Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Summary

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Abstract

Użycie genetycznie modyfikowanych myszy znacząco przyczyniło się do badań nad zarówno fizjologicznymi, jak i patologicznymi procesami in vivo. Wstrzyknięcie przedjądrowe konstruktów ekspresji DNA do zapłodnionych oocytów pozostaje najczęściej stosowaną techniką generowania myszy transgenicznych pod kątem nadekspresji. Wraz z wprowadzeniem technologii CRISPR do celowania w geny, wstrzyknięcie projądrka do zapłodnionych oocytów zostało rozszerzone na pokolenie myszy zarówno knockout, jak i knockin. W pracy opisano przygotowanie DNA do iniekcji oraz generowanie przewodników CRISPR do celowania w geny, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości. Procedury genotypowania wymagane do identyfikacji potencjalnych założycieli mają kluczowe znaczenie. W artykule przedstawiono innowacyjne strategie genotypowania, które wykorzystują możliwości "multipleksowania" CRISPR. Przedstawiono również zabiegi chirurgiczne. Razem, etapy protokołu pozwolą na generowanie genetycznie modyfikowanych myszy, a następnie na tworzenie kolonii myszy dla wielu dziedzin badań, w tym immunologii, neurobiologii, raka, fizjologii, rozwoju i innych.

Introduction

Modele zwierzęce, zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców, odegrały kluczową rolę w badaniu patofizjologii ludzkich schorzeń, takich jak choroba Alzheimera^1,2. Są one również nieocenionymi narzędziami do poszukiwania modyfikatorów choroby i ostatecznie do opracowywania nowych strategii leczenia w nadziei na wyleczenie. Chociaż każdy model ma swoje ograniczenia, wykorzystanie zwierząt jako całych modeli systemowych ma kluczowe znaczenie dla badań biomedycznych. Dzieje się tak, ponieważ metaboliczne i złożone środowisko fizjologiczne nie może być całkowicie symulowane w hodowli tkankowej.

Protocol

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu Nowej Południowej Walii.

1. Przygotowanie transgenu (integracja losowa)

1. Analityczna elektroforeza w żelu agarozowym.
   1. Trawić plazmid w celu wycięcia transgenu za pomocą odpowiednich enzymów (1 godzinna inkubacja) lub enzymów szybko trawionych (inkubacja trwająca od 15 do 30 minut) w termocyklerze zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Rysunek 2A i jego legenda).
   2. Odleć 1% żel agarozowy z kwasem tris-octanu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TEA), barwiony 0....

Results

Poniżej opisano przebieg pracy dla mikroiniekcji w przypadku losowej integracji i celowania genów za pośrednictwem CRISPR (Rysunek 1).

Rysunek 1: Typowy przebieg pracy dla pokolenia genetycznie zmodyfikowanych myszy. W celu losowej integracji, oczyszczony transgen jest wstrzykiwany do przedjądrza z.......

Discussion

Krytyczne kroki w ramach protokołu

Wiadomo, że pokolenie genetycznie modyfikowanych myszy jest wyzwaniem technicznym. Jednak przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowaną i uproszczoną metodą, która pozwala opanować i rozwiązać problem z techniką w rekordowo krótkim czasie. Do pomyślnego zakończenia techniki niezbędne są dwa kroki. Po pierwsze, syntezę liniowych matryc DNA (do syntezy sgRNA) można osiągnąć bez chlorku magnezu (MgCl₂). Jednak zdecydowanie zaleca się systematyczne do.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikropipeta 0,1-2,5 μ L	Eppendorf	4920000016
Mikropipeta 2 - 20 szt.; L	Eppendorf	4920000040
Mikropipeta 20 - 200 szt.; L	Eppendorf	4920000067
Mikropipeta 100 - 1 000 μ L	Eppendorf	4920000083
Marker masy cząsteczkowej	Bioline	BIO-33025	HyperLadder 1 kb
Marker masy cząsteczkowej	Bioline	BIO-33056	HyperLadder 100 bp
Agaroza	Bioline	BIO-41025
Bufor EDTA	Sigma-Aldrich	93296	10x - Rozcieńczony do 1x
bromku etydyny	Thermo Fisher Scientific	15585011
SYBR Bezpieczna bejca żelowa	Invitrogen	S33102
Zestaw do ekstrakcji żelu	Qiagen	28706
Zestaw do oczyszczania PCR (Qiaquick)	Qiagen	28106
System próżniowy (kolektor)	Promega	A7231
Bufor do mikroiniekcji bez nukleazy	Millipore	MR-095-10F
Ultrafree-MC	Millipore	UFC30GV00
Cas9 mRNA	Sigma-Aldrich	CAS9MRNA
plazmid eksprymujący CRISPR (px330)	Addgene	42230
Woda wolna od nukleaz	Polimeraza Phusion Sigma-Aldrich	W4502
	New England Biolabs	M0530L
T7 Szybki zestaw RNA o wysokiej wydajności	New England Biolabs	E2050S
Kolumny wirowe do oczyszczania RNA (NucAway)	Thermo Fisher Scientific	AM10070
ssOligos	Sigma-Aldrich	OLIGO STANDARD
Plazmid dawcy	Thermo Fisher Scientific	GeneArt
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H3884
Pożywka do hodowli zarodków KSOMaa	Zenith Biotech	ZEKS-100
Olej mineralny	Zenith Biotech	ZSCO-100
M2 Medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cytochalazyna B	Sigma-Aldrich	C6762
Ustnik	Sigma-Aldrich	A5177
Mikrokapilary	szklane Sutter Instrument	BF100-78-10
Aplikacja Proteinaza K		A3830.0100
Kleszcze Dumont #5	Narzędzia naukowe	91150-20
Nożyczki do tęczówki	Narzędzia do nauki pięknej	91460-11
Zacisk do naczyń	Fine Science Tools	18374-43
Klipsy do nawijania	Narzędzia naukowe	12040-01
Aplikator klipsów	Narzędzia naukowe	12018-12
Mikronożyczki	Narzędzia naukowe	15000-03
Kauteryzator	Narzędzia do nauki pięknej	18000-00
Niewchłanialne nici chirurgiczne (Ethilon 3-0)	Ethicon	1691H
5% inkubator CO2	MG Scientific	Galaxy 14S
Spektrofotometr	Thermo Fisher Scientific	Nanodrop 2000c
Thermocycler	Eppendorf	6321 000.515
Konfiguracja elektroforezy	BioRad	1640300
Oświetlacz UV	BioRad	1708110EDU
Termocykler	Eppendorf	6334000069
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZX7
Mikroskop odwrócony	Olympus	IX71
2x Mikromanipulatory	Eppendorf	5188000.012
Oocyty manipulator	Eppendorf	5176000.025
Mikrowtryskiwacz (Femtojet)	Eppendorf	5247000.013
Myszy szczep C57BL/6J	Australian BioResources	C57BL/6JAusb