Method Article

Integracja zminiaturyzowanej ekstrakcji do fazy stałej i wykrywania LC-MS/MS 3-nitrotyrozyny w ludzkim moczu do zastosowań klinicznych

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selektywna i czuła metoda tandemowej chromatografii mas chromatografii cieczowej (LC-MS/MS) w połączeniu z efektywną ekstrakcją do fazy stałej na 96-dołkowej mikropłytce z wymianą kationową w trybie mieszanym (MCX) została opracowana do pomiaru wolnej 3-nitrotyrozyny (3-NT) w ludzkim moczu o wysokiej przepustowości, która jest odpowiednia do zastosowań klinicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Free 3-nitrotyrozyna (3-NT) była szeroko stosowana jako możliwy biomarker stresu oksydacyjnego. Podwyższone poziomy 3-NT odnotowano w wielu różnych stanach patologicznych. Jednak istniejące metody nie mają wystarczającej czułości i/lub swoistości niezbędnej do wiarygodnego pomiaru niskiego endogennego poziomu 3-NT i są zbyt kłopotliwe do zastosowań klinicznych. W związku z tym pilnie potrzebne są ulepszenia analityczne, aby dokładnie określić ilościowo poziomy 3-NT i zweryfikować rolę 3-NT w stanach patologicznych. Protokół ten przedstawia opracowanie nowatorskiej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w połączeniu ze zminiaturyzowaną ekstrakcją do fazy stałej (SPE) w celu szybkiego i dokładnego pomiaru 3-NT w ludzkim moczu jako nieinwazyjnego biomarkera stresu oksydacyjnego. SPE przy użyciu 96-dołkowej płytki znacznie uprościło proces, łącząc oczyszczanie próbki i wzbogacanie analitu bez żmudnych etapów derywatyzacji i odparowywania, zmniejszając zużycie rozpuszczalnika, utylizację odpadów, ryzyko zanieczyszczenia i całkowity czas przetwarzania. Zastosowanie octanu amonu 25 mM (NH4OAc) o pH 9 jako roztworu elucji SPE znacznie zwiększyło selektywność. Odpowiedź sygnału spektrometrii mas została poprawiona dzięki dostosowaniu przejść monitorowania reakcji wielokrotnych (MRM). Zastosowanie 0,01% HCOOH jako dodatku w kolumnie pentafluorofenylowej (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) poprawiło odpowiedź sygnału o kolejne 2,5 razy i skróciło całkowity czas pracy do 7 minut. Osiągnięto dolną granicę oznaczalności (LLOQ) wynoszącą 10 pg/ml (0,044 nM), co stanowi znaczną poprawę czułości w porównaniu z raportowanymi testami. Ta uproszczona, szybka, selektywna i czuła metoda pozwala na przetworzenie dwóch płytek z próbkami moczu (n = 192) w ciągu 24 godzin. Biorąc pod uwagę znacznie lepszą wydajność analityczną oraz nieinwazyjne i niedrogie pobieranie próbek moczu, proponowany test jest korzystny dla badań przedklinicznych i klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ stresu oksydacyjnego na obraz kliniczny został wysunięty na pierwszy plan w ostatnich latach1. Jednym z badanych biomarkerów jest 3-nitrotyrozyna (3-NT), stabilny produkt końcowy, który powstaje, gdy reaktywne formy azotu (RNS) oddziałują z tyrozyną, prekursorem neuroprzekaźnika katecholaminowego. Podczas gdy 3-NT może mieć wartość kliniczną jako biomarker RNS in vivo, istotne zmiany właściwości i funkcji tyrozyny mogą niekorzystnie wpływać na odpowiednie białka i funkcje komórkowe1,2. Pojawiające się badania sugerują, że 3-NT może odgrywać ważną rolę w stanach zapalnych<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania z udziałem próbek ludzkiego moczu zostały przeprowadzone zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez Pharmasan/Neuroscience Institutional Review Board (IRB).

1. Pobieranie próbek moczu i oznaczanie kreatyniny (Cr)

  1. Zebrać 5 ml próbek moczu następnego ranka po ok. 10 godzinach całonocnego postu w 5 ml probówce transportowej A zawierającej 250 μl 3 N HCl jako środka konserwującego i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Rozmrozić i odwirować 5 ml moczu transportować probówkę A i odwirować w wirówce (np. Sorvall) (2297 x g, 10 min).
  3. Podajcie 1 ml moczu dwa razy z 5 ml probówki ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 ilustruje, że 3-NT jest całkowicie chromatograficznie oddzielony od innych strukturalnie podobnych analogów tyrozyny w zoptymalizowanych warunkach LC, co eliminuje zakłócenia koelucji spowodowane przez te znacznie nadmierne związki i w konsekwencji zwiększa stopień selektywności testu. Ponadto elucja gradientowa z 0,01% HCOOH jako dodatkiem w MA i metanolu przy natężeniu przepływu 0,45 ml/min umożliwia szybką elucję 3-NT (tj. 3 min przy cza.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znaczne różnice w stężeniach zgłaszanych wcześniej w literaturze dla endogennego wolnego 3-NT w próbkach moczu ludzkiego ujawniają problemy metodologiczne związane z dostępnymi testami 8,9,10,11. Dokładne określenie niskiego podstawowego poziomu 3-NT w ludzkim moczu pozostaje trudnym zadaniem, które wymaga specjalnych środków ostrożności przy przygotowywaniu próbek i analizie LC-MS/MS. Protokó.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Scottowi Howardowi i Abigail Marinack za ogólne wsparcie i koordynację tej pracy.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-tyrozynaSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-tyrozyna-13C9Sigma652296-5,0 mg
Mass Spec Gold UrineGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µ Płytka elucyjnaWody186001830BA
Phenomenex   AH0-7194
96 dodatni procesorWaters 
LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV waterSigma14263-2L
Kwas mrówkowy do spektrometrii masSigma94318-50ML-F
Roztwór wodorotlenku amonuSigma338818-1L
Kolumny propylowe Ultra PFPRestek9179362
5500 Triple quadAB Sciex /Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej informacji
UFLC-XRShimadzu /Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać więcej szczegółów
Integra 400 Plus Roche/kreatynina w moczu Jaffé Metoda Gen 2
Fiolka z gwintem 12 x 32 mm z gwintem z certyfikatem LCMSWoda600000751CV
Certyfikat LCGC Fiolka z całkowitą szyjką 12 x 32 mmWody186000384C
5 ml rurka transportowaPhenixTT-3205
50 ml Probówka wirówkowaCrystalgen 23-2263
15 mL Probówka wirówkowaCrystalgen 23-2266
Pipeta elektroniczna eLineWirówka do mikrofuzy Sartorius
 Beckman CoulterA46474
Waga OHAUS   Skale Kennedy'ego, inc.735
Mieszalnik wirowy Bernstead ThermolyneM16715
2 ml 96-dołkowa płytka zbiorcza 186005521 730391

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

Related Articles