Method Article

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selektywna i czuła metoda tandemowej chromatografii mas chromatografii cieczowej (LC-MS/MS) w połączeniu z efektywną ekstrakcją do fazy stałej na 96-dołkowej mikropłytce z wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX) została opracowana do pomiaru wolnej 3-nitrotyrozyny (3-NT) w ludzkim moczu o wysokiej przepustowości, która jest odpowiednia do zastosowań klinicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Free 3-nitrotyrozyna (3-NT) była szeroko stosowana jako możliwy biomarker stresu oksydacyjnego. Podwyższone poziomy 3-NT odnotowano w wielu różnych stanach patologicznych. Jednak istniejące metody nie mają wystarczającej czułości i/lub swoistości niezbędnej do wiarygodnego pomiaru niskiego endogennego poziomu 3-NT i są zbyt kłopotliwe do zastosowań klinicznych. W związku z tym pilnie potrzebne są ulepszenia analityczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować rolę 3-NT w stanach patologicznych. Protokół ten przedstawia opracowanie nowatorskiej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w połączeniu ze zminiaturyzowaną ekstrakcją do fazy stałej (SPE) w celu szybkiego i dokładnego pomiaru 3-NT w ludzkim moczu jako nieinwazyjnego biomarkera stresu oksydacyjnego. SPE przy użyciu 96-dołkowej płytki znacznie uprościło proces, łącząc oczyszczanie próbki i wzbogacanie analitu bez żmudnych etapów derywatyzacji i odparowywania, zmniejszając zużycie rozpuszczalnika, utylizację odpadów, ryzyko zanieczyszczenia i całkowity czas przetwarzania. Zastosowanie octanu amonu 25 mM (NH4OAc) o pH 9 jako roztworu elucji SPE znacznie zwiększyło selektywność. Odpowiedź sygnału spektrometrii mas została poprawiona dzięki dostosowaniu przejść monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Zastosowanie 0,01% HCOOH jako dodatku w kolumnie pentafluorofenylowej (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) poprawiło odpowiedź sygnału o kolejne 2,5 razy i skróciło całkowity czas pracy do 7 minut. Osiągnięto dolną granicę oznaczalności (LLOQ) wynoszącą 10 pg/ml (0,044 nM), co stanowi znaczną poprawę czułości w porównaniu z raportowanymi testami. Ta uproszczona, szybka, selektywna i czuła metoda pozwala na przetworzenie dwóch płytek z próbkami moczu (n = 192) w ciągu 24 godzin. Biorąc pod uwagę znacznie lepszą wydajność analityczną oraz nieinwazyjne i niedrogie pobieranie próbek moczu, proponowany test jest korzystny dla badań przedklinicznych i klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ stresu oksydacyjnego na obraz kliniczny został wysunięty na pierwszy plan w ostatnich latach1. Jednym z badanych biomarkerów jest 3-nitrotyrozyna (3-NT), stabilny produkt końcowy, który powstaje, gdy reaktywne formy azotu (RNS) oddziałują z tyrozyną, prekursorem neuroprzekaźnika katecholaminowego. Podczas gdy 3-NT może mieć wartość kliniczną jako biomarker RNS in vivo, istotne zmiany właściwości i funkcji tyrozyny mogą niekorzystnie wpływać na odpowiednie białka i funkcje komórkowe1,2. Pojawiające się badania sugerują, że 3-NT może odgrywać ważną rolę w stanach zapalnych3, zaburzeniach neurodegeneracyjnych4,5, chorobach sercowo-naczyniowych6 i cukrzycy7, a także w stanach związanych ze stresem oksydacyjnym. Obserwacje te opierają się jednak na wynikach metodologii, w których brakuje czułości i/lub selektywności8,9,10,11. Ogromne zakresy stężeń 3-NT dla próbek biologicznych wcześniej zgłoszonych w literaturze ujawniają, że z tymi testami wiążą się poważne problemy analityczne i potrzebne są ulepszenia techniczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować jego rolę w patologii tych stanów.

Ilościowe określenie wolnego 3-NT w matrycach biologicznych stanowi szczególne wyzwanie dla człowieka i instrumentu8,9,10,11. Po pierwsze, śladowy poziom endogennego 3-NT wymaga ultraczułego wykrywania; po drugie, istnienie licznych strukturalnie podobnych analogów, zwłaszcza tyrozyny, która występuje w znacznym nadmiarze, wymaga wysokiego stopnia selektywności; po trzecie, sztuczne tworzenie 3-NT przez nitrowanie tyrozyny z wszechobecnym azotanem i azotynami wymaga szczególnej uwagi podczas przygotowywania próbki, aby uniknąć fałszywego przeszacowania 3-NT.

Wśród szerokiej gamy metodologii stosowanych do pomiaru 3-NT, MS/MS został uznany za złoty standard ze względu na jego wysoką czułość i selektywność11,12,13,14. Chromatografia gazowa (GC) sprzężona z MS/MS oferuje najlepszą czułość, jednak niezbędne etapy derywatyzacji próbki są zbyt żmudne i czasochłonne, aby były efektywne dla użyteczności klinicznej15,16. LC-MS/MS nie wymaga skomplikowanej derywatyzacji próbki, co czyni ją bardziej obiecującą opcją. Niemniej jednak istnieje kilka przeszkód do pokonania, takich jak czułość metod LC-MS/MS opisana w literaturze, która musi ulec poprawie w przypadku pomiaru niskiej obfitości 3-NT7,17,18 oraz stosunkowo długi czas realizacji musi zostać skrócony dla aplikacji o wysokiej przepustowości12,13,17,19.

Dodatkowo, przy rozważaniu zastosowań klinicznych, znaczącą rolę odgrywa zastosowana matryca biologiczna. Powinien być łatwy i niedrogi do uzyskania oraz nieinwazyjny, jeśli to możliwe20,21,22. Osocze, tradycyjnie stosowana próbka w literaturze, nie jest klinicznie pożądaną matrycą, dlatego poszukiwano metodologii wykorzystującej mocz, która jest nieinwazyjna i opłacalna.

Podjęto kilka prób opracowania wiarygodnych i specyficznych metodologii LC-MS/MS przy użyciu urine9,10,11. Jednak wszystkie one nie są ani selektywne, ani wystarczająco niezawodne, ani wystarczająco skuteczne do użytku klinicznego. Zakwestionowano skuteczność dominującego SPE przy użyciu tradycyjnego wkładu z odwróconą fazą (typ C18) jako oczyszczania próbki do analizy 3-NT i zaproponowano sekwencyjną SPE silnej wymiany kationów (SCX) i odwróconej fazy C18-OH6,7,19. Jedna z niedawno opracowanych metod LC-MS/MS wykorzystywała wieloetapowy proces oczyszczania ręcznego C18 SPE, preparatywnej wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) i SPE online do analizy klasy 3-NT23. Chociaż metoda ta była wystarczająco czuła do celów klinicznych, z LLOQ 0,041 nM, proces oczyszczania był intensywny i żmudny oraz wymagał 3 ml moczu, co ograniczało jego wykonalność w przypadku wysokiej przepustowości. Jako sorbent SPE zastosowano polimer z nadrukiem molekularnym, aby poprawić wydajność procesu oczyszczania14, ale uzyskany LLOQ (0,7 μg/ml) nie był wystarczająco niski dla próbek klinicznych. Inna metoda wymagała dwuwymiarowej (2D) LC-MS/MS i chromatografii immunopowinowactwa do oczyszczania próbki w celu osiągnięcia granicy wykrywalności (LOD) wynoszącej 0,022 nM24. Chociaż wszystkie te metody poczyniły postępy w ocenie 3-NT, żadna z nich nie osiągnęła czułości, niezawodności i wydajności niezbędnych do zastosowań klinicznych.

W celu zbadania patologii wolnego 3-NT i jego roli jako biomarkera stresu oksydacyjnego w warunkach klinicznych, opracowaliśmy metodologię, która jest prosta, wydajna, dokładna i precyzyjna, umożliwiając zastosowanie kliniczne o wysokiej przepustowości25. Wdrożono zminiaturyzowaną mikropłytkę ekstrakcyjną z 96-dołkową wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX), aby uzyskać proste i skuteczne oczyszczanie próbki i wzbogacanie 3-NT w jednej ekstrakcji, z pominięciem wad widocznych w istniejących metodach, które wymagają derywatyzacji, odparowania i 2D-LC. Chromatografia cieczowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w fazie ruchomej zapewniła lepszą odpowiedź sygnału przy krótkim czasie cyklu. Selektywność została dodatkowo poprawiona dzięki zastosowaniu łagodnego roztworu elucji NH4OAc do selektywnej elucji 3-NT oraz zastosowaniu przejścia MRM zarówno dla 3-NT, jak i wzorca wewnętrznego (IS). Efekt matrycy skompensowano poprzez zastosowanie zmniejszonej ilości preferowanego izotopowego IS znakowanego 13C do oceny ilościowej. Wraz z pojawieniem się tej metodologii, naukowcy i klinicyści będą mogli zweryfikować rolę 3-NT w stanach klinicznych i dalej badać wpływ stresu oksydacyjnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania z udziałem próbek ludzkiego moczu zostały przeprowadzone zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Pharmasan/Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Pobieranie próbek moczu i oznaczanie kreatyniny (Cr)

  1. Zebrać 5 ml próbek moczu następnego ranka po ok. 10 godzinach całonocnego postu w 5 ml probówce transportowej A zawierającej 250 μl 3 N HCl jako środka konserwującego i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Rozmrozić i odwirować 5 ml moczu transportować probówkę A i odwirować w wirówce (np. Sorvall) (2297 x g, 10 min).
  3. Podajcie 1 ml moczu dwa razy z 5 ml probówki transportowej A.
  4. Określ Cr metodą kreatyniny w moczu26.

2. Przygotowanie próbek wzorcowych, IS i kontroli jakości (QC)

  1. Przygotować roztwór podstawowy 3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z 0,01% ruchomą fazą A (MA) HCOOH i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować roboczy roztwór wzorcowy 3-NT o stężeniu 100 ng/ml, rozcieńczając 100 μg/ml roztworu podstawowego 3-NT MA.
  3. Generuj wzorce w zakresie od 5 do 2500 pg/ml przez rozcieńczenie wzorca roboczego 100 ng/ml z 0,15 M zakwaszonym ślepym moczem HCl wolnym od 3-NT wraz z ślepymi i podwójnie ślepymi próbkami.
  4. Przygotować roztwór podstawowy IS 13C 9-3-NT o stężeniu 100 μg/ml w wodzie z MA i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotować roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml przez rozcieńczenie 100 μg/ml 13C 9-3-NT roztworu podstawowego IS z MA.
  6. Ustalić pięć poziomów próbek kontroli jakości obejmujących LLOQ, niski, średni i wysoki poziom (tj. 10, 25, 100, 500 i 1,250 pg/ml), przez rozcieńczenie wzorca roboczego 3-NT w zakwaszonym ślepym moczu.

3. Procedura ekstrakcji do fazy stałej

  1. Rozmrażanie i wirowanie próbek moczu, wzorców i próbek kontroli jakości.
  2. Dodać próbki moczu, wzorce i próbki kontroli jakości (po 250 μl każda) do 32 dołków czystej 2 ml 96-dołkowej płytki zbiorczej.
  3. Wprowadzić roztwór roboczy IS o stężeniu 500 pg/ml (50 μl) do każdego dołka, z wyjątkiem studzienki z podwójną próbą ślepą. Dodać 0,01% HCOOH (50 μl) do studzienki z podwójną ślepą próbą.
  4. Dodaj wodę LC-MS/MS z 0,1% HCOOH (250 μL).
  5. Wymieszaj powyższą mieszaninę trzykrotnie pipetą 8-kanałową.
  6. Przykryj płytę do momentu załadowania SPE.
  7. Umieść 96-dołkową płytkę ekstrakcyjną MCX i zbiornik zbiorczy na procesorze nadciśnieniowym.
  8. Kondycjonować płytkę ekstrakcyjną z przepływającym MeOH (200 μl) przez sorbent.
  9. Zrównoważyć przez przepływającą wodę z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.
  10. Ostrożnie załadować całą objętość każdej z wstępnie zmieszanych próbek na wstępnie kondycjonowaną płytkę ekstrakcyjną za pomocą 8-kanałowej pipety.
  11. Ustawić niskie nadciśnienie (np. 3 psi) na procesorze nadciśnieniowym, aby mieszanina mogła powoli przepływać przez sorbent, w razie potrzeby wyreguluj ciśnienie.
  12. Umyć studnie przepływającą wodą z 2% HCOOH (200 μL) przez sorbent.
  13. Przepłukać studzienki, przepuszczając metanol (200 μl) przez sorbent.
  14. Umyć studzienki przepływającą wodą (200 μl) przez sorbent.
  15. Całkowicie wysuszyć studzienki przy ustawieniu wysokiego nadciśnienia (np. 40 psi) na procesorze nadciśnieniowym.
  16. Wymień zbiornik na czystą 96-dołkową płytkę o pojemności 2 ml.
  17. Zastosować 25 mM NH4OAc przy pH 9 (50 μl) w celu wymycia pozostałego analitu i stabilizacji z płytki ekstrakcyjnej.
  18. Odpipetować LC-MS wodą z 5% HCOOH (50 μL) w celu zneutralizowania eluatu.
  19. Wymieszać trzykrotnie z pipetą 8-kanałową i przesłać do stacji LC-MS/MS w celu analizy.

4. Analiza LC-MS/MS

  1. Dokładnie odmierz 2,000 ml wody LC-MS za pomocą cylindra z podziałką i przenieś ją do butelki o pojemności 2 litrów.
  2. Odpipetować 200 μl czystego HCOOH do powyższej butelki zawierającej wodę LC-MS.
  3. Dokładnie wymieszać i oznaczyć jako ruchomą fazę A (MA). Dołącz inicjały, datę przygotowania i datę ważności.
  4. Weź 2-litrową butelkę metanolu LC-MS i oznacz ją jako fazę ruchomą B (MB) z datą początkową i datą ważności.
  5. Ustawić temperaturę automatycznego próbnika na 4 °C.
  6. Umieścić płytkę zbiorczą z przygotowanymi próbkami w automatycznym podajniku próbek.
  7. Umieść kolumnę PFP (150 mm x 2.1 mm średnica wew., 3 μm) i kolumnę ochronną w piekarniku.
  8. Ustaw temperaturę piekarnika na 30 °C.
  9. Równoważyć 10 minut przy użyciu metody akwizycji z elucją w gradiacji LC, jak pokazano w tabeli 1.
Rozdział Rozdział
Czas (min)modułZdarzeniaparametr
0PompyPompa B Conc.5
0,5PompyPompa B Conc.20
1PompyPompa B Conc.50
3PompyPompa B Conc.Rozdział 80
4PompyPompa B Conc.90
Norma 4.01PompyPompa B Conc.95 Rozdział 95
Rozdział 5.5PompyPompa B Conc.95 Rozdział 95
5,6PompyPompa B Conc.5
7kontrolerzatrzymać

Tabela 1: Warunki elucji gradientu chromatografii cieczowej

  1. Utwórz listę partii zawierającą wzorce, kontrolę jakości i próbki moczu.
  2. Rozpocząć partię od wstrzyknięcia przygotowanych próbek (12 μl).

5. Identyfikacja szczytów, integracja i przetwarzanie danych

  1. Kontroluj gromadzenie i przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania.
  2. Zidentyfikuj i zintegruj piki 3-NT i IS dla wszystkich próbek.
  3. Ustalić krzywą wzorcową w zakresie 10-2,500 pg/ml dla oznaczania ilościowego 3-NT przez regresję liniową stosunku powierzchni pików 3-NT i IS w stosunku do nominalnego stężenia 3-NT ze współczynnikiem wagowym 1/x.
  4. Określić ilościowo wszystkie próbki za pomocą krzywej wzorcowej.
  5. Określ, czy próbki kontroli jakości mieszczą się w ustalonym zakresie.
  6. Przelicz wykryte stężenia próbek moczu na wyniki końcowe w jednostce nM lub nmol/mmol Cr.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje, że 3-NT jest całkowicie chromatograficznie oddzielony od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny w zoptymalizowanych warunkach LC, co eliminuje zakłócenia koelucji spowodowane przez te znacznie nadmierne związki i w konsekwencji zwiększa stopień selektywności testu. Ponadto elucja gradientowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w MA i metanolu przy natężeniu przepływu 0,45 ml/min umożliwia szybką elucję 3-NT (tj. 3 min przy cza...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczne różnice w stężeniach zgłaszanych wcześniej w literaturze dla endogennego wolnego 3-NT w próbkach moczu ludzkiego ujawniają problemy metodologiczne związane z dostępnymi testami 8,9,10,11. Dokładne określenie niskiego podstawowego poziomu 3-NT w ludzkim moczu pozostaje trudnym zadaniem, które wymaga specjalnych środków ostrożności przy przygotowywaniu próbek i analizie LC-MS/MS. Protokó...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Scottowi Howardowi i Abigail Marinack za ogólne wsparcie i koordynację tej pracy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tyrozynaSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tyrozyna-13C9Sigma652296-5,0 mg
Mass Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µ Płytka elucyjnaWody186001830BA
Phenomenex   AH0-7194
96 dodatni procesorWaters 
LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV waterSigma14263-2L
Kwas mrówkowy do spektrometrii masSigma94318-50ML-F
Roztwór wodorotlenku amonuSigma338818-1L
Kolumny propylowe Ultra PFPRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej informacji
UFLC-XRShimadzu /Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej szczegółów
Integra 400 Plus Roche/kreatynina w moczu Jaffé Metoda Gen 2
Fiolka z gwintem 12 x 32 mm z gwintem z certyfikatem LCMSWoda600000751CV
Certyfikat LCGC Fiolka z całkowitą szyjką 12 x 32 mmWody186000384C
5 ml rurka transportowaPhenixTT-3205
50 ml Probówka wirówkowaCrystalgen 23-2263
15 mL Probówka wirówkowaCrystalgen 23-2266
Pipeta elektroniczna eLineWirówka do mikrofuzy Sartorius
 Beckman CoulterA46474
Waga OHAUS   Skale Kennedy'ego, inc.735
Mieszalnik wirowy Bernstead ThermolyneM16715
2 ml 96-dołkowa płytka zbiorcza 186005521 730391

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles