| Szczep i stadium myszy | St. Constant, Quebec, Kanada | | C57BL/6 Femals; 18. dzień ciąży (P18) i 14. dzień laktacji (L14), Charles River Kanada |
| PBS 10x (magazyn) | | | 1) Rozpuść 80 g NaCl (FW: 58.44), 2 g KCl (FW 74.55), 26.8 g Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) i 2.4 g KH2PO4 (FW:136.09) w 800 ml wody destylowanej; 2) Dostosuj pH do 7,4; 3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. |
| TBS 10x (podstawowy) | | | 1) Rozpuść 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl w 800 ml wody destylowanej; 2) Dostosuj pH do 7,5; 3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l. |
| Część 1: Immunofluorescencja |
| Zamrażanie podłoża | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Kanada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Kanada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Kriostat 115 V 60 Hz |
| Ostrza | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Kanada | BLM1001C | Wysokoprofilowe ostrza pokryte złotem |
| Pióro Pap | Cedarlane, Burlington, ON, Kanada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific, Burlington, ON, Kanada | 12-550-15 | Fisherbrand Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus |
| Formaldehyd | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Kanada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, Kalifornia, USA | | |
| Roztwór | | | 3% BSA w TBS |
| Roztwór | | | TBS-Tween 20 0,1% |
| Polisorbat 20 | Oakville, ON, Kanada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Media montażowe | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25 (EM) | Fluoromount-G |
| Pierwsze i drugorzędowe przeciwciała | Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | E-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) 1/50 (sygnalizacja komórkowa) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Sygnalizacja komórkowa |
| Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe | Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) z anty-króliczą IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Sygnalizacja komórkowa) |
| Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe | Santa Cruz Biotechnology, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone; Fischer Scientific, Burlington, ON, Kanada | Zobacz komentarze | β-Przeciwciało kateninowe (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) z anty-kozimi IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), sonda molekularna (Fisher Scientific) |
| Przeciwciała pierwsze i wtórne | Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Barwienie jąder | Fisher Scientific, Burlington, ON, Kanada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylalldole, Dichlorowodorek) 1/1,000 w PBS |
| Mikroskop fluorescencyjny | Nikon Kanada, Mississauga, On, Kanada | | Konfokalny laser mikroskopowy Nikon A1R+ wyposażony w detektor spektralny |
| Oprogramowanie do analizy obrazów IF | Nikon Kanada, Mississauga, On, Kanada | | Oprogramowanie do elementów NIS (wersja 4) |
| Część 2: Immunoprecypitacja |
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8,0 | | | 1) Wymieszać 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (FW: 58,44), 0,02% Azek sodu, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% deoksycholan sodu w 80 ml destylowany H2O. 2) Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl 6 N (~0,5 ml). 3) Dostosuj głośność do 100 mL. Przechowywać w lodówce. W dniu ekstrakcji białka należy użyć 1/100 NaVo3, 1/100 inhibitora proteazy/fosfatazy i 1/25 NAF w obliczonej ilości buforu do lizy potrójnego detergentu: Fluorek sodu (podstawowy) roztwór 1,25 M (F.W.: 41.98), Orthowandan sodu (zapas) Roztwór 1 M (F.W.: 183.9) |
| Inhibitor proteazy/fosfatazy | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy, bez EDTA (100x) |
| Dawkowanie białka | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA |
| Młynek do tkanek | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Koraliki magnetyczne i podstawka | Millipore, Etobicoke, ON, Kanada | | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) |
| Roztwór do płukania dla IP | | | PBS lub PBS-Tween20 0,1% w zależności od kroku |
| Podstawowe przeciwciała do immunoprecypitacji | Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | IgG Królik (królik (DA1E) mAb IgG Kontrola izotypu (#3900s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L |
| Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacji | Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | IgG Mysz mysz (G3A1) mAb IgG Kontrola izotypu (#5415s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L |
| Pierwszorzędowe przeciwciała immunoprecypitacyjne | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada | Zobacz komentarze | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 &mikro; L/200 &mikro; L |
| Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacji | Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA | Zobacz komentarze | E-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) (sygnalizacja komórkowa) 1 i mikro; L/200 &mikro; L |
| Bufor Laemmli | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Kanada | 1610747 | 4x bufor do próbek Laemmli (dodać β-merkaptoetanol zgodnie z zaleceniami producenta) |
| Glicyna kwasowa | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0,2 M glicyna; dostosuj pH = 2,5 za pomocą HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE żele akrylowe | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutions (7,8%, 10%, 12%) |
| Bufor biegowy 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1704272 | Tris 30.3 g/glicyna 144,1 g /SDS 10 g in 1 l wody destylowanej |
| Membrany | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1704272 | Membrany PVDF, Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF |
| Metoda transferu | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1704155 | System Turbo Transferu Trans-Blot |
| Suche mleko | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Kanada | | Beztłuszczowe odtłuszczone mleko w proszku instant, |
| roztwór blokujący goździk dla blot | | | 5% mleko w proszku w TBS-Tween 20 0,1% |
| Roztwory myjące do blotów | | | TBS-Tween 20 0,1% |
| Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko bleksom (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Kanada | Zobacz komentarze | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada) |
| Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10 mL) | Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Kanada | Zobacz komentarze | E-kadheryna (24E10) królicze mAb 1/1,000 (#3195s) (sygnalizacja komórkowa) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada) |
| Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, Kanada | Zobacz komentarze | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada) |
| Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, Kanada | Zobacz komentarze | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała wtórnego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada) |
| Roztwór luminolu do wykrywania sygnału na blot | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate Imaging Blot Blot Blot |
| Blot | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | 1708280 | Obrazowanie ChemiDoc MP system |
| Analayzing blot | BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada | | Oprogramowanie ImageLab 5.2 |