został również przekształcony w 3. format aplikacji dostępnej pod adresem https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dodatek 3. Przykładowe dane zebrane przy użyciu drożdży eksponujących ERα i CPRG jako substrat. Uwzględniono pomiary OD610 i OD574 dla każdego z siedmiu standardów E2, kontroli nośnika i pożywki oraz pojedynczej reprezentatywnej próbki PCP, wraz z obliczonymi wartościami LacZ. Wartości LacZ standardów zostały wykorzystane do stworzenia czteroparametrowego modelu regresji logistycznej krzywej wzorcowej, zgodnie z opisem w krokach 7A i B powyżej. Model ten posłużył do interpolacji potrójnych szacunków EEQ reprezentatywnej próbki w ng/mL w dołkach mikropłytki. Wartości te zostały następnie przeliczone na EEQ wyrażone jako ng/g próbki (krok 8.1). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
YES to tania metoda stosowana do wykrywania ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych, takich jak woda, żywność, tkanki roślinne lub produkty higieny osobistej. Przedstawione tutaj dane porównują 2 receptory estrogenowe (ERα i ERβ), 2 substraty (ONPG i CPRG) oraz 2 osie czasu (protokół 2 d bez chłodzenia i protokół siedmiodniowy z chłodzeniem) do pomiaru estrogenności w produktach higieny osobistej za pomocą testu YES. 7-dniowy protokół chłodniczy wykorzystujący CPRG i drożdże wyrażające ERα i/lub ERβ najlepiej określa ilościowo EEQ, a jednocześnie jest zgodny z ograniczeniami czasowymi narzuconymi przez kursy laboratoryjne na studiach licencjackich, które odbywają się tylko raz w tygodniu przez kilka godzin. W rzeczywistości, w porównaniu z testem 2 d bez chłodzenia, siedmiodniowy test z chłodzeniem wiązał się ze zmniejszoną wariancją między powtórzeniami płytek. Ponadto część liniowa krzywej standardowej została nieznacznie rozszerzona dla danych zebranych za pomocą testu chłodzonego. Liniowa część krzywej wzorcowej określa zakres wykrywania testu i jest jedyną częścią krzywej wzorcowej, którą można wykorzystać do interpolacji EEQ próbki.
We wszystkich badanych próbkach, z wyjątkiem jednej, EEQ mierzone za pomocą CPRG były niższe niż te oznaczone ilościowo za pomocą ONPG. Dzięki wyższemu współczynnikowi ekstynkcji i niższemu Km i Vmax, CPRG jest dziesięć razy bardziej czuły niż ONPG17. W związku z tym CPRG może być stosowany w niższych stężeniach i może być stosowany do wykrywania mniejszych ilości β-galaktozydazy. Z tych powodów CPRG jest generalnie preferowany w stosunku do ONPG18,19. Jednak większa czułość substratu nie wyjaśnia niższych wartości EEQ wykrytych za pomocą CPRG. Wyższe wartości EEQ wykryte za pomocą ONPG mogą być spowodowane interferencją matrycy z testem, jak zauważyli inni autorzy 2,18. Żółte pigmenty z ekstraktów produktów higieny osobistej mogą zawyżać wartości EEQ wykrywane za pomocą ONPG. Inni obeszli ten problem, włączając kontrolę pigmentu do swojego projektu eksperymentalnego2, podejście, które podwaja liczbę płytek w eksperymencie. Gdy interferencja matrycy może być problematyczna, CPRG może być preferowanym substratem do testu YES, chociaż jest droższy i wymaga dłuższego czasu inkubacji niż ONPG. Co więcej, zmiana koloru wywołana rozszczepieniem substratu przez β-galaktozydazę jest bardziej dramatyczna w przypadku CPRG, co ułatwia uczniom wizualizację wyników.
Miller i in. (2010), którzy zaprojektowali drożdże użyte w tym protokole, zauważyli, że drożdże wykazujące ekspresję ERβ były 30 razy bardziej wrażliwe na 17β-estradiol niż drożdże eksprymujące ERα, co potwierdzają nasze dane14. Poza potencjalnymi niuansami w budowie plazmidu, Miller i in. (2010) nie mogli wyjaśnić tej różnicy w czułości14. Jedną z różnic między tymi dwoma konstruktami plazmidu jest to, że ekspresja ERα jest regulowana przez galaktozę, podczas gdy ekspresja ERβ jest regulowana przez glukozę lub galaktozę. Drożdże użyte w teście YES są hodowane w pożywkach z glukozą i podaje się im galaktozę tylko wtedy, gdy są rozcieńczone na początku testu. W związku z tym drożdże wykazujące ekspresję ERβ mogą gromadzić większą liczbę kopii białek receptorowych przed rozpoczęciem testu, nadając w ten sposób większą wrażliwość ligandom estrogenowym.
Niższa czułość drożdży wykazujących ekspresję ERα może wyjaśniać wyższe wskaźniki niewykrywania estrogenności w próbkach mierzonych za pomocą ERα w porównaniu z ERβ. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że EEQ próbki zostaną wykryte, użytkownicy mogą zastosować różne rozpuszczalniki i metody ekstrakcji lub dodać większe objętości próbki do drożdży. Jeżeli stosuje się większe objętości próbek, stężenia wzorców E2 powinny być dostosowane w taki sposób, aby ta sama objętość wzorców i próbek mogła być użyta w badaniu. Jednym z ograniczeń związanych z dodawaniem większej ilości próbki jest to, że drożdże tolerują tylko 6 - 10% etanolu, z lepszą tolerancją w temperaturach inkubacji 30 w porównaniu z 35 °C20. W celu kontroli wpływu etanolu na drożdże, badacze powinni dodać trzy studzienki "tylko drożdże" do układu płytki i potwierdzić, że OD610 tych studzienek "tylko drożdże" jest porównywalne z OD610 studzienek kontrolnych nośnika bezpośrednio po dodaniu buforu LacZ. Alternatywnie, próbki rozpuszczone w etanolu można dodać do suchych płytek mikrodołkowych, a etanol odparować przed dodaniem drożdży. Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest również stosowany jako rozpuszczalnik próbki w testach YES, ale końcowe stężenie robocze DMSO z drożdżami powinno być ograniczone do 1%12.
Test YES jest potężnym narzędziem przesiewowym do wykrywania estrogenowości w próbkach środowiskowych. W szczególności YES wykrywa ligandy, które wiążą jądrowe receptory estrogenowe, które oddziałują z elementami odpowiedzi estrogenowej w celu bezpośredniej ekspresji genów14. Jednak TAK ma również istotne ograniczenia. TAK nie wykrywa EE, które działają poprzez mechanizmy niejądrowe, takie jak błonowe receptory estrogenowe lub mechanizmy obejmujące dodatkowe elementy, takie jak czynniki transkrypcyjne białka aktywującego 1 (AP-1). Co więcej, ponieważ drożdże nie mają takiej samej zdolności metabolicznej jak komórki ssaków, TAK nie mogą wykryć ligandów, które wymagają aktywacji metabolicznej, aby być estrogennymi.
Ponadto test YES nie może łatwo rozróżnić ligandów estrogenowych i antyestrogenowych w złożonych próbkach. Zamiast tego mierzy estrogenność netto , która jest sumą efektu ligandów estrogenowych i antyestrogenowych. Aby określić ilościowo stężenie antagonistów ER lub ocenić aktywność hamującą mieszanin, test można zmodyfikować poprzez inkubację drożdży zarówno ze standardowym agonistą (17β-estradiolem), jak i zakresem stężeń próbki testowej12. Proces ten określa, czy antagoniści w próbkach mogą zmniejszać aktywność reporterową indukowaną przez agonistów i stanowi przydatne badanie przesiewowe do identyfikacji obecności antagonistów ER w próbkach.
Przedstawiony tutaj protokół może uwzględniać różne typy próbek, chociaż niektóre próbki mogą wymagać modyfikacji etapów ekstrakcji i przygotowania próbki. Na przykład EEQ różniły się znacznie w zależności od replikacji niektórych produktów higieny osobistej. Bardziej zróżnicowane próbki zawierały kropelki oleju lub w inny sposób nie były całkowicie jednorodne, co wskazuje, że pomocny byłby bardziej lipofilowy rozpuszczalnik, taki jak eter dietylowy. Alternatywnie, oleje i wosk w produktach higieny osobistej można wykluczyć, ekstrahując próbki z 50% etanolem zamiast 100% etanolu. Ekstrakcja 50% etanolem wychwyci również więcej rozpuszczalnych w wodzie ligandów estrogenowych (np. Niektóre pigmenty). Jednak 50% etanolu odparowuje wolniej niż 100% etanolu, a tym samym może wydłużyć czas ekstrakcji. Ponadto niektóre próbki (takie jak mydła) były cytotoksyczne dla drożdży, co skutkowało zmniejszonymi pomiarami gęstości komórek (OD610). Fox i in. (2008) sugerują, że takie próbki należy rozcieńczyć i ponownie przetestować, jeśli różnice w gęstości komórek przekraczają 30% w porównaniu z dołkami kontrolnymi nośników12.
Jeżeli test TAK jest stosowany do celów badań analitycznych, można przebadać krzywe rozcieńczania puli próbek w celu prewencyjnego określenia odpowiednich objętości ekstraktu, który ma zostać dodany do drożdży w kroku 4.5. Alternatywnie, ekstrakty mogą być jednocześnie testowane w wielu objętościach (np. 5 μl i 20 μl ekstraktu dodanego do drożdży w kroku 4.5) lub rozcieńczeniach, które obejmują rzędy wielkości (np. 0,2 μl, 2 μl i 20 μl). "Odpowiednie" objętości ekstraktu to te, które identyfikują estrogenność poprzez dopasowanie wartości LacZ wzdłuż liniowej części krzywej wzorcowej. Optymalizacja zapobiega problemom spowodowanym dodaniem zbyt dużej lub zbyt małej próbki do drożdży, takim jak cytotoksyczność, wyniki fałszywie ujemne lub estrogenność przekraczająca krzywą standardową. Jak wspomniano powyżej, objętość próbek i wzorce E2 powinny być dostosowane, gdy stosuje się różne ilości liganda, tak aby drożdże były wystawione na działanie stałej objętości i stężenia etanolu lub innego nośnika na płytce.
Pomimo możliwości uzyskania wyników fałszywie ujemnych, test YES został zidentyfikowany jako narzędzie testowe poziomu 3 dla substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego przez Schug i in. (2013), którzy opracowali kompleksowy wielopoziomowy protokół zaburzeń endokrynologicznych (TiPED)21. W przypadku edukacji licencjackiej test jest cenny w nauczaniu pojęć związanych z zaburzeniami endokrynologicznymi, hodowlą komórek, wiązaniem receptorów, aktywnością enzymów, inżynierią genetyczną, statystyką i projektowaniem eksperymentalnym. Studenci, którzy korzystają z testu, ćwiczą również podstawowe i szeroko stosowane umiejętności laboratoryjne, takie jak seryjne rozcieńczanie roztworów wzorcowych; pobieranie próbek; tworzenie rozwiązań; konstruowanie i interpolowanie krzywych standardowych; obliczanie stężeń; tworzenie rozwiązań; demonstrowanie sterylnej techniki; hodowla komórek; identyfikowanie zmiennych i kontroli; gromadzenie, organizowanie i analizowanie danych; konstruowanie i interpretacja wykresów; oraz przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikropipety i spektrofotometry.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ten projekt został sfinansowany przez fundusze start-upów dla TME i AMR odpowiednio z Louisiana Tech University i Furman University. Dodatkowe finansowanie pochodziło z grantu Faculty Advancement Grant dla AMR i TME w 2015 r. z The Associated Colleges of the South, grantu Louisiana EPSCoR Pfund dla TME z National Science Foundation i Louisiana Board of Regents oraz nagrody podróżniczej dla TME z University of the South. Dziękujemy dr Davidowi Eubanksowi (Furman) za pomoc w analizach statystycznych oraz panu Christopherowi Moore'owi za "podanie nam ręki" podczas kręcenia filmu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (do jednej lub wielu rur) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Wystarczy dowolny mikser. |
| Wirówka kubełkowa | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Każda wirówka kubełkowa wystarczy, jeśli jest w stanie odwirować stożkowe probówki z prędkością 4000 obr./min. |
| Palnik Bunsena | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Wystarczy dowolny palnik Bunsena lub zamiast niego można użyć palnika alkoholowego (Fisher Scientific 04-245-1). |
| Inkubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Każdy inkubator jest wystarczający, jeśli jest w stanie utrzymać temperaturę 30 stopni Celsjusza. |
| Czytnik mikropłytek | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | Czytnik płytek innej marki wystarczy, jeśli może mierzyć absorbancję przy długościach fal 405, 574 i 610 nm. |
| Oprogramowanie czytnika mikropłytek i imagera Gen5 | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | zależy od marki i modelu czytnika płytek; Oprogramowanie GEN5 jest przeznaczone do użytku z czytnikiem płytek BioTek. |
| Lodówka | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Każda lodówka wystarczy, jeśli jest w stanie utrzymać temperaturę 4 stopni Celsjusza. |
| Pipetor lub PipetAid kompatybilny z pipetami serologicznymi 1 - 10 ml | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Wszelkie pipety będą wystarczające, jeśli są kompatybilne z pipetami serologicznymi o pojemności 1 i 10 ml. |
| Mikropipet P10 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Każdy mikropipet wystarczy, jeśli jest w stanie dozować 5 &mikrolitrów. |
| Mikropipeta P200 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Każdy mikropipet wystarczy, jeśli jest w stanie dozować do 200 &mikrolitrów. |
| Pipetor wielokanałowy P300 | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Każdy pipet wielokanałowy jest wystarczający, jeśli jest w stanie dozować 50 - 205 &mikrolitrów. |
| Pipetor powtarzalny | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Musi być w stanie dostarczyć 100 - 320 &mikro; l; Ten pipetor jest opcjonalny, ponieważ zamiast niego można użyć pipetora wielokanałowego. |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Supplies | |||
| Sterylne probówki stożkowe 15 ml z nakrętkami | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Szklane fiolki scyntylacyjne | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Polistyren 96-dołkowy, płaskie płytki z pokrywką (niesterylne) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Polipropylen 96-dołkowy, mikropłytki płaskodenne bez pokrywy | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| Zlewki szklane 100 ml | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Wystarczą dowolne szklane zlewki, jeśli można je sterylizować w autoklawie. |
| Szklane kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Wystarczą dowolne szklane kolby Erlenmeyera, jeśli można je sterylizować w autoklawie. |
| Sterylna, klejąca, porowata folia | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Kleszcze metalowe | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Wystarczą dowolne kleszcze metalowe. |
| Zbiornik odczynnika | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Jednostki filtracyjne (0,2 i mikro; m) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Butelka ze spryskiwaczem (na etanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Wystarczą dowolne laboratoryjne butelki do spryskiwania. |
| Autoklawowalne butelki do przechowywania | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Wystarczą dowolne szklane butelki do przechowywania w autoklawie. |
| 10 ml szklane pipety serologiczne (sterylne) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Wystarczą dowolne szklane pipety serologiczne. |
| 1 ml szklane pipety serologiczne (sterylne) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Wystarczą dowolne szklane pipety serologiczne. |
| Końcówki do mikropipetorów P10 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem. |
| Końcówki do mikropipetorów P200 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem. |
| Końcówki do mikropipet P300 | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem. |
| Końcówki strzykawkowe do pipetora powtarzalnego | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Wymagane tylko w przypadku użycia pipetora powtarzalnego. |
| Sterylne szalki Petriego | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Wystarczą dowolne sterylne szalki Petriego. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Drożdże Szczepy | |||
| Saccharomyces cerevisiae które nie mają produktu genu TRP1 (np. , W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | są również dostępne na życzenie autorów. |
| Receptor/plazmid reporterowy dla ER&alfa; | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plazmid #23061) | |
| Receptor/plazmid reporterowy dla ER i beta; | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plazmid #23062) | |
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| Chemicals | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | UWAGA: Ditiotreitol działa drażniąco na skórę i oczy. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestoria, maskę przeciwpyłową), aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami, wdychania i połknięcia. |
| Orto-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Chlorofenol czerwony-β-D-galaktopyranozyd | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Drożdżowa zasada azotowa | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Sigma | glukozy (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galaktoza | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Siarczan adeniny | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracyl | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucyna | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histydyna | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol& nbsp; | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedycyna | E8875-250 mg 0219456401 - 1 mg | UWAGA: Estradiol jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i toksyczne działanie na rozrodczość. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, połknięcia lub wchłaniania przez skórę. Estradiol może szkodzić dzieciom i płodom karmionym piersią. Estradiol jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestorio, maska przeciwpyłowa) i unikać narażenia w czasie ciąży i laktacji. Estradiol powinien być utylizowany jako odpad niebezpieczny i nie powinien być uwalniany do środowiska. |
| 100% etanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Sodu fosforan dwuzasadowy (bezwodny) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Chlorek magnezu | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Chlorek | potasuSigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (sól sodowa N-lauroilosarkozyny) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Węglan sodu | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Nazwa | Company | Numer katalogowy | Komentarze |
| Software | |||
| Excel arkusz kalkulacyjny | Microsoft | Excel to wygodne oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych do zarządzania danymi wyjściowymi i generowania plików .csv do analizy R. | |
| Oprogramowanie Java (wymagane dla aplikacji z Załącznika 1) | Oracle Corporation | Aby obliczyć wartości LacZ za pomocą aplikacji wymienionej w Załączniku 1, należy najpierw pobrać bezpłatne oprogramowanie Java (https://www.java.com/en/download/), a następnie otworzyć aplikację LacZ w Załączniku 1. Wyniki LacZ utworzone przez aplikację można skopiować, naciskając "control (ctrl) + c" na klawiaturach PC lub "command + c" na klawiaturach Mac. | |
| Oprogramowanie statystyczne JMP w wersji 13.0.0 | SAS Institute | Załącznik 2 zawiera wskazówki dotyczące korzystania z JMP w celu dopasowania danych LacZ do czteroparametrowej krzywej regresji logistycznej. Krzywa służy do interpolacji ekwiwalentów estradiolu (EEQ) próbki testowej w stosunku do krzywej wzorca estradiolu. | |
| R oprogramowanie do obliczeń statystycznych i grafiki | R Foundation | Bezpłatne oprogramowanie R można pobrać ze strony https://www.r-project.org/. Wskazówki i kod dotyczący stosowania R w celu dopasowania danych LacZ do czteroparametrowej krzywej regresji logistycznej podano w dodatku 2. |
Bibliografia
- Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents. Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).
- Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage. Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).
- Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products. J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).
- Wagner, M., Oehlmann, J. Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).
- Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens. Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).
- Odum, J., et al. The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay. Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).
- Mellanen, P., et al. Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout. Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).
- Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). , Available from: http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/ (2013).
- Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization. Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).
- Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay. Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).
- De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder. Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).
- Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).
- Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays. Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).
- Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors. Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).
- Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. , Available from: http://www.ewg.org/skindeep (2016).
- Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells. Biotechniques. 11 (6), (1991).
- Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).
- Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood. J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).
- Gray, W. D. Studies on the alcohol tolerance of yeasts. J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).
- Schug, T. T., et al. Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals. Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).
Przedruki i uprawnienia
