Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

Wpływ stresu oksydacyjnego na obraz kliniczny został wysunięty na pierwszy plan w ostatnich latach¹. Jednym z badanych biomarkerów jest 3-nitrotyrozyna (3-NT), stabilny produkt końcowy, który powstaje, gdy reaktywne formy azotu (RNS) oddziałują z tyrozyną, prekursorem neuroprzekaźnika katecholaminowego. Podczas gdy 3-NT może mieć wartość kliniczną jako biomarker RNS in vivo, istotne zmiany właściwości i funkcji tyrozyny mogą niekorzystnie wpływać na odpowiednie białka i funkcje komórkowe^1,2. Pojawiające się badania sugerują, że 3-NT może odgrywać ważną rolę w stanach zapalnych³, zaburzeniach neurodegeneracyjnych^4,5, chorobach sercowo-naczyniowych⁶ i cukrzycy⁷, a także w stanach związanych ze stresem oksydacyjnym. Obserwacje te opierają się jednak na wynikach metodologii, w których brakuje czułości i/lub selektywności^8,9,10,11. Ogromne zakresy stężeń 3-NT dla próbek biologicznych wcześniej zgłoszonych w literaturze ujawniają, że z tymi testami wiążą się poważne problemy analityczne i potrzebne są ulepszenia techniczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować jego rolę w patologii tych stanów.

Ilościowe określenie wolnego 3-NT w matrycach biologicznych stanowi szczególne wyzwanie dla człowieka i instrumentu^8,9,10,11. Po pierwsze, śladowy poziom endogennego 3-NT wymaga ultraczułego wykrywania; po drugie, istnienie licznych strukturalnie podobnych analogów, zwłaszcza tyrozyny, która występuje w znacznym nadmiarze, wymaga wysokiego stopnia selektywności; po trzecie, sztuczne tworzenie 3-NT przez nitrowanie tyrozyny z wszechobecnym azotanem i azotynami wymaga szczególnej uwagi podczas przygotowywania próbki, aby uniknąć fałszywego przeszacowania 3-NT.

Wśród szerokiej gamy metodologii stosowanych do pomiaru 3-NT, MS/MS został uznany za złoty standard ze względu na jego wysoką czułość i selektywność^11,12,13,14. Chromatografia gazowa (GC) sprzężona z MS/MS oferuje najlepszą czułość, jednak niezbędne etapy derywatyzacji próbki są zbyt żmudne i czasochłonne, aby były efektywne dla użyteczności klinicznej^15,16. LC-MS/MS nie wymaga skomplikowanej derywatyzacji próbki, co czyni ją bardziej obiecującą opcją. Niemniej jednak istnieje kilka przeszkód do pokonania, takich jak czułość metod LC-MS/MS opisana w literaturze, która musi ulec poprawie w przypadku pomiaru niskiej obfitości 3-NT^7,17,18 oraz stosunkowo długi czas realizacji musi zostać skrócony dla aplikacji o wysokiej przepustowości^12,13,17,19.

Dodatkowo, przy rozważaniu zastosowań klinicznych, znaczącą rolę odgrywa zastosowana matryca biologiczna. Powinien być łatwy i niedrogi do uzyskania oraz nieinwazyjny, jeśli to możliwe^20,21,22. Osocze, tradycyjnie stosowana próbka w literaturze, nie jest klinicznie pożądaną matrycą, dlatego poszukiwano metodologii wykorzystującej mocz, która jest nieinwazyjna i opłacalna.

Podjęto kilka prób opracowania wiarygodnych i specyficznych metodologii LC-MS/MS przy użyciu urine^9,10,11. Jednak wszystkie one nie są ani selektywne, ani wystarczająco niezawodne, ani wystarczająco skuteczne do użytku klinicznego. Zakwestionowano skuteczność dominującego SPE przy użyciu tradycyjnego wkładu z odwróconą fazą (typ C18) jako oczyszczania próbki do analizy 3-NT i zaproponowano sekwencyjną SPE silnej wymiany kationów (SCX) i odwróconej fazy C18-OH^6,7,19. Jedna z niedawno opracowanych metod LC-MS/MS wykorzystywała wieloetapowy proces oczyszczania ręcznego C18 SPE, preparatywnej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) i SPE online do analizy klasy 3-NT23. Chociaż metoda ta była wystarczająco czuła do celów klinicznych, z LLOQ 0,041 nM, proces oczyszczania był intensywny i żmudny oraz wymagał 3 ml moczu, co ograniczało jego wykonalność w przypadku wysokiej przepustowości. Jako sorbent SPE zastosowano polimer z nadrukiem molekularnym, aby poprawić wydajność procesu oczyszczania¹⁴, ale uzyskany LLOQ (0,7 μg/ml) nie był wystarczająco niski dla próbek klinicznych. Inna metoda wymagała dwuwymiarowej (2D) LC-MS/MS i chromatografii immunopowinowactwa do oczyszczania próbki w celu osiągnięcia granicy wykrywalności (LOD) wynoszącej 0,022 nM²⁴. Chociaż wszystkie te metody poczyniły postępy w ocenie 3-NT, żadna z nich nie osiągnęła czułości, niezawodności i wydajności niezbędnych do zastosowań klinicznych.

W celu zbadania patologii wolnego 3-NT i jego roli jako biomarkera stresu oksydacyjnego w warunkach klinicznych, opracowaliśmy metodologię, która jest prosta, wydajna, dokładna i precyzyjna, umożliwiając zastosowanie kliniczne o wysokiej przepustowości²⁵. Wdrożono zminiaturyzowaną mikropłytkę ekstrakcyjną z 96-dołkową wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX), aby uzyskać proste i skuteczne oczyszczanie próbki i wzbogacanie 3-NT w jednej ekstrakcji, z pominięciem wad widocznych w istniejących metodach, które wymagają derywatyzacji, odparowania i 2D-LC. Chromatografia cieczowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w fazie ruchomej zapewniła lepszą odpowiedź sygnału przy krótkim czasie cyklu. Selektywność została dodatkowo poprawiona dzięki zastosowaniu łagodnego roztworu elucji NH₄OAc do selektywnej elucji 3-NT oraz zastosowaniu przejścia MRM zarówno dla 3-NT, jak i wzorca wewnętrznego (IS). Efekt matrycy skompensowano poprzez zastosowanie zmniejszonej ilości preferowanego izotopowego IS znakowanego ¹³C do oceny ilościowej. Wraz z pojawieniem się tej metodologii, naukowcy i klinicyści będą mogli zweryfikować rolę 3-NT w stanach klinicznych i dalej badać wpływ stresu oksydacyjnego.

Wszystkie badania z udziałem próbek ludzkiego moczu zostały przeprowadzone zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Pharmasan/Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Pobieranie próbek moczu i oznaczanie kreatyniny (Cr)

1. Zebrać 5 ml próbek moczu następnego ranka po ok. 10 godzinach całonocnego postu w 5 ml probówce transportowej A zawierającej 250 μl 3 N HCl jako środka konserwującego i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
2. Rozmrozić i odwirować 5 ml moczu transportować probówkę A i odwirować w wirówce (np. Sorvall) (2297 x g, 10 min).
3. Podajcie 1 ml moczu dwa razy z 5 ml probówki transportowej A.
4. Określ Cr metodą kreatyniny w moczu²⁶.

2. Przygotowanie próbek wzorcowych, IS i kontroli jakości (QC)

1. Przygotować roztwór podstawowy 3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z 0,01% ruchomą fazą A (MA) HCOOH i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Przygotować roboczy roztwór wzorcowy 3-NT o stężeniu 100 ng/ml, rozcieńczając 100 μg/ml roztworu podstawowego 3-NT MA.
3. Generuj wzorce w zakresie od 5 do 2500 pg/ml przez rozcieńczenie wzorca roboczego 100 ng/ml z 0,15 M zakwaszonym ślepym moczem HCl wolnym od 3-NT wraz z ślepymi i podwójnie ślepymi próbkami.
4. Przygotować roztwór podstawowy IS ¹³C 9-3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z MA i przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Przygotować roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml przez rozcieńczenie 100 μg/ml ¹³C 9-3-NT roztworu podstawowego IS z MA.
6. Ustalić pięć poziomów próbek kontroli jakości obejmujących LLOQ, niski, średni i wysoki poziom (tj. 10, 25, 100, 500 i 1,250 pg/ml), przez rozcieńczenie wzorca roboczego 3-NT w zakwaszonym ślepym moczu.

3. Procedura ekstrakcji do fazy stałej

1. Rozmrażanie i wirowanie próbek moczu, wzorców i próbek kontroli jakości.
2. Dodać próbki moczu, wzorce i próbki kontroli jakości (po 250 μl każda) do 32 dołków czystej 2 ml 96-dołkowej płytki zbiorczej.
3. Wprowadzić roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml (50 μl) do każdego dołka, z wyjątkiem studzienki z podwójną próbą ślepą. Dodać 0,01% HCOOH (50 μl) do studzienki z podwójną ślepą próbą.
4. Dodaj wodę LC-MS/MS z 0,1% HCOOH (250 μL).
5. Wymieszaj powyższą mieszaninę trzykrotnie pipetą 8-kanałową.
6. Przykryj płytę do momentu załadowania SPE.
7. Umieść 96-dołkową płytkę ekstrakcyjną MCX i zbiornik zbiorczy na procesorze nadciśnieniowym.
8. Kondycjonować płytkę ekstrakcyjną z przepływającym MeOH (200 μl) przez sorbent.
9. Zrównoważyć przez przepływającą wodę z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.
10. Ostrożnie załadować całą objętość każdej z wstępnie zmieszanych próbek na wstępnie kondycjonowaną płytkę ekstrakcyjną za pomocą 8-kanałowej pipety.
11. Ustawić niskie nadciśnienie (np. 3 psi) na procesorze nadciśnieniowym, aby mieszanina mogła powoli przepływać przez sorbent, w razie potrzeby wyreguluj ciśnienie.
12. Umyć studnie przepływającą wodą z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.
13. Przepłukać studzienki, przepuszczając metanol (200 μl) przez sorbent.
14. Umyć studzienki przepływającą wodą (200 μl) przez sorbent.
15. Całkowicie wysuszyć studzienki przy ustawieniu wysokiego nadciśnienia (np. 40 psi) na procesorze nadciśnieniowym.
16. Wymień zbiornik na czystą 96-dołkową płytkę o pojemności 2 ml.
17. Zastosować 25 mM NH₄OAc przy pH 9 (50 μl) w celu wymycia pozostałego analitu i stabilizacji z płytki ekstrakcyjnej.
18. Odpipetować LC-MS wodą z 5% HCOOH (50 μL) w celu zneutralizowania eluatu.
19. Wymieszać trzykrotnie z pipetą 8-kanałową i przesłać do stacji LC-MS/MS w celu analizy.

4. Analiza LC-MS/MS

1. Dokładnie odmierz 2,000 ml wody LC-MS za pomocą cylindra z podziałką i przenieś ją do butelki o pojemności 2 litrów.
2. Odpipetować 200 μl czystego HCOOH do powyższej butelki zawierającej wodę LC-MS.
3. Dokładnie wymieszać i oznaczyć jako ruchomą fazę A (MA). Dołącz inicjały, datę przygotowania i datę ważności.
4. Weź 2-litrową butelkę metanolu LC-MS i oznacz ją jako fazę ruchomą B (MB) z datą początkową i datą ważności.
5. Ustawić temperaturę automatycznego próbnika na 4 °C.
6. Umieścić płytkę zbiorczą z przygotowanymi próbkami w automatycznym podajniku próbek.
7. Umieść kolumnę PFP (150 mm x 2.1 mm średnica wew., 3 μm) i kolumnę ochronną w piekarniku.
8. Ustaw temperaturę piekarnika na 30 °C.
9. Równoważyć 10 minut przy użyciu metody akwizycji z elucją w gradiacji LC, jak pokazano w tabeli 1.

Tabela 1: Warunki elucji gradientu chromatografii cieczowej

10. Utwórz listę partii zawierającą wzorce, kontrolę jakości i próbki moczu.
11. Rozpocząć partię od wstrzyknięcia przygotowanych próbek (12 μl).

5. Identyfikacja szczytów, integracja i przetwarzanie danych

1. Kontroluj gromadzenie i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania.
2. Zidentyfikuj i zintegruj piki 3-NT i IS dla wszystkich próbek.
3. Ustalić krzywą wzorcową w zakresie 10-2,500 pg/ml dla oznaczania ilościowego 3-NT przez regresję liniową stosunku powierzchni pików 3-NT i IS w stosunku do nominalnego stężenia 3-NT ze współczynnikiem wagowym 1/x.
4. Określić ilościowo wszystkie próbki za pomocą krzywej wzorcowej.
5. Określ, czy próbki kontroli jakości mieszczą się w ustalonym zakresie.
6. Przelicz wykryte stężenia próbek moczu na wyniki końcowe w jednostce nM lub nmol/mmol Cr.

Rysunek 1 ilustruje, że 3-NT jest całkowicie chromatograficznie oddzielony od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny w zoptymalizowanych warunkach LC, co eliminuje zakłócenia koelucji spowodowane przez te znacznie nadmierne związki i w konsekwencji zwiększa stopień selektywności testu. Ponadto elucja gradientowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w MA i metanolu przy natężeniu przepływu 0,45 ml/min umożliwia szybką elucję 3-NT (tj. 3 min przy czasie realizacji 7 min).

Rysunek 1: Wyjściowe chromatograficzne oddzielenie LC 3-NT od innych analogów tyrozyny w roztworze wzorcowym. (A) p-tyrozyna; B) m-tyrozyna; C) o-tyrozyna; d) Cl-tyrozyna; (E) 3-NT. Kliknij tutaj aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 pokazuje, że w podwójnej próbce ślepej nie zaobserwowano sygnału 3-NT, co wskazuje na brak powstawania artefaktu 3-NT podczas całego procesu. Rysunek 3 ilustruje reprezentatywne chromatogramy MRM 3-NT i IS dla zdrowej osoby. Jak widać, w czasach retencji 3-NT i IS nie obserwuje się żadnych sygnałów zakłócających. Ponadto zaobserwowano mniej niż ± 6% różnicę w 3-NT między próbkami moczu bez wzbogacania i z dodatkiem wzbogaconym z azotynami (50 μM), azotanami (50 μM) i tyrozyną (50 mg/L)25, co dodatkowo potwierdza specyficzność testu.

Rysunek 2: Chromatogramy MRM 3-NT i IS w reprezentatywnej próbce podwójnej ślepej. (A) kwantyfikator 3-NT MRM 227,0 >90,0; (B) Kwantyfikator MRM IS 236,0 >189,0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Chromatogramy MRM 3-NT i IS w reprezentatywnej próbce moczu osób zdrowych. (A) kwantyfikator 3-NT MRM 227,0 >90,0; (B) Kwantyfikator MRM IS 236,0 >189,0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Krzywa standardowa została ustalona przez ekstrakcję zakwaszonego ślepego moczu wzbogaconego 3-NT w zakresie 10-2,500 pg/ml poprzez wykreślenie stosunku powierzchni pików 3-NT i IS do nominalnego stężenia 3-NT z liniowym dopasowaniem o wadze 1/x. Reprezentatywna krzywa standardowa jest pokazana na rysunku Rysunek 4. LOD, zdefiniowany jako najniższe stężenie o stosunku sygnału do szumu większym niż trzy, określono na 2 pg/ml (0,0088 nM). LLOQ określono na 10 pg/ml (0,044 nM) z definicji jako najniższe stężenie mierzone w granicach ± 20% niedokładności i dokładności przy stosunku sygnału do szumu większym niż dziesięć.

Rysunek 4: Reprezentatywna krzywa wzorcowa 3-NT w zakresie 10-2 500 pg/ml. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.