Method Article

Analiza oddziaływań białko-białko i kolokalizacji między składnikami połączeń szczelinowych, ścisłych i adherenowych w mysich gruczołach sutkowych

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenia międzykomórkowe są niezbędne do funkcjonowania i rozwoju gruczołu sutkowego. Manuskrypt ten zawiera szczegółowy protokół badania interakcji białko-białko (PPI) i kolokalizacji przy użyciu mysich gruczołów sutkowych. Techniki te pozwalają na badanie dynamiki fizycznego związku między połączeniami międzykomórkowymi na różnych etapach rozwoju.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje komórka-komórka odgrywają kluczową rolę w zachowaniu integralności tkanek i bariery między różnymi przedziałami gruczołu sutkowego. Interakcje te są zapewniane przez białka połączeniowe, które tworzą połączenia między sąsiednimi komórkami. Błędna lokalizacja białek połączeniowych i zmniejszone fizyczne powiązania z ich partnerami wiążącymi mogą prowadzić do utraty funkcji, a w konsekwencji do dysfunkcji narządów. W związku z tym identyfikacja lokalizacji białek i interakcji białko-białko (IPP) w tkankach prawidłowych i związanych z chorobą jest niezbędna do znalezienia nowych dowodów i mechanizmów prowadzących do progresji chorób lub zmian w statusie rozwojowym. W artykule przedstawiono dwuetapową metodę oceny IPP w mysich gruczołach sutkowych. W sekcji 1 protokołu opisano metodę przeprowadzania koimmunofluorescencji (co-IF) przy użyciu przeciwciał podniesionych przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie przeciwciał drugorzędowych znakowanych fluorochromami. Chociaż co-IF pozwala na wykazanie bliskości białek, umożliwia badanie ich fizycznych interakcji. W związku z tym szczegółowy protokół koimmunoprecypitacji (co-IP) znajduje się w punkcie 2 protokołu. Metoda ta służy do określania oddziaływań fizycznych między białkami, bez potwierdzania, czy oddziaływania te są bezpośrednie, czy pośrednie. W ciągu ostatnich kilku lat techniki co-IF i co-IP wykazały, że niektóre składniki połączeń międzykomórkowych kolokalizują się i oddziałują ze sobą, tworząc zależne od etapu węzły połączeniowe, które zmieniają się podczas rozwoju gruczołu sutkowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost i rozwój gruczołu sutkowego następuje głównie po urodzeniu. Narząd ten nieustannie się przebudowuje przez cały okres reprodukcji ssaka1. Dorosły nabłonek gruczołu sutkowego składa się z wewnętrznej warstwy komórek nabłonka światła i zewnętrznej warstwy komórek podstawnych, składającej się głównie z komórek mioepitelialnych, otoczonej błoną podstawną2. Aby uzyskać dobry przegląd na temat budowy i rozwoju gruczołu sutkowego, czytelnik może zapoznać się z Sternlicht1. Interakcje komórka-komórka poprzez połączenia szczelinowe (GJ), ścisłe (TJ) i adherens (AJ) są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcji gruczołu1,3,4,5,6. Głównymi składnikami tych połączeń w mysim gruczole sutkowym są Cx26, Cx30, Cx32 i Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 i -7 oraz ZO-1 (TJ); oraz E-kadheryna, P-kadheryna i β-katenina (AJ)7,8. Poziomy ekspresji tych różnych białek połączeniowych zmieniają się w sposób zależny od etapu rozwoju gruczołu sutkowego, co sugeruje zróżnicowane wymagania dotyczące interakcji komórka-komórka9. GJ, TJ i AJ są połączone strukturalnie i funkcjonalnie i wiążą inne białka strukturalne lub regulatorowe z sąsiednimi miejscami sąsiednich komórek, tworząc w ten sposób węzeł węzłowy 10. Skład węzła połączeniowego może wpływać na mostkowanie z leżącym poniżej cytoszkieletem, a także na przepuszczalność i stabilność węzła, a w konsekwencji może wpływać na funkcję gruczołu8,9,10,11. Składniki połączeń międzykomórkowych znajdujących się w węzłach połączeniowych lub oddziałujących ze sobą na różnych etapach rozwoju gruczołu sutkowego analizowano ostatnio za pomocą koimmunofluorescencji (co-IF) i koimmunoprecypitacji (co-IP)9. Podczas gdy inne techniki pozwalają na ocenę funkcjonalnego związku między białkami, metody te nie zostały przedstawione w tym manuskrypcie.

Ponieważ białka działają samodzielnie do funkcjonowania, badanie interakcji białko-białko (PPI), takich jak transdukcje sygnału i kaskady biochemiczne, jest niezbędne dla wielu badaczy i może dostarczyć istotnych informacji na temat funkcji białek. Co-IF i analiza mikroskopowa pomagają ocenić kilka białek, które dzielą tę samą przestrzeń subkomórkową. Jednak liczba celów jest ograniczona przez przeciwciała, które muszą być hodowane u różnych zwierząt, oraz przez dostęp do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w lasery o różnej długości fali i detektor spektralny do multipleksowania. Co-IP potwierdza lub ujawnia oddziaływania fizyczne o wysokim powinowactwie między dwoma lub więcej białkami znajdującymi się w kompleksie białkowym. Pomimo rozwoju nowych technik, takich jak transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET)12 i test ligacji zbliżeniowej (PLA)13, które mogą jednocześnie wykrywać lokalizację i interakcje białek, co-IP pozostaje odpowiednią i niedrogą techniką do badania interakcji między endogennymi białkami.

Metoda krok po kroku opisana w tym manuskrypcie ułatwi badanie lokalizacji białek i IPP oraz wskaże pułapki, których należy unikać podczas badania endogennych IPP w gruczołach sutkowych. Metodologia rozpoczyna się od przedstawienia różnych procedur konserwacji tkanek wymaganych dla każdej techniki. W części 1 przedstawiono, jak badać kolokalizację białek w trzech etapach: i) podział gruczołów sutkowych, ii) podwójne lub potrójne znakowanie różnych białek przy użyciu techniki co-IF oraz iii) obrazowanie lokalizacji białek. Część 2 pokazuje, jak wytrącić endogenne białko i zidentyfikować jego oddziałujące białka w trzech etapach: i) przygotowanie lizatu, ii) pośrednia immunoprecypitacja białek oraz iii) identyfikacja partnera wiążącego za pomocą SDS-PAGE i Western blot. Każdy etap tego protokołu jest zoptymalizowany pod kątem tkanek gruczołu sutkowego gryzoni i generuje wysokiej jakości, specyficzne i powtarzalne wyniki. Protokół ten może być również wykorzystany jako punkt wyjścia do badań IPP w innych tkankach lub liniach komórkowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Identyfikacja kolokalizacji białek

  1. Od szkiełek higienicznych do szkiełek mikroskopowych
    UWAGA: Chusteczki i skrawki należy obchodzić na suchym lodzie.
    1. Wyciąć gruczoły sutkowe od zwierzęcia (pełny opis tej procedury znajduje się w Plante i wsp.)14.
    2. Zanurzyć wyciętą tkankę w podłożu do zamrażania/mocowania na suchym lodzie. Dodaj tyle podłoża, aby pokryć gruczoł. Gdy podłoże zastygnie, przenieś tkanki do zamrażarki w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania9.
    3. Za pomocą kriomikrotomu ustawionego na ≤ -35 °C pociąć tkanki na odcinki o grubości 7-10 μm i umieścić je na szkiełkach mikroskopowych.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, umieść dwie sekcje na każdym slajdzie; Lewa sekcja zostanie wykorzystana jako kontrola ujemna w celu sprawdzenia swoistości przeciwciał i autofluorescencji tkanki, podczas gdy prawa strona zostanie oznaczona przeciwciałami.
    4. Utrzymuj sekcje w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Barwienie Co-IF
    1. Wyjmij odpowiednie mikroskopijne szkiełka z zamrażarki i natychmiast przymocuj sekcje, zanurzając je w formaldehydzie 4% na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Następnie zanurz szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej. Pozostaw szkiełka w PBS w temperaturze pokojowej do czasu przejścia do następnego kroku.
    3. Zakreśl każdą sekcję szkiełka za pomocą dostępnej w handlu bariery hydrofobowej lub wodoodpornego pisaka laboratoryjnego (patrz tabela materiałów). Uważaj, aby nie dotknąć tkanki. Natychmiast dodaj krople PBS do tkanki i umieść szkiełko w wilgotnej komorze histologicznej na pozostałą część zabiegu.
      UWAGA: Skrawki tkanki muszą pozostać nawilżone. Alternatywnie użyj pudełka z pokrywką i połóż mokre ręczniki papierowe na dnie.
    4. Zablokować każdy wycinek tkanki 100-200 μl 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)-tris-buforowanej soli fizjologicznej (TBS)-0,1% polisorbatu 20 (patrz tabela materiałów) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas gdy próbki blokują się, przygotuj pierwszorzędowe i drugorzędowe roztwory przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała w TBS-0,1% polisorbat 20,
      UWAGA: Wymagane stężenie przeciwciała jest podane przez producenta; zob. tabelę materiałów oraz rysunki 1 i 2 dla przykładów, a także Dianati i wsp.9. Chociaż nie jest konieczne wykonywanie pracy w ciemności podczas korzystania z większości przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, unikaj wystawiania roztworów przeciwciał lub poplamionych tkanek na intensywne, jasne światło.
    5. Usunąć roztwór blokujący przez aspirację i inkubować skrawki rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego w 100-200 μl przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego przez aspirację i przemyć skrawki 250-500 μl TBS-0,1% polisorbatu 20 przez 5 minut. Usunąć roztwór płuczący przez aspirację i powtórzyć płukanie dwukrotnie.
    7. Usunąć roztwór płuczący przez aspirację i inkubować skrawki z 100-200 μl odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Usunąć roztwór przeciwciała wtórnego przez aspirację i przemyć skrawki 250-500 μl TBS-0,1% polisorbatu 20 przez 5 minut. Usunąć roztwór płuczący i powtórzyć dwukrotnie.
    9. Powtórzyć krok 2.5-2.8, stosując odpowiednią kombinację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych dla kolejnych białek będących przedmiotem zainteresowania.
    10. Usunąć roztwór płuczący przez aspirację i przeprowadzić barwienie jąder przez inkubację przekroju ze 100-200 μl 1 mg/ml 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w TBS-0,1% polisorbatu 20 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Usunąć roztwór DAPI przez zasysanie i zamontować szkiełka za pomocą rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego medium montażowego (patrz Tabela Materiałów) i szkiełek nakrywkowych. Postępuj krok po kroku.
      UWAGA: Inkubacja barwienia jądra przez ponad 5 minut nie zmieni intensywności barwienia. Alternatywnie, usunąć roztwór DAPI ze wszystkich szkiełek i inkubować tkanki w PBS podczas montażu szkiełek.
    12. Umieścić szkiełka podstawowe w lodówce o temperaturze 4 °C na co najmniej 8 godzin. Przystąpić do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz rysunki 1 i 2).
  3. Obrazowanie mikroskopowe
    1. Wizualizuj przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w różne lasery wymagane do wzbudzenia fluoroforów na ich określonych długościach fal.
      Uwaga: Aby móc uwidocznić przewody i pęcherzyki płucne, sugerowany jest obiektyw 40X z aperturą numeryczną 0,95. Przykład konkretnych ustawień przedstawiono na rysunku 1.
    2. Sprawdź lokalizację każdego białka indywidualnie, skanując obraz o jedną długość fali na raz.
      Uwaga: Na tym etapie ważne jest, aby krytycznie przeanalizować lokalizację białek połączeniowych. Aby móc tworzyć węzły połączeniowe, białka te muszą być zlokalizowane w błonie plazmatycznej.
    3. Określ kolokalizację białek, łącząc obrazy zeskanowane za pomocą laserów na różnych długościach fali.
      Uwaga: Kolokalizacja białek może być wizualizowana przez zmianę koloru wynikającą z emisji dwóch lub więcej fluoroforów w tym samym miejscu i może być mierzona za pomocą odpowiedniego oprogramowania (Rysunki 1 i 2; patrz również Odnośnik 9).

2. Badanie IPP

UWAGA: Gruczoły sutkowe w jamie brzusznej powinny być używane do badania IPP, ponieważ gruczoły piersiowe są ściśle związane z mięśniami piersiowymi. Wyciąć gruczoły sutkowe (pełny opis tej procedury znajduje się w Plante i wsp.)14 i utrzymuj je w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

  1. Przygotowanie lizatu
    1. Umieść papier wagowy i probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml na suchym lodzie, aby je wstępnie schłodzić przed przystąpieniem do kolejnych kroków.
    2. Pobrać tkankę gruczołu mlekowego o temperaturze od -80 °C i przechowywać ją na suchym lodzie.
    3. Zważyć chusteczki na wstępnie schłodzonych bibułkach wagowych, a następnie przenieść tkankę do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml (uchwyt na suchym lodzie). Należy użyć od 50 do 100 mg tkanki na próbkę. Chusteczkę należy trzymać na suchym lodzie do kroku 2.1.5.
    4. Przygotować wymaganą ilość buforu do lizy potrójnego detergentu uzupełnionego NaF, NaVO3 i inhibitorem proteazy/fosfatazy, jak wskazano w tabeli materiałów, stosując następujące wzory. Myszy: wymagany bufor (μL) = masa tkanki myszy (mg) x 3; Szczur: wymagany bufor (μL) = masa tkanki szczura (mg) x 5.
    5. Dodać wymaganą ilość lodowatego buforu do lizy (obliczoną w kroku 2.1.4) do probówki o pojemności 2 ml zawierającej tkankę.
      UWAGA: W krokach 2.1.5-2.1.6 postępuj z jedną rurką na raz.
    6. Homogenizuj tkankę przez 30-40 sekund, stosując ciągłą homogenizację na młynku do tkanek; zawsze trzymaj probówkę na lodzie. Ustaw homogenizator tkankowy na średnią prędkość i delikatnie przesuwaj młynek w górę iw dół wewnątrz tuby.
    7. Powtórz kroki 1.6 i 1.7 z pozostałymi probówkami.
    8. Inkubować lizaty na lodzie przez 10-30 min.
    9. Odwirować probówki o sile 170 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. W międzyczasie zidentyfikuj 6-10 probówek do mikrowirówek (0,6 ml) dla każdej próbki i trzymaj je na lodzie.
    11. Po zakończeniu wirowania sprawdź probówki. Upewnij się, że zawierają górną warstwę tłuszczu, klarowne, żółte do różowych lizaty (w zależności od etapu rozwoju) i osad.
    12. Utwórz otwór w warstwie lipidowej za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby uzyskać dostęp do fazy ciekłej. Zmień końcówkę i zbierz lizat bez naruszania osadu lub zasysania warstwy lipidowej. Podwielokrotność lizatu rozmieścić w uprzednio oznakowanych probówkach na lodzie (etap 2.1.11) i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    13. Użyć podwielokrotności do ilościowego określenia stężenia białka przy użyciu odpowiedniego zestawu dostępnego w handlu (patrz tabela materiałów).
  2. Immunoprecypitacja pośrednia
    1. Na lodzie rozmrozić dwie podwielokrotności całkowitego lizatu gruczołu mlekowego przygotowanego wcześniej.
      UWAGA: Jedna podwielokrotność zostanie użyta do IP białka docelowego, podczas gdy druga posłuży jako kontrola ujemna.
    2. Zebrać 500-1,000 μg lizatu i rozcieńczyć go w PBS, aby osiągnąć końcową objętość 200 μl w każdej probówce 1,5 ml.
      UWAGA: Ilość lizatu, która ma być użyta, zależy od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania i skuteczności przeciwciała (patrz rysunek 3 dla przykładu, a także tabela materiałów). Aby zoptymalizować dla każdego celu, należy użyć różnych ilości lizatu (tj. 500, 750 i 1,000 μg) i przeciwciał (tj. 5, 10 i 20 μg). Wykonaj następujące czynności (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Dodać przeciwciało przeciwko badanemu antygenowi do pierwszej probówki lizatu i trzymać ją na lodzie.
      UWAGA: Wymagana ilość jest zwykle sugerowana w instrukcji dostarczanej przez każdą firmę (patrz Tabela Materiałów).
    4. W drugiej probówce przygotować kontrolę ujemną, dodając takie samo stężenie kontrolnej izotypu IgG, jak przeciwciało użyte w kroku 2.2.3.
    5. Inkubować probówki przez noc w temperaturze 4 °C na mieszalniku rurowym z małą prędkością.
    6. Następnego dnia dodaj 50 μl kulek magnetycznych do nowych probówek o pojemności 1,5 ml w celu prania wstępnego.
      1. Wybierz kulki magnetyczne białka A lub białka G w oparciu o względne powinowactwo do przeciwciała.
      2. Ważne jest, aby unikać używania zagregowanych kulek; delikatnie wymieszaj zawiesinę kulek, aż zostanie równomiernie ponownie zawieszona przed dodaniem jej do probówek.
    7. Umieść rurki zawierające koraliki na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom migrować do magnesu. Usuń bufor do przechowywania z kulek za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
    8. Umyj kulki, dodając 500 μl PBS-0,1% polisorbatu 20 i energicznie wiruj probówki przez 10 sekund.
    9. Umieść rurki z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom migrować do magnesu.
    10. Usunąć nadmiar buforu do płukania, pipetując pipetą o pojemności 200 μl.
    11. Dodać kompleks reakcyjny (lizat-przeciwciało) z kroku 2.2.5 do kulek i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej na mieszalniku rolkowym.
    12. Umieść rurki na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom migrować do magnesu. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl odessać i wyrzucić lizat, a następnie umieścić probówki na lodzie.
    13. Umyj kulki, dodając 500 μl PBS, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym i usuwając płyn za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Powtórz ten krok prania. Na etapach mycia należy unikać wirowania i utrzymywać próbki na lodzie.
    14. Umyj kulki raz PBS-0,1% polisorbatem 20 bez wirowania i wyrzuć ostatni bufor do płukania za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl.
    15. Aby wymyć, dodaj 20 μl 0,2 M kwaśnej glicyny (pH = 2,5) do probówek i potrząsaj nimi przez 7 minut na mieszadle rolkowym.
    16. Wirować z dużą prędkością przez kilka sekund (szybkie wirowanie) i zebrać supernatant w świeżej, lodowatej probówce.
    17. Powtórz kroki 2.2.14 i 2.2.15 dla każdej tube.
      UWAGA: Ostateczna objętość wyniesie 40 μL.
    18. Dodać 10 μl 4x buforu Laemmli do 40-μl eluowanej próbki z kroku 2.2.16.
      UWAGA: Kolor zmieni kolor na żółty z powodu kwaśnego pH.
    19. Natychmiast dodać 1 M Tris (pH = 8), po jednej kropli na raz, do eluowanej próbki od kroku 2.2.18, aż jej kolor zmieni kolor na niebieski. Przejdź do kolejnych rurek.
    20. Gotować próbki z etapu 2.2.18 w temperaturze 70-90 °C przez 10 minut. Natychmiast przejść do elektroforezy żelowej. Alternatywnie, przenieść próbki do zamrażarki w temperaturze -80 °C do momentu załadunku.
  3. Dalsza aplikacja: elektroforeza żelowa, a następnie Western blot
    1. Przygotuj żele akryloamidowe SDS-PAGE (grubość 1,5 mm) do oddzielania i układania w stosy zgodnie ze standardowymi procedurami15.
      UWAGA: Wybór żelu (8-15% akrylamidu, gradient: patrz Tabela Materiałów) powinien być określony na podstawie wielkości cząsteczki białka, które ma być wytrącone, oraz potencjalnych partnerów wiążących, które mają być analizowane. Białka te muszą być oddzielone od siebie, aby umożliwić prawidłowe wykrycie immunologiczne.
    2. Próbki eluowane przez immunoprecypitację (IP) rozmrozić (etap 2.2.20) na lodzie.
    3. Przygotować lizaty białkowe z tych samych próbek (użytych do powyższej procedury IP). Użyć 50 μg całkowitego lizatu i dodać 4X bufor do próbki Laemmli. Próbki gotować w temperaturze 70–90 °C przez 5 minut i umieszczać na lodzie do momentu załadunku.
      UWAGA: Próbki te zostaną załadowane obok eluowanej próbki IP, aby wykazać obecność wytrąconych białek w całkowitym lizacie.
    4. Załadować przygotowane lizaty z kroku 2.3.3 i wytrącone próbki z kroku 2.2.20 obok siebie do żelu akrylowo-amidowego i umieścić je w buforze bieżącym (10x bufor bieżący: 30,3 g Tris, 144,1 g glicyny i 10 g SDS w 1 litrze wody destylowanej) pod napięciem 100 V przez około 95 minut lub do momentu, gdy krawędź migrujących białek dotrze do dna żelu.
    5. Przenieś żele na membranę nitrocelulozową lub PVDF przy użyciu standardowego protokołu9,15.
    6. Zablokuj membranę na 1 godzinę na bujaku na niskich obrotach w 5% suchym mleczku-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl i 0,05% polisorbatu 20).
    7. Określ, czy opady się powiodły.
      1. Zbadać błonę przy użyciu pierwszego przeciwciała przeciwko wytrąconemu białku, rozcieńczonego w 5% suchym mleku TTBS w stężeniu zalecanym przez producenta, przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej z powolnym mieszaniem.
        UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z zaleceniami.
      2. Następnego dnia umyj membranę 3 razy po 5 minut za pomocą TTBS na bujanej platformie z dużym mieszaniem.
      3. Inkubować błonę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonym w TTBS, przez 1 godzinę w temperaturze suchej atr na platformie kołyszącej z powolnym mieszaniem.
        UWAGA: Alternatywnie można zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorochromem, jeśli dostępna jest odpowiednia aparatura do wykrywania sygnału.
      4. Wykonaj od 3 do 6 prań, każde przez 5 minut, z TTBS na bujanej platformie z dużym mieszaniem. Przeanalizować sygnał przeciwciała drugorzędowego, inkubując membranę z dostępnym w handlu roztworem luminolu (patrz Tabela materiałów) i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wykryj sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego (patrz tabela materiałów).
        UWAGA: Szczegółowy protokół analizy Western blot znajduje się w Odnośniku 16.
    8. Aby zidentyfikować białka oddziałujące na siebie, wykonaj kroki 2.3.7.1-2.3.7.4, używając odpowiednich przeciwciał na tym samym blot.
      UWAGA: Jeśli białka wchodzą w interakcje, partnerzy wiążący będą równoimmunoprecypitowani z białkiem docelowym, a zatem będą wykrywalni przez Western blot. Krok 2.3.8 można powtórzyć z większą liczbą przeciwciał w celu określenia, czy inne białka znajdują się w tym samym kompleksie białkowym, o ile masy cząsteczkowe białek różnią się na tyle, aby były dobrze oddzielone na żelu i błonie.
    9. Aby potwierdzić, że zidentyfikowani partnerzy powiązań nie są artefaktami, należy wykonać odwrotny adres IP.
      UWAGA: Odbywa się to poprzez powtórzenie kroków 2.2.1-2.2.20 z tym samym lizatem, ale wytrącając jednego z partnerów wiążących określonych w kroku 3.8. Następnie kroki 3.1-3.8 powtarza się przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko pierwszemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ustalić, czy komponenty GJ, AJ i TJ mogą oddziaływać ze sobą w gruczole sutkowym, najpierw przeprowadzono testy co-IF. Cx26, białko GJ i β-katenina, białko AJ, były badane za pomocą specyficznych przeciwciał i ujawnione za pomocą sprzężonych z fluoroforem przeciwciał myszy-647 (zielony, pseudokolor) i kozy-568 (czerwony) odpowiednio (Figura 1B i C). Dane wykazały, że kolokalizują się one na błonie komórkowej komórek nabłonkowych gruczołu sutkowego mys...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje komórka-komórka za pośrednictwem połączeń są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania i rozwoju wielu narządów, takich jak gruczoł sutkowy. Badania wykazały, że białka połączeniowe mogą regulować funkcję i stabilność siebie nawzajem oraz aktywować transdukcję sygnału poprzez wiązanie się nawzajem na błonie komórkowej10. Protokoły przedstawione w obecnym manuskrypcie dostarczyły interesujących odkryć na temat różnicowej ekspresji, lokalizacji i interakcji białek połączeniowych podczas no...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I.P. jest finansowany z grantu Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC #418233-2012); Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), nagrody Quebec Breast Cancer Foundation oraz grantu Leader Founds z grantu Canadian Foundation for Innovation. E.D. otrzymał stypendium od Fondation universitaire Armand-Frappier.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szczep i stadium myszySt. Constant, Quebec, KanadaC57BL/6 Femals; 18. dzień ciąży (P18) i 14. dzień laktacji (L14), Charles River Kanada 
PBS 10x (magazyn)1) Rozpuść 80 g NaCl (FW: 58.44), 2 g KCl (FW 74.55), 26.8 g Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) i 2.4 g KH2PO4 (FW:136.09) w 800 ml wody destylowanej;
2) Dostosuj pH do 7,4;
3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.
TBS 10x (podstawowy)1) Rozpuść 60,5 g TRIS, 87,6 g NaCl w 800 ml wody destylowanej;
2) Dostosuj pH do 7,5;
3) Dodaj wodę, aby osiągnąć końcową objętość 1 l.
Część 1: Immunofluorescencja
Zamrażanie podłożaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Kanada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Kanada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Kriostat 115 V 60 Hz
OstrzaC.L. Sturkey, Inc. Les Produits  Scientifiques  ESBE  St-Laurent, QC, KanadaBLM1001CWysokoprofilowe ostrza pokryte złotem
Pióro PapCedarlane, Burlington, ON, Kanada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific, Burlington, ON, Kanada12-550-15Fisherbrand  Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus
FormaldehydBioShop Canada Inc, Burlington, ON, KanadaFOR201.1Forlmadehyde
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, Kalifornia, USA
Roztwór3% BSA w TBS
RoztwórTBS-Tween 20 0,1%
Polisorbat 20Oakville, ON, KanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Media montażoweCedarlane, Burlington, ON17984-25 (EM)Fluoromount-G
Pierwsze i drugorzędowe przeciwciałaSygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeE-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) 1/50 (sygnalizacja komórkowa) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Sygnalizacja komórkowa 
Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) z anty-króliczą IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Sygnalizacja komórkowa) 
Przeciwciała pierwszo- i drugorzędowe Santa Cruz Biotechnology, Inc., Kalifornia, Stany Zjednoczone; Fischer Scientific, Burlington, ON, Kanada Zobacz komentarzeβ-Przeciwciało kateninowe (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) z anty-kozimi IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), sonda molekularna (Fisher Scientific)
Przeciwciała pierwsze i wtórne Technologie życiowe, Waltham, MA, Stany Zjednoczone i Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) z anty-mysim IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Barwienie jąderFisher Scientific, Burlington, ON, KanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylalldole, Dichlorowodorek) 1/1,000 w PBS
Mikroskop fluorescencyjnyNikon Kanada, Mississauga, On, KanadaKonfokalny laser mikroskopowy Nikon A1R+ wyposażony w detektor spektralny 
Oprogramowanie do analizy obrazów IFNikon Kanada, Mississauga, On, KanadaOprogramowanie do elementów NIS (wersja 4)
Część 2: Immunoprecypitacja
Triple-detergent Lysis buffer (100  mL) pH=8,01) Wymieszać 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150  mM NaCl (FW: 58,44), 0,02% Azek sodu, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% deoksycholan sodu w 80 ml destylowany H2O.
2) Dostosuj pH do 8,0 za pomocą HCl 6  N (~0,5  ml).
3) Dostosuj głośność do 100  mL. Przechowywać w lodówce.
W dniu ekstrakcji białka należy użyć 1/100 NaVo3, 1/100 inhibitora proteazy/fosfatazy i 1/25 NAF w obliczonej ilości buforu do lizy potrójnego detergentu:
Fluorek sodu (podstawowy) roztwór 1,25  M (F.W.: 41.98), Orthowandan sodu (zapas) Roztwór 1  M (F.W.: 183.9)
Inhibitor proteazy/fosfatazyFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy, bez EDTA (100x)
Dawkowanie białkaThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA 
Młynek do tkanekFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Koraliki magnetyczne i podstawkaMillipore, Etobicoke, ON, KanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Roztwór do płukania dla IPPBS lub PBS-Tween20 0,1% w zależności od kroku
Podstawowe przeciwciała do immunoprecypitacjiSygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeIgG Królik (królik (DA1E) mAb IgG Kontrola izotypu (#3900s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacjiSygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeIgG Mysz mysz (G3A1) mAb IgG Kontrola izotypu (#5415s) (sygnalizacja komórkowa) 0,5 i mikro; L/200 &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała immunoprecypitacyjneSigma-Aldrich, Oakville, ON, KanadaZobacz komentarzeConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  &mikro; L/200  &mikro; L
Pierwszorzędowe przeciwciała do immunoprecypitacjiSygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USAZobacz komentarzeE-kadheryna (4A2) Mysi mAb (#14472s) (sygnalizacja komórkowa) 1 i mikro; L/200 &mikro; L
Bufor Laemmli BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Kanada16107474x bufor do próbek Laemmli (dodać β-merkaptoetanol zgodnie z zaleceniami producenta)
Glicyna kwasowa Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50,2 M glicyna; dostosuj pH = 2,5 za pomocą HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE żele akrylowe BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutions (7,8%, 10%, 12%)
Bufor biegowy 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704272Tris 30.3  g/glicyna 144,1  g /SDS 10  g in 1 l wody destylowanej
MembranyBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704272Membrany PVDF, Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF
Metoda transferuBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1704155System Turbo Transferu Trans-Blot
Suche mlekoSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, KanadaBeztłuszczowe odtłuszczone mleko w proszku instant,
roztwór blokujący goździk dla blot5% mleko w proszku w TBS-Tween 20 0,1%
Roztwory myjące do blotówTBS-Tween 20 0,1%
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko bleksom (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, KanadaZobacz komentarzeConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)Sygnalizacja komórkowa, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, KanadaZobacz komentarzeE-kadheryna (24E10) królicze mAb 1/1,000 (#3195s) (sygnalizacja komórkowa) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, KanadaZobacz komentarzeClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała drugorzędowego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Pierwszorzędowe i drugorzędowe przeciwciała przeciwko blot (10  mL)Life technologies, Waltham, MA, Stany Zjednoczone & Abcam, Toronto, ON, KanadaZobacz komentarzeClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 z Veriblot sprzężonym z HRP dla przeciwciała wtórnego IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Kanada)
Roztwór luminolu do wykrywania sygnału na blotBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate Imaging Blot Blot Blot
BlotBIO-RAD, Mississauga, ON, Kanada1708280Obrazowanie ChemiDoc MP system
Analayzing blotBIO-RAD, Mississauga, ON, KanadaOprogramowanie ImageLab 5.2 
blokujący do mycia

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein protein InteractionsCo immunofluorescenceCo immunoprecipitationGap JunctionsTight JunctionsAdherens JunctionsMammary GlandsFluorescence MicroscopyWestern BlotMagnetic Beads

Related Articles