Method Article

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

DOI:

10.3791/55756

⸱

April 20th, 2017

 , 
1U.S. Arid Land Agricultural Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterologiczne systemy ekspresji białek są używane do produkcji białek rekombinowanych, interpretacji transportu/lokalizacji komórkowej oraz określania funkcji biochemicznej białek na poziomie suborganizmów. Chociaż systemy ekspresji bakulowirusa są coraz częściej wykorzystywane do produkcji białek w licznych zastosowaniach biotechnologicznych, farmaceutycznych i przemysłowych, systemy nielityczne, które nie wiążą się z infekcją wirusową, przynoszą wyraźne korzyści, ale często są pomijane i niedostatecznie wykorzystywane. W tym miejscu opisujemy metodę generowania nielitycznych wektorów ekspresyjnych i przejściowej ekspresji białek rekombinowanych. Protokół ten pozwala na efektywną lokalizację komórkową rekombinowanych białek i może być wykorzystany do szybkiego rozpoznania transportu białek w komórce. Pokazujemy ekspresję czterech rekombinowanych białek w dostępnej na rynku linii komórkowej owadów, w tym dwóch białek akwaporyny z owada Bemisia tabaci, a także subkomórkowych białek markerowych specyficznych dla błony komórkowej plazmatyki i lizosomów wewnątrzkomórkowych. Wszystkie rekombinowane białka wyprodukowano jako chimery z fluorescencyjnymi markerami białkowymi na ich końcach karboksylowych, co pozwala na bezpośrednie wykrycie rekombinowanych białek. Podwójna transfekcja komórek z plazmidami zawierającymi konstrukty dla genów będących przedmiotem zainteresowania i znanym markerem subkomórkowym pozwala na obrazowanie żywych komórek i lepszą walidację lokalizacji białek komórkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białek rekombinowanych za pomocą systemów ekspresji komórek owadów oferuje liczne korzyści dla badania białek eukariotycznych. Mianowicie, komórki owadów mają podobne modyfikacje potranslacyjne, mechanizmy przetwarzania i sortowania, jak te obecne w komórkach ssaków, co jest korzystne dla produkcji prawidłowo pofałdowanych białek1,2,3. Systemy komórkowe owadów zazwyczaj wymagają również mniej zasobów oraz mniej czasu i wysiłku na utrzymanie niż linie komórkowe ssaków4,5. System ekspresji bakulowirusa jest jednym z takich systemów opartych na komórkach owadów, który jest obecnie szeroko stosowany w wielu dyscyplinach, w tym w produkcji rekombinowanych białek do charakteryzacji białek i terapii, immunogennej prezentacji obcych peptydów i białek wirusowych do produkcji szczepionek, syntezie kompleksów wielobiałkowych, produkcji białek glikozylowanych itp. 1,2,4,6. Istnieją jednak sytuacje, w których ekspresja bakulowirusa może nie mieć zastosowania3,7, a użycie nielitycznych i przejściowych systemów ekspresji owadów może być bardziej odpowiednie. W szczególności przejściowa ekspresja komórek owadów daje możliwość szybkiej syntezy rekombinowanego białka, wymaga mniej rozwoju i konserwacji, nie wiąże się z lizą komórek narzuconą przez wirusa i zapewnia środki do lepszego badania transportu komórkowego podczas syntezy białek7,8,9,10.

Ten protokół opisuje szybkie generowanie wektorów ekspresyjnych za pomocą dwuetapowego nakładania się PCR (OE-PCR) 11 oraz standardowego klonowania plazmidowego DNA u Escherichia coli. Plazmidy są używane do podwójnej transfekcji dostępnych na rynku hodowanych komórek owadów i do produkcji reprezentatywnych białek. Protokół opisuje produkcję i wykorzystanie dwóch różnych, znakowanych fluorescencyjnie subkomórkowych białek markerowych i wykazuje kolokalizację z dwoma białkami akwaporyny owada Bemisia tabaci. Poniższy protokół zawiera podstawową metodologię OE-PCR, utrzymania i transfekcji komórek owadów oraz mikroskopii fluorescencyjnej do lokalizacji komórkowej docelowych białek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. OE-PCR do budowy plazmidów ekspresyjnych

Uwaga: Zobacz Tabelę 1 dla wszystkich starterów używanych w OE-PCR. Stosowanie polimerazy DNA o wysokiej wierności jest zalecane w przypadku wszystkich amplifikacji. Ponieważ jednak enzymy te często nie opuszczają 3' A, konieczne jest wykonanie krótkiej, nieamplifikującej inkubacji z polimerazą DNA Taq w celu "ogona" produktów PCR przed sklonowaniem ich do wektora ekspresji komórek owadów TA. Protokół ten demonstruje metodę generowania plazmidów ekspresji owadów zawierających białka chimeryczne, z białkami fluorescencyjnymi połączonymi w ramce z końcem karboksylowym interesujących genów (w tym przypadku z dwoma białkami akwaporyny Bemisia tabaci) lub z subkomórkowymi białkami markerowymi (Figura 1).

  1. Użyj OE-PCR, który składa się z dwóch niezależnych rund amplifikacji, aby wygenerować: (1) sekwencje kodujące interesujące geny (B. tabaci akwaporyna 1: BtDrip1; B. tabaci akwaporyna 2: BtDrip2_v1) połączona w ramce z zielonym wariantem białka fluorescencyjnego zwanym EGFP lub (2) markerami subkomórkowymi (receptor peptydu płciowego Drosophila melanogaster: DmSPR; Homo sapiens fosfolipaza A2: HsPLA2) z sekwencją kodującą mCherry. Bezpośrednio podwiązywać końcowe produkty OE-PCR do plazmidu pIB/V5-His-TA.
    1. W pierwszej rundzie OE-PCR (oznaczonej przez A-D i A'-D' na rysunku 1) należy użyć startera zmysłowego specyficznego dla genu (pokazanego pogrubioną czcionką w tabeli 1) i chimerycznego startera antysensownego (kursywą w tabeli 1) odpowiadającego końcowym 15 pz (bez kodonu stop) genu będącego przedmiotem zainteresowania/markera subkomórkowego i 15 pz końca 5' pożądanego białka fluorescencyjnego (EGFP lub mCherry) w celu wytworzenia produktu z wysięgiem 3'.
      Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR.
    2. W osobnej probówce użyj specyficznego dla genu startera antysensownego białka fluorescencyjnego (pokazanego z podkreśleniem w Tabeli 1) i chimerycznego startera zmysłowego, który zawiera 15 pz od końca 3' genu będącego przedmiotem zainteresowania / markera subkomórkowego i 15 pz od końca 5' pożądanego białka fluorescencyjnego, aby wytworzyć produkt o zwisie 5'.
      Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR. Matryca PCR może być albo produktem PCR zwalidowanym sekwencyjnie, albo, co bardziej pożądane, plazmidowym DNA zawierającym pożądaną sekwencję. Opisane tutaj badanie wykorzystuje plazmidy zwalidowane sekwencyjnie.
    3. Oddzielić produkty PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym (przy użyciu standardowej agarozy molekularnej).
    4. Należy wyciąć i oczyścić produkty o oczekiwanych rozmiarach (zob. tabela 2) przy użyciu dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelem DNA (zob. tabela materiałów dla konkretnego zestawu stosowanego w niniejszym protokole).
    5. Użyj oczyszczonych w żelu produktów PCR z kroku 1.1.4, aby wygenerować końcowe produkty przedłużające zakładkę (wskazane przez A''-D'' na rysunku 1). Użyj specyficznego dla genu startera zmysłowego dla genu będącego przedmiotem zainteresowania/markera subkomórkowego i odpowiadającego mu specyficznego dla genu startera antysensownego dla białka fluorescencyjnego, aby wygenerować pożądaną sekwencję chimeryczną.
      Uwaga: Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z warunkami PCR. Konieczne może być empiryczne określenie optymalnych ilości produktów pierwszej rundy rozszerzania nakładania się, które należy dodać do mieszaniny reakcyjnej w celu uzyskania końcowego, pełnego produktu chimerycznego PCR.
    6. Oddzielić produkty OE-PCR drugiej rundy za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym. Wyciąć i oczyścić produkty za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu DNA.
    7. Inkubować oczyszczone żelem produkty OE-PCR drugiej rundy z 1 jednostką głównej mieszanki polimerazy DNA Taq przez 10 minut w temperaturze 72 °C w celu wytworzenia 3' adenylowanych (tj. A-ogoniastych) produktów potrzebnych do klonowania TA.
    8. Związać powstałe produkty adenylowane z wektorem ekspresyjnym pIB i zastosować standardowe techniki klonowania molekularnego w celu przekształcenia chemicznie kompetentnych (szok cieplny) lub elektrokompetentnych (elektroporacja) komórek Escherichia coli. Płytkę przez noc umieszczać na podłożu zawierającym odpowiedni znacznik selekcyjny (tj. ampicylinę lub karbenicylinę).
    9. Wykonaj PCR12 przy użyciu startera specyficznego dla wektora i startera specyficznego dla insertu, aby zidentyfikować kolonie dodatnie dla insercji, które zostały przekształcone z plazmidami ekspresyjnymi zawierającymi insert w orientacji 5'-3'. Przygotuj nocne kultury kolonii, uzyskując produkty PCR o oczekiwanych rozmiarach.
    10. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z konkretnym zestawem używanym w tym protokole). Zweryfikuj integralność sekwencji każdej wstawki za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania DNA.

2. Utrzymanie hodowli komórek owadów

Uwaga: Aby utrzymać sterylne warunki, przeprowadzaj wszystkie manipulacje komórkami wymagające otwarcia kolby do hodowli tkankowej w kapturze z przepływem laminarnym. Włącz lampę bakteriobójczą UV z przepływem laminarnym co najmniej 1 godzinę przed manipulacją komórkami. Nosić rękawice nitrylowe i przed użyciem odkazić powierzchnię stołu, pipet, przyborów kuchennych, probówek i kolb 70% etanolem. Zalecana znajomość podstawowych technik hodowli komórkowych13.

  1. Należy użyć komórek Tni (ustalonej linii hodowli komórkowych pochodzącej z tkanki jajnika Trichoplusia ni), które są przystosowane do podłoża bez surowicy, i utrzymywać je jako przylegającą hodowlę jednowarstwową w pożywce dla owadów bez surowicy w temperaturze 28 °C w kolbach do hodowli tkankowych T25.
  2. Utrzymuj komórki Sf9 (ustaloną linię hodowli komórkowych pochodzącą z tkanki jajnika Spodoptera frugiperda) podobnie, ale przy użyciu pożywki do hodowli owadów TNM-FH uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  3. Wysiewać początkową kulturę z zamrożonych komórek Sf9 lub Tni, wyjmując fiolki podstawowe z temperatury -80 °C i pozwalając im rozmrozić się w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu odkazić fiolki 70% etanolem i umieścić je na lodzie.
  4. Dodać 4 ml pożywki z komórek owadów do nowej kolby T25 i przenieść 1 ml zawiesiny rozmrożonych komórek owadów. Umieścić kolbę w nienawilżanym inkubatorze o temperaturze 28 °C i pozostawić komórki do przyczepienia się na 30-45 minut.
  5. Zastąpić podłoże wysiewające 5 ml odpowiedniego podłoża i przenieść kolby do inkubatora bez nawilżania o temperaturze 28 °C. Codziennie monitoruj zbieg komórek. Przejdź przez komórki, gdy osiągną 90% konfluencji.
    Uwaga: Pełne pokrycie kolby T25 odpowiada ~5 x 106 komórek.
  6. Przejście komórek owadów.
    1. Aby przejść przez komórki, należy najpierw usunąć wyczerpane podłoże z kolby zawierającej zbiegające się komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przechylić kolbę tak, aby pożywka spływała do jednego rogu, z dala od monowarstwy komórek. Ostrożnie usunąć pożywkę za pomocą pipety, nie naruszając komórek.
    2. Usunąć komórki Tni poprzez delikatne przepłukanie kolb T25 zawierających zlewającą się monowarstwę 4 ml pożywki dla owadów bez surowicy za pomocą nowej, sterylnej pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przesunąć końcówkę pipety w poprzek kolby i powoli irygować, aby usunąć komórki luźno przylegające do dna kolby.
      1. Sprawdzić, czy komórki są odpowiednio oderwane, usuwając wszystkie media, obracając kolbę i obserwując, czy dno kolby jest czyste.
    3. W przypadku komórek Sf9, które przylegają ściślej, dodaj 4 ml świeżej pożywki TNM-FH i użyj skrobaka do komórek, aby usunąć przyczepione komórki. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby delikatnie wymieszać i zmniejszyć zbrylanie komórek.
    4. Użyj automatycznego licznika komórek, aby oszacować liczbę żywotnych komórek owadów na objętość pożywki. Przenieś 0,1 ml mieszaniny komórek/pożywki do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. W oddzielnej probówce do mikrofuge o pojemności 0,5 ml dodaj 10 μl mieszaniny komórek/pożywki do 10 μl błękitu trypanowego.
    5. Wyjąć z opakowania szkiełko z komorą licznika komórek i dodać 10 μl mieszaniny komórek/pożywki/błękitu trypanowego z każdej strony szkiełka zliczającego. Włóż szkiełko do licznika komórek i określ gęstość komórek i żywotność.
    6. Korzystając z gęstości komórek, oblicz i dodaj odpowiednią objętość pożywki z komórek owadów (do 5 ml) do nowych, sterylnych kolb T25.
    7. Przenieść około 1-1,5 x 106 komórek do kolb T25 ze świeżą pożywką; oznaczyć kolby linią komórkową, datą, użytą pożywką, liczbą dodanych komórek i numerem pasażu (Pn + 1 pokolenie, gdzie Pn jest numerem pasażu dla poprzedniego pokolenia komórek); i umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 28 °C na czas do 72 godzin
      Uwaga: Komórki owadów mogą być rozmnażane w sposób ciągły, chociaż komórki mogą być mniej podatne na transfekcję i/lub ekspresję białek heterologicznych po 30 przejściach. Przed wyrzuceniem potraktuj wszystkie wyrzucone komórki/pożywki 10% roztworem wybielacza i autoklaw jednorazowe plastikowe naczynia.

3. Transfekcja komórek owadów

  1. Umieścić kolbę T25 z maksymalnie 1 x 10 6 komórek Tni lub Sf9 w odpowiednim podłożu dla komórek owadów (pożywka dla owadów niezawierająca surowicy dla Tni i TNM-FH dla Sf9) i rosnąć do zbiegu przez 72 godziny w temperaturze 28 °C.
  2. Usunąć i wyrzucić starą pożywkę i usunąć komórki za pomocą 4 ml świeżej pożywki dla owadów bez surowicy (patrz kroki 2.6.2 i 2.6.3 powyżej).
  3. Oszacuj gęstość komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz krok 2.6.4 powyżej).
  4. Dodać około 7 x 105 komórek do pojedynczych naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostawić komórki na 20-25 minut w temperaturze 28 °C.
  5. Do każdej transfekcji dodać 2 μg plazmidowego DNA (z jednego plazmidu w przypadku pojedynczych transfekcji lub 2 μg z każdego z dwóch plazmidów w przypadku podwójnej transfekcji) do 0,1 ml pożywki dla owadów bez surowicy (bez FBS zarówno dla transfekcji Sf9, jak i Tni) w sterylnej probówce do mikrofugowania o pojemności 1,5 ml.
  6. W osobnej probówce wymieszaj 8 μl odczynnika do transfekcji z 0,1 ml pożywki dla owadów bez surowicy, a następnie przenieś ten roztwór do probówki zawierającej plazmidowe DNA, które Cię interesuje. Lekko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 - 30 minut.
  7. Rozcieńczyć mieszaninę transfekcji plazmidu z etapów 3.5 i 3.6 0,8 ml pożywki dla owadów niezawierających surowicy, tak aby całkowita objętość wynosiła 1 ml.
  8. Ostrożnie wyjmij nośnik ze szklanych naczyń zawierających przyczepione komórki. Nałóż przyłączone komórki na rozcieńczoną pożywkę do transfekcji plazmidu.
  9. Inkubować komórki w temperaturze 28 °C przez 5 h.
    Uwaga: Warunki transfekcji wymagają empirycznej optymalizacji w celu uzyskania maksymalnej wydajności transfekcji (np. transfekcja przez noc zamiast 5 godzin, ilość użytego plazmidowego DNA, skład chemiczny użytego odczynnika do transfekcji itp.).
  10. Usunąć i wyrzucić pożywkę do transfekcji i delikatnie umyć komórki 1 ml pożywki dla owadów bez surowicy, uważając, aby nie usunąć komórek.
  11. Dodać 2 ml świeżej pożywki z komórek owadów (pożywki dla owadów bez surowicy dla Tni i TNM-FH dla Sf9) i inkubować w temperaturze 28 °C przez 48-72 godz.
    Uwaga: Ponownie, warunki wymagają empirycznej optymalizacji dla maksymalnej ekspresji białka heterologicznego.

4. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna

  1. Po 48-72 godzinach od transfekcji przemyj komórki raz 1 ml pożywki dla owadów IPL-41, a następnie przykryj 2 ml IPL-41 do obrazowania.
    Uwaga: Ten etap mycia zmniejsza autofluorescencję tła obserwowaną w przypadku pożywki z komórek owadów używanej do normalnej konserwacji komórek.
  2. Dodać 4 krople odczynnika do barwienia żywych komórek Hoechst (patrz tabela materiałów dla specyficznego barwnika jądrowego stosowanego w niniejszym protokole) do pożywki i inkubować w temperaturze 28 °C przez 20-25 min.
    Uwaga: Można zastąpić dodatkowe barwniki jądrowe, chociaż barwnik powinien mieć profil fluorescencyjny unikalny dla EGFP i mCherry.
  3. Umieść czaszę o średnicy 35 mm w samozamykającym się laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów dla konkretnego instrumentu używanego w tym protokole).
  4. Dostosuj mikroskop do warunków obserwacji Hoechst, EGFP i mCherry: wzbudzenie/emisja Hoechsta - 359/461 nm; wzbudzenie/emisja EGFP - 489/510 nm; mWzbudzenie/emisja wiśni - 580/610 nm.
  5. Wykonaj wstępne skanowanie przy użyciu obiektywu 10x, aby potwierdzić ekspresję fluorescencyjną, a następnie przełącz się w tryb skanowania za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie z kontrastem fazowym 60x.
  6. Dostosuj moc lasera (5-7%), czułość detektora (47-49%), prędkość skanowania, głębokość osi Z i zoom cyfrowy, aby zoptymalizować kontrast i rozdzielczość obrazu. Zobrazuj komórki z 1,5-krotnym zoomem cyfrowym, aby uzyskać łączne 90-krotne wzmocnienie.
    Uwaga: Parametry mikroskopu wymagają empirycznej regulacji w celu optymalnego zbierania obrazu i mogą być specyficzne dla używanego instrumentu.
  7. Eksportuj surowe dane jako pliki obrazów TIFF i modyfikuj (przycinaj i nakładaj) w celu wygenerowania figury.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OE-PCR

OE-PCR pozwala na syntezę chimerycznych produktów DNA, które po wprowadzeniu do wektora ekspresyjnego pozwalają na produkcję rekombinowanych białek chimerycznych odpowiadających dowolnemu testowemu genowi będącemu przedmiotem zainteresowania oraz białku markerowemu fluorescencyjnemu. Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat wytwarzania wektorów ekspresyjnych pIB zawierających sekwencje kodujące akwaporynę B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterologiczne systemy ekspresji białek są ważnymi narzędziami do produkcji białek rekombinowanych wykorzystywanych w licznych dalszych zastosowaniach4. Wybór spośród różnych dostępnych systemów ekspresji zależy od celu końcowego dla interesującego nas białka. Dostępnych jest kilka systemów ekspresji komórek owadów, które stanowią elastyczną alternatywę dla prokariotycznych i eukariotycznych systemów ekspresji komórek 5,6. Systemy owadzie,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Lynn Forlow-Jech i Dannialle LeRoy za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez podstawowe finansowanie CRIS dla USDA ARS, National Program 304 - Crop Protection and Quarantine [Project #2020-22620-022-00D] dla J.A.F. i J.J.H. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służy wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznacza rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Polimeraza DNA KODEMD Millipore71085-3Polimeraza DNA o wysokiej wierności stosowana do amplifikacji PCR PCR z amplifikacją rozszerzania nakładania się produktów PCR
Polimeraza DNA ExTaq Polimeraza DNATaKaRa-ClontechRR001Bstosowana do ogonowania A produktów PCR
EconoTaq PLUS ZIELONY 2x Polimeraza DNA Master MixLucigen30033-1Polimeraza DNA stosowana do PCR
kolonii bakteryjnychProfesjonalny termocykler gradientowyBiometra/LABRepCo070-851
Agaroza LEBenchmark ScientificA1705
SYBR Bezpieczne barwienie żelem DNAThermoFisherS33102
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA do montażuEMD MilliporeLSKGEL050
pIB/V5-His Zestaw do ekspresji TOPO TAThermoFisherK89020Zawiera składniki potrzebne do klonowania produktów PCR z rozszerzeniem nakładania się, w tym linearyzowany i aktywowany topoizomerazą wektor pIB / V5-His-TOPO, chemicznie kompetentny E. coli One Shot TOP10 i roztwór soli.
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
QIAcube Robotic WorkstationQiagen9001292
Purifier Vertical Clean BenchLabconco3970401
Allel linii komórek owadów z hodowlą TniBiotechABP-CEL-10005
Sf9 Allel linii komórek owadówBiotechABP-CEL-10002
Pożywka do hodowli owadów bez surowicyBiotechABP-MED-10002
TNM-FH Pożywka do hodowli owadówBiotechABP-MED-10001
IPL-41 Pożywka dla owadówThermoFisher11405081
Odczynnik do transfekcji Cellfectin IIThermoFisher10362100
16 cm Jednorazowe skrobaki do komórekSarstedt83.1832Cell skrobaki z ostrzem dwupozycyjnym
25 cm2 (T25) Kolby do hodowli tkankowych z nasadkami filtra odpowietrzającego Produktyz branży nauk przyrodniczychCT-229331
Pipety transferoweFisher1371120
sterylne, 50 ml Probówki do bioreakcjinauk przyrodniczychCT-229475
PipeBoyVWR14222-180
5 ml Serologiczne PipetySarstedt86.1253.001
0,5 ml probówki do PCR z płaską nasadkąFisher14230200
Polipropylenowe worki autoklawe BiohazardFisher01828C
35 mm #1,5 Naczynia ze szklanym dnemMatsunami GlassD35-14-1.5-UŚrednica czaszy 35 mm, średnica szkła 14 mm, grubość szkła 1,5 mm, niepowlekany
Inkubator, model 1510EVWR35823-961
Licznik komórek Countess II FLThermoFisherAMQAF1000
Szkiełka komory do liczenia komórek Countess z 0,4% odczynnikiem błękitu trypanowegoThermoFisherC10228
Fluoview FV10i-LIV Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyOlympusFV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plazmidowe DNAtransOMIC TechnologiesTCH1303
pmCherry VectorClontech632522
odczynnik NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605
Produkty dla

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Insect Cell TransfectionRecombinant Protein ExpressionFluorescent Protein TaggingConfocal Microscopy ImagingCellular Protein LocalizationSubcellular Marker ProteinsLive Cell ImagingPlasmid DNA TransfectionSerum Free Insect MediumGlass Bottom Dishes

Related Articles