Method Article

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

DOI:

10.3791/55773

⸱

June 16th, 2017

 , 
1Department of Medical Genetics, Institute of Biomedicine, Gothenburg University, 2Department of Clinical Chemistry and Transfusion Medicine, Institute of Biomedicine, Gothenburg University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola długich niekodujących RNA (lncRNA) w raku wysuwa się na pierwszy plan ze względu na rosnące zainteresowanie zrozumieniem ich mechanistycznych funkcji podczas rozwoju i progresji raka. Mimo to globalna regulacja epigenetyczna lncRNA i powtarzających się sekwencji w nowotworach nie została dobrze zbadana, szczególnie w przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL). Badanie to koncentruje się na unikalnym podejściu: opartym na immunoprecypitacji wychwytywaniu dwuniciowych, metylowanych fragmentów DNA przy użyciu białek domeny wiążącej metyl (MBD), a następnie sekwencjonowaniu nowej generacji (MBD-seq). W badaniu wykorzystano próbki pacjentów z PBL należące do dwóch podgrup prognostycznych: (5 próbek z mutacją IGVH + 5 próbek niezmutowanych IGVH). Analiza wykazała 5 800 hipermetylowanych i 12 570 hipometylowanych genów specyficznych dla CLL (cllDMG) w porównaniu z normalnymi zdrowymi grupą kontrolną. Co ważne, wyniki te zidentyfikowały kilka specyficznych dla CLL, różnicowo metylowanych lncRNA, powtarzających się elementów i genów kodujących białka o potencjalnej wartości prognostycznej. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół dla sekwencyjnego MBD i bioinformatycznego potoku opracowanego w celu kompleksowej analizy globalnych profili metylacji w regionach o wysokiej zawartości CpG przy użyciu próbek pacjentów z CLL. Na koniec gen kodujący białko i lncRNA poddano walidacji za pomocą pirosekwencjonowania, które jest wysoce ilościową metodą analizy poziomów metylacji CpG w celu dalszego potwierdzenia ustaleń z protokołu MBD-seq.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie technik sekwencjonowania nowej generacji do analizy globalnych profili metylacji DNA stało się w ostatnich latach coraz bardziej popularne. Testy metylacji całego genomu, w tym metody oparte na mikromacierzach i bez mikromacierzy, opracowano w oparciu o: konwersję wodorosiarczynu genomowego DNA, trawienie enzymem restrykcyjnym wrażliwym na metylację oraz immunoprecypitację metylowanego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla metylu CpG.

Nieprawidłowa metylacja DNA jest jedną z cech charakterystycznych białaczki i chłoniaków, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL). Wcześniej kilka grup, w tym nasza, scharakteryzowało profile metylacji DNA różnych podgrup prognostycznych PBL i normalnych, zdrowych kontroli komórek B za pomocą konwersji wodorosiarczynowej genomowego DNA, a następnie metod opartych na mikromacierzach lub sekwencjonowania całego genomu1,2,3,4. Konwersja wodorosiarczynowa genomowego DNA prowadzi do deaminacji niezmodyfikowanych cytozyn do uracylu, pozostawiając zmodyfikowane metylowane cytozyny w genomie. Po przekształceniu status metylacji DNA można określić za pomocą amplifikacji i sekwencjonowania PCR przy użyciu różnych metod ilościowych lub jakościowych, takich jak sekwencjonowanie wodorosiarczynowe oparte na mikromacierzach lub całego genomu (WGBS). Chociaż metody oparte na konwersji wodorosiarczynów mają wiele zalet i są szeroko stosowane w różnych typach nowotworów do analizy poziomów metylacji DNA, istnieje kilka wad związanych z tą techniką. Sekwencjonowanie WGBS umożliwia rozdzielczość pojedynczej pary zasad przy mniejszych ilościach DNA i jest najlepszą opcją do analizy dużej liczby próbek. Jednak ta metoda nie jest w stanie rozróżnić modyfikacji między poziomami 5 mC i 5 hmC w genomie5,6. Ponadto metody oparte na mikromacierzach nie zapewniają pełnego pokrycia genomu.

W niedawnym badaniu z naszego laboratorium7, metody oparte na immunoprecypitacji, a nie konwersji wodorosiarczynów, zostały użyte do identyfikacji wysoce bogatych w CpG, różnicowo metylowanych regionów w skali globalnej u pacjentów z PBL i normalnych zdrowych osób z grupy kontrolnej. Sekwencjonowanie nowej generacji domeny wiążącej inmetylo-CpG (MBD) (MBD-seq), wzbogacenie dwuniciowego fragmentarycznego DNA zależy od stopnia metylacji CpG. Metoda ta może przezwyciężyć wady metody konwersji wodorosiarczynu, a także może zapewnić pokrycie całego genomu metylacją CpG w sposób bezstronny i niezależny od PCR. Dodatkowo, w przeciwieństwie do metod mikromacierzy opartych na konwersji wodorosiarczynu, MBD-seq może być używany do analizy stanu metylacji powtarzających się elementów, takich jak długie przeplatane elementy jądrowe (LINE), krótkie przeplatane elementy jądrowe (SINE), długie powtórzenia końcowe (LTRS) itp. Jednak w porównaniu z metodami konwersji wodorosiarczynów, protokół MBD-seq wymaga stosunkowo dużej ilości wejściowego DNA. Ponadto jakość odczytów sekwencjonowania i danych zależy od swoistości, powinowactwa i jakości zastosowanych przeciwciał.

Obecne badanie wyjaśnia szczegółowy protokół MBD-seq do wzbogacania metylowanego DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Wykorzystuje komercyjny zestaw do wzbogacania wiązania metylowanego DNA (wymieniony w tabeli materiałów), a także potok obliczeniowy do wizualizacji i interpretacji danych sekwencjonowania metylacji w celu identyfikacji specyficznych dla CLL regionów hiper- i hipometylowanych w porównaniu z normalnymi zdrowymi kontrolami. Zasadniczo metoda ta wykorzystuje zdolność MBD ludzkiego białka MBD2 do interakcji z metylowanymi CpG do ekstrakcji DNA wzbogaconego metylowanymi CpG, a następnie następuje wysokoprzepustowe sekwencjonowanie metylowanego DNA.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etyczna zgoda na pobieranie próbek CLL pochodzi z 2007-05-21, z następującym numerem rejestracyjnym: EPN Gbg dnr 239/07. Wszyscy pacjenci z PBL zostali zdiagnozowani zgodnie z niedawno zmienionymi kryteriami8, a próbki zostały pobrane w momencie diagnozy. Do badania włączono pacjentów z różnych oddziałów hematologii w zachodniej części Szwecji po uzyskaniu pisemnej zgody. W tym badaniu wybrano tylko próbki komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z procentem komórek białaczkowych w guzie ≥70%.

1. Przygotowania

  1. Wyizolować PBMC do ekstrakcji DNA z PBL i normalnych, zdrowych próbek krwi obwodowej za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Autoklaw w probówkach 1,5 ml. Rozmrozić wszystkie odczynniki w zestawie do wiązania metylowanego DNA (patrz tabela materiałów).
  3. Użyj wody wolnej od DNaz, aby przygotować 10 ml 1x buforu do płukania kulek z 5x bufora do płukania dostarczonego przez zestaw, aby umyć kulki i rozcieńczyć białko MBD dostarczone przez zestaw.
  4. Zaopatrz się lub przygotuj wcześniej następujące elementy: 3 M octan sodu, etanol absolutny i 70% etanol do wytrącania DNA (tabela materiałów).

2. Ekstrakcja genomowego DNA i sonikacja

  1. Użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA (tabela materiałów), aby wyizolować genomowe DNA z próbek pacjenta i normalnych PBMC zgodnie z protokołem producenta. Określić ilościowo genomowe DNA za pomocą spektrofotometru przy 260 nm.
    UWAGA: Pojemność kolumny do ekstrakcji DNA wynosi maksymalnie 5-6 milionów komórek; Dlatego ważne jest, aby używać więcej niż jednej kolumny dla próbek zawierających więcej niż 5 milionów komórek. Eluować DNA dwukrotnie w równych objętościach, co daje łącznie 100 μl 10 mM buforu Tris EDTA (TE). Białko MBD-biotyny stosowane w zestawie do wydobywania metylu do sekwencjonowania MBD nie wiąże się z jednoniciowym DNA. Dlatego bardzo ważne jest, aby wymywane DNA było zamrożone lub w temperaturze 4 °C, aby zachować jego dwuniciowy charakter.
  2. Rozcieńczyć 5 μg genomowego DNA z każdej próbki do łącznej objętości 200 μl przy użyciu buforu TE (pH 8), uzyskując końcowe stężenie 25 ng/μl.
  3. Wykonaj sonikację w specjalnie zaprojektowanych probówkach za pomocą sonikatora (Tabela Materiałów) przez łącznie 30 cykli (30 s na cykl i 30 s na cykl; po każdych 5 cyklach krótko zakręć probówkami, aby zebrać próbki na dno).
    UWAGA: W ten sposób powstanie fragmentaryczne DNA o gęstości od 150 pz do 300 pz, co jest optymalne dla tego protokołu.
  4. Sprawdź zakres sonikacji dla wszystkich próbek przed przejściem do następnego etapu sekwencjonowania MBD, uruchamiając 1 μl rozdrobnionych próbek DNA i drabinkę wielkości DNA na dostępnym na rynku, wstępnie odlanym 2% żelu agarozowym przy użyciu sprzętu do obrazowania elektroforezy DNA. Wizualizacja DNA za pomocą standardowego transiluminatora UV.

3. Przygotowanie kulek przed wiązaniem z białkiem MBD-biotyny

  1. Zawiesić magnetyczne kulki streptawidyny z rurki dołączonej do zestawu, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Nie obracaj koralików wirami ani nie pozwól im wyschnąć.
  2. Umieść 50 μl kulek (na każde 5 μg rozdrobnionej próbki DNA) w oddzielnych, czystych i oznakowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl 1x bufor do płukania kulek, aby osiągnąć końcową objętość 100 μL.
    UWAGA: W przypadku używania małych pasków reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o pojemności 0,5 ml do prania kulek stosuje się około 150-200 μl buforu do płukania na probówkę, jak wspomniano w protokole zestawu. Natomiast w przypadku probówek o pojemności 1,5 ml należy dodać co najmniej 250 μl do 300 μl buforu do przemywania na probówkę do płukania kulek.
  3. Umieść rurki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby wszystkie kulki magnetyczne skoncentrowały się na wewnętrznej ściance rurki skierowanej w stronę magnesu. Usunąć płyn, nie dotykając kulek, za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  4. Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, dodaj 250 μl 1x buforu do płukania kulek i delikatnie wymieszaj kulki za pomocą pipety.
  5. Powtórzyć kroki 3.3 i 3.4 co najmniej 4-5 razy dla wszystkich próbek, a na koniec ponownie zawiesić w 250 μl 1x bufor do płukania kulek. Trzymaj je na lodzie.

4. Wiązanie białka MBD-biotyny z umytymi kulkami

  1. Dodaj 35 μl białka MBD (7 μl na 1 μg próbki DNA) do oddzielnych probówek i zwiększ całkowitą objętość do 250 μl za pomocą 1x bufor do płukania kulek.
  2. Do 250 μl umytych kulek dodać 250 μl rozcieńczonego białka MBD i pozostawić je na obrotów od końca do końca w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  3. Po mieszaniu kulek i białka przez 1 godzinę należy przemyć biotynę białkową MBD związaną z magnetycznymi kulkami streptawidyny.
    1. Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń płyn bez dotykania kulek za pomocą pipety. Dodaj 250 μl 1x bufor do płukania kulek i umieść probówki na mieszalniku rotacyjnym na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Powtórz krok 4.3.1 jeszcze dwa razy i na koniec ponownie zawieś umyte kulki MBD-biotyny w 200 μl 1x bufora do płukania kulek, przygotowując kulki do wychwytywania metylowanego DNA.
    UWAGA: Mycie 2-3 razy w ten sposób usuwa całe tło niezwiązanych kulek białkowych MBD i poprawia efektywne wiązanie kulek sprzężonych z białkiem MBD z pofragmentowanym genomowym DNA.

5. Wiązanie koralików MBD-biotyny z fragmentarycznym genomowym DNA

  1. W czystej probówce o pojemności 1,5 ml wolnej od DNaz dodać 100 μl 5x buforu do płukania kulek i 180 μl rozdrobnionego genomowego DNA (krok 2.3). Doprowadzić końcową objętość do 500 μl za pomocą wody wolnej od DNazy.
  2. Dodaj 380 μl wody wolnej od DNaz do pozostałych 20 μl rozdrobnionego genomowego DNA i zamroź je. Próbki te należy wykorzystać jako wejściowe kontrole DNA i wytrącić je później wraz z końcowymi eluowanymi próbkami metylowanego DNA (patrz krok 7.1).
  3. Umieść probówki zawierające umyte kulki MBD-biotyny (krok 4.4) na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń płyn bez naruszania kulek. Dodać 500 μl rozdrobnionego genomowego DNA rozcieńczonego w buforze do płukania kulek.
  4. Szczelnie uszczelnić wszystkie probówki folią parafinową i pozostawić je na noc w temperaturze 4 °C na stojaku obrotowym od końca do końca z prędkością 8-10 obr.
    UWAGA: Reakcję wiązania DNA i kulek biotyny można przeprowadzać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ale pozostawienie jej na noc w temperaturze 4 °C może poprawić odzyskiwanie końcowego metylowanego DNA.

6. Usuwanie niezwiązanego DNA i wymywanie metylowanego DNA z koralików

  1. Po reakcji wiązania DNA i kulek MBD umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby skoncentrować wszystkie kulki na wewnętrznej ściance probówki.
  2. Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą pipety, nie dotykając kulek i zachować tę niezwiązaną frakcję próbki DNA na lodzie.
  3. Dodaj 200 μl 1x buforu do płukania kulek do kulek i umieść probówki na obrotowym stojaku na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń płyn. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki niezwiązanego DNA.
  4. Po ostatnim płukaniu dodać 200 μl buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli (2 000 mM NaCl), znajdującego się w zestawie w celu elucji DNA.
  5. Umieść probówki na obrotowym stojaku na 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i za pomocą pipety ostrożnie przenieś supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 200 μl buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli i powtórzyć elucję, obracając probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać drugą elucję do tej samej probówki zawierającej 200 μl pierwszej elucji.
    UWAGA: Końcowe 400 μl całkowitego wymytego DNA jest teraz gotowe do wytrącania etanolem w celu ekstrakcji oczyszczonego DNA nadającego się do sekwencjonowania nowej generacji.

7. Wytrącanie etanolu i wzbogacanie metylowanego DNA

  1. Dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μl; zawarte w zestawie), 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 800 μl lodowatego etanolu absolutnego do 400 μl eluowanego DNA, a także do 400 μl wejściowych próbek DNA przygotowanych w kroku 5.2.
  2. Dobrze wymieszać probówki przez wirowanie i inkubować je w temperaturze -80 °C przez noc.
  3. Odwirować probówki przy 12 000 x g (maksymalna prędkość) i temperaturze 4 °C. Sklarowany sklarat należy ostrożnie wyrzucić, nie naruszając osadu, dodać 500 μl 70% etanolu i przemieszać probówki.
  4. Ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Odwirować probówki z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć resztki etanolu za pomocą końcówki pipety.
  5. Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Do osadu DNA dodać 10 μl wody wolnej od DNaz. Przejdź do kwantyfikacji metylowanego DNA (krok 7.6), sekwencjonowania MBD (krok 7.7) i analizy (sekcje 8 i 9).
  6. Określić ilościowo końcowe odzyskane próbki metylowanego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do fluorometrycznego oznaczania ilościowego (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Uwaga: Korzystając z tego protokołu, z każdej próbki odzyskano 30-50 ng końcowego DNA. Próbki DNA są gotowe do wysłania na suchym lodzie w celu budowy biblioteki i sekwencjonowania MBD o wysokiej przepustowości
  8. Wykonaj budowę biblioteki DNA i wysokoprzepustowe sekwencjonowanie MBD przy użyciu platformy komercyjnej (Tabela materiałów), zgodnie z opisem w reference9.
    UWAGA: W celu wstępnej kontroli jakości końcowego metylowanego DNA należy przeprowadzić przygotowania biblioteczne przy użyciu sekwencjonowania par końców 50 pz dla wszystkich próbek. Przetwarzaj surowe dane do kontroli jakości po sekwencjonowaniu, jak opisano w kroku 8.1, a następnie przetwarzaj je przy użyciu podejść bioinformatycznych i metod statystycznych, jak opisano poniżej (kroki 8.2-9.6).

8. Metoda analizy bioinformatycznej 1: Identyfikacja regionów o zróżnicowanej metylacji związanych z CLL (cllDMR)

  1. Wyczyść uzyskane odczyty 49 pz (format FASTQ) dla adapterów za pomocą dostępnych narzędzi do kontroli jakości, takich jak Trimmomatic10 lub Cutadapt. Sprawdź jakość przyciętych odczytów za pomocą zestawu narzędzi FastQC:
    java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:30:10
  2. Dopasuj oczyszczone pliki FASTQ za pomocą wyrównywacza genomu z krótkim odczytem Bowtie do referencyjnego genome11. Określ parametry jak poniżej:
    1. Zezwalaj na maksymalnie dwie niezgodności (parametr muszki: -v 2).
    2. Ogranicz raportowanie do sześciu najlepszych wyrównań na odczyt (parametr Bowtie: -m 6), aby kontrolować odczyty z wieloma mapowaniami.
      muszka -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S PRÓBKA.fastq > PRÓBKA.sam
      UWAGA: Przekonwertuj pliki SAM wygenerowane dla poszczególnych próbek po wyrównaniu na BAM za pomocą SAMtools.
      samtools view -bS -o PRÓBKA.BAM PRÓBKA.sam
  3. Użyj opartej na modelu analizy szczytowego wywołania ChIP-Seq (MACS) na wyrównanych próbkach (BAM), aby przewidzieć wzbogacone/zmetylowane regiony z podgrup CLL12.
    UWAGA: Porównanie I: Użyj próbki wejściowej jako grupy kontrolnej oraz próbek pacjentów w kolorze normalnym i PBL jako grup leczonych. Ten krok polega na zebraniu wszystkich ujemnych pików (pików wzbogaconych w Input/background). Porównanie II: Użyj normalnej grupy próbnej jako grupy kontrolnej i grupy próbnej pacjentów z PBL jako grupy leczonej. Uzyskane dodatnie piki to hipermetylowane regiony CLL, a ujemne piki to hipometylowane regiony CLL nad normalnymi lub różnicowo metylowanymi regionami (DMR).
    macs14 -t powiedział: SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs
  4. Usuń piki tła porównania I z różnicowo metylowanych regionów (DMR) za pomocą BEDtools13.
    narzędzia do łóżek odejmują -a -b
  5. Przewiduj procentową zawartość pierwiastków powtórzeniowych (SINE-Alu, LINE itp.) wzbogaconych w DMR.
    1. Użyj fastacmd, aby wyodrębnić sekwencję FASTA DMR za pomocą współrzędnych chromosomowych z genomu referencyjnego HG19.
      fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosom -L Początek,Koniec -l 50000 > DMRs.fasta
    2. Użyj narzędzia wiersza poleceń RepeatMasker, aby przewidzieć procent powtarzających się elementów obecnych w sekwencji FASTA DMRs.
      RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta
  6. Opisz przewidywane DMR za pomocą "annotatePeaks.pl" Homera z dostępną adnotacją transkryptu Ensembl [PMC4919035] lub Gencode [PMID 22955987] (transkrypty kodujące białka i niekodujące).
    annotatePeaks.pl DMRs.bed -gtf <Ensembl lub Gencode GTF>
    UWAGA: Dostarcza informacji na temat rozkładu pików w różnych regionach genowych (tj. promotorze, eksonie, intronie, 3' UTR i 5' UTR) i regionach międzygenowych. Transkrypty lub geny związane z DMR nazywane są genami zróżnicowanie metylowanymi (DMG).
  7. Użyj narzędzia do wzbogacania ze zaktualizowaną lub aktualną funkcjonalną bazą danych, aby znaleźć funkcje wzbogacone o CLL DMG (tylko geny kodujące białka)14.
    UWAGA: Grupowanie zestawów genów w oparciu o adnotację funkcjonalną (GeneSCF)14 to narzędzie do analizy wzbogacania funkcjonalnego w czasie rzeczywistym, które wykorzystuje zaktualizowane KEGG i Gene Ontology jako referencyjną bazę danych.

9. Metoda analizy bioinformatycznej 2: Identyfikacja znacząco zróżnicowanych regionów metylowanych związanych z CLL (cll sigDMR)

  1. Wykonaj kroki 8.1-8.5 z metody I (sekcja 8) i użyj analizy wzbogacania różnicowego opartej na zliczaniu odczytu, wykorzystując dostępne narzędzia, jak opisano w krokach 9.2 - 9.6, aby dodać jeszcze jeden poziom statystyk do potoku analizy.
  2. Określ ilościowo liczbę odczytów odwzorowanych na poszczególne piki lub DMR w próbkach pacjentów w normie i PBL, używając "featureCounts" z pakietu "Subread"15.
    subread/bin/featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
    UWAGA: Można wprowadzić filtr jakości mapowania, aby uniknąć ilościowego określania odczytów o złej jakości (np. -Q 30). Na potrzeby tego kroku należy przygotować pliki SAF dla uzyskanych DMR-ów. Aby uzyskać więcej informacji na temat formatu pliku SAF, skorzystaj z tego linku http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/.
  3. Użyj tabeli odczytów RAW zawierającej liczbę odczytów dla poszczególnych pików w grupach próbek pacjentów z prawidłową i PBL w edgeR jako input16.
    UWAGA: Porównaj grupy próbek pacjentów normalnych i pacjentów z PBL, aby znaleźć sigDMR. W przypadku analizy wzbogacania różnicowego postępuj zgodnie z przewodnikiem edgeR, aby uzyskać szczegółowe instrukcje krok po kroku (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf).
  4. Filtruj sigDMR przy użyciu współczynnika fałszywych wykryć (FDR) i zmiany logarytmicznie przewidywanej przez edgeR16.
  5. Opisz przewidywane sigDMR za pomocą "annotatePeaks.pl" Homera z dostępną adnotacją transkryptu Ensembl lub Gencode (transkrypty kodujące białka i niekodujące).
    annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf -CpG
    UWAGA: Dostarcza informacji na temat rozkładu pików w różnych regionach genowych (tj. promotorze, eksonie, intronie, 3' UTR i 5' UTR) i regionach międzygenowych. Transkrypty lub geny związane z sigDMR nazywane są sigDMG.
  6. Użyj narzędzia do wzbogacania ze zaktualizowaną lub aktualną funkcjonalną bazą danych, aby znaleźć funkcje wzbogacone o CLL sigDMG (tylko geny kodujące białka)14.
    UWAGA: GeneSCF, jedno z narzędzi do analizy wzbogacenia funkcjonalnego w czasie rzeczywistym, wykorzystuje KEGG i Gene Ontology jako referencyjne bazy danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MBD-seq został niedawno przeprowadzony na pacjentach z PBL i dopasowanych, normalnych, zdrowych kontrolnych w celu zidentyfikowania specyficznych dla CLL genów o zróżnicowanej hiper- i hipometylowanej osobowości7. Eksperymentalny i bioinformatyczny potok używany do analizy danych wygenerowanych z PBL i normalnych zdrowych próbek jest pokazany w Rysunek 1A i 1B. Analizy te zidentyfikowały kilka specyficznych dla CLL zróżnicowanyc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MBD-seq to opłacalna technika oparta na immunoprecypitacji, którą można wykorzystać do badania wzorców metylacji z pełnym pokryciem całego genomu. Zarówno sekwencja MeDIP (immunoprecypitacja metylowanego DNA, a następnie sekwencjonowanie), jak i sekwencjonowanie MBD powodują wzbogacenie metylowanego DNA bogatego w CpG. Jednak MBD-seq wykazuje większe powinowactwo do wiązania się z regionami o wysokiej zawartości CpG w porównaniu z MeDIP seq19. Za pomocą zestawu do wzbogacania wiązań metylowych moż...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Fundację Knuta i Alice Wallenbergów (KAW) oraz FoU VästraGötalandsregionen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dneasy Zestaw do krwi i tkanekQaigen69504
Roztwór do przygotowania limfatycznegoA X I S-S H I E L D
Nano kropla 2000Thermo Fischersceintific
TE bufor pH 8Sigma aldrich93283
Standardowe urządzenie soniczne BioruptorDiagenodeUCD-200
Probówki biologiczne TPX 1,5 mlDiagenodeC30010010-300
3 M octan soduDiagenodeC03030002
E-gel iBase bezpieczny zestaw do obrazowaniaThermo FischersceintificG6465EU
E-gel 2% Żele agarozoweThermo FischersceintificG441002
Methylminer Zestaw do wzbogacania metylowanego DNAThermo FischersceintificME10025
Labquake Tube Shaker/RotatoryThermo Fischersceintific415110
Dynal MPC-SThermo FischersceintificA13346
Mieszalnik wirowyVWR12620-848
Absolutny etanolDowolna firma
70% EthanoolDowolna firma
Woda wolna od DNAMilli Q
Środek strącający DNA (octan sodu 3M)DiagenodeC03030002
Bezpieczne uszczelnienie 1,5 ml probówek eppendorfEppendorf4036-3204
Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HSThermo FischersceintificQ32851
Probówki kubitowe 0,5 mlThermo FischersceintificQ32856
KubitThermo FischersceintificQ32866
Platforma Illumina Hiseq2000Illumina
Water  KąpielGrant
Blok ciepłagrant
Obracacz rurkiLabquake
1114544

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
  2. Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
  3. Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
  4. Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
  5. Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
  6. Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
  7. Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106(2016).
  8. Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
  9. De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068(2013).
  10. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  11. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  12. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  13. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  14. Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365(2016).
  15. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  16. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  17. Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
  18. Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
  19. Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Methylation AnalysisMBD seq MethodChronic Lymphocytic LeukemiaMethylated DNA CaptureNext Generation SequencingPyrosequencing ValidationCLL specific Differentially Methylated GenesLong Noncoding RNAsRepetitive ElementsProtein coding Genes

Related Articles