Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

Streszczenie

Zawał mięśnia sercowego i następująca po nim kaskada niedokrwienna powodują rozległą utratę kardiomiocytów, prowadząc do zastoinowej niewydolności serca, głównej przyczyny śmiertelności na całym świecie. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecującą opcją dla terapii komórkowych, która może zastąpić obecne, inwazyjne techniki. MSCs mogą różnicować się w linie mezenchymalne, w tym typy komórek serca, ale nie osiągnięto jeszcze pełnego różnicowania w funkcjonalne komórki. Dotychczasowe metody różnicowania opierały się na środkach farmakologicznych lub czynnikach wzrostu. Jednak bardziej fizjologicznie istotne strategie mogą również umożliwić MSCs przejście transformacji kardiomiogennej. W tym artykule przedstawiono metodę różnicowania z wykorzystaniem agregatów MSC na warstwach zasilających kardiomiocyty w celu wytworzenia kurczących się komórek przypominających kardiomiocyty. Wykazano, że

Wykazano, że ludzkie komórki okołonaczyniowe pępowiny (HUCPVC) mają większy potencjał różnicowania niż powszechnie badane typy MSC, takie jak MSC szpiku kostnego (BMSC). Jako ontogenetycznie młodsze źródło, zbadaliśmy potencjał kardiomiogenny HUCPVC w pierwszym trymestrze ciąży (FTM) w porównaniu ze starszymi źródłami. HUCPVC FTM są nowym, bogatym źródłem MSC, które zachowują swoje właściwości immunouprzywilejowane w macicy podczas hodowli in vitro. Korzystając z tego protokołu różnicowania, FTM i term HUCPVC osiągnęły znacznie zwiększone różnicowanie kardiomiogenne w porównaniu z BMSC, na co wskazuje zwiększona ekspresja markerów kardiomiocytów (tj. czynnika wzmacniającego miocyty 2C, troponiny sercowej T, miozyny serca łańcucha ciężkiego, białka regulatorowego sygnału α i koneksyny 43). Utrzymywały również znacznie niższą immunogenność, o czym świadczy ich niższa ekspresja HLA-A i wyższa ekspresja HLA-G. Stosując różnicowanie oparte na agregatach, HUCPVC FTM wykazały zwiększony potencjał tworzenia agregatów i wygenerowały kurczące się klastry komórek w ciągu 1 tygodnia od kohodowli na warstwach zasilających serce, stając się pierwszym typem MSC, który tego dokonał.

Nasze wyniki pokazują, że ta strategia różnicowania może skutecznie wykorzystać kardiomiogenny potencjał młodych MSC, takich jak FTM HUCPVC, i sugeruje, że predyferencjacja in vitro może być potencjalną strategią zwiększenia ich skuteczności regeneracyjnej in vivo.

Wprowadzenie

Zastoinowa niewydolność serca (CHF) nadal jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Niewydolność serca często występuje w wyniku masywnej utraty kardiomiocytów i rozwoju bezkomórkowej tkanki bliznowatej jako patologiczny wynik zawału mięśnia sercowego (MI)1. Podczas gdy serce jest częściowo samoodnawiającym się narządem, rezydentna pula komórek macierzystych i progenitorowych odpowiedzialnych za regenerację tkanek znacznie zmniejsza się pod względem liczebności i funkcji u starszych pacjentów, często stając się niewystarczająca do optymalnego powrotu do zdrowia po urazie. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem eksperymentalnych metod leczenia, które polegają na przeszczepianiu zdrowych komórek dawcy do uszkodzonego mięśnia sercowego. Konieczne jest, aby komórki dawcy nie tylko odbudowały strukturę tkanki, ale także osiągnęły funkcjonalne odzyskanie dotkniętego mięśnia sercowego.

Rodzime serce wykorzystuje komórki macierzyste pochodzące z tkanki serca i endogennego szpiku kostnego do naprawy po urazie2,3,4. Komórki regeneracyjne – zarówno pochodzące od gospodarza, jak i dawcy – muszą mieć zdolność do uzyskania odpowiedniego fenotypu i funkcji w mikrośrodowisku przebudowywanego mięśnia sercowego, a także zdolność do skutecznego i bezpiecznego zastępowania utraconych komórek. Metody różnicowania in vitro są szeroko stosowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności produkcji kardiomiocytów opartej na komórkach macierzystych5,6. Profil ekspresji markerów linii serca służy do zdefiniowania procesu różnicowania komórek macierzystych w kierunku linii serca7. Wczesne markery różnicowania, takie jak NKX2.5, czynnik wzmacniający miocyty 2C (Mef2c) i GATA48,9, mogą wskazywać na inicjację procesu kardiomiogennego. Dojrzałe markery kardiomiocytów powszechnie stosowane do oceny skuteczności różnicowania to α białka regulatorowego sygnału (SIRPA)10, troponina sercowa T (cTnT)11, miozyna sercowa o ciężkim łańcuchu (MYH6)8,12,13 i connexin 43 (Cx43)14,15,16. Metody wykorzystujące embrionalne komórki macierzyste (ESC) i pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) zostały dokładnie zoptymalizowane i omówione pod kątem szczegółów czynników indukcyjnych, gradientów tlenu i składników odżywczych oraz dokładnego czasu działania5,6,7,17,18. Niemniej jednak technologie oparte na ESC i PSC nadal wiążą się z wieloma problemami etycznymi i bezpieczeństwa, a także z nieoptymalnymi cechami elektrofizjologicznymi i immunologicznymi19,20. Gospodarze, którym przeszczepiono te komórki, często doświadczają odrzucenia immunologicznego i wymagają trwałej immunosupresji. Wynika to głównie z niedopasowania cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) u gospodarza i dawcy oraz z wynikającej z tego odpowiedzi limfocytów T21. Podczas gdy indywidualne dopasowanie MHC klasy I jest możliwym rozwiązaniem, bardziej dostępna praktyka kliniczna wymagałaby źródła komórek, które jest powszechnie immunouprzywilejowane, aby przezwyciężyć problem odrzucenia.

Jako alternatywne źródło komórek do zastosowań klinicznych, MSC, a w szczególności BMSC, były badane pod kątem wykorzystania w regeneracji tkanek od czasu ich początkowego opisu w 1995 roku22. Uważa się, że MSCs są rezydentnymi komórkami regeneracyjnymi, które można znaleźć w prawie każdej unaczynionej tkance23. Po wyizolowaniu od pożądanego źródła, MSCs mogą być łatwo namnażane w hodowli, mają dużą pojemność parakrynną i często posiadają właściwości immunouprzywilejowane lub immunomodulujące24,25. Ich bezpieczeństwo i skuteczność zostały już wykazane w kilku badaniach przedklinicznych, w szczególności dotyczących regeneracji serca3,26.

Wiele strategii różnicowania MSC wykorzystuje środki farmakologiczne, takie jak 5-azacytydyna22 i DMSO27, oraz czynniki wzrostu lub morfogenne, takie jak BMPs5,7,28,29 lub angiotensyna II30, ze zmienną wydajnością. Strategie te nie opierają się jednak na przeszkodach, które naiwna komórka regeneracyjna może napotkać po naprowadzeniu lub dostarczeniu do miejsca uszkodzenia in vivo. Bardziej fizjologicznie istotne strategie, choć trudniejsze do zdefiniowania i manipulowania, opierają się na założeniu, że różnicowanie MSC może być indukowane przez sygnały z samego mikrośrodowiska tkankowego. Wcześniejsze badania wykazały, że narażenie na lizaty komórek serca 31 lub komorowy mięsień sercowy32,33, lub bezpośredni kontakt z pierwotnymi kardiomiocytami in vitro15,34, może zwiększyć ekspresję markerów sercowych w MSCs. Inni wykazali spontaniczną kardiomiogenezę po leczeniu urazów serca za pomocą MSCs35,36,37,38, chociaż częściowo, fuzja BMSC i kardiomiocytów39,40 wygenerował powstający mięsień sercowy. Zgodnie z naszą wiedzą, nie zgłoszono jeszcze funkcjonalnych, spontanicznie kurczących się kardiomiocytów z ludzkich MSC (hMSC) z jakiegokolwiek źródła tkankowego.

Obecny konsensus jest taki, że wszystkie MSCs powstają z komórek okołonaczyniowych23. Młode MSCs o właściwościach perycytów można wyizolować z obszaru okołonaczyniowego tkanki pępowiny człowieka41,42,43. W porównaniu z BMSC, HUCPVC mają zwiększony potencjał różnicowania i kilka innych zalet regeneracyjnych, zarówno in vitro41,44, jak i in vivo45,46,47. Warto zauważyć, że źródłem jest interfejs matka-płód, HUCPVC mają znacznie niższą immunogenność w porównaniu z dorosłymi źródłami MSC. Nasze badania koncentrują się na charakterystyce i przedklinicznych zastosowaniach HUCPVC FTM, najmłodszego badanego źródła MSC, które, jak wykazaliśmy wcześniej, mają zwiększoną proliferację i wyższą zdolność różnicowania wieloliniowego, w tym w linii kardiomiogennej41.

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy tworzenie agregatów i główne warstwy zasilające komórki serca jako siły indukcyjne, aby osiągnąć pełne kardiomiogenne różnicowanie MSC. Agregaty zapewniają środowisko 3D, które lepiej modeluje warunki in vivo w porównaniu do kultur przylegających do 2D. Wykorzystanie warstw zasilających serce zapewnia środowisko, które jest reprezentatywne dla ostatecznego miejsca przeszczepu dla MSC. Wykazaliśmy, że młodsze źródła MSC wyizolowane z pępowiny przed lub po urodzeniu mają większą zdolność do tworzenia agregatów i osiągania fenotypu serca w porównaniu z dorosłymi BMSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich przywilejów immunologicznych. Oprócz gwałtownego wzrostu genów markerowych linii serca i indukowanej ekspresji białek wewnątrzkomórkowych (tj. cTnT i MYH6) i powierzchniowych komórek (tj. SIRPA i Cx43) specyficznych dla kardiomiocytów, pokazujemy, że potencjał różnicowania HUCPVC FTM można wykorzystać tą metodą i że mogą one powodować spontanicznie kurczące się komórki podobne do kardiomiocytów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone i zgłoszone zgodnie z wytycznymi ARRIVE48. Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą instytucjonalnej komisji bioetycznej ds. badań naukowych (numer REB 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Uniwersytet w Toronto, Toronto, Kanada). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia (Toronto, Kanada), a wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (National Institutes of Health 2011).

1. Hodowla tkankowa

  1. Hodowle FTM HUCPVC, termin HUCPVC (wcześniej ustalone, n ≥ 3 niezależne linie dla każdego)42 i dostępne na rynku BMSC w pożywce o minimalnej ilości niezbędnej alfa (MEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% koktajlem penicyliny/streptomycyny (P/S). Hodowla pierwotnych kardiomiocytów szczurów i kokultur kardiomiocytów MSC w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM-F12) zawierająca 10% FBS i 1% P/S.
    UWAGA: Wysterylizuj pożywkę za pomocą filtra 0,2 μm. Przygotowane roztwory pożywki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.
  2. Utrzymuj hodowle komórkowe w nawilżonych inkubatorach (95% wilgotności względnej, 37 °C i 5% CO2 ) i pasaż przy zbieganiu 70-80%, określonym za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Stosować odpowiednie objętości pożywki do wielkości użytego naczynia do hodowli tkankowej (np. 10 ml w 10-centymetrowym naczyniu i 2 ml na dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej). Stosuj te warunki hodowli przez cały czas trwania protokołu.
  3. Dysocjować monowarstwy MSC do pasażu lub kohodowli MSC-kardiomiocytów za pomocą roztworu enzymu dysocjacyjnego (2 ml/dołek na płytce 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.
  4. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
  5. Odessać supernatant bez przerywania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej odpowiedniej do liczenia przy użyciu automatycznego licznika komórek. Zasiej komórki zgodnie z opisem w poniższych sekcjach protokołu.

2. Przygotowanie pierwotnych kardiomiocytów szczurów i kokultur MSC

  1. Uzyskaj tkankę serca do pierwotnej izolacji kardiomiocytów.
    1. Eutanazja szczeniąt szczurów (5-6 dni po porodzie) za pomocą uduszenia CO2 . Ustaw komory CO2 na 20% wymianę gazu (natężenie przepływu = 0,2 x objętość komory na minutę). Potwierdź wyjście przez brak odruchu szczypania.
    2. Usuń przedsionki z łączącymi je głównymi naczyniami krwionośnymi za pomocą wysterylizowanych narzędzi (np. kleszczy i zakrzywionych nożyczek)41. Przenieść serca do 50-mililitrowych probówek zawierających sterylny PBS z 1% P/S (PBS-P/S) na lodzie.
    3. Przeciąć komory na pół i pozwolić, aby krew wypłukała się w 10-centymetrowym naczyniu z 10 ml PBS-P/S na lodzie. Pokrój ściany komór na małe kawałki (średnica = 2-3 mm) za pomocą zakrzywionych nożyczek.
    4. Przenieś kawałki serca od 10-12 zwierząt do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej i pozwól im się uspokoić.
    5. Usuń jak najwięcej PBS-P/S bez usuwania jakichkolwiek kawałków serca. Dodać 10 ml nowego PBS-P/S.
  2. Trawić tkankę serca, aby wyizolować kardiomiocyty.
    1. Pozwól, aby kawałki serca opadły. Zastąp PBS-P/S 10 ml 0,15% trypsyny w PBS i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Odrzucić supernatant. Powtórzyć trawienie opisane w kroku 2.2.1 jeszcze trzy razy, ale zdekantować supernatanty do 50-mililitrowych probówek zbiorczych zawierających 10 ml 100% FBS.
  3. Odwirować komórki (400 x g, 5 min) i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S i wysiewać na 6-dołkowej płytce (1 x 105 komórek/cm2, 2 ml podłoża na studzienkę).
  4. Po upływie 1 godziny przenieść pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki do probówki o pojemności 50 ml i wyrzucić przyłączone komórki. Policz komórki w zawiesinie i ponownie umieść je na nowych płytkach 6-dołkowych (1 x 105 komórek/cm2, 2 ml DMEM-F12 zawierających 10% FBS i 1% P/S na studzienkę).
  5. Hamować proliferację komórek za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU).
    Uwaga: BrdU jest silnym teratogenem i podejrzewa się, że działa mutagennie. Przed użyciem upewnij się, że zapewniono odpowiednie szkolenie i zapoznaj się z kartą charakterystyki.
    1. Po przyczepieniu się komórek zastąp pożywkę w płytce 6-dołkowej DMEM-F12 zawierającą 10% FBS, 1% P/S (2 ml pożywki na dołek) i 5 μM BrdU. Inkubować przez 16 godzin (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Usuń pożywkę zawierającą BrdU i zastąp DMEM-F12 zawierającą 10% FBS i 1% P/S (2 ml pożywki na studzienkę).
  6. Przygotuj wstępnie wybarwione MSC.
    1. Gdy kultury MSC osiągną 70-80% zbieżności w 10-centymetrowych szalkach, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 3 ml roztworu dysocjacji komórek. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut.
    2. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.
    3. Odessać supernatant bez przerywania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S w celu zliczenia przy użyciu automatycznego licznika komórek.
    4. Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 106 MSC/ml DMEM-F12 zawierającego 10% FBS i 1% P/S.
    5. Inkubować MSCs z żywym, nieprzenoszalnym barwnikiem fluorescencyjnym (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2 ) w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml przez 1 godzinę.
    6. Odwirować probówki o stężeniu 400 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S dla stężenia komórek 1 x10,6 MSC/ml. Powtórz to w sumie 3 razy.
  7. Przenieść MSCs na kardiomiocyty (krok 2.5.2) w stężeniu 10 x 104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej.

3. Przygotowanie zbiorczych kokultur

  1. Przygotować jednokomórkową zawiesinę MSCs (2 x 104 komórki/ml pożywki, pasaż # ≤ 6) w alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS i 1% P/S (patrz krok 2.6).
    UWAGA: Patrz sekcja 1 protokołu, aby uzyskać informacje na temat pasażowania komórek. Alternatywnie, wstępnie zabarwić MSC zgodnie z krokiem 2.6.
  2. Zainicjuj tworzenie agregatu, umieszczając 25 μl kropli zawiesiny komórek (500 komórek) na wewnętrznej powierzchni pokrywek 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkankowych (do 50 kropli na pokrywkę). Umieścić pokrywki na ich dolnych odpowiednikach zawierających PBS-P/S. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Umieść 5-7 ml PBS-P/S w naczyniu hodowlanym poniżej wiszących kropli, aby uniknąć parowania kropli.
  3. Obserwuj tworzenie się agregatów w kroplach po 3 dniach za pomocą stereomikroskopu. Jeśli ponad 40 z 50 kropli zawiera uformowane agregaty, należy zebrać krople z pokrywek za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml i przenieść agregaty bezpośrednio na pierwotne monowarstwy kardiomiocytów szczura (przygotowane w krokach 2.1-2.7; 10 kropli/dołek). Należy unikać intensywnego pipetowania, aby zachować integralność kruszywa.
  4. Utrzymuj zagregowane kokultury w inkubatorach przez okres do 2 tygodni, zmieniając pełną objętość pożywki (2 ml DMEM-F12 zawierającej 10% FBS i 1% P/S na studzienkę) co 72 godziny.
    1. Codziennie obserwuj agregaty przyczepiające się do warstw komórek zasilających za pomocą mikroskopii jasnego pola. Rejestruj zagregowane kontrakty, gdy są obserwowane.
  5. Przygotowanie agregatów do analizy.
    1. Usuń pożywkę i dodaj 2 ml PBS na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Usunąć PBS i dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Wirować przy 400 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Zawiesić ponownie w podłożu, jak określono dla zastosowań opisanych w kolejnych krokach (patrz kroki 4.1, 5.1 i 6.1) i przepuścić przez sitko do komórek o średnicy 70 μm.

4. Cytometria przepływowa (FC) i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)

  1. Zawiesiny komórek inkubować (1 x 105 komórek w 200 μl PBS zawierającego 3% FBS) z pierwszorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem (FITC lub APC) (tj. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G i SIRPA dla FC lub TRA-1-85 dla FACS; 1:40) w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chroniąc przed światłem.
  2. Odwirować (400 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS z 3% FBS dla FC lub PBS z 0,5% FBS dla FACS.
    UWAGA: FC MSCs został zoptymalizowany przez Hong i wsp.41.
  3. Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności, aż będą gotowe do analizy przez FC (co najmniej 1 x 104 zdarzenia) lub FACS. Posortuj komórki zgodnie z opisem41. Ponownie płytkować TRA-1-85 wysoce dodatnie posortowane komórki na płytkach 6-dołkowych (1 x 104 komórki / dołek, 2 ml DMEM-F12 zawierające 10% FBS i 1% P / S) w ciągu 1 godziny
    UWAGA: Aby zapoznać się ze strategią bramkowania antygenu powierzchniowego komórek ludzkich TRA-1-85, patrz rysunek uzupełniający.

5. Immunocytochemia (ICC) i mikroskopia

  1. Zawiesiny komórkowe otrzymane z kokultur (krok 3.5.2) lub FACS (sekcja 4) należy ponownie umieścić na szkiełkach komorowych (1 x 104 komórki / dołek, 2 ml DMEM-F12 zawierające 10% FBS i 1% P / S na studzienkę). Pozwól komórkom przyczepić się na noc w inkubatorze do hodowli tkankowych (patrz sekcja 1, aby zapoznać się z warunkami).
  2. Utrwal komórki za pomocą 3 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy 3 ml PBS zawierającego 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA; PBS-BSA) przez 5 minut na pranie.
    Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  3. Przepuszczalność komórek w 3 ml PBS-BSA z 0,1% Triton X-100. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w przypadku antygenów wewnątrzkomórkowych (tj. alfa sarkomerycznej aktyniny (aSarc) i Cx43) lub 25 minut w przypadku antygenów wewnątrzjądrowych (tj. Mef2c i ludzkiego antygenu jądrowego (HuNu)). Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.
  4. Zablokuj próbki przed niespecyficznymi reakcjami przeciwciał za pomocą 3 ml PBS zawierającego 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i 1% BSA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.
  5. Inkubować komórki w pierwszorzędowych przeciwciałach (tj. Mef2c, aSarc, Cx43 i HuNu) rozcieńczonych w stosunku 1:200 w 3 ml PBS-BSA w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Przemyć 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.
  7. Przechowywać wybarwione próbki w 3 ml podłoża montażowego.
  8. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj obiektywu 10X (NA = 0,3) i obiektywu 20X (NA = 0,45) do obrazowania o mniejszym powiększeniu. Dla stosowanych przeciwciał drugorzędowych należy stosować kostki filtra fluorescencyjnego i długości fal dla GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) i RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) (patrz tabela materiałów i sprzętu).
  9. Określ ilościowo obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania (zalecane oprogramowanie znajduje się w Tabeli materiałów i sprzętu). Znormalizuj odczyty intensywności fluorescencji do wtórnych akwizycji kontrolnych.

6. Izolacja RNA i ilościowy RT-PCR

  1. Przygotować próbki RNA z niezróżnicowanych kultur MSC lub MSCs posortowanych z kokultur przy użyciu izolacji RNA opartej na kolumnach, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 1 x 104 do 1 x 106 komórek w 0,7 ml buforu do lizy komórek (dostarczonego z zestawem do izolacji RNA) na próbkę.
  2. Przygotuj cDNA z maksymalnie 2 μg RNA na 100 μl reakcji RT.
  3. Przeprowadzić qPCR przy użyciu 10 ng cDNA na reakcję (40 cykli, 60 °C wyżarzanie/rozszerzanie temperatury).
    1. Stosować startery dla ludzkich MY6H i cTnT w stężeniu 500 nM i 1-100 ng cDNA na reakcję (patrz Tabela materiałów i sprzętu). Użyj GAPDH, ACTB i HPRT jako wewnętrznych normalizatorów sprzątania. Stosować dostępne na rynku indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych jako kontrolę pozytywną.
      UWAGA: Wyraź zmianę krotności ekspresji w porównaniu z niezróżnicowanymi próbkami cDNA pochodzącymi z MSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

HUCPVCs wykazują wyższy potencjał tworzenia agregatów i poziomy ekspresji CD49f w porównaniu do BMSCs:

Aby indukowć różnicowanie hMSC (tj. FTM HUCPVCs, term HUCPVCs oraz BMSCs), zawiesiny pojedynczych niezróżnicowanych komórek MSC lub krople wiszące zawierające MSC (Table 1) przeniesiono na monowarstwy pierwotnych kardiomiocytów szczura w celu utworzenia odpowiednio bezpośrednich współh...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Różnicowanie komórek macierzystych serca jest rozwijane od ponad 2 dekad, przy czym do generowania komórek podobnych do kardiomiocytów ze źródeł MSC stosuje się kilka różnych strategii. Wiele z tych strategii jest jednak nieskutecznych, a stosowane warunki często nie są reprezentatywne dla środowiska, z którym przeszczepiane komórki stykają się in vivo.

W przeciwieństwie do istniejących metod, przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje kombinację pierwotnych warstw zasilających serce i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Clifford L. Librach jest współposiadaczem patentu: Metody izolacji i wykorzystania komórek pochodzących z tkanki pępowinowej pierwszego trymestru, przyznanego w Kanadzie i Australii.

Podziękowania

Autorzy dziękują następującym pracownikom i pracownikom naukowym za ich wkład: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg i Andrée Gauthier-Fisher. Prace te były wspierane przez The Ontario Research Fund - Research Excellence (ORF-RE, Round #7) oraz CReATe Program Inc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% Trypsyna / EDTAGibco25200056Do dysocjacji komórek
Alpha-MEMGibco12571071Do pożywek hodowlanych HUCPVC i BMSC.
Przeciwciało anty-ludzkie/mysie CD49f sprzężone z PEBiolegend313612Marker integrynowy dla
FC Sprzężone z APC ludzkie przeciwciało Cx43 / GJA1R& D SystemsFAB7737Amarker Connexin 43 dla
przeciwciała HLA-A2 sprzężonego z FC FITCGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Marker immunogenności dla
przeciwciała anty-HLA-HLA-G [MEM-G/9] sprzężonego z FITCABCAMAB7904Marker immunogenności dla
mysiego przeciwciała antyludzkiego SIRPA/CD172a skoniugowanego z FC FITCAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FMarker sercowy dla
ludzkiego przeciwciała TRA-1-1-85/CD147 sprzężonego z FC APCR& D SystemsFAB3195AMarker komórek ludzkich dla
ludzkiego przeciwciała TRA-1-85 / CD147 sprzężonego z FC i FACS FITCR& D SystemsFAB3195FMarker komórek ludzkich dla przeciwciała
antykoneksynowego 43 / GJA1Abcamab11370Cx43. Dla
wtórnego ICC Goat anty-króliczego IgG (H + L) wchłoniętego krzyżowo, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Dla przeciwciała ICC
Anty-sarkomerycznej alfa aktyniny [EA-53]Abcamab9465aSARC. Dla
wtórnego ICC Goat anty-mysiego łańcucha ciężkiego IgM wchłoniętego krzyżowo, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426królika ICC
Mef2C (D80C1) XPNew England BioLabs Ltd.5030SDla
przeciwciała wtórnego ICC Donkey anty-króliczego IgG (H + L), Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Dla przeciwciała ICC
Anti-nuclei (HuNu) (klon 235-1)EMD MilliporeMAB1281Dla ICC
MZ9.5 StereomikroskopLeicaDo agregacji obrazowania.
1,5 ml mikroprobówki wirówkoweAxygenMCT-150-CDo barwienia MSCs barwnikiem fluorescencyjnym.
ImageJOprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym.
Aria II Placówka BDUHN SickKids FC. Do sortowania komórek.
Szpik kostny, mezechomalne komórki zręboweLonzaPT-2501BMSCs,
albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7030-100G, BSA. Aby przygotować roztwory dla ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Uwaga: BrdU jest silnym teratogenem i podejrzewa się działanie mutagenne. Przed użyciem upewnij się, że jesteś odpowiednio przeszkolony i zapoznaj się z kartą charakterystyki.
Obiekt Canto IIBDUHN SickKids FC. Do cytometrii przepływowej.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570Do przygotowania cDNA do qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Obrazowanie fluorescencyjne cytoplazmy komórkowej
Countess automatyczny licznik komórekInvitrogen Inc.C10227Do zliczania komórek
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Do pierwotnej pożywki hodowli kardiomiocytów szczurów.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGibcofirmy Dulbecco 10010023D-PBS, bez Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesWłasny mikroskop fluorescencyjny
FACSCaliburBDIn-house. Do cytometrii przepływowej.
Płodowa surowica bydlęca (Hyclon)GE HealthcareSH3039603FBS. Składnik pożywki do hodowli komórkowych.
Sondy IDT Prime Time qPCRZintegrowane technologie danychFAM fluoroforhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision Wodne medium montażowe PermaFluorThermoScientificTA-030-FMDo przechowywania komórek, które mają zostać poddane ICC
LSR II Placówka BDUHN SickKids FC. Do cytometrii przepływowej.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. Do sortowania komórek.
Normalna surowica koziaTechnologia sygnalizacji komórkowej5425SNGS. Stosowany w roztworze blokującym do ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-dołkowyThermo Scientific Nunc155409Do przygotowania próbek do ICC
OmniPur Triton X-100 SurfaktantEMD Millipore9410-OPJako składnik roztworu przepuszczalnego podczas przygotowywania komórek do
ICC Paraformaldehyd, 16% roztwór, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710Do mocowania komórek do ICC.
Penicylina/streptomycynaGibco15140122Składnik pożywki do hodowli komórkowych.
StarterySigmaNiestandardowe standardowe oligonukleotydy DNA, odsolone, 0,2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Kardiomiocyty pochodzące z komórek hiPSReproCellRCD001NKontrola pozytywna dla qPCR
RNeasy mini kitQiagen74106Do izolacji RNA do qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Do qPCR z mieszanką główną
RPMI 1640GibcoA1049101Do MSC, pożywka do kohodowli monocytów.
Testy starterowe TaqMan qPCRThermo Fisher Scientific4444556Dla qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Barwienie komórek pod kątem żywotności i liczenia
TrypsynaGibco272500108Do dysocjacji komórek
MocPerkin-ElmerVolocity 6.3Oprogramowanie do obrazowania
0,2 i mu; m filtr porowyThermo Fisher Scientific566-0020Do sterylizacji pożywek do hodowli
tkankowych HERAcell 150i Inkubator CO2Thermo Fisher Scientific51026410Do inkubacji komórek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu
KleszczeAlmedic7727- A10-704Do podawania serca szczura. Można użyć dowolnych podobnych kleszczy.
NożyczkiFine Science Tools14059-11Do mielenia serca szczura. Zalecane zakrzywione nożyczki.
Probówka 50 mlBD Falcon352070Do pobierania podczas pobierania kardiomiocytów i ogólnych procedur hodowli tkanek
Probówka 15 mlBD Falcon352096Do ogólnych procedur hodowli tkanek
Płytki 6-dołkoweThermo Scientific NuncCA73520-906Do hodowli tkankowych
10 cm Naczynia do hodowli tkankowychCorning25382-428Do formowania agregatów
Mikroskop Axiovert 40CZeissDo obrazowania w jasnym polu przez naszą hodowlę tkankową i resztę protokołu
70 μ m Sitkokomórkowe Fisherbrand22363548Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki przed cytometrią przepływową lub sortowaniem
Triton X-100EMD Millipore9410-1LStosowany w roztworze przepuszczalnym dla ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Bejca stosowanego podczas wizualizacji lokalizacji Cx43
, FC i FACS przeciwciała przeciwciała Dla przeciwciała , , ,

Bibliografia

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie kardiomiocytówformowanie agregatówkardiologiczne warstwy komórek pokarmowychcytometria przepływowamikroskopia fluorescencyjnamarkery kardiomiocytówróżnicowanie HUCPVCocena immunogennościkurczące się klastry komórek
In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.