Zoptymalizowany protokół ekstrakcji białek z ludzkiej zastawki mitralnej

Summary

Skład białkowy ludzkiej zastawki mitralnej jest nadal częściowo nieznany, ponieważ jego analiza jest skomplikowana przez niską komórkowość, a tym samym niską biosyntezę białek. Praca ta zapewnia protokół do efektywnej ekstrakcji białka do analizy proteomu zastawki mitralnej.

Abstract

Analiza proteomu komórkowego może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób dzięki rozwojowi technologii, które pozwalają na identyfikację i kwantyfikację białek obecnych w złożonych systemach biologicznych. Wiedza uzyskana dzięki podejściu proteomicznemu może potencjalnie doprowadzić do lepszego zrozumienia mechanizmów patogennych leżących u podstaw chorób, co pozwoli na identyfikację nowych markerów diagnostycznych i prognostycznych chorób oraz, miejmy nadzieję, celów terapeutycznych. Jednak zastawka mitralna serca stanowi bardzo trudną próbkę do analizy proteomicznej ze względu na niską komórkowość proteoglikanów i macierzy zewnątrzkomórkowej wzbogaconej kolagenem. To sprawia, że ekstrakcja białek do globalnej analizy proteomicznej jest trudna. W tej pracy opisano protokół, który jest zgodny z późniejszą analizą białek, taką jak proteomika ilościowa i immunoblotting. Może to pozwolić na korelację danych dotyczących ekspresji białek z danymi dotyczącymi ilościowej ekspresji mRNA i nieilościowej analizy immunohistochemicznej. Rzeczywiście, podejścia te, jeśli zostaną przeprowadzone razem, doprowadzą do bardziej wszechstronnego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw chorób, od mRNA po potranslacyjną modyfikację białek. W związku z tym metoda ta może być istotna dla naukowców zainteresowanych badaniem fizjopatologii zastawek serca.

Introduction

Ostatnie dowody zmieniły rozumienie ról wielu mechanizmów regulacyjnych, które zachodzą po syntezie mRNA. Rzeczywiście, procesy translacyjne, potranskrypcyjne i proteolityczne mogą regulować obfitość i funkcję białek. Dogmat – który mówi, że stężenia mRNA są wskaźnikami zastępczymi odpowiednich białek, zakładając, że poziomy transkryptów są głównym wyznacznikiem obfitości białek – został częściowo zrewidowany. Rzeczywiście, poziomy transkryptów tylko częściowo przewidują obfitość białek, co sugeruje, że zdarzenia potranskrypcyjne zachodzą w celu regulacji białek w komórkach^1,2.

Ponadto, białka ostatecznie dyktują funkcję komórki, a tym samym dyktują jej fenotyp, który może ulegać dynamicznym zmianom w odpowiedzi na czynniki autokrynne, parakrynne i endokrynne, mediatory przenoszone przez krew, temperaturę, leczenie farmakologiczne i rozwój choroby. W związku z tym analiza ekspresji skoncentrowana na poziomie białka jest przydatna do scharakteryzowania proteomu i rozwikłania krytycznych zmian, które zachodzą w nim w ramach patogenezy choroby³.

Dlatego możliwości, jakie stwarza proteomika w celu wyjaśnienia warunków zdrowotnych i chorobowych, są ogromne, pomimo istniejących wyzwań technologicznych. Szczególnie obiecujące obszary badań, do których może przyczynić się proteomika, obejmują: identyfikację zmienionej ekspresji białek na dowolnym poziomie (tj. całych komórek lub tkanek, przedziałów subkomórkowych i płynów biologicznych); identyfikację, weryfikację i walidację nowych biomarkerów przydatnych w diagnozowaniu i prognozowaniu choroby; oraz, miejmy nadzieję, identyfikacja nowych celów białkowych, które mogą być wykorzystane do celów terapeutycznych, a także do oceny skuteczności i toksyczności leków⁴.

Uchwycenie złożoności proteomu stanowi wyzwanie technologiczne. Obecne narzędzia proteomiczne dają możliwość przeprowadzania wielkoskalowych, wysokoprzepustowych analiz w celu identyfikacji, kwantyfikacji i walidacji zmienionych poziomów białek. Ponadto wprowadzenie technik frakcjonowania i wzbogacania, mających na celu uniknięcie zakłóceń powodowanych przez białka najliczniej występujące, również poprawiło identyfikację białek poprzez włączenie białek najobficiej występujących. Wreszcie, proteomika została uzupełniona o analizę modyfikacji potranslacyjnych, które stopniowo stają się ważnymi modulatorami funkcji białek.

Jednak przygotowanie próbki i odzyskiwanie białek w analizowanych próbkach biologicznych nadal pozostaje etapem ograniczającym w przepływie pracy proteomicznej i zwiększa potencjał możliwych pułapek⁵. Rzeczywiście, w większości technik biologii molekularnej, które muszą zostać zoptymalizowane, pierwszymi krokami są homogenizacja tkanek i liza komórek, zwłaszcza podczas analizy białek o niskiej liczebności, dla których nie istnieją metody amplifikacji. Ponadto chemiczna natura białek może wpływać na ich własną regenerację. Na przykład analiza białek o wysokiej hydrofobowości jest bardzo trudna, ponieważ łatwo wytrącają się one podczas ogniskowania izoelektrycznego, podczas gdy białka transbłonowe są prawie nierozpuszczalne (przegląd w Piśmiennictwie 5). Co więcej, zmienność składu tkanek stanowi istotną barierę dla opracowania uniwersalnej metody ekstrakcji. Wreszcie, ponieważ prawie wszystkie próbki kliniczne mają ograniczoną ilość, konieczne jest umożliwienie przygotowania białka z maksymalnym odzyskiem i odtwarzalnością przy minimalnych ilościach próbki⁶.

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół ekstrakcji białka z normalnej ludzkiej zastawki mitralnej serca, która stanowi bardzo trudną próbkę do analizy proteomicznej. Prawidłowa zastawka mitralna jest złożoną strukturą leżącą między lewym przedsionkiem a lewą komorą serca (Ryc. 1). Odgrywa ważną rolę w kontroli przepływu krwi z przedsionka do komory, zapobiegając cofaniu się i zapewniając prawidłowy poziom dopływu tlenu do całego organizmu, utrzymując tym samym odpowiedni rzut serca. Jednak często uważa się, że jest to tkanka "nieaktywna", o niskiej komórkowości i niewielu składnikach, głównie w macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzieje się tak, ponieważ w normalnych warunkach rezydentne zastawkowe komórki śródmiąższowe (VIC) prezentują fenotyp spoczynkowy o niskim tempie biosyntezy białek⁷.

Wykazano jednak, że w stanie patologicznym liczba VIC w gąbczastym wzrasta i aktywowana jest ich synteza białek, wraz z innymi zmianami funkcjonalnymi i fenotypowymi⁸. Nic więc dziwnego, że minimalne dane dostępne w literaturze koncentrują się na analizie patologicznych zastawek mitralnych ^9,10, w których zwiększona liczba aktywowanych VIC może wyjaśniać stosunkowo dużą liczbę zidentyfikowanych białek.

Podsumowując, obecny protokół może służyć do pogłębienia zrozumienia mechanizmów patogennych odpowiedzialnych za choroby zastawki mitralnej poprzez badanie składników białkowych zastawki mitralnej. Rzeczywiście, lepsze zrozumienie leżących u podstaw procesów patologicznych może pomóc w poprawie leczenia klinicznego chorób zastawek, których obecne wskazania do interwencji są w dużej mierze oparte na rozważaniach hemodynamicznych.

Protocol

W tym protokole, ludzkie serca są pobierane podczas eksplantacji wielonarządowej (czas zimnego niedokrwienia 4-12 h, średnio 6 ± 2 h) od dawców wielonarządowych wykluczonych z transplantacji narządów z przyczyn technicznych lub funkcjonalnych, pomimo normalnych parametrów echokardiograficznych. Są one wysyłane do Banku Tkanek Sercowo-Naczyniowych w Mediolanie, Centrum Kardiologicznego Monzino (Mediolan, Włochy) w celu bankowania zastawek aortalnych i płucnych. Płatki zastawki mitralnej tylnej nie są wykorzystywane do celów klinicznych, dlatego pobiera się je podczas izolacji zastawki aortalnej i płucnej po uzyskaniu świadomej zgody krewnych dawców. Tkanki do przeszczepu i badań są pobierane wyłącznie za zgodą rodziców; w karcie zgody, zezwalają (lub nie) na wykorzystanie tkanki serca do badań tylko wtedy, gdy nie nadaje się ona do użytku klinicznego u ludzi (tj. problemy mikrobiologiczne, funkcjonalne i serologiczne), zgodnie z wytycznymi komisji etycznej Centrum Kardiologicznego Monzino.

1. Przygotowanie zastawki mitralnej

1. Zbierz ludzką zastawkę mitralną tak szybko, jak to możliwe po eksplantacji narządów (czas zimnego niedokrwienia 4-12 godzin).
2. W pomieszczeniu czystym wyjąć serce z torby transportowej zawierającej zimny (4 °C) roztwór (tj. roztwór soli fizjologicznej lub zbilansowane podłoże Eurocollins lub Wisconsin). Włóż go do wiadra i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego (pionowy przepływ powietrza o zagrożeniu biologicznym, klasa A, klasyfikacja Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP)), aby przystąpić do przygotowania zaworu.
3. Umieść serce na sterylnej jednorazowej serwety w szafce. Za pomocą sterylnego jednorazowego skalpela należy przeciąć serce całkowicie, prostopadle do jego osi głównej, na poziomie lewej i prawej komory, w odległości około 4 cm od wierzchołka.
4. Przesuń aortę wstępującą i tętnicę płucną, aby wyświetlić dach lewego przedsionka.
5. Za pomocą sterylnych kleszczyków i kilofów, które można sterylizować w autoklawie, przeciąć wokół lewej małżowiny usznej na lewym dachu przedsionka, uwidaczniając zastawkę mitralną i umożliwiając identyfikację dużej płatka mitralnego (przedniej) i małej płatka mitralnego (tylnej).
   UWAGA: Spoidła przednio-boczne i tylne przyśrodkowe wyznaczają granicę przedniego płatka i tylnego obszaru.
6. Za pomocą sterylnych nożyczek do sterylizacji w autoklawie i nieurazowych kleszczy należy rozciąć lewy przedsionek i grubość ściany komory na całym obwodzie całej zastawki mitralnej.
7. Zidentyfikuj ciągłość mitro-aortalnej zastawki.
   UWAGA: Lewa komora zawiera całą zastawkę mitralną i cięciwy.
8. Oddziel przednią płatkę zastawki mitralnej od tylnej płatki zastawki mitralnej, przecinając tylną płatkę wzdłuż przyczepu z komorą (spoidło).
9. Umyj tylną ulotkę w roztworze soli fizjologicznej. Pokrój ulotkę na małe kawałki (<1 cm²) i pojedynczo zawiń je w folię aluminiową. Zamroź je ciekłym azotem.
   Ostrzeżenie: Podczas korzystania z ciekłego azotu należy przestrzegać organizacyjnych procedur bezpieczeństwa.
   1. Pod koniec zabiegu zdezynfekuj stół szafki 70% roztworem alkoholu izopropylowego i 6% roztworem nadtlenku wodoru.

2. Ekstrakcja białka

1. Za pomocą kleszczy podnieś próbkę przechowywaną w ciekłym azocie i natychmiast umieść ją na suchym lodzie, nadal owinięta w folię aluminiową. Nie pozostawiać próbki do rozmrożenia podczas przenoszenia.
2. Przed mieleniem schłodzić moździerz porcelanowo-cyrkonowy i tłuczki systemu młynka (np. CryoGrinder) wraz z próbką, umieszczając je w kolbie Dewara zawierającej ciekły azot (~500 ml).
   Ostrzeżenie: Podczas korzystania z ciekłego azotu należy przestrzegać organizacyjnych procedur bezpieczeństwa.
3. Umieść moździerz i tłuczki w styropianowym pudełku zawierającym suchy lód. Wyjmij próbkę z folii aluminiowej i włóż ją do moździerza.
4. Zmiel próbkę dużym tłuczkiem o moździerz 15-20 razy, używając śrubokręta do obracania tłuczka. Wymieszać próbkę z końcówką wstępnie schłodzonej szpatułki podczas procesu mielenia.
   1. Powtórz z małym tłuczkiem.
5. Przenieś zmieloną próbkę do wcześniej zważonej probówki (np. probówki wirówkowej o pojemności 15 ml), odwracając probówkę, umieszczając ją nad zaprawą i odwracając je razem, aby przenieść próbkę do probówki. Użyj wstępnie schłodzonej szpatułki, aby odzyskać cały materiał z zaprawy.
   1. Probówkę z próbką należy przechowywać na suchym lodzie, aby uniknąć rozmrożenia próbki podczas przenoszenia.
6. Obliczyć masę netto próbki.
7. Oczyścić moździerz i tłuczki po każdej próbce i odkazić je poprzez autoklawowanie lub podgrzewanie w temperaturze 200 °C przez 2 godziny.
8. Przenieść sproszkowaną próbkę z probówki wirówkowej do szklanej probówki homogenizatora przez odwrócenie.
9. Dodać przefiltrowany bufor mocznikowy (8 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% w/v CHAPS, 20 mM Tris i 55 mM ditiotreitol) do szklanej probówki, 200 μl buforu mocznikowego na każde 10 mg sproszkowanej tkanki.
   UWAGA: Pozostałą sproszkowaną próbkę pozostawioną w probówce wirówkowej można odzyskać, wykorzystując część obliczonej objętości buforu mocznikowego.
10. Homogenizować próbkę za pomocą mieszadła wyposażonego w moździerz ze szkła borokrzemianowego i tłuczek z politetrafluoroetylenu (PTFE). Powoli dociśnij tłuczek do próbki ruchem obrotowym (1 500 obr./min) 10 razy.
11. Odzyskać supernatant i przenieść go do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml. Ponownie ekstrahować pozostałą próbkę świeżym buforem mocznikowym, dodając połowę objętości użytej podczas pierwszej ekstrakcji.
12. Powtórz krok 2.10.
13. Odzyskać supernatant i połączyć go z supernatantem z kroku 2.11. Umieścić połączony supernatant na rotatorze probówkowym na 30 minut.
14. Odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze 13 000 x g i temperaturze 4 °C.
15. Odzyskać supernatant i zmierzyć stężenie białka za pomocą testu białkowego Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

Results

Ekstrakcja i rozpuszczanie białek w buforze mocznika jest bezpośrednio kompatybilne z metodami proteomiki opartymi na izoelektrofokusowaniu (elektroforeza dwuwymiarowa (2-DE)¹¹ i izoelektrofokusiowanie w fazie ciekłej (IEF)¹²) i immunoblotting po rozcieńczeniu w buforze Laemmli¹³ zawierającym koktajl inhibitorów proteaz¹⁴.

W przypadku...

Discussion

Jednym z krytycznych etapów tego protokołu jest użycie ciekłego azotu do zamrożenia próbki i schłodzenia systemu mielenia. Stosowanie ciekłego azotu zapobiega degradacji biologicznej i pozwala na efektywne sproszkowanie, ale wymaga specjalnego przeszkolenia w zakresie bezpiecznej obsługi.

W tym protokole zastosowano system młynka do mielenia próbek, ponieważ małe próbki są trudne do odzyskania ze standardowego moździerza i tłuczków. W tym przypadku małe próbki rozprowadzają się w postaci drobn...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór			fizjologicznej 0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Zrównoważona pożywka transportowa narządu. Połączyć 400 ml Eurocollins A ze 100 ml Eurocollins B, aby uzyskać zrównoważoną pożywkę Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Zrównoważona pożywka transportowa narządów. Połącz 400 ml Eurocollins A ze 100 ml Eurocollins B, aby uzyskać zrównoważoną pożywkę Eurocollins
Wisconsin	Żywotność mostka	RM/N 4081	Zrównoważone podłoże do transportu narządów
Zagrożenie biologiczne przepływ pionowy powietrza	Burdinola		klasa A Klasyfikacja GMP Dewar
Flask	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
System kriomłynka	Diagnostyka OPS	CG 08-01	System młynka zawierający moździerze, tłuczki i śrubokręt
Kleszcze
nierdzewnej Szpatułka
Jednorazowy sterylny skalpel	Medisafe	MS-10
Nożyczki			Autoklawowalne
Wykitiery			Autoklawowalne
Jednorazowa sterylna serwetka	Mon& Tex	3.307.08
Roztwór sterylizujący z alkoholem			70% alkohol izopropylowy
Roztwór sterylizujący z nadtlenkiem			6% Nadtlenek wodoru
Mikropipeta, 1 mL, z końcówkami
Probówki wirówkowe 15 ml	VWR international	9278
1,7 ml	VWR International	PIER90410
Bufor			8 M mocznik, 2 M tiomocznik, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Ditiotreitol
Mocznik	Sigma aldrich	U6504-1KG	Do stosowania jako Bufor mocznikowy
Tiomocznik	Sigma aldrich	T8656	Do stosowania jako Bufor mocznikowy
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Do stosowania jako Bufor mocznikowy
Ditiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Do stosowania do buforu mocznikowego
Strzykawka 50 ml			Do stosowania do filtrowania buforu mocznika
0,22 i mikro; m filtr	Millipore	SLGP033RB	Do stosowania do filtrowania Bufor mocznikowy
PFTE Tłuczek, 2 ml	Kartell	6302	Część homogenizatora Potter-Elvehjem
Moździerz ze szkła borokrzemianowego	Kartell	6102	Część homogenizatora Potter-Elvehjem
Mieszadło	VELP scientifica	Mieszadło DLH	Do stosowania do homogenizacji metodą Potter-Elvehjem
Bradford Test białka	Laboratoria Bio-Rad	5000006
Rotator rurowy	Pbi International	F205
Ciekły azot
Folia
Lód
Pudełko
Wirówka
			Do wirowania probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml przy 13 000 x g
Zamrażarka -80° C
Autoklaw
wagi
Rękawice kriogeniczne do ciekłego azotu
Rękawice
Profesjonalna wentylacja wymuszona i piec			Do sterylizacji
Koktajl inhibitora proteazy	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X roztwór
Zestaw do wytrącania białek ProteoExtract	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	wersja 2.7	Platforma oprogramowania do analizy ontologii genów
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	wersja 3.0.3	Wtyczka do analizy ontologii genów
Przeciwciało AlphaB Crystallin/CRYAB	Novus Biologicals	NBP1-97494	Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko
przeciwciału CryAB Septin-11	Novus Biologicals	NBP1-83824	Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko septynie-11
Przeciwciało FHL1	Novus Biologicals	NBP-188745	Przeciwciało poliklonalne królika przeciwko przeciwciału Dermatopontyny FHL-1
	Novus Biologicals	NB110-68135	Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko dermatopontynie
Koza Anty mysie IgG HRP	Sigma aldrich	A4416-0,5ML	Przeciwciało drugorzędowe do immunoblottingu
Koza Anty królik IgG HRP	Bio-Rad laboratories	170-5046	Przeciwciało drugorzędowe do immunoblottingu