Analiza oddziaływań białko-białko i kolokalizacji między składnikami połączeń szczelinowych, ścisłych i adherenowych w mysich gruczołach sutkowych

Summary

Połączenia międzykomórkowe są niezbędne do funkcjonowania i rozwoju gruczołu sutkowego. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół badania interakcji białko-białko (PPI) i kolokalizacji przy użyciu mysich gruczołów sutkowych. Techniki te pozwalają na badanie dynamiki fizycznego związku między połączeniami międzykomórkowymi na różnych etapach rozwoju.

Abstract

Interakcje komórka-komórka odgrywają kluczową rolę w zachowaniu integralności tkanek i bariery między różnymi przedziałami gruczołu sutkowego. Interakcje te są zapewniane przez białka połączeniowe, które tworzą połączenia między sąsiednimi komórkami. Błędna lokalizacja białek połączeniowych i zmniejszone fizyczne powiązania z ich partnerami wiążącymi mogą prowadzić do utraty funkcji, a w konsekwencji do dysfunkcji narządów. W związku z tym identyfikacja lokalizacji białek i interakcji białko-białko (IPP) w tkankach prawidłowych i związanych z chorobą jest niezbędna do znalezienia nowych dowodów i mechanizmów prowadzących do progresji chorób lub zmian w statusie rozwojowym. W artykule przedstawiono dwuetapową metodę oceny IPP w mysich gruczołach sutkowych. W sekcji 1 protokołu opisano metodę przeprowadzania koimmunofluorescencji (co-IF) przy użyciu przeciwciał podniesionych przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorochromami. Chociaż co-IF pozwala na wykazanie bliskości białek, umożliwia badanie ich fizycznych interakcji. W związku z tym szczegółowy protokół koimmunoprecypitacji (co-IP) znajduje się w punkcie 2 protokołu. Metoda ta służy do określania oddziaływań fizycznych między białkami, bez potwierdzania, czy oddziaływania te są bezpośrednie, czy pośrednie. W ciągu ostatnich kilku lat techniki co-IF i co-IP wykazały, że niektóre składniki połączeń międzykomórkowych kolokalizują się i oddziałują ze sobą, tworząc zależne od etapu węzły połączeniowe, które zmieniają się podczas rozwoju gruczołu sutkowego.

Introduction

Wzrost i rozwój gruczołu sutkowego następuje głównie po urodzeniu. Narząd ten nieustannie się przebudowuje przez cały okres reprodukcji ssaka¹. Dorosły nabłonek gruczołu sutkowego składa się z wewnętrznej warstwy komórek nabłonka światła i zewnętrznej warstwy komórek podstawnych, składającej się głównie z komórek mioepitelialnych, otoczonej błoną podstawną². Aby uzyskać dobry przegląd na temat budowy i rozwoju gruczołu sutkowego, czytelnik może zapoznać się z Sternlicht¹. Interakcje komórka-komórka poprzez połączenia szczelinowe (GJ), ścisłe (TJ) i adherens (AJ) są niezbędne do prawidłowego rozwoj....

Protocol

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Identyfikacja kolokalizacji białek

1. Od szkiełek higienicznych do szkiełek mikroskopowych
   UWAGA: Chusteczki i skrawki należy obchodzić na suchym lodzie.
   1. Wyciąć gruczoły sutkowe od zwierzęcia (pełny opis tej procedury znajduje się w Plante i wsp.)¹⁴.
   2. Zanurzyć wyciętą tkankę w podłożu do zamrażania/mocowania na suchym lodzie. Dodaj tyle podłoża, aby pokryć gruczoł. Gdy podłoż....

Results

Aby ustalić, czy komponenty GJ, AJ i TJ mogą oddziaływać ze sobą w gruczole sutkowym, najpierw przeprowadzono testy co-IF. Cx26, białko GJ i β-katenina, białko AJ, były badane za pomocą specyficznych przeciwciał i ujawnione za pomocą sprzężonych z fluoroforem przeciwciał myszy-647 (zielony, pseudokolor) i kozy-568 (czerwony) odpowiednio (Figura 1B i C). Dane wykazały, że kolokalizują się one na błonie komórkowej komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego mys.......

Discussion

Interakcje komórka-komórka za pośrednictwem połączeń są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i rozwoju wielu narządów, takich jak gruczoł sutkowy. Badania wykazały, że białka połączeniowe mogą regulować funkcję i stabilność siebie nawzajem oraz aktywować transdukcję sygnału poprzez wiązanie się nawzajem na błonie komórkowej¹⁰. Protokoły przedstawione w obecnym manuskrypcie dostarczyły interesujących odkryć na temat różnicowej ekspresji, lokalizacji i interakcji białek połączeniowych podczas no.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szczep i stadium myszy	St. Constant, Quebec, Kanada		C57BL/6 Femals; 18. dzień ciąży (P18) i 14. dzień laktacji (L14), Charles River Kanada
PBS 10x (magazyn)			1) Rozpuść 80 g NaCl (FW: 58.44), 2 g KCl (FW 74.55), 26.8 g Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) i 2.4 g KH2PO4 (FW:136.09) w 800 ml wody destylowanej; 2) Dostosuj pH do 7,4; 3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.
TBS 10x (podstawowy)			1) Rozpuść 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl w 800 ml wody destylowanej; 2) Dostosuj pH do 7,5; 3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.
Część 1: Immunofluorescencja
Zamrażanie podłoża	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Kanada	95067-840	VMR frozen sections compound
Microtome	Mississauga, ON, Kanada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Kriostat 115 V 60 Hz
Ostrza	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits  Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, Kanada	BLM1001C	Wysokoprofilowe ostrza pokryte złotem
Pióro Pap	Cedarlane, Burlington, ON, Kanada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific, Burlington, ON, Kanada	12-550-15	Fisherbrand  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus
Formaldehyd	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Kanada	FOR201.1	Forlmadehyde
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, Kalifornia, USA
Roztwór			3% BSA w TBS
Roztwór			TBS-Tween 20 0,1%
Polisorbat 20	Oakville, ON, Kanada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Media montażowe	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25 (EM)	Fluoromount-G
Pierwsze i drugorzędowe przeciwciała	Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	E-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) 1/50 (sygnalizacja komórkowa) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Sygnalizacja komórkowa
Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe	Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) z anty-króliczą IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Sygnalizacja komórkowa)
Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe	Santa Cruz Biotechnology, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone; Fischer Scientific, Burlington, ON, Kanada	Zobacz komentarze	β-Przeciwciało kateninowe (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) z anty-kozimi IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), sonda molekularna (Fisher Scientific)
Przeciwciała pierwsze i wtórne	Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
Barwienie jąder	Fisher Scientific, Burlington, ON, Kanada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylalldole, Dichlorowodorek) 1/1,000 w PBS
Mikroskop fluorescencyjny	Nikon Kanada, Mississauga, On, Kanada		Konfokalny laser mikroskopowy Nikon A1R+ wyposażony w detektor spektralny
Oprogramowanie do analizy obrazów IF	Nikon Kanada, Mississauga, On, Kanada		Oprogramowanie do elementów NIS (wersja 4)
Część 2: Immunoprecypitacja
Triple-detergent Lysis buffer (100  mL) pH=8,0			1) Wymieszać 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150  mM NaCl (FW: 58,44), 0,02% Azek sodu, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% deoksycholan sodu w 80 ml destylowany H2O. 2) Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl 6  N (~0,5  ml). 3) Dostosuj głośność do 100  mL. Przechowywać w lodówce. W dniu ekstrakcji białka należy użyć 1/100 NaVo3, 1/100 inhibitora proteazy/fosfatazy i 1/25 NAF w obliczonej ilości buforu do lizy potrójnego detergentu: Fluorek sodu (podstawowy) roztwór 1,25  M (F.W.: 41.98), Orthowandan sodu (zapas) Roztwór 1  M (F.W.: 183.9)
Inhibitor proteazy/fosfatazy	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy, bez EDTA (100x)
Dawkowanie białka	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA
Młynek do tkanek	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Koraliki magnetyczne i podstawka	Millipore, Etobicoke, ON, Kanada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Roztwór do płukania dla IP			PBS lub PBS-Tween20 0,1% w zależności od kroku
Podstawowe przeciwciała do immunoprecypitacji	Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	IgG Królik (królik (DA1E) mAb IgG Kontrola izotypu (#3900s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacji	Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	IgG Mysz mysz (G3A1) mAb IgG Kontrola izotypu (#5415s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała immunoprecypitacyjne	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	Zobacz komentarze	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  &mikro; L/200  &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacji	Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA	Zobacz komentarze	E-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) (sygnalizacja komórkowa) 1 i mikro; L/200 &mikro; L
Bufor Laemmli	BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Kanada	1610747	4x bufor do próbek Laemmli (dodać β-merkaptoetanol zgodnie z zaleceniami producenta)
Glicyna kwasowa	Fisher Scientific, Burlington, ON	PB381-5	0,2 M glicyna; dostosuj pH = 2,5 za pomocą HCl
Tris	Fisher Scientific, Burlington, ON	BP152-1	1 M (pH=8)
SDS-PAGE żele akrylowe	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1610180 -5	TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutions (7,8%, 10%, 12%)
Bufor biegowy 10x	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1704272	Tris 30.3  g/glicyna 144,1  g /SDS 10  g in 1 l wody destylowanej
Membrany	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1704272	Membrany PVDF, Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF
Metoda transferu	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1704155	System Turbo Transferu Trans-Blot
Suche mleko	Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Kanada		Beztłuszczowe odtłuszczone mleko w proszku instant,
roztwór blokujący goździk dla blot			5% mleko w proszku w TBS-Tween 20 0,1%
Roztwory myjące do blotów			TBS-Tween 20 0,1%
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko bleksom (10  mL)	Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Kanada	Zobacz komentarze	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)	Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Kanada	Zobacz komentarze	E-kadheryna (24E10) królicze mAb 1/1,000 (#3195s) (sygnalizacja komórkowa) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)	Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, Kanada	Zobacz komentarze	Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)	Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, Kanada	Zobacz komentarze	Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała wtórnego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Roztwór luminolu do wykrywania sygnału na blot	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1705061	Clarity Western ECL Blotting Substrate Imaging Blot Blot Blot
Blot	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada	1708280	Obrazowanie ChemiDoc MP system
Analayzing blot	BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada		Oprogramowanie ImageLab 5.2