Protokół wykorzystania analizy wzbogacenia zestawu genów w celu zidentyfikowania odpowiedniego modelu zwierzęcego do badań translacyjnych

Podsumowanie

Dostarczamy ustandaryzowany protokół do analizy wzbogacenia zestawu genów danych transkryptomicznych w celu zidentyfikowania idealnego modelu myszy do badań translacyjnych.
Protokół ten może być używany z danymi z mikromacierzy DNA i sekwencjonowania RNA, a następnie może być rozszerzony na inne dane omiczne, jeśli dane są dostępne.

Streszczenie

Ostatnie badania, które porównywały transkryptomiczne zestawy danych chorób ludzkich z zestawami danych z modeli mysich przy użyciu tradycyjnych technik porównywania genów z genami, doprowadziły do sprzecznych wniosków dotyczących znaczenia modeli zwierzęcych dla badań translacyjnych. Główną przyczyną rozbieżności między różnymi analizami ekspresji genów jest arbitralne filtrowanie genów o zróżnicowanej ekspresji. Co więcej, porównywanie pojedynczych genów między różnymi gatunkami i platformami jest często ograniczone przez wariancję techniczną, co prowadzi do błędnej interpretacji zgodności / rozbieżności między danymi z modeli ludzkich i zwierzęcych. W związku z tym potrzebne są ustandaryzowane podejścia do systematycznej analizy danych. Aby przezwyciężyć subiektywne filtrowanie genów i nieskuteczne porównania między genami, wykazaliśmy niedawno, że analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA) może potencjalnie uniknąć tych problemów. W związku z tym opracowaliśmy ustandaryzowany protokół korzystania z GSEA, aby odróżnić odpowiednie i nieodpowiednie modele zwierzęce do badań translacyjnych. Protokół ten nie jest odpowiedni do przewidywania, w jaki sposób projektować nowe systemy modelowe a priori, ponieważ wymaga istniejących eksperymentalnych danych omicznych. Protokół opisuje jednak, w jaki sposób interpretować istniejące dane w ustandaryzowany sposób, aby wybrać najbardziej odpowiedni model zwierzęcy, unikając w ten sposób niepotrzebnych eksperymentów na zwierzętach i wprowadzających w błąd badań translacyjnych.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce są powszechnie używane do badania ludzkich chorób, ze względu na ich domniemane podobieństwo do ludzi pod względem genetyki, anatomii i fizjologii. Co więcej, modele zwierzęce często służą jako strażnicy terapii klinicznych i mogą mieć ogromny wpływ na powodzenie badań translacyjnych. Staranny wybór optymalnego modelu zwierzęcego może zmniejszyć liczbę wprowadzających w błąd badań na zwierzętach. Ostatnio kontrowersyjnie dyskutowano o znaczeniu modeli zwierzęcych w badaniach translacyjnych, szczególnie dlatego, że analiza tych samych zestawów danych uzyskanych z ludzkich chorób zapalnych i powiązanych modeli mysich doprowadziła do sprzecznych wniosków ^1,2. Dyskusja ta ujawniła podstawowy problem podczas analizy danych omicznych: potrzebne są ustandaryzowane podejścia do systematycznej analizy danych w celu zmniejszenia tendencyjnej selekcji genów i zwiększenia wiarygodności porównań międzygatunkowych ³.

Tradycyjnie, analiza danych transkryptomicznych (i innych danych omicznych) odbywa się na poziomie pojedynczego genu i obejmuje początkowy etap selekcji genów w oparciu o rygorystyczne parametry odcięcia (np. zmiana krotności >2,0, wartość p <0,05). Jednak ustawienie początkowych parametrów odcięcia często jest subiektywne, arbitralne i nieuzasadnione biologicznie, a nawet może prowadzić do przeciwnych wniosków^1,2. Co więcej, początkowa selekcja genów na ogół ogranicza analizę do kilku genów o wysokiej i niskiej regulacji, a zatem nie jest wystarczająco czuła, aby objąć większość genów, które były wyrażane w różny sposób w mniejszym stopniu.

Wraz z nadejściem ery genomiki na początku lat 2000 i rosnącą wiedzą o szlakach i kontekstach biologicznych, opracowano alternatywne podejścia statystyczne, które pozwoliły obejść ograniczenia analiz na poziomie pojedynczego genu. Analiza wzbogacenia zestawu genów (GSEA)⁴, która jest jedną z powszechnie akceptowanych metod analizy danych transkryptomicznych, wykorzystuje a priori zdefiniowane grupy genów (np. szlaki sygnałowe, proksymalne położenie na chromosomie itp.). GSEA najpierw mapuje wszystkie wykryte niefiltrowane geny do zamierzonych zestawów genów (np. szlaków), niezależnie od ich indywidualnej zmiany ekspresji. Podejście to obejmuje zatem również umiarkowanie regulowane geny, które w przeciwnym razie zostałyby utracone w wyniku analiz na poziomie pojedynczego genu. Addytywna zmiana ekspresji w zestawach genów jest następnie wykonywana przy użyciu statystyki sumy bieżącej.

Pomimo szerokiego zastosowania w badaniach medycznych, GSEA i pokrewne podejścia do wzbogacania zbiorów nie są oczywiście brane pod uwagę przy analizie złożonych danych omicznych. W tym miejscu opisujemy protokół porównywania danych omicznych z próbek ludzkich z danymi z modeli mysich w celu zidentyfikowania idealnego modelu do badań translacyjnych. Wykazujemy możliwość zastosowania protokołu w oparciu o zbiór modeli mysich, które są używane do naśladowania ludzkich zaburzeń zapalnych. Jednak ten proces analizy nie ogranicza się do porównań człowieka i myszy i można go dostosować do dalszych pytań badawczych.

Protokół

1. Pobieranie oprogramowania GSEA oraz bazy danych sygnatur molekularnych

1. Przejdź do oficjalnej strony internetowej GSEA Broad Institute (http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp) i zarejestruj się, aby uzyskać dostęp do narzędzia programistycznego GSEA oraz bazy danych sygnatur molekularnych (MSigDB).
2. Pobierz aplikację desktopową javaGSEA lub alternatywne oprogramowanie (np., skrypt R).
   UWAGA: Wszystkie opcje implementują dokładnie ten sam algorytm. Oprogramowanie GSEA jest bezpłatnie dostępne dla pracowników naukowych oraz sektora przemysłowego do wewnętrznych celów badawczych.
3. Aby uzyskać więcej szczegółowych informacji na temat oprogramowania GSEA, należy odwiedzić stronę z dokumentacją (http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Main_Page) oraz zapoznać się z przewodnikiem użytkownika GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html).
4. Pobierz bazę Molecular Signatures Database (MSigDB) ze strony internetowej GSEA, aby uzyskać dostęp do poszczególnych kolekcji zbiorów genów.
   UWAGA: MSigDB to zbiór adnotowanych zestawów genów przeznaczonych do wykorzystania w oprogramowaniu GSEA lub w innych celach. Zestawy genów mogą być podzielone według szlaków sygnalizacyjnych, terminów ontologii genów, motywów regulacyjnych cis, sygnatur eksperymentalnych i innych. Geny z MSigDB są zawsze nazywane zgodnie z oficjalnym symbolem genu HUGO (Human Genome Organisation). W przypadku porównywania regulacji szlaków między daną chorobą u ludzi a różnymi modelami mysimi zaleca się pobranie wszystkie szlaki kanoniczne, symbole genów Plik (c2.cp.v5.2.symbols.gmt). Plik ten zawiera zestawy genów, które zostały adnotowane i zorganizowane w szlaki sygnalizacyjne przez KEGG ^5,6, Reactome ^7,8 oraz BioCarta ⁹Ciąg znaków „v5.2” reprezentuje informacje o wersji zbioru. Należy upewnić się, że pobrano najnowszą wersję plików. Baza MSigDB jest bezpłatnie udostępniona osobom z sektora akademickiego i przemysłowego do wewnętrznych celów badawczych. Pobieranie MSigDB nie jest konieczne, jeśli podczas analizy zapewnione jest połączenie z internetem. W takim przypadku bazę MSigDB można wybrać bezpośrednio w interfejsie użytkownika GSEA.
5. Pobierz pliki adnotacji kości DNA (macierzy) ze strony internetowej GSEA, aby przełożyć identyfikatory sond specyficzne dla macierzy na ogólne symbole genów HUGO (np., Mouse430_2.chip).
   UWAGA: Jeśli podczas analizy dostępna jest łączność z internetem, pobieranie adnotacji dla chipa DNA nie jest konieczne. W takim przypadku adnotacje chipa DNA można wybrać bezpośrednio w interfejsie użytkownika GSEA. Protokół można stosować również w przypadku danych z sekwencjonowania RNA. W takiej sytuacji pobieranie plików z adnotacjami nie jest wymagane. Należy natomiast użyć narzędzia GSEA preranked do analizy danych ekspresji genów (patrz krok 4.12).

2. Pobierz eksperymentalne dane o ekspresji genów dla schorzenia ludzkiego oraz odpowiednich modeli zwierzęcych

1. Zidentyfikuj eksperymentalne badania ekspresji genów (transkryptomika) dla wybranego schorzenia człowieka (np. profile ekspresji genów leukocytów pochodzących od pacjentów z sepsą, GSE9960).
2. Podobnie wyszukaj kilka modeli zwierzęcych, które mają zostać porównane z badaniami na ludziach (np. profile ekspresji genów komórek krwi pochodzących od myszy po wstrzyknięciu Staphylococcus aureus (S. aureus), GSE20524). Na tym etapie wykorzystaj wiedzę wstępną do wstępnej selekcji modeli zwierzęcych, które mogą być odpowiednie do odwzorowania stanu chorobowego u człowieka.
3. W tym celu skorzystaj z literatury oraz baz danych, takich jak Gene Expression Omnibus (GEO) ¹⁰ lub ArrayExpress ¹¹, i pobierz interesujące Cię znormalizowane dane transkryptomiczne. Zapisz dane jako pliki tekstowe na lokalnym dysku twardym. W przypadku bazy GEO zaleca się pobranie plików tekstowych serii macierzy rozdzielonych tabulatorami. Zwróć również uwagę na platformę (typ macierzy) użytą w danym badaniu, ponieważ informacja ta jest niezbędna do przypisania specyficznych dla macierzy identyfikatorów sond do ogólnych symboli genów HUGO.
   UWAGA: Zapewnij wystarczającą ilość pamięci do przechowywania danych, ponieważ zestawy danych transkryptomicznych zazwyczaj obejmują kilkaset MB.

3. Przetwarzanie i formatowanie danych

1. Przed importowaniem eksperymentalnych danych o ekspresji genów do narzędzia programistycznego GSEA, należy rozważyć wymaganą strukturę danych. Dla każdego badania należy ręcznie utworzyć dwa różne pliki: 1) plik danych o ekspresji genów zawierający wartości pomiarowe dla różnych genów i próbek oraz 2) plik fenotypowy zawierający etykiety próbek służące do grupowania poszczególnych próbek (np. do grup traktowania).
   W celu uzyskania dalszych szczegółów i opcji struktury danych należy przejść na stronę formatów danych GSEA (http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Data_formats).
   UWAGA: Co do zasady wszystkie formy danych transkrypcyjnych są kompatybilne z protokołem, w tym eksperymenty z mikromacierzą DNA, badania RNA-seq lub ChIP-seq. W przypadku stosowania eksperymentów z mikromacierzą DNA plik danych o ekspresji genów powinien zawierać specyficzny dla macierzy identyfikator sondy lub symbole genów HUGO dla każdego genu (identyfikatory sond zostaną przetłumaczone na symbole genów HUGO podczas analizy, patrz kroki 1.5 i 4.10). W przypadku korzystania z danych RNA-seq lub ChIP-seq zamiast danych z poszczególnych próbek należy użyć ręcznie obliczonych miar grupowych dla danych o ekspresji genów (np. stosunku średnich grup). Miary grupowe te powinny być następnie analizowane za pomocą narzędzia GSEA preranked (patrz krok 4.12). Dane o ekspresji genów muszą zostać znormalizowane w standardowy sposób przed importem do oprogramowania GSEA. Rodzaj normalizacji (np. kwartylowa lub sześcienna splajnowa) pozostaje zazwyczaj do decyzji badacza.
2. Plik danych o ekspresji genów: Do opisu zestawu danych o ekspresji należy użyć formatu pliku tekstowego z rozdzielaczem tabulacyjnym (*.txt), jak przedstawiono na Rysunku 1A. Patrz również wspierany plik przykładu GSE20524_expression.txt.
   UWAGA: Plik danych o ekspresji genów zawiera wartości ekspresji dla wszystkich wykrywalnych genów (lub sond), również dla genów, które mogą nie wykazywać różnicowej ekspresji. Plik ten zazwyczaj obejmuje zatem wiele tysięcy genów. Jest on zorganizowany zgodnie z Rysunkiem 1A. Pierwsza linia zawiera nazwę etykiety (np. symbol genu lub identyfikator sondy), a następnie identyfikator dla każdej próbki w zbiorze danych (np. próbka 1, próbka 2 itp.). Pozostała część pliku zawiera wartości ekspresji dla każdego z genów i dla każdej próbki w zbiorze danych. Narzędzie programistyczne GSEA wykonuje obliczenia dla miar grupowych (np. stosunku średnich grup lub stosunku sygnału do szumu), dlatego zaleca się uwzględnienie danych dla każdej poszczególnej próbki. Alternatywnie można zastosować zewnętrznie obliczone miary grupowe dla danych o ekspresji genów (patrz Rysunek 1B).
3. Plik fenotypowy: Należy utworzyć oddzielny plik do definiowania i etykietowania grup składających się z poszczególnych próbek, jak przedstawiono na Rysunku 2. Do rozdzielania pól należy używać spacji lub tabulatorów. Plik należy zapisać w formacie CLS (C++ Class Definition). Patrz również wspierany plik przykładu GSE20524_pheno_infection.cls.
   UWAGA: Pierwsza linia zawiera całkowitą liczbę próbek, a następnie liczbę grup (Rysunek 2). Podczas gdy liczba próbek powinna odpowiadać plikowi danych o ekspresji genów (patrz 3.2), liczba grup zależy od projektu badania. Trzecie pole pierwszej linii to zawsze '1'.
   Druga linia w pliku CLS zawiera nazwę dla każdej grupy. Linia ta powinna zaczynać się od znaku hash (#), po którym następuje spacja (Rysunek 2).
   Trzecia linia zawiera etykietę grupy dla każdej próbki. Etykieta grupy może być dowolnym numerem lub tekstem. To wyłącznie kolejność etykiet określa przypisanie każdej próbki do grup: pierwsza użyta etykieta jest przypisana do pierwszej grupy w drugiej linii; druga unikalna etykieta jest przypisana do drugiej grupy i tak dalej. Należy upewnić się, że każda próbka z tej samej grupy ma na tym etapie taką samą etykietę oraz że liczba etykiet jest taka sama, jak liczba próbek określona w pierwszej linii. Na koniec należy zapisać plik jako plik tekstowy z rozdzielaczem tabulacyjnym (*.txt) i ręcznie zmienić rozszerzenie nazwy pliku na (*.cls).
4. (opcjonalnie) Pliki bazy zestawów genów: Zdefiniuj własne zestawy genów. Do zestawów genów należy użyć formatu pliku GMT (Gene Matrix Transposed) z rozdzielaczem tabulacyjnym, jak przedstawiono na Rysunku 3. Patrz również wspierany plik przykładu Gene_sets_Inflammation_BIOCARTA_KEGG_REACTOME.gmt.
   UWAGA: Definiowanie własnych zestawów genów może być przydatne na przykład do ograniczenia analizy wzbogacenia zestawu genów do szlaków o szczególnym znaczeniu (np. sygnalizacja immunologiczna w badaniach nad sepsą) lub do definiowania od podstaw własnych zestawów genów (np. genów aktywowanych i hamowanych w badaniach podlegających porównaniu). Plik jest zorganizowany zgodnie z Rysunkiem 3. W formacie GMT każdy wiersz reprezentuje zestaw genów (Rysunek 3). Każdy zestaw genów jest opisany nazwą, opisem oraz genami wchodzącymi w skład zestawu. Pierwsza kolumna zawiera unikalne nazwy zestawów genów. Druga linia może opcjonalnie zawierać opis zestawu genów. Kolejne kolumny zawierają nazwy genów (oficjalne symbole genów HUGO) odpowiadającego zestawu genów. Na koniec należy zapisać plik jako plik tekstowy z rozdzielaczem tabulacyjnym (*.txt) i ręcznie zmienić rozszerzenie nazwy pliku na (*.gmt).

4. Przeprowadzanie analizy GSEA

1. Otwórz narzędzie programistyczne GSEA (patrz 1.2).
2. Kliknij wczytaj dane przycisk po lewej stronie głównego okna (Rysunek 4A). Otworzy się nowa karta do importowania wymaganych plików danych (Rycina 4B). Przejdź w nowej karcie do pliku z danymi o ekspresji genów (*.txt) (patrz 3.2), pliku z fenotypem (*.cls) (patrz 3.3) oraz opcjonalnie do pliku z niestandardowymi zestawami genów (*.gmt) (Rysunek 4B).
   1. W przypadku braku połączenia programu GSEA z internetem, należy również wczytać pobrane pliki MSigDB (*.gmt) (np., c2.cp.v5.2.symbols.gmt (w przypadku ścieżek patrz pkt 1.4) oraz pliki adnotacji chipa DNA (macierzy) (*.chip) (np. Mouse430_2.chip, patrz pkt 1.5). Poprawnie zaimportowane dane pojawiają się w „ładuj dane sekcja (Rycina 4C).
      UWAGA: Każde badanie ekspresji genów musi zostać przeanalizowane indywidualnie za pomocą GSEA. Porównanie dwóch badań (np. (zaburzenie u ludzi vs model mysi) zostanie wykonane w kroku 5.
3. Kliknij „Przeprowadź analizę GSEA przycisk po lewej stronie głównego okna. Otwarta zostanie nowa karta w celu ustawienia parametrów analizy (Rysunek 4D). Zakładka jest podzielona na trzy części: wymagane pola, pola podstawowe i zaawansowane dziedziny.
4. W wymagane pola, najpierw wybierz zbiór danych ekspresji załadowane w kroku 4.2 (Rysunek 4D).
5. Wybierz baza zestawów genów, albo z połączonej strony internetowej, albo z ręcznie zaimportowanego pliku ze zbiorem genów (Rycina 4D).
6. Edytuj etykiety fenotypowe aby wybrać grupy próbek, które mają być ze sobą porównane (np., *S. aureus* leczenie kontra zdrowa grupa kontrolna) (Rycina 4D).
7. Zredukuj zestaw danych do symboli genów (=prawda) w celu przetłumaczenia identyfikatorów sond w zbiorze danych ekspresyjnych na oficjalne symbole genów HUGO stosowane w bazie danych zestawów genów. Wybierz fałszjeśli zestaw danych ekspresji zawiera już symbole genów HUGO (Rysunek 4D).
8. Ustaw liczba permutacji do ustawienie domyślne na 1000 (Rycina 4D).
   UWAGA: W przypadku większych wartości czas obliczeń ulegnie znacznemu wydłużeniu.
9. Zmień typ permutacji do „zbioru genów”, ponieważ permutacje fenotypów są zalecane tylko wtedy, gdy w każdym fenotypie znajduje się więcej niż siedem próbek (Rycina 4D).
10. Na koniec należy wybrać platformę chipową wykorzystaną do wygenerowania danych o ekspresji genów, wybierając ją z połączonej strony internetowej lub z ręcznie zaimportowanego pliku z adnotacjami do chipów DNA (macierzy) (Rysunek 4D).
    UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy w przesłanym zbiorze danych ekspresji zastosowano identyfikatory sond.
11. W ramach podstawowe pola edytuj przynajmniej nazwa analizy i zapisać wyniki w tym folderze sekcja służąca do ponownego odnalezienia pliku z wynikami (Rysunek 4D). Ponadto można zmienić dodatkowe parametry statystyczne. Więcej szczegółów na temat parametrów i zaawansowane dziedziny prosimy przejść do przewodnika użytkownika GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html).
12. (Opcjonalnie): W przypadku zewnętrznie obliczonych metryk grupowych dla danych z ekspresji genów (np., stosunek średnich grupowych) należy użyć narzędzia GSEA preranked. Analiza zostanie wówczas przeprowadzona na podstawie prostej listy genów przypisanych do wcześniej obliczonych metryk grupowych, które służą do rankingowania genów. Po wczytaniu alternatywnego pliku z ekspresją genów przejdź do głównego paska nawigacji i kliknij w Narzędzia/GseaPrerankedPodobnie otworzy się nowa karta do ustawienia parametrów analizy (Rysunek 4E).
    UWAGA: W przypadku badań, w których nie dysponowano danymi o ekspresji genów dla poszczególnych próbek, zaleca się stosowanie narzędzia GSEA preranked. Może to mieć miejsce w sytuacji, gdy w danych zastosowano specjalne procedury statystyczne lub normalizacyjne, w wyniku których uzyskano wartości średnie dla grup zamiast danych z pojedynczych próbek. Stosowanie narzędzia GSEA preranked jest zalecane dla danych z sekwencjonowania RNA. Należy znormalizować dane o ekspresji z sekwencjonowania RNA i obliczyć wskaźniki grupowe dla próbek (np., logarytm zmiany krotności), który może być wykorzystany do rankingowania genów według poziomu ich ekspresji.
13. Kliknij „Uruchom przycisk w prawym dolnym rogu okna.
    UWAGA: Analiza może następnie potrwać od kilku do kilkunastu minut, w zależności od szybkości obliczeń. Postępy analizy można śledzić w sekcji raportów GSEA w lewym dolnym rogu okna. Po zakończeniu analizy w sekcji raportów GSEA pojawi się status „success”.
14. Kliknij pomyślnie przeprowadzoną analizę w Raporty GSEA sekcja służąca do otwarcia wyników analizy.
    UWAGA: W oknie przeglądarki otworzy się nowe menu nawigacyjne zawierające podsumowanie wszystkich wyników i ustawień parametrów (Rycina 5Dwie górne sekcje menu nawigacyjnego zawierają wyniki wzbogacania zestawów genów dla zdefiniowanych grup (np. wzbogacenie w próbkach traktowanych S. aureus lub w próbkach zdrowej grupy kontrolnej). Pierwsze linie obu sekcji przedstawiają podsumowanie wyników statystycznych. Zestawy genów, które są istotnie wzbogacone przy stopniu fałszywych odkryć (FDR) poniżej 25%, są uznawane za wzbogacone w poniższej interpretacji. Dalsze szczegóły dotyczące interpretacji analizy można znaleźć w przewodniku użytkownika GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html).
15. Kliknij w szczegółowe wyniki wzbogacenia w formacie Excel aby wyeksportować wyniki analizy do arkusza kalkulacyjnego (Rycina 6A). Eksportuj szczegółowe wyniki wzbogacenia w programie excel osobno dla obu fenotypów (Rycina 5) i połącz dane z wynikami w jednym arkuszu kalkulacyjnym. W celu późniejszego porównania danych o ekspresji genów z kilku badań, zachowaj co najmniej nazwę zestawu genów (kolumna A), jego znormalizowany wynik wzbogacenia (NES) (kolumna F) oraz wartość FDR (false discovery rate — poziom fałszywych odkryć) (kolumna H) (Rysunek 6B).
    UWAGA: Plik arkusza kalkulacyjnego zawiera obszerny zestaw danych dla każdego z analizowanych zestawów genów, w tym nazwę zestawu genów (kolumna A), jego wielkość (tj. liczbę genów wykrytych w danych ekspresji genów, kolumna D), wartość NES (ilościowa miara kierunku i zakresu wzbogacenia, kolumna F), nominalną wartość p (niepoprawioną, kolumna G) oraz wartość FDR (poprawioną pod kątem wielokrotnego testowania hipotez, kolumna H). Dalsze szczegóły dotyczące interpretacji znajdują się w przewodniku użytkownika GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.html).
16. Powtórz analizę wzbogacenia zestawów genów (kroki od 4.1 do 4.15) dla drugiej grupy badawczej (np., S. aureus GSE9960) oraz dla wszystkich dalszych badań, które mają być ze sobą porównywane. Należy uwzględnić jak najwięcej klinicznych badań na ludziach oraz różnych modeli mysich, aby zidentyfikować optymalny model mysi dla badanej kwestii translacyjnej.

5. Porównanie wyników GSEA

1. Aby zidentyfikować optymalny model zwierzęcy naśladujący sytuację u ludzi, należy porównać ze sobą wyniki GSEA ze wszystkich badań. Należy wykorzystać wskaźniki wzbogacenia (enrichment scores) oraz wartości FDR, aby zaklasyfikować szlaki (zbiory genów) jako aktywne (NES >0, FDR <25%), zahamowane (NES <0, FDR <25%) lub żadnego z nich (FDR >25%). Dla każdego porównania dwóch badań należy obliczyć liczbę realizacji dziewięciu możliwych kombinacji regulacji szlaków, zgodnie z tabelą kontyngencji 3x3 (Rysunek 7A).
2. Oceń korelację między dwoma badaniami poprzez obliczenie dodatniej wartości predykcyjnej (ppv) oraz ujemnej wartości predykcyjnej (npv), które z definicji stanowią tę część szlaków, które wykazują taką samą regulację (aktywację lub inhibicję) w obu badaniach.
   1. Oblicz PPV oraz NPV zgodnie z następującymi wzorami (1) i (2):
      (1)
      (2)
      UWAGA: Ponieważ pokrywanie się wyników może być czysto przypadkowe, wartości ppv i npv muszą zostać dodatkowo porównane z wartościami oczekiwanymi dla zdarzeń przypadkowych. Podejście to pozwala oszacować ilość informacji, jaką można uzyskać z jednego badania w celu przewidywania efektów w innym badaniu. Na przykład, gdyby procesy regulacyjne w dwóch modelach były od siebie niezależne (a pokrywały się jedynie przypadkowo) i gdyby w pierwszym modelu 10% szlaków było upregulowanych, wówczas ppv dla drugiego modelu również wynosiłoby 10%, co oznaczałoby brak dodatkowego przyrostu informacji. Z drugiej strony, jeśli oba modele byłyby powiązane wspólnymi mechanizmami regulacyjnymi, wówczas ppv (i npv) byłyby znacznie wyższe niż oczekiwano w przypadku zdarzeń przypadkowych. Przykładowo, dla przewidywania zmian w ekspresji genów podczas sepsy u ludzi (GSE9960) na podstawie efektów w mysim modelu wstrzyknięcia S. aureus (GSE20524), ppv wynosi 43% (6/(6+8+0)), a npv wynosi 61% (11/(0+7+11)). Innymi słowy, 43% aktywowanych szlaków w mysim modelu wstrzyknięcia S. aureus (GSE20524) jest również aktywowanych podczas sepsy u ludzi (GSE9960). Podobnie, 61% zahamowanych szlaków w mysim modelu wstrzyknięcia S. aureus (GSE20524) jest również zahamowanych podczas sepsy u ludzi (GSE9960) (Rycina 7B). Wartości PPV i NPV można wyznaczyć również dla konfiguracji odwrotnej (czyli przewidywania z badania 1 na badanie 2).
3. Aby obliczyć prawdopodobieństwo przypadkowego pokrycia, należy odwołać się do tabeli kontyngencji 3x3 (Rycina 7) i obliczyć ppvchance oraz npvchance zgodnie z następującymi wzorami (3) i (4):
   (3)
   (4)
   UWAGA: Na przykład w przypadku przewidywania zmian w ekspresji genów podczas sepsy u ludzi (GSE9960) na podstawie efektów w mysim modelu wstrzyknięcia S. aureus (GSE20524), wartość ppvchance wynosi 13% (8/64), a npvchance wynosi 22% (14/64).
4. Oblicz przyrost PPV w stosunku do prawdopodobieństwa przypadkowego, odejmując ppvchance od ppv. Postąp analogicznie w przypadku NPV:
   (5)
   (6)
   UWAGA: Na przykład w przypadku przewidywania zmian ekspresji genów podczas sepsy u ludzi (GSE9960) na podstawie efektów w mysim modelu wstrzyknięcia S. aureus (GSE20524), zmiana ppv i npv w stosunku do wartości przypadkowej wynosi odpowiednio +30% (43% - 13%) i +39% (61% - 22%).
5. Oblicz przyrost informacji, jaki można uzyskać z badania 2 w odniesieniu do badania 1, wyciągając średnią z ppvgain i npvgain:
   (7)
6. Użyj tabeli kontyngencji zdefiniowanej w kroku 5.1 dla pary badań (study1.pathway, study2.pathway), aby obliczyć wartość p za pomocą testu chi-kwadrat.
   Przechowaj dane z tabeli kontyngencyjnej w macierzy X. Przeprowadź test chi-kwadrat, np., przy użyciu funkcji R test.chi2.
   UWAGA: Na przykład, porównując wybraną badanie sepsy u ludzi (GSE9960) z badaniem na myszach S. aureus model iniekcyjny (GSE20524) wykazuje statystycznie istotną zbieżność w regulacji szlaków zapalnych:
   > chisq.test(X,simulate.p.value=F)$p.value
   3,82e-07

6. Identyfikacja optymalnego modelu zwierzęcego

1. Porównaj wyniki GSEA dla wszystkich kombinacji badań wybranych do analizy.
   UWAGA: Zaleca się również porównywanie ze sobą (podobnych) badań na ludziach, jak i różnych badań na zwierzętach. Takie porównanie może dostarczyć informacji o wariancji wewnątrzgatunkowej badań klinicznych (lub zaburzeń) oraz różnych modeli zwierzęcych. Oczekuje się, że badania kliniczne wykażą akceptowalną zgodność oraz istotny przyrost informacji, ponieważ w przeciwnym razie badania kliniczne mogłyby być zbyt heterogeniczne, aby znaleźć model zwierzęcy, który mógłby naśladować sytuację ludzką. W takim przypadku zaleca się uwzględnienie tylko tych badań na ludziach, które są do siebie podobne, w celu identyfikacji odpowiednich modeli zwierzęcych.
2. Posortuj wszystkie kombinacje według przyrostu informacji (krok 5.5). W przypadku porównania wielu zbiorów danych użyj macierzy i zwizualizuj wyniki za pomocą kolorowej mapy ciepła lub podobnej metody (Rysunek 8).
3. Wybierz model zwierzęcy z najwyższym przyrostem informacji. Aby ocenić istotność przyrostu informacji, weź pod uwagę również test chi-kwadrat (krok 5.6).
   UWAGA: Modele zwierzęce powinny być uznane za odpowiednie tylko wtedy, gdy przyrost informacji jest znaczny, a wartość p testu chi-kwadrat znajduje się poniżej poziomu istotności. Progi zdefiniowane przez użytkownika będą zazwyczaj zależeć od kilku czynników: 1) wiedzy przedbadawczej na temat przenoszalności wyników z modelu zwierzęcego na ludzi (np. podobna fizjologia), 2) oczekiwanej korzyści dla ludzi w przypadku domniemanego sukcesu, 3) praktycznej wykonalności danego eksperymentu na zwierzętach oraz 4) przewidywanego bólu, cierpienia lub szkód wyrządzonych zwierzętom laboratoryjnym.

Wyniki

Przedstawiono schemat pracy GSEA oraz zrzuty ekranu przykładowych danych. Rysunek 1 przedstawia plik z danymi ekspresji genów, który zawiera interesujące dane transkrypcyjne. Dla każdego badania wymagany jest opisowy plik fenotypu, który pokazano na Rysunku 2. Adnotowane zestawy genów (np. szlaki metaboliczne) są zdefiniowane w pliku bazy zestawów genów (Rysunek 3). Rysu...

Dyskusja

Modele zwierzęce od dawna są stosowane do badania mechanizmów chorobowych i opracowywania nowych strategii terapeutycznych. Jednak sceptycyzm co do przewidywalności modeli zwierzęcych zaczął się rozprzestrzeniać po niepowodzeniach badań klinicznych¹². Co więcej, kontrowersyjne dyskusje na temat odpowiednich strategii analizy i interpretacji danych big omicznych z badań przedklinicznych zostały wywołane przez przeciwstawne wnioski wyciągnięte z tych samych danych po zastosowaniu różnych strategii a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Excel	Microsoft Corporation