Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

21K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55765

⸱

15 czerwca 2017

 , 
1Transgenic Animal Unit, Mark Wainwright Analytical Centre, University of New South Wales

W tym artykule

Podsumowanie

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Streszczenie

Użycie genetycznie modyfikowanych myszy znacząco przyczyniło się do badań nad zarówno fizjologicznymi, jak i patologicznymi procesami in vivo. Wstrzyknięcie przedjądrowe konstruktów ekspresji DNA do zapłodnionych oocytów pozostaje najczęściej stosowaną techniką generowania myszy transgenicznych pod kątem nadekspresji. Wraz z wprowadzeniem technologii CRISPR do celowania w geny, wstrzyknięcie projądrka do zapłodnionych oocytów zostało rozszerzone na pokolenie myszy zarówno knockout, jak i knockin. W pracy opisano przygotowanie DNA do iniekcji oraz generowanie przewodników CRISPR do celowania w geny, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości. Procedury genotypowania wymagane do identyfikacji potencjalnych założycieli mają kluczowe znaczenie. W artykule przedstawiono innowacyjne strategie genotypowania, które wykorzystują możliwości "multipleksowania" CRISPR. Przedstawiono również zabiegi chirurgiczne. Razem, etapy protokołu pozwolą na generowanie genetycznie modyfikowanych myszy, a następnie na tworzenie kolonii myszy dla wielu dziedzin badań, w tym immunologii, neurobiologii, raka, fizjologii, rozwoju i innych.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce, zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców, odegrały kluczową rolę w badaniu patofizjologii ludzkich schorzeń, takich jak choroba Alzheimera1,2. Są one również nieocenionymi narzędziami do poszukiwania modyfikatorów choroby i ostatecznie do opracowywania nowych strategii leczenia w nadziei na wyleczenie. Chociaż każdy model ma swoje ograniczenia, wykorzystanie zwierząt jako całych modeli systemowych ma kluczowe znaczenie dla badań biomedycznych. Dzieje się tak, ponieważ metaboliczne i złożone środowisko fizjologiczne nie może być całkowicie symulowane w hodowli tkankowej.

Do tej pory mysz pozostaje najczęściej używanym gatunkiem ssaków do manipulacji genetycznych, ponieważ ma kilka zalet. Procesy fizjologiczne i geny związane z chorobami są wysoce konserwatywne między myszami a ludźmi. Mysz była pierwszym ssakiem, u którego zsekwencjonowano pełny genom (2002), rok przed genomem człowieka (2003). Oprócz tego bogactwa informacji genetycznej, mysz ma dobre zdolności rozrodcze, szybki cykl rozwojowy (6 tygodni od zapłodnienia do odsadzenia) i rozsądny rozmiar. Wszystkie te zalety, w połączeniu ze wskaźnikami fizjologicznymi, takimi jak wyraźne kolory sierści (wymagane w strategiach krzyżowania), sprawiły, że mysz stała się atrakcyjnym modelem do manipulacji genetycznych. Warto zauważyć, że w bardzo wczesnym wieku nowoczesnej genetyki Gregor Mendel rozpoczął pracę na myszach, zanim przeniósł się do plants3.

Techniki transferu genów doprowadziły do stworzenia pierwszej transgenicznej myszy ponad trzy dekady temu4, początkowo stworzonej przy użyciu dostarczania wirusa. Jednak naukowcy szybko zdali sobie sprawę, że jednym z głównych wyzwań transgenezy myszy jest niezdolność do kontrolowania losu egzogennego DNA. Ze względu na to, że wirusowe dostarczanie transgenów do oocytów myszy skutkowało powstawaniem wielu kopii losowo zintegrowanych z genomem, możliwość ustanowienia kolejnych linii transgenicznych była ograniczona.

Jedno z takich ograniczeń zostało przezwyciężone, gdy Gordon i in. stworzyli pierwszą transgeniczną linię myszy metodą mikroiniekcji5,6. W ten sposób rozpoczęła się era technologii rekombinacji DNA, a parametry wpływające na wynik sesji mikroiniekcji były szeroko badane7. Chociaż mikroiniekcja nie pozwala na kontrolę nad miejscem integracji transgenu (co ostatecznie skutkuje określonymi poziomami ekspresji dla każdej myszy założycielskiej), główną zaletą mikroiniekcji projądrowej pozostaje tworzenie konkamerów (tj. tablic wielu kopii transgenu, połączonych szeregowo) przed integracją genomową5. Ta cecha była wykorzystywana przez lata do ustanowienia tysięcy transgenicznych linii myszy, które nadmiernie eksprymują interesujący nas gen. Od tego czasu transgeneza, sztuczna modyfikacja genomu organizmu, jest szeroko stosowana do identyfikacji roli pojedynczych genów w występowaniu chorób.

Kolejnym kluczowym osiągnięciem w manipulowaniu genomem myszy było skuteczne uszkodzenie pojedynczego genu u myszy, otwierając erę celowania w geny8. Jednak szybko pojawiły się poważne wady celowania genów opartych na komórkach ES, w tym wyzwania związane z hodowlą komórek ES, nieco zmienny stopień chimeryzmu i długość procesu (tj. minimum 12-18 miesięcy do uzyskania myszy).

Ostatnio, postępy w nowych technologiach, takich jak inżynieryjne endonukleazy (np. nukleazy palca cynkowego (ZFN), nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) i zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR/Cas9)) pojawiły się jako alternatywne metody przyspieszania procesu celowania genów u myszy9,10. Te endonukleazy można łatwo wstrzyknąć do oocytów myszy za pomocą mikroiniekcji, co pozwala na wytworzenie myszy ukierunkowanych na gen w ciągu zaledwie 6 tygodni.

Od czasu pierwszego raportu na temat wykorzystania CRISPR do edycji genomu11, ten bakteryjny adaptacyjny system odpornościowy zastąpił ZFN i TALEN ze względu na swoje liczne zalety, w tym łatwość syntezy i możliwość celowania w wiele loci jednocześnie (określane jako "multipleksowanie"). CRISPR został po raz pierwszy użyty do celowania w geny u myszy12 i od tego czasu został zastosowany do niezliczonych gatunków, od roślin po ludzi13,14. Do tej pory nie ma doniesień o ani jednym gatunku odpornym na edycję genomu CRISPR.

Dwa główne etapy ograniczające tworzenie transgenicznych myszy to wstrzykiwanie oocytów i reimplantacja tych oocytów samicom pseudo-ciężarnym. Chociaż technika ta została opisana przez nas15 i inni16, ostatnie ulepszenia techniczne w embriologii myszy i technikach transferu genów zrewolucjonizowały proces generowania genetycznie modyfikowanych myszy. Ulepszenia te zostaną opisane w niniejszym dokumencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu Nowej Południowej Walii.

1. Przygotowanie transgenu (integracja losowa)

  1. Analityczna elektroforeza w żelu agarozowym.
    1. Trawić plazmid w celu wycięcia transgenu za pomocą odpowiednich enzymów (1 godzinna inkubacja) lub enzymów szybko trawionych (inkubacja trwająca od 15 do 30 minut) w termocyklerze zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Rysunek 2A i jego legenda).
    2. Odleć 1% żel agarozowy z kwasem tris-octanu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (TEA), barwiony 0,5-1,0 μg/ml bromku etydyny (EtBr).
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas korzystania z EtBr; Jest to silny mutagen. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (patrz karta charakterystyki).
    3. Załaduj marker o masie cząsteczkowej 1 kb.
    4. Załaduj zlinearyzowane fragmenty (tj. transgen i szkielet).
    5. Uruchomić elektroforezę przy napięciu 100 V na 45 minut.
    6. Wizualizuj żel na transiluminatorze ultrafioletowym (UV), aby sprawdzić, czy trawienie zostało zakończone i potwierdzić prawidłowy rozmiar transgenu (tj. 7 338 pz; patrz Rysunek 2A).
  2. Preparatywna elektroforeza w żelu agarozowym.
    1. Odlać 1% żel agarozowy TAE zabarwiony barwnikiem żelowym o niskiej toksyczności. Załadować 8 podwielokrotności (po 1 μg każdy) zlinearyzowanego transgenu bez markera masy cząsteczkowej i uruchomić elektroforezę przy napięciu 100 V przez 45 minut. Użyj skalpela, aby wyciąć wszystkie 8 prążków odpowiadających zlinearyzowanemu transgenowi.
    2. Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela materiałów).
      1. Rozpuść fragmenty żelu w temperaturze 50 °C w probówkach o pojemności 1,5 ml przez co najmniej 15 minut. Wytnij je izopropanolem, a następnie dodaj bufor wiążący.
      2. Połącz całe DNA, pipetując je wszystkie do jednej kolumny. Eluować do wolnego od nukleaz buforu do mikroiniekcji (8 mM Tris-HCl i 0,15 mM EDTA). Przefiltrować przez filtr mikrowirówkowy 0,22 μm i wirować przez 60 s przy 12 000 x g.
    3. Zmierzyć stężenie i jakość DNA za pomocą spektrofotometru. Sprawdź, czy stosunek A260/A280 wynosi około 1,8 (tj. brak zanieczyszczenia białkami), a stosunek A260/A230 wynosi co najmniej 2,0 (tj. brak zanieczyszczenia rozpuszczalnikami organicznymi). Rozcieńczyć do 3 ng/μl w beznukleazowym buforze do mikroiniekcji, podwielokrotność (20-50 μl) i zamrozić w temperaturze -20 °C.

2. Synteza komponentów CRISPR (celowanie genów)

  1. mRNA Cas9.
    1. Rozcieńczyć mRNA Cas9 (uzyskane ze źródła komercyjnego, patrz tabela materiałów) do stężenia 1 μg/μl w beznukleazowym buforze do mikroiniekcji.
    2. Podwielokrotność w 2 μl i zamrozić w temperaturze -80 °C.
  2. Jednoprzewodnikowy RNA (SgRNA).
    1. Zidentyfikuj pożądane sekwencje genomowe (przewodniki) z dwoma celami za pomocą narzędzia do projektowania obliczeniowego, które pozwala na minimalną potencjalną aktywność poza celem17.
      1. Do nokautu genu należy systematycznie wybierać dwa przewodniki znajdujące się w odległości kilkuset par zasad (bp) od siebie, w przeciwnych kierunkach, i dołączyć kodon start interesującego genu. Aby uzyskać bezpośrednią naprawę homologii, wybierz dwie nakładające się prowadnice (jeśli to możliwe) w przeciwnych kierunkach.
        UWAGA: Na przykład, poniższe przewodniki zostały ostatnio z powodzeniem wstrzyknięte w celu zakłócenia pierwszego eksonu genu TPM4.2:
        Przewodnik 1: 5' CGCCATCCAGTTCGCGCTGC 3';
        Przewodnik 2: 5' CAGAACGATTGAGCTATGGC 3'
    2. Zamów zestaw podkładów zgodnie z opisem w Tabeli 1.
    3. Zsyntetyzuj liniową matrycę DNA.
      1. Rozcieńczyć plazmid px33012 do 10 ng/μL w wodzie wolnej od nukleaz.
      2. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie ze wskazaniami w tabeli 1. Na końcu dodaj polimerazę i trzymaj mieszankę wzorcową na lodzie.
      3. Wymieszaj i podziel to na 8 probówek PCR (19 μl/probówkę). Dodać 1 μl px330 na probówkę i uruchomić PCR w następujących warunkach: 1 min w temperaturze 98 °C; 40 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 64 °C przez 30 s i 72 °C przez 15 s; i końcowe wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      4. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz tabela materiałów), kolektora i źródła próżni (w celu szybszego przetwarzania). Zastosuj maksymalną siłę podciśnienia (tj. 8 mbar).
        1. Dodać 5 objętości (100 μl) buforu wiążącego do 1 objętości próbki PCR i wymieszać.
        2. Umieść (dostarczoną) kolumnę wirującą z membraną krzemionkową w (dostarczonej) probówce zbiorczej o pojemności 2 ml do odwirowania lub na kolektorze do przetwarzania próżniowego. Aby związać DNA, należy kolejno umieścić wszystkie 8 próbek w kolumnie i odkurzyć lub odwirować przez 60 s przy 12 000 x g dla każdego ładunku.
        3. Aby przepłukać, dodać 0,75 ml buforu płuczącego (bufor PE) do kolumny i odkurzać lub odwirowywać przez 60 s przy 12 000 x g. Odwirować kolumnę przez 60 s przy 12 000 x g w celu usunięcia pozostałości etanolu.
        4. Umieść kolumnę w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Aby wymyć DNA, dodaj 30 μl wody wolnej od nukleaz do środka błony, pozostaw kolumnę na 1 minutę i odwiruj przez 60 s przy 12 000 g.
      5. Zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru; zazwyczaj stężenie powinno wynosić 100 ng/μl lub więcej. Sprawdź, czy stosunek A260/A280 wynosi około 1,8 (tj. brak zanieczyszczenia białkami), a stosunek A260/A230 wynosi co najmniej 2,0 (tj. brak zanieczyszczenia rozpuszczalnikami organicznymi).
    4. Transkrypcja in vitro przy użyciu zestawu do syntezy RNA T7.
      1. Przygotować mieszankę wzorcową, jak wskazano w tabeli 1, i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w termocyklerze. Dodać 28 μl wody wolnej od nukleaz i 2 μl DNazy I i inkubować przez kolejne 15 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze.
    5. Oczyszczanie RNA za pomocą kolumn wirowych.
      1. Rozpuścić proszek zawarty w dostarczonej kolumnie wirowej w 650 μl buforu do mikroiniekcji bez nukleaz, ostrożnie usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza. Zakryj probówkę i nawilżaj przez 5 - 15 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Zdejmij niebieską nasadkę na dole i umieść kolumnę w probówce o pojemności 2 ml. Wirować przez 2 minuty w temperaturze 750 x g i temperaturze pokojowej. Umieść kolumnę w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml i nałóż kroplami 50 μl roztworu RNA do środka, nie dotykając ścianki kolumny. Obracaj kolumnę przez 2 minuty przy 750 x g.
      3. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (typowa wydajność jednej reakcji to 30 - 50 μg). Sprawdź, czy stosunek A260/A280 wynosi około 2,0 (tj. brak zanieczyszczenia białkami), a stosunek A260/A230 wynosi co najmniej 2,0 (tj. brak zanieczyszczenia rozpuszczalnikami organicznymi). Przechowywać sgRNA w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      4. Oceń jakość RNA za pomocą 1% żeli TAE rutynowo stosowanych do elektroforezy DNA. Uruchom równolegle 200-400 ng matrycy DNA i odpowiadającego jej sgRNA. Prążek RNA (≈ 100 pz) powinien być nieco większy niż prążek DNA (patrz Rysunek 3A).

3. Szablon dawcy

  1. Zamów komercyjnie syntetyzowane jednoniciowe oligonukleotydy (ssOligos, patrz tabela materiałów) do mutacji punktowych lub do integracji małych sekwencji do 50 pz; ramiona homologii mają zwykle długość 60-90 pz.
  2. W przypadku większych insercji użyj plazmidu dawcy jako szablonu. Wygeneruj odpowiedni plazmid przy użyciu klasycznej metody klonowania lub syntezy de novo ze źródła komercyjnego.
    UWAGA: Zalecane jest minimum 800 pz na ramię homologii. Wielkość szkieletu nie ma wpływu na skuteczność bezpośredniej naprawy homologii (HDR).

4. Mieszanka iniekcyjna

  1. Rozcieńczyć mRNA Cas9 do 50 ng / μl i sgRNA do 12,5 ng / μL (łącznie 25 ng / μL) za pomocą buforu mikroiniekcyjnego bez nukleaz do eksperymentów z nokautem genów. Dodać matrycę dawcy (ssOligo lub plazmid) w stężeniu 200 ng/μL do eksperymentów edycji genomu opartych na bezpośredniej naprawie homologii.
    UWAGA: Objętości rozcieńczenia można łatwo określić za pomocą narzędzi online, takich jak kalkulator ponownego zaparcia18.
  2. Każdą porcję należy przechowywać na lodzie podczas sesji mikroiniekcji, a następnie wyrzucić (nie zamrażać ponownie mieszanki do wstrzykiwań).

5. Wazektomia moszny

UWAGA: Dwa rodzaje wazektomii są powszechnie wykonywane u myszy: brzuszna i mosznowa. Ten drugi jest mniej inwazyjny i został już wcześniej opisany jako 15.

  1. Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.
  2. Określ masę myszy za pomocą wagi i znieczul samce przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) ze środkami znieczulającymi do wstrzykiwań (ketamina 100 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
  3. Monitoruj utratę odruchu szczypania palców u stóp, a gdy mysz zostanie uspokojona, umieść ją na poduszce grzewczej.
  4. Zdezynfekuj skórę wokół jąder naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna i 70% etanol.
  5. Wepchnij jądra do worka mosznowego i wykonaj nacięcie skóry skalpelem.
  6. Wizualizuj jądro, ogon najądrza i nasieniowód
    7. .
  7. Chwyć nasieniowody kleszczami, przytrzymaj je i kauteryzuj po obu stronach kleszczy, aby usunąć 3 mm nasieniowodów.
  8. Wykonaj tę samą procedurę na drugim jądrze.
  9. Zamknij nacięcia skóry klipsami do ran i uważnie monitoruj mysz aż do pełnego wyzdrowienia.

6. Superowulacja (dawcy oocytów) i krycie czasowe (kobiety w ciąży rzekomej)

UWAGA: Technika generowania odpowiedniej liczby zapłodnionych oocytów i zatkanych przybranych samic do reimplantacji została opisana gdzie indziej15.

  1. Wstrzyknąć 10 samicom i.p. 5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG; w 100 μl) około godziny 12 w dniu 1.
  2. Wstrzyknąć samicom i.p. 5 j.m. ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG; w 100 μl) 46-48 godzin później (około 11 rano w 3 dniu).
  3. Natychmiast kojarz samice z samcami trzymanymi samotnie przez noc.

7. Zastrzyki projądrowe (losowa integracja) i cytoplazmatyczne (celowanie w geny)

  1. Usuń myszy z superowulacją przez zwichnięcie szyjki macicy, odsłoń brzuch i uzyskaj dostęp do jajników i jajowodów, jak opisano wcześniej15. Rozwiń jajowody i zbierz kompleksy wzgórko-oocytów (COC) pod stereomikorskopem15. Umieść je w kropli pożywki optymalizacyjnej potasu simplex uzupełnionej aminokwasami (KSOMaa) zgodnie z tradycyjną metodą15.
  2. Oczyść oocyty, dodając około 1 μl hialuronidazy (10 mg/ml) do kropli pożywki KSOMaa za pomocą ustnika aspiratora i umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C / 5% CO2 na 30 s do 1 minuty.
  3. Umyj oocyty 4 świeżymi kroplami pożywki KSOMaa za pomocą ustnika aspiratora i przenieś je do ostatniej kropli pożywki KSOMaa pokrytej olejem mineralnym (około 2 ml). Umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C / 5% CO2 do momentu, aż oocyty będą gotowe do wstrzyknięcia.
  4. Wstrzyknięcie projądrkowe (całkowanie losowe).
    1. Wizualizuj jaja pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś około 50 jaj do komory iniekcyjnej (kropla pożywki M2 pokryta olejem mineralnym) za pomocą ustnika aspiratora.
    2. Przenieść komorę iniekcyjną do mikroskopu odwróconego i wstrzyknąć zapłodnione oocyty (dwa widoczne przedjądrza) kilkoma pikolitrami mieszanki iniekcyjnej, celując w przedjądrze (można celować w dowolne z przedjądrzy). Wyobraź sobie udane wstrzyknięcie, obserwując obrzęk przedjądrza.
  5. Wstrzyknięcie cytoplazmatyczne (celowanie w geny).
    1. Przenieść około 50 jaj do kropli KSOMaa zawierającej 5 μg/ml cytochalazyny B za pomocą ustnika i inkubować przez 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C / 5% CO2 .
    2. Przenieść jaja do komory iniekcyjnej za pomocą ustnika.
    3. Wstrzyknąć kilka pikolitrów mieszanki iniekcyjnej do cytoplazmy pod bardzo niskim ciśnieniem (50-100 hPa), używając w miarę możliwości ciśnienia kompensacyjnego automatycznego mikrowstrzykiwacza.
    4. Po wstrzyknięciu przenieś oocyty z powrotem do kropli KSOMaa (za pomocą ustnika) i trzymaj je w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 do momentu załadowania do reimplantacji do jajowodu samic w rzekomej ciąży.

8. Reimplantacja

  1. Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych ze stali nierdzewnej.
  2. Określ masę ciała myszy za pomocą wagi i znieczul samice przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) ze środkami znieczulającymi do wstrzykiwań (ketamina 100 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
  3. Monitoruj utratę odruchu szczypania palców u stóp, a gdy mysz zostanie uspokojona, umieść ją na poduszce grzewczej.
  4. Przytnij duży obszar futra wokół grzbietowej linii środkowej samicy myszy.
  5. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę naprzemiennymi chusteczkami z miejscowym środkiem antyseptycznym, takim jak chlorheksydyna i 70% etanol.
  6. Odsłoń układ rozrodczy zgodnie z tradycyjną metodą15. Wykonaj nacięcie skóry o długości 1 cm równolegle do grzbietowej linii środkowej, przetnij mięsień i chwyć poduszeczkę tłuszczową kleszczami, a następnie delikatnie wyciągnij jajnik, aż przyczepiony do niego jajowód i macica będą wyraźnie widoczne.
  7. Zamocuj poduszeczkę tłuszczową za pomocą zacisku do naczyń. Wizualizuj jajowód pod mikroskopem stereoskopowym i za pomocą mikronożyczek wykonaj nacięcie w ścianie jajowodu kilka milimetrów przed bańką.
  8. Pod mikroskopem stereoskopowym załaduj 25 mikroiniekowanych jaj do szklanej kapilary połączonej z ustnikiem (wewnętrzna średnica kapilary powinna mieć około 120 μm szerokości). Wprowadź szklaną kapilarnę do jajowodu i wydal, aż pęcherzyk powietrza będzie widoczny wewnątrz bańki.
  9. Delikatnie usuń szklaną naczynkę i umieść układ rozrodczy z powrotem w jamie brzusznej. Zszyj nacięcie niewchłanialnymi szwami chirurgicznymi 3-0, a następnie zamknij klipsami do ran. Uważnie monitoruj mysz aż do pełnego odzyskania sprawności.

9. Strategie genotypowania/sekwencjonowanie

UWAGA: Wyizoluj genomowe DNA z 2-milimetrowych biopsji ogona lub ucha, przestrzegając odpowiednich przepisów etyki zwierząt.

  1. Szybka ekstrakcja genomowego DNA (integracja losowa).
    1. Lizować próbki tkanek (~2 mm) w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę w 100 μl alkalicznego odczynnika do lizy (25 mM wodorotlenku sodu i 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    2. Dodać 100 μl odczynnika neutralizującego (40 mM Tris-HCl, pH = 5).
    3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 g i temperaturze 4 °C.
  2. Wysokiej jakości ekstrakcja genomowego DNA (celowanie genowe).
    1. Dodać 500 μl buforu ogonowego (50 mM Tris, pH = 8; 100 mM EDTA, pH = 8; 100 mM NaCl; 1% SDS i 0,5 mg/ml proteinazy K, świeżo dodanej).
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 55 °C.
    3. Mieszaj przez 5 minut, odwracając (nie wiruj).
    4. Dodać 250 μl nasyconego NaCl (6 M) i mieszać przez 5 minut, odwracając (nie wirować).
    5. Wirować przez 5-10 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C, a następnie wlać supernatant do nowej probówki.
    6. Dodać 500 μl izopropanolu i mieszać przez 5 minut, odwracając (nie wirować).
    7. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze pokojowej.
    8. Zdekantować supernatant (osad jest niewidoczny i przykleja się do probówki).
    9. Umyć 1 ml 70% etanolu.
    10. Wirować przez 5-10 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze pokojowej. Usunąć sklarowany osad ostrożnie, ponieważ biała osadka nie jest już lepka i może zostać utracona.
    11. Suszyć na powietrzu przez ~1 godzinę.
    12. Dodać 400 μl buforu TE (10 mM Tris i 1 mM EDTA, pH = 8).
    13. Rozpuścić DNA w temperaturze 55–60 °C przez 2 godziny.
  3. Projekt podkładu.
    1. Projektuj podkłady o długości co najmniej 20 pz za pomocą narzędzia obliczeniowego19.
      UWAGA: W przypadku integracji losowej startery powinny hybrydyzować z transgenem, generując wyraźny fragment o wartości 200-800 pz. W przypadku celowania w geny zaprojektuj startery tak, aby hybrydyzowały z genomowym DNA, generując wyraźny fragment o długości kilkuset pz wokół miejsc cięcia. W przypadku dużych insercji, startery mogą znajdować się na transgenie, ale potwierdzenie docelowej integracji powinno być następnie wykonane za pomocą chodzenia startera lub podobnej techniki.
  4. Genotypowanie metodą PCR.
    1. Dla każdej modyfikacji genomu zaprojektuj nowy protokół PCR i przetestuj go empirycznie. Weź pod uwagę długość wygenerowanego fragmentu i temperaturę topnienia (Tm) każdej pary starterów.
  5. Sekwencjonowanie.
    1. W przypadku celowania genowego wyślij produkty PCR do dostawcy usług sekwencjonowania Sanger.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej opisano schematy postępowania dla mikroiniekcji w przypadku integracji losowej oraz celowanego wprowadzania genów za pomocą metody CRISPR (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w ramach protokołu

Wiadomo, że pokolenie genetycznie modyfikowanych myszy jest wyzwaniem technicznym. Jednak przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowaną i uproszczoną metodą, która pozwala opanować i rozwiązać problem z techniką w rekordowo krótkim czasie. Do pomyślnego zakończenia techniki niezbędne są dwa kroki. Po pierwsze, syntezę liniowych matryc DNA (do syntezy sgRNA) można osiągnąć bez chlorku magnezu (MgCl2). Jednak zdecydowanie zaleca się systematyczne do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy świadczą akademickie usługi transgenezy u myszy za pośrednictwem Centrum Analitycznego Marka Wainwrighta Uniwersytetu Nowej Południowej Walii.

Podziękowania

Autorzy dziękują personelowi ośrodka dla zwierząt (BRC) za ich nieustające wsparcie. Praca ta została sfinansowana przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych oraz Australijską Radę ds. Badań Naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikropipeta 0,1-2,5 μ LEppendorf4920000016
Mikropipeta 2 - 20 szt.; LEppendorf4920000040
Mikropipeta 20 - 200 szt.; LEppendorf4920000067
Mikropipeta 100 - 1 000 μ LEppendorf4920000083
Marker masy cząsteczkowej BiolineBIO-33025HyperLadder 1 kb
Marker masy cząsteczkowej BiolineBIO-33056HyperLadder 100 bp
AgarozaBiolineBIO-41025
Bufor EDTASigma-Aldrich9329610x - Rozcieńczony do 1x
bromku etydynyThermo Fisher Scientific15585011
SYBR Bezpieczna bejca żelowaInvitrogenS33102
Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen28706
Zestaw do oczyszczania PCR (Qiaquick)Qiagen28106
System próżniowy (kolektor)PromegaA7231
Bufor do mikroiniekcji bez nukleazy MilliporeMR-095-10F
Ultrafree-MC MilliporeUFC30GV00
Cas9 mRNASigma-AldrichCAS9MRNA
plazmid eksprymujący CRISPR (px330)Addgene42230
Woda wolna od nukleazPolimeraza Phusion Sigma-AldrichW4502
New England BiolabsM0530L
T7 Szybki zestaw RNA o wysokiej wydajnościNew England BiolabsE2050S
Kolumny wirowe do oczyszczania RNA (NucAway)Thermo Fisher ScientificAM10070
ssOligosSigma-AldrichOLIGO STANDARD
Plazmid dawcyThermo Fisher ScientificGeneArt
HialuronidazaSigma-AldrichH3884
Pożywka do hodowli zarodków KSOMaaZenith Biotech ZEKS-100
Olej mineralnyZenith Biotech ZSCO-100
M2 MediumSigma-AldrichM7167
Cytochalazyna BSigma-AldrichC6762
UstnikSigma-AldrichA5177
Mikrokapilaryszklane Sutter InstrumentBF100-78-10
Aplikacja Proteinaza KA3830.0100
Kleszcze Dumont #5Narzędzia naukowe 91150-20
Nożyczki do tęczówkiNarzędzia do nauki pięknej 91460-11
Zacisk do naczyńFine Science Tools 18374-43
Klipsy do nawijania Narzędzia naukowe 12040-01
Aplikator klipsów Narzędzia naukowe 12018-12
Mikronożyczki Narzędzia naukowe 15000-03
KauteryzatorNarzędzia do nauki pięknej 18000-00
Niewchłanialne nici chirurgiczne (Ethilon 3-0)Ethicon1691H
5% inkubator CO2MG ScientificGalaxy 14S
SpektrofotometrThermo Fisher ScientificNanodrop 2000c
ThermocyclerEppendorf6321 000.515
Konfiguracja elektroforezyBioRad1640300
Oświetlacz UVBioRad1708110EDU
TermocyklerEppendorf6334000069
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX7
Mikroskop odwróconyOlympusIX71
2x MikromanipulatoryEppendorf5188000.012
Oocyty manipulatorEppendorf5176000.025
Mikrowtryskiwacz (Femtojet)Eppendorf5247000.013
Myszy szczep C57BL/6JAustralian BioResourcesC57BL/6JAusb 
Filtr mikrowirówkowy

Bibliografia

  1. Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
  2. Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. Science. 354 (6314), 904-908 (2016).
  3. Marantz Henig, R. The Monk in the Garden. , Mariner books. (2000).
  4. Jaenisch, R., Mintz, B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).
  5. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  6. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  7. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  8. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  9. Carbery, I. D. Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases. Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).
  10. Sung, Y. H. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).
  11. Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Wang, H. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  13. Kang, X. Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing. J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).
  14. Liang, P. CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).
  15. Ittner, L. M., Götz, J. Pronuclear injection for the production of transgenic mice. Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).
  16. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  17. CRISPR DESIGN. , Available from: http://crispr.mit.edu (2017).
  18. Integrated DNA Technologies. Resuspension Calculator. , Available from: https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/ (2017).
  19. BioTools at UMass Medical School. Primer3: WWW primer tool. , Available from: http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi (2017).
  20. Auerbach, A. B. Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production. Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).
  21. Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months. Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).
  22. Nakagawa, Y., et al. Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice. Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).
  23. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  24. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).
  25. Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 29 (17), E88(2001).
  26. Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nat Commun. 7, 10431(2016).
  27. Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. , (2016).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21, 70-71 (1999).
  29. Liu, X., et al. A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling. J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).
  30. Ke, Y. D. Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS. Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).
  31. Auerbach, A. B. Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection. Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).
  32. Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nat Methods. 12 (6), 479(2015).
  33. Zhou, Y. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  34. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum. Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).
  35. Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).
  36. Biggers, J. D., Summers, M. C. Choosing a culture medium: making informed choices. Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).
  37. Nakagata, N. Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice. Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).
  38. Truett, G. E. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  39. Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  40. Delerue, F., Ittner, L. M. Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects. Clon. Transgen. 4, (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroiniekcja oocyt winiekcja pronuklearnacelowanie genowe CRISPRsynteza przewodniego RNAoczyszczanie DNAtranskrypcja RNAchirurgiczna reimplantacjaprocedury genotypowaniaidentyfikacja za o ycieli
Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.