Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

18.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55790

⸱

24 stycznia 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

W tym artykule

Podsumowanie

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Streszczenie

Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promieniowanie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej. Nie można jednak przewidzieć warunków krystalizacji białek, DNA, RNA i ich kompleksów. Stosowanie szerokiej gamy warunków jest sposobem na zwiększenie wydajności wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych. W Laboratorium Biologii Molekularnej MRC (Cambridge, Anglia, MRC-LMB) opracowano dwa w pełni zautomatyzowane systemy, które ułatwiają badanie przesiewowe krystalizacji w stosunku do 1920 warunków początkowych poprzez dyfuzję pary w nanolitrowych kropelkach. Opracowano również półautomatyczne protokoły w celu optymalizacji warunków poprzez zmianę stężeń odczynników, pH lub wprowadzenie dodatków, które potencjalnie poprawiają właściwości otrzymanych kryształów. Wszystkie odpowiednie protokoły zostaną szczegółowo opisane i pokrótce omówione. Podsumowując, umożliwiają one wygodną i wysoce wydajną krystalizację makromolekularną w obiekcie dla wielu użytkowników, dając jednocześnie użytkownikom kontrolę nad kluczowymi parametrami ich eksperymentów.

Wprowadzenie

Krystalografia rentgenowska jest szeroko stosowana, aby dalej rozwijać nasze zrozumienie mechanizmów biologicznych i chorobowych na poziomie atomowym, a następnie wspomagać racjonalne podejścia do odkrywania leków1. W tym celu oczyszczone i skoncentrowane (2-50 mg/ml) makrocząsteczkowe próbki białek, DNA, RNA, innych ligandów i ich kompleksów są testowane pod kątem ich skłonności do tworzenia uporządkowanych trójwymiarowych sieci poprzez krystalizację2,3,4. Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promienie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej5,6. Co najważniejsze, nie można przewidzieć warunków krystalizacji nowej próbki, a wydajność kryształów wysokiej jakości jest zwykle bardzo niska. Podstawowym powodem jest to, że wiele interesujących próbek ma trudne właściwości biochemiczne, które sprawiają, że są niestabilne w odpowiedniej skali czasowej krystalizacji (zwykle kilka dni). Wreszcie, proces ten jest spotęgowany przez czas potrzebny do wyprodukowania próbek i wariantów próbek oraz optymalizacji ich oczyszczania i krystalizacji7,8.

Warunek krystalizacji to roztwór z precydentem, który zmniejsza rozpuszczalność próbki, a warunki często zawierają również i dodatki. Setki takich odczynników są dobrze przystosowane do zmiany parametrów eksperymentów krystalizacji, ponieważ mają niską skłonność do ingerowania w integralność próbki (takiej jak rozwijanie białka lub kwasu nukleinowego). Podczas gdy testowanie milionów kombinacji odczynników do krystalizacji nie jest wykonalne, testowanie od kilku do wielu zestawów przesiewowych - opracowanych przy użyciu różnych strategii9,10 - jest możliwe dzięki zminiaturyzowanym próbom i zautomatyzowanym protokołom. W tej perspektywie najbardziej podatną techniką jest prawdopodobnie dyfuzja pary wodnej z kropelkami o wielkości 100-200 nL osadzonymi na małej studni nad zbiornikiem zawierającym stan krystalizacji (25-250 μL), zaimplementowana w specjalistycznych płytkach krystalizacyjnych11,12. Próbka i stan białka są często łączone w stosunku 1:1 w celu uzyskania całkowitej objętości 200 nL podczas umieszczania kropelek w górnych studzienkach. Zrobotyzowana krystalizacja białek w nanolitrach może być realizowana za pomocą alternatywnych technik i płytek, takich jak under-oil batch13 i Lipidic Cubic Phase14 (najnowsza z nich jest stosowana specjalnie do białek transbłonowych, które są bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie).

Instalacja krystalizacji w MRC-LMB została uruchomiona na początku 2000 roku, a wczesne podsumowanie naszych automatycznych protokołów zostało przedstawione w 2005 roku15. Przedstawiono historyczne wprowadzenie do krystalizacji białek, a także zarys zalet robotycznego podejścia nanolitrowego (wówczas nowatorskiego podejścia do rutynowych eksperymentów). Ponieważ krystalizacja makromolekularna jest zasadniczo procesem stochastycznym, w którym nie ma zbyt wielu użytecznych informacji wstępnych, zastosowanie szerokiej gamy (odpowiednich) warunków początkowych zwiększa wydajność wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych16. Poza tym często pomijaną zaletą dużego ekranu początkowego jest w wielu przypadkach znaczne zmniejszenie potrzeby optymalizacji próbek i kryształów. Oczywiście, może być jeszcze konieczne przystąpienie do optymalizacji niektórych warunków początkowych w późniejszym czasie. Zazwyczaj stężenie odczynników i pH są następnie systematycznie badane. Do zoptymalizowanych warunków można również wprowadzić więcej odczynników, aby jeszcze bardziej zmienić parametry krystalizacji. Z pewnością należy podjąć próbę krystalizacji ze świeżo przygotowaną próbką, stąd odpowiednie protokoły muszą być proste i dostępne w każdej chwili.

Tutaj w pełni opisane są dwa w pełni zautomatyzowane systemy zaprojektowane w MRC-LMB (systemy 1 i 2) oraz odpowiadające im protokoły. Głównym zastosowaniem tych dwóch systemów jest wstępne przesiewanie przez dyfuzję pary w płytkach krystalizacyjnych w kropli siedzącej. System 1 integruje urządzenie do obsługi cieczy, automatyczną karuzelę do magazynowania płyt, drukarkę atramentową do etykietowania płyt oraz samoprzylepną zgrzewarkę do płyt. W systemie 1 72 96-dołkowe płytki są wypełnione dostępnymi na rynku zestawami przesiewowymi (80 μl stanu przeniesionego do zbiornika z początkowej objętości 10 ml w probówkach), oznakowanymi i zaplombowanymi. Płytki są następnie przechowywane w inkubatorze o temperaturze 10 °C, gdzie są dostępne dla użytkowników w dowolnym momencie (jako początkowe sita zwane "płytkami LMB").

System 2 integruje obsługę płynów, dozownik nanolitrów i samoprzylepny uszczelniacz do płyt. W systemie 2 siedzące kropelki (100-1000 nL) do eksperymentów dyfuzji parowej są wytwarzane przez połączenie warunków i próbki w górnych studzienkach 20 48- lub 96-dołkowych płytek wstępnie wypełnionych warunkami. Oznacza to, że testowanych jest 1 920 wstępnych warunków przesiewowych przy użyciu 20 płytek LMB w systemie 2.

Roboty są również używane indywidualnie do optymalizacji wybranych warunków, a odpowiednie protokoły półautomatyczne są również opisane. Metoda 4-rogowa17 jest rutynowo stosowana do tworzenia ekranów optymalizacyjnych. Odpowiedni protokół wymaga najpierw ręcznego przygotowania 4 roztworów ("A, B, C i D"). Dwa liniowe gradienty stężeń (dla dwóch głównych czynników krystalizacyjnych) są następnie automatycznie generowane bezpośrednio do zbiorników płytki krystalizacyjnej. W tym celu strzykawka do obsługi płynów dozuje 4 roztwory narożne w różnych proporcjach.

Aby jeszcze bardziej zoptymalizować warunek, można zastosować sita addytywne, które potencjalnie poprawiają właściwości powstałych kryształów18. Dostępne są dwa podejścia do badania przesiewowego dodatków: protokół rozpoczynający się od dodatków dozowanych do zbiorników płytek krystalizacyjnych przed ustawieniem kropelek (protokół 1) oraz drugi protokół, w którym sitko dodatku jest dozowane bezpośrednio na kropelki (protokół 2).

Inne użyteczne rozwiązania, które zostały zainicjowane w MRC-LMB w celu ułatwienia automatycznej krystalizacji makromolekularnej, są również prezentowane. Zasadniczo płytki krystalizacyjne i związane z nimi urządzenia, takie jak pokrywka Society of Biomolecular Screening (SBS), która minimalizuje parowanie warunków podczas korzystania z systemu 2.

Dla zwięzłości, zakłada się, że użytkownicy są zaznajomieni z podstawowymi funkcjami i obsługą dozownika nanolitrów, drukarki atramentowej i samoprzylepnego uszczelniacza do płyt. O ile nie określono inaczej, tabliczki znamionowe na pokładzie robotów są umieszczone w taki sposób, aby studzienka A1 ("narożnik A1") była skierowana w stronę lewego tylnego rogu plate carriera.

Protokół

1. Dwa w pełni zautomatyzowane systemy (wstępne badanie)

  1. System 1: przygotowanie 72 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych wypełnionych zestawami do przesiewania (płytki LMB)
    1. Przed wykonaniem procedury należy upewnić się, że roboty systemu są zainicjowane, a ich oprogramowanie sterujące jest otwarte. Włączyć agregat chłodniczy nośnika chłodzenia rurowego na około 30 minut przed rozpoczęciem programu głównego.
    2. Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy folia jest prawidłowo nałożona. Powtórz ten test jeszcze dwa razy, aby sprawdzić, czy uszczelniacz do płyt jest gotowy.
    3. Następnie dodaj 20 l wody dejonizowanej do głównego pojemnika urządzenia do obsługi cieczy. Odłączyć wkładki sprzęgające od małego pojemnika (20% roztwór płuczący etanolu) i podłączyć wkładki do głównego pojemnika.
    4. Wprowadź odpowiednią nazwę ekranu (Tabela 1) na ekranie dotykowym drukarki atramentowej. Następnie otwórz i zamknij drzwi karuzeli, aby uruchomić obrót karuzeli. Otwórz drzwi, gdy pojawi się pierwszy stos.
    5. Całkowicie załaduj pierwszy stos 22 płytkami krystalizacyjnymi, każda z kolumną 1 skierowaną na zewnątrz. W ten sam sposób w pełni załaduj kolejne dwa stosy.
    6. Załaduj pozostałe 6 talerzy na najwyższe pozycje czwartego stosu. Następnie zamknij drzwi karuzeli.
    7. Sprawdź, czy wyświetlacz agregatu chłodniczego wskazuje 14 °C. Delikatnie i wielokrotnie odwracaj wybrane zestawy przesiewcze przez 1 minutę. Następnie otwórz przedni panel uchwytu do cieczy.
    8. Otwórz rurki i umieść je w nośniku chłodzącym zgodnie ze standardowym układem 96 dołków (A1, A2 itd.). Po umieszczeniu każdej probówki w nosidełku umieść jej pokrywkę na tacy w tym samym układzie 96 dołków.
    9. Sprawdź krzyżowo pozycje rur i upewnij się, że wszystkie rurki są wypoziomowane i osadzone w nośniku. Następnie zamknij panel przedni.
    10. W oknie "Uruchamianie" oprogramowania do obsługi cieczy wybierz opcję "Uruchom konserwację" i otwórz program płukania. Uruchom program, aby wypłukać 20% etanol z systemu i umyć zewnętrzną część końcówek dozujących płyn
      11. .
    11. Po zakończeniu opróżniania kliknij "Anuluj", aby powrócić do "Uruchamiania". Wybierz opcję "Uruchom istniejący proces" i kliknij "Rozpocznij wybór". Otwórz program "Dozowanie zestawu MRC". Wpisz "18" dla "Instancji" na ekranie konfiguracji i uruchom program.
    12. Monitoruj system, gdy pierwsze cztery płytki są etykietowane, napełniane i plombowane.
    13. Po przygotowaniu wszystkich 72 płytek i umieszczeniu ich z powrotem w karuzeli, zmień wkładki sprzęgające z głównego pojemnika na mały pojemnik. Uruchom program 'Start up flush' (patrz krok 1.1.10).
    14. Wyłącz agregat chłodniczy i wyrzuć puste rurki zestawu przesiewającego. Ostrożnie wyjmij 72 przygotowane talerze z karuzeli. Wyrzuć nieprawidłowo wypełnione lub źle uszczelnione talerze. Gotowe do użycia talerze należy przechowywać w temperaturze 10 °C.
  2. System 2: ustawienie kropelek krystalizacji (stan 100 nL białka + 100 nL) z pojedynczej próbki na 20 płytkach LMB
    1. Najpierw upewnij się, że roboty systemu są włączone, dozownik nanolitrów jest zainicjowany z otwartym oprogramowaniem, a menedżer metod obsługi cieczy jest otwarty. Włącz nośnik chłodzący mikrorurki na około 15 minut przed rozpoczęciem programu głównego.
    2. Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy płyta jest prawidłowo uszczelniona. Przetestuj zgrzewarkę do płyt trzy razy.
    3. Następnie uruchom dozownik nanolitrów, aby ustawić 100-nL kropelki roztworu testowego na płytce testowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropelki są prawidłowo ustawione. Zamknij oprogramowanie dozownika nanolitrów i wyjmij blok uchwytu paska z pokładu.
    4. Następnie włożyć do specjalnie zaprojektowanego uchwytu płytki (patrz Reprezentatywne wyniki: Urządzenia do krystalizacji opracowane w LMB) płytkę LMB z największą względną ilością lotnych odczynników w swoich warunkach (Tabela 1). Usuń folię samoprzylepną z płytki.
    5. Otwórz przedni panel wózka do obsługi cieczy i umieść nieuszczelnioną płytę na pokładzie, z tyłu pierwszego przesuwnego nośnika (przesuwne nośniki można wyciągnąć w celu ułatwienia dostępu).
    6. Przykryj talerz aluminiową pokrywką SBS. Ustaw pokrywę w kierunku tylnego lewego rogu nosidełka, delikatnie naciskając na przeciwległy róg pokrywy.
    7. Rozszczelnić, załadować do przesuwnych nośników i przykryć pozostałe 19 płyt w ten sam sposób, pracując w warunkach największej do najmniej lotnej. Gdy nośnik chłodzący mikrorurki osiągnie temperaturę 4 °C, co sygnalizuje zielone światło, zdejmij jego pokrywę.
    8. Odciąć pokrywkę mikroprobówki zawierającej (co najmniej) 440 μl próbki białka (tabela 2). Upewnij się, że próbka nie ma piany powyżej menisku, ponieważ będzie to kolidować z systemem wykrywania cieczy. Umieść rurkę w pozycji 1 nośnika chłodzącego mikrorurki.
    9. Umieść płytkę PCR na pokładzie do obsługi cieczy przed nośnikiem adaptera do przesuwania płyty. Następnie zamknij panel przedni.
    10. Po załadowaniu pokładu upewnij się, że pokład dozownika nanolitrów jest wolny od bloku uchwytu paska i że nośniki z tyłu stosów końcówek o pojemności 50 μl są wolne od aluminiowych pokryw SBS.
    11. W interfejsie "Zarządzanie metodami" w module obsługi cieczy wybierz opcję "Płyty nastawcze". Monitoruj inicjalizację obu systemów i wypełnij parametry uruchamiania. Postępuj zgodnie ze wskazówkami interfejsu zarządzania metodą (podpowiedzi, rysunki i system zarządzania końcówkami pomagają w przygotowaniu).
    12. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie wymagane komponenty są gotowe, a następnie rozpocznij proces.
    13. Monitoruj system, gdy dozownik nanolitrów ustawia krople w pierwszej płytce, a następnie zgrzewarka do płytek uszczelnia płytkę.
    14. Gdy wszystkie 20 płytek zostanie przygotowanych z kropelkami krystalizacji i automatycznie zwróconych do przesuwanych nośników, otwórz panel przedni i delikatnie wyjmij płytki. Sprawdź, czy płytki są prawidłowo zamknięte przed przechowywaniem ich do krystalizacji.
    15. Oczyść pokrywki SBS 20% roztworem etanolu przed ułożeniem ich po lewej stronie pojemnika na płyny do przechowywania. Wyrzucić płytkę PCR i mikroprobówkę.
    16. Wyłącz nośnik chłodzący mikrorurki i zetrzyj kondensację. Pozostaw ręcznik papierowy na chłodniejszej powierzchni, aby wchłonąć dalszą kondensację. Następnie załóż pokrywę bagażnika i zamknij panel przedni.

2. Optymalizacja warunków

  1. Strzykawkowy płyn: wytwarzanie dwóch liniowych gradientów stężeń w zbiornikach płytki krystalizacyjnej (metoda 4-kątna).
    1. Najpierw upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest włączone i zainicjowane z otwartym oprogramowaniem.
    2. Na karcie 'GRADIENT': Otwórz żądany program, wybierz typ płytki krystalizacyjnej i końcową objętość w zbiornikach (Tabela 3). Zaawansowane ustawienie "maksymalnej objętości strzału" należy obniżyć z 6 000 do 3 000 w przypadku stosowania roztworów zawierających [izopropanol] > 10% v/v i [MPD] > 20% v/v.
    3. Przygotować strzykawki. Umieść tłok w każdej strzykawce (spiczastymi końcami do dołu) i włóż tylną część strzykawek do wyznaczonych rowków pod głowicą robota. Przekręcić strzykawkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować ją na miejscu (program rozpocznie się tylko wtedy, gdy wszystkie wymagane strzykawki są prawidłowo podłączone).
    4. Przygotuj koryta. Zdejmij ramę ze stali nierdzewnej i włóż koryta. 4 pozycje po lewej stronie odpowiadają 4 rogom A, B, C, D. Przełącz na zakładkę "SET UP", która wyświetla objętości roztworów wymagane w każdej strzykawce (w Tabeli 3 do wyświetlanych objętości dodano 0,5 ml martwej objętości). Wlej roztwory narożne do odpowiednich koryt i umieść ramę z powrotem na pokładzie (rama utrzymuje się na miejscu za pomocą 2 małych magnesów umieszczonych z przodu pokładu). Alternatywnym sposobem wykonania tego kroku jest wlanie roztworów do koryt, gdy są już umieszczone na pokładzie.
    5. Umieścić płytkę krystalizacyjną na zmotoryzowanym nośniku SBS.
    6. Kliknij "ASPIRATE" i poczekaj, aż ten krok zostanie zakończony (gdy tłoki zatrzymają się w drodze do góry).
    7. Przejdź do zakładki "URUCHOM" i uruchom program.
    8. Po zakończeniu programu wróć do zakładki SET UP i kliknij "USUŃ": system oczyszcza strzykawki z resztek roztworów, a następnie podnosi tłoki do góry. Zamiast "REMOVE" można zażądać "PURGE"; spowoduje to pozostawienie tłoków w dolnym położeniu, gotowych do zasysania większej liczby roztworów za pomocą tych samych strzykawek.
    9. Wyjąć strzykawki, przekręcając je w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
    10. Wyrzuć strzykawki i koryta do odpowiedniego pojemnika (lub spłucz je wodą dejonizowaną, a następnie 20% v/v roztworem etanolu do ponownego użycia).
    11. Uszczelnij płytkę i umieść ją na mieszalniku do mikropłytek na 3 minuty przy 1 000 obr./min lub 10 minut, gdy mieszane są roztwory o dużej lepkości. Płytka jest gotowa do ustawiania kropelek krystalizacji na dozowniku nanolitrów.
  2. Protokół badania przesiewowego dodatków 1 (umieszczanie kropelek krystalizacji w 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej wstępnie wypełnionej sitkiem z dodatkami)
    1. Najpierw należy przygotować warunek z początkowymi stężeniami odczynników zwiększonymi o 10% (min. obj. 15 ml przy przenoszeniu stanu z pojemnika na sito dodatku z płynem).
    2. Upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest gotowe do pracy. Otwórz program 'Dodaj sitko do dodatków' dla pojedynczej płytki (w zbiornikach wpisać objętość: '72 μL'). Podpowiedzi, cyfry i system zarządzania końcówkami (wymagane końcówki 12 x 1 000 μl) pomagają upewnić się, że robot jest gotowy do pracy zgodnie z wybranymi opcjami.
    3. Wyjmij sitko z dodatkiem z inkubatora o temperaturze -20 °C i natychmiast zdejmij jego aluminiową uszczelkę (użyj uchwytu na płytkę), a następnie umieść płytkę na pokładzie urządzenia do obsługi cieczy. Program działa w układzie pionowym (tabliczka jest umieszczona z rogiem A1 znajdującym się z przodu po lewej stronie nośnika). Umieść również pojemnik wypełniony stanem. Uruchom program.
    4. Po napełnieniu zbiorników płytki umieść ją na wytrząsarce do mikropłytek i uruchom program. Wypłukać pojemnik z kondycją wodą dejonizowaną i 20 % etanolem do ponownego użycia.
    5. Ustaw kropelki na dozowniku nanolitrów. Najpierw rozszczelnić płytkę krystalizacyjną (użyć uchwytu płytki). Następnie umieść płytkę i 8-dołkowy pasek białkowy w pierwszej pozycji bloku uchwytu paska. Zakładka "Ustawienia" w oprogramowaniu sterującym wyświetla rzeczywiste pozycje każdego elementu na pokładzie. Załadować każdą studzienkę paska próbką białka zgodnie z wymaganą wielkością kropli (Tabela 4). Uruchom program, aby przygotować kropelki.
    6. Po zakończeniu programu zdejmij płytkę z pokładu i natychmiast ją uszczelnij (użyj uszczelniacza do płyt, taśmy klejącej o szerokości 3 cali). Wyrzuć pasek do odpowiedniego pojemnika.
    7. Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.
  3. Protokół przesiewania dodatków 2 (umieszczanie kropelek krystalizacji na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej z sitkiem do wielokrotnego użytku)
    1. Najpierw przygotuj sitko z dodatkiem: pozostaw odpowiednią zamrożoną 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie odwirować przesiewanie dodatku o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
    2. Przygotować warunek (min. 15 ml przy przenoszeniu warunku z pojemnika na sito dodatków za pomocą urządzenia do obsługi cieczy).
    3. Napełnij zbiorniki 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej warunkiem. Na urządzeniu do obsługi cieczy postępować w taki sam sposób, jak w protokole 1, krok 2.2.2, ale wprowadzić "80 μl" dla objętości w zbiornikach.
    4. Umieść kropelki na dozowniku nanolitrów z 3 składnikami na pokładzie (płytka zawierająca sitko z dodatkiem, wraz z płytką krystalizacyjną i 8-dołkowym paskiem białkowym w pierwszej pozycji bloku uchwytu na paski, tabela 4).
    5. Uszczelnić płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sito blachą aluminiową i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze -20 °C.
    6. Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.

Wyniki

1. System 1 i płytki LMB

Rycina 1A pokazuje system 1 oparty na dozowniku cieczy pracującym z układem cieczy (wodą dejonizowaną). Układ cieczy składa się z pojemnika, pompy, węży, 8 strzykawek wyposażonych w zawory oraz 8 stałych końcówek. Ustawienia klasy cieczy zostały zoptymalizowane w celu pobierania i dozowania szerokiej gamy roztworów oraz wielokrotnego dozowania do 4 płytek (wielokrotne dozowanie wymaga stosunkowo dużej nadmiarowej objętości pobranej cieczy). Pod systemem przechowywane są zbiornik wody o pojemności 22 L oraz mniejszy pojemnik (5 L) zawierający 20 % v/v etanolu, służące zasilaniu układu cieczy. Każdy pojemnik wyposażony jest w dwa wloty sprzęgające. Jeden wlot (kolor niebieski) doprowadza ciecz do systemu, drugi (kolor czerwony) służy jako przewód zwrotny do zmniejszenia nadmiaru ciśnienia. Po użyciu płukanie wodą, a następnie roztworem etanolu o stężeniu 20 % v/v zapobiega wzrostowi mikroorganizmów. Jednostka chłodząca (również umieszczona pod systemem) jest podłączona do specjalnie zaprojektowanego nośnika chłodzącego rury. Szerokość systemu 1 wynosi 2050 mm, wliczając karuzelę, głębokość 760 mm, a wysokość 88 mm. Dodatkowo z przodu wymagane jest 550 mm na stół roboczy, na którym umieszczona jest jednostka sterująca drukarki atramentowej oraz urządzenie do laminowania płytek. Obok systemu konieczna jest również dodatkowa przestrzeń na komputer sterujący. Program do produkcji 72 wstępnie napełnionych płytek (czyli 18 cykli po 4 płytki) trwa 3 h i 50 min.

Rycina 1B przedstawia zbliżenie pokładu głównego wyposażonego w 8 stałych końcówek (Rycina 1C) zamontowanych na automatycznym ramieniu pipetującym, drugim ramieniu z chwytakiem, stacji do płukania końcówek, nośnikach 2 x 4-pozycyjnych do płyt SBS oraz nośniku do chłodzenia probówek. Główny program przetwarza jednocześnie 4 płyty, które są automatycznie pobierane z karuzeli i umieszczane na pokładzie, gdzie są wypełniane warunkami krystalizacji (80 µL w zbiornikach, Rycina 1D). Poziomy cieczy są automatycznie wykrywane, ponieważ końcówki są przewodzące. Podczas gdy dozownik cieczy rozprowadza warunki do jednego zestawu płyt, inny zestaw pustych płyt jest pobierany z karuzeli, oznaczany i umieszczany na głównym pokładzie. Aby umieścić głowicę drukarki i jej czujnik z tyłu głównego pokładu, wymagany był mały, specjalnie zaprojektowany uchwyt oraz otwór w tylnej ściance dozownika cieczy. Po każdym etapie dozowania, składającym się z 4 porcji w odpowiednich kolumnach zbiorników, 8 końcówek jest przepłukiwanych i mytych wodą z głównego pojemnika. Po wypełnieniu 4 płyt, są one automatycznie zamykane i umieszczane z powrotem w swoich oryginalnych pozycjach na karuzeli. Zamknięcie płyt jest inicjowane przez specjalny sterownik (wywoływany przez oprogramowanie kontrolne). Zamykarka używa rolki 3-calowej taśmy samoprzylepnej, która jest nakładana na płytę za pomocą wałków pod ciśnieniem mechanicznym. Po zakończeniu programu wstępnie wypełnione płyty są ręcznie usuwane ze stert na karuzeli i przechowywane w inkubatorze o temperaturze 10 °C znajdującym się w obiekcie.

Zautomatyzowane ustawienie do oczyszczania białek z elementami robotyki, obsługi próbek i ładowania plytek.
Rycina 1: Wypełnianie zbiorników zestawami do wstępnego przesiewu. (A) Widok ogólny całkowicie zautomatyzowanego systemu 1. Karuzela to oddzielna zautomatyzowana jednostka z wieżami plytek, umieszczona w komorze wykonanej z przezroczystych płyt akrylowych po prawej stronie głównej platformy. (B) Główna platforma dozownika cieczy podczas pracy, z (a) chłodzonym nośnikiem probówek (podłączonym do jednostki chłodzącej umieszczonej pod spodem, niewidocznej), (b) szybką stacją płukania (podłączoną do odpływu, niewidocznego), (c) ramieniem pipetującym napełniającym 8 zbiorników płytki krystalizacyjnej 96-dołkowej, (d) ramieniem chwytaka przemieszczającym wypełnioną płytkę na (e) napędzany nośnik SBS uszczelniający płytki. Z tyłu platformy znajduje się (f) głowica drukarki atramentowej podłączona do (g) sterownika drukarki atramentowej umieszczonego pod uszczelniającym urządzeniem. (C) Oznaczona płytka (nazwa przesiewu i data produkcji) wypełniana warunkami krystalizacji za pomocą 8 przewodzących stałych końcówek wykonanych ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem. (D) Przekrój uszczelnionego dołka krystalizacyjnego. Zbiornik zawiera 80 µL warunków krystalizacji (górny dołek jest pusty). Wymagania dotyczące głębokości zbiornika i górnego dołka podane są w milimetrach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1 przedstawia różne składniki dostępnych komercyjnie zestawów do badań w probówkach. Zestawy te są regularnie wykorzystywane do napełniania zbiorników 96-dołkowych płyt do krystalizacji (LMB01-LMB22) przy użyciu systemu 1.

Nazwa płytkinazwa zestawudostawcanumer katalogowyrurkipodstawowy opis
LMB01Crystal Screen 1Hampton ResearchHR2-11048Macierz rzadka (pH 4,6–8,5)
Crystal Screen 2Hampton ResearchHR2-11248Próbkowanie stochastyczne (pH 4,6–9,0)
LMB02Wizard 1Rigaku100953048Próbkowanie stochastyczne (pH 4,5–10,5)
Wizard 2Rigaku100953148Próbkowanie stochastyczne (pH 4,5–10,5)
LMB03Grid Screen Ammonium SulfateHampton ResearchHR2-21124Siatka testowa, [AmS] = 0,8–3,2 M oraz bufory pH 4,0–9,0
Grid Screen PEG/LiClHampton ResearchHR2-21724Siatka testowa, [PEG 6000] = 0–30 % wag./obj., stęż. LiCl = 1,0 M oraz bufory pH 4,0–9,0
Quick ScreenHampton ResearchHR2-22124Siatka testowa, [NaKPO4] = 0,8–1,8 M przy pH 5,0–8,2
Grid Screen Sodium ChlorideHampton ResearchHR2-21924Siatka testowa, [NaCl] = 1,0–4,0 M oraz bufory pH 4,0–9,0
LMB04Grid Screen PEG 6000Hampton ResearchHR2-21324Siatka testowa, [PEG 6000] = 5–30 % wag./obj. oraz bufory pH 4,0–9,0
Grid Screen MPDHampton ResearchHR2-21524Siatka testowa, [MPD] = 10–65 % wag./obj. oraz bufory pH 4,0–9,0
MemFacHampton ResearchHR2-11448Macierz rzadka dla białek błonowych (pH 4,6–8,5)
LMB05PEG-IonHampton ResearchHR2-12648Siatka testowa, [PEG 3350] = 20 % wag./obj. oraz różne sole o stężeniu 0,2 M (bez buforów)
NatrixHampton ResearchHR2-11648Niekompletna faktoryzacja (pH 5,6–8,5)
LMB06Crystal Screen LiteHampton ResearchHR2-12848Crystal Screen 1 z połową pierwotnych stężeń osadzających
Custom Lite screenMolecular Dimensionsn/a48Dodatkowe warunki o niskich stężeniach osadzających
LMB07Wizard Cryo 1Rigaku100953648Próbkowanie stochastyczne z warunkami kriozabezpieczonymi przy użyciu PEG o niskiej masie cząsteczkowej (pH 4,5–9,4)
Wizard Cryo 2Rigaku100953748Próbkowanie stochastyczne z warunkami kriozabezpieczonymi przy użyciu PEG o niskiej masie cząsteczkowej (pH 4,5–10,1)
LMB08JBS1JenaBioScienceCS-101L24Niekompletna faktoryzacja oparta na różnych PEG (pH 4,6–9,0)
JBS2JenaBioScienceCS-102L24Niekompletna faktoryzacja oparta na PEG 4000 (pH 4,6–8,5)
JBS3JenaBioScienceCS-103L24Niekompletna faktoryzacja oparta na PEG 4000 (pH 4,6–8,5)
JBS4JenaBioScienceCS-104L24Niekompletna faktoryzacja oparta na PEG o średniej masie cząsteczkowej (pH 6,5–8,5)
LMB09JBS5JenaBioScienceCS-105L24Niekompletna faktoryzacja oparta na PEG o dużej masie cząsteczkowej (pH 6,5–9,5)
JBS6JenaBioScienceCS-106L24Niekompletna faktoryzacja oparta na AmS (pH 4,6–8,5)
JBS7JenaBioScienceCS-107L24Niekompletna faktoryzacja oparta na MPD (pH 4,6–8,5)
JBS8JenaBioScienceCS-108L24Niekompletna faktoryzacja oparta na MPD i etanolu (pH 4,6–8,5)
LMB10JBS9JenaBioScienceCS-109L24Niekompletna faktoryzacja oparta na typowych solach i 2-propanolu (pH 4,6–8,5)
JBS10JenaBioScienceCS-110L24Niekompletna faktoryzacja oparta na typowych solach (pH 4,6–8,5)
Clear Strategy Screen 1 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 1 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
LMB11Clear Strategy Screen 1 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 1 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 1 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 2 pH 4.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
LMB12Clear Strategy Screen 2 pH 5.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 2 pH 6.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 2 pH 7.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
Clear Strategy Screen 2 pH 8.5Molecular DimensionsMD1-16LMB24Siatka testowa z różnymi PEG
LMB13IndexHampton ResearchHR2-14496Mała macierz rzadka i siatki testowe (pH 3,0–9,0)
LMB14SaltRX 1Hampton ResearchHR2-10748Siatka testowa zawierająca 22 unikalne sole w zależności od stężenia soli i pH (4,1–9,0)
SaltRX 2Hampton ResearchHR2-10948Siatka testowa zawierająca 22 unikalne sole w zależności od stężenia soli i pH (4,1–9,0)
LMB15MemStartMolecular DimensionsMD1-2148Macierz rzadka dla białek błonowych (pH 4,0–10,0)
MemSysMolecular DimensionsMD1-2548Siatka testowa dla białek błonowych (głównie PEG, pH 3,5–9,5)
LMB16JCSG+Qiagen13072096Macierz rzadka (pH 4,0–10,0)
LMB17MORPHEUS screenMolecular DimensionsMD1-4696Siatka testowa zawierająca mieszaniny dodatków i warunki kriozabezpieczone (pH 6,5–8,5)
LMB18Pi minimal screenJenaBioScienceCS-12796Niekompletna faktoryzacja (pH 4,0–9,5)
LMB19Pi-PEG screenJenaBioScienceCS-12896Niekompletna faktoryzacja dla białek błonowych (pH 4,8–8,8)
LMB20MORPHEUS II screenMolecular DimensionsMD1-9196Siatka testowa zawierająca mieszaniny dodatków (ciężkie atomy) i warunki kriozabezpieczone (pH 6,5–8,5)
LMB21LMB crystallization screenMolecular DimensionsMD1-9896Macierz rzadka zawierająca warunki wybrane z publikacji LMB
LMB22MORPHEUS III screenMolecular Dimensionsn/a96Siatka testowa zawierająca mieszaniny dodatków (związki lekowe) i warunki kriozabezpieczone (pH 6,5–8,5)

Tabela 1: Skład kity do płyt LMB. Każdy komercyjny zestaw do badań zawiera 24/48/96 warunków początkowo w probówkach. Płyty LMB są przechowywane w inkubatorach o temperaturze 10 °C znajdujących się w obiekcie, gdzie są dostępne dla użytkowników w dowolnym czasie.

2. System 2 i wymagania dotyczące przygotowania kropelek

Rycina 2A przedstawia system 2 oparty na dozowniku cieczy19 działającym w oparciu o przesunięcie pozytywne i jednorazowe końcówki. Jednorazowe końcówki są dostarczane w stosowanych stojakach odpowiednich do automatycznego manipulowania. Trzystopniowy dozownik nanolitrowy20 został zintegrowany z prawej strony systemu. Aspiracja/dozowanie na dozowniku nanolitrowym działa również za pomocą przesunięcia pozytywnego, wykorzystując jednorazowe mikroszczepy (dostarczane w dużych szpulach). Jako samodzielny robot, do ładowania próbek białek stosuje się wymienny blok uchwytu pasków. W przypadku całkowicie zautomatyzowanego procesu, uchwyt pasków zastępowany jest płytą PCR o 384 dołkach. Podobny samoprzylepny uszczelniacz płyty, jak w systemie 1, został zintegrowany z lewej strony. Uszczelniacz oraz dozownik nanolitrowy umieszczone są na specjalnie zaprojektowanych podniesionych stołach roboczych, aby główny chwytak mógł sięgnąć nośników płytek tych dwóch zintegrowanych robotów (w obu bocznych panelach dozownika cieczy musiano wykonać otwory, aby umożliwić chwytakowi dostęp na zewnątrz głównej platformy). Główny program uruchamia odpowiednie sterowniki w odpowiednim czasie, by wywołać programy dozowania nanolitrowego oraz działanie uszczelniacza. System 2 ma szerokość 2850 mm, głębokość 800 mm i wysokość 800 mm. Obok robota wymagana jest dodatkowa przestrzeń na wyświetlacz sterującego komputera PC. Dwa pojemniki na odpady znajdują się pod systemem i służą do odbioru zużytych końcówek oraz mikroszczepów (sterujący komputer PC jest również przechowywany w tej przestrzeni). Ważną cechą systemu 2 jest ogólna układka, która zapewnia łatwy dostęp do trzech robotów, umożliwiając ich indywidualne wykorzystanie w protokołach optymalizacyjnych opisanych wcześniej lub w innych protokołach opisanych w innych miejscach, takich jak krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych21 czy losowe ekranowanie macierzy mikronasiennych22.

Rysunek 2B to powiększenie platformy wyposażonej w pojedyncze ramię robotyczne. Ramię to integruje 12 niezależnych pipetujących sond oraz główny chwytak. Położenia sond można kontrolować indywidualnie w jednym kierunku, aby uzyskać dostęp do różnych miejsc wzdłuż osi między sondami lub nawet pojedynczych probówek. Sondy mogą pobierać jednorazowe końcówki (1–12) lub parę adapterów do przemieszczania płyt. Początkowo ładowane są dwa zestawy po 4 stosy zawierające po 50 µL jednorazowych końcówek. Poziom cieczy jest automatycznie wykrywany, ponieważ końcówki są przewodzące. Adaptery do przemieszczania płyt są wyposażone w dwóch ostrych szpilkach po wewnętrznej stronie, które w razie potrzeby tworzą dodatkowy chwytak. Na głównej platformie znajduje się chłodzony nośnik mikroprobówek na 24 pozycje przeznaczony do próbek, choć w tym przypadku wykorzystywane są tylko 1–2 pozycje. Dodatkowo znajduje się tam nośnik dla płyty PCR oraz dwa nośniki do przechowywania nakładek SBS, które można układać w stosy i które zostały specjalnie zaprojektowane (Rysunek 2C). Na koniec znajdują się cztery przesuwne nośniki, z których każdy ma 5 miejsc na płyty do krystalizacji (4 × 5 = 20 płyt).

Automatyczny system dozowania cieczy; układ mikopłytki; schemat procesu parowania; analiza kropli.
Rycina 2: Przygotowanie kropelek do eksperymentów dyfuzji par. (A) Widok ogólny całkowicie zautomatyzowanego systemu 2. (B) główna platforma urządzenia do manipulacji cieczami w trakcie pracy z (anośniki magazynowe do przechowywania zestawów pokrywek SBS, (b) nakładalne końcówki, (cchłodzoną podkładkę z próbką w mikroprobówce, (d) nośnik dla 2 adaptorów przesuwających płytki, (e) płytę PCR do przeniesienia białka do robota do manipulacji w skali nanolitra, (f9 zamkniętych płytek, które zostały ponownie umieszczone w ich początkowych pozycjach, (gopcjonalny chwytak usuwający pokrywkę SBS płytki 10th płyta przed transportem na stację roboczą dozownika cieczy, (hnastępne 10 płytek przygotować z pokrywkami SBS na górze,igłówny chwytak, który służy do transportu płyt PCR i krystalizacyjnych,j) główny automatyczny manipulator integrujący 12 sond pipetujących (2 z nich służą dodatkowo jako opcjonalny chwytak) oraz główny chwytak, oraz (ktalerz dozownika nanolitrowego.CWłasnoręcznie wykonane pokrywki SBS z aluminium. Pokrywki są wyposażone w arkusz gumowy zapobiegający parowaniu warunków oraz dwa niewielkie otwory umożliwiające precyzyjne podchwycenie przez opcjonalny chwytak.D) Przekrój uszczelnionego dołka krystalizacyjnego, w którym rezerwuar wypełniony jest warunkiem krystalizacji, a górna część dołka zawiera kroplę składającą się z próbki białka i warunku. Ponieważ stężenie czynnika wytrącającego w kropli jest niższe niż w warunku, stężenia wszystkich składników w kropli wzrastają wskutek utraty wody podczas procesu wyrównywania stężeń przez dyfuzję par (przedstawiono w sposób bardzo schematyczny za pomocą strzałki).E) mikrografie świetlne 100 nL i (FKrople o objętości 200 nL wytworzone za pomocą dozownika nanolitrowego z roztworem testowym (20% v/v polietylenu glikolu 400, 0,001% w/v safraniny jako barwnika czerwonego). Rozmiar i kształt kropelek może się różnić w zależności od właściwości chemiczno-fizycznych warunków. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Główny program rozpoczyna się od opcjonalnego chwytaka, który usuwa pokrywkę SBS z pierwszej płytki krystalizacyjnej. Po przeniesieniu pokrywki do odpowiedniego nośnika magazynowego, płytkę krystalizacyjną transportuje się na stolik dozownika nanolitrowego. Następnie ramię pipety przenosi wymaganą ilość próbki potrzebną do przygotowania kropelek z chłodzonego zazwyczaj mikroprobówka do pierwszej kolumny płytki PCR. Następnie główny chwytak przesuwa płytkę PCR na stolik dozownika nanolitrowego, który przygotowuje kropelki zgodnie z opcjami wybranymi przez użytkownika na początku (np. rozmiar kropelek). W tym celu próbkę białka najpierw dozuje się do górnych dołków (przy użyciu jednego zestawu 8 mikroszczecik i wielokrotnego dozowania), a następnie warunki krystalizacji dozuje się na kropelki białka (każdy rząd wymaga teraz 8 nowych mikroszczecik, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego). Po zakończeniu programu przygotowującego kropelki, główny chwytak transportuje odpowiednią płytkę do uszczelniacza, a następnie umieszcza płytkę PCR z powrotem w jej oryginalnym położeniu (w następnej kolumnie płytki PCR zostanie dozowana kolejna porcja białka dla kolejnej płytki). Wreszcie uszczelnioną płytkę krystalizacyjną przesuwa się z powrotem na jej oryginalne miejsce na stoliku: eksperymenty dyfuzji par już się rozpoczęły na tej płytce (Rycina 2D). Cykl ten powtarza się zgodnie z liczbą platek. W razie potrzeby opcjonalny chwytak usuwa pustą stację z końcówkami, umożliwiając ramieniu pipety dostępu do większej liczby końcówek. Program trwa 2 godziny i 20 minut oraz wymaga 440 µL próbki, aby przygotować pojedyncze kropelki na 20 płytkach, używając 100 nL próbki + 100 nL warunku (Rycina 2E i 2F).

Podczas korzystania z dozownika w skali nanolitrowej jako niezależnego robota do dwóch dodatkowych płytek (zobacz Protokół, krok 1.2.3), można przygotować cały zestaw dostępnych początkowych plytek do badania w inkubatorze o temperaturze 10 °C (22 płytki LMB × 96 warunków = 2112 warunki).

Tabela 2 przedstawia wymagania dotyczące głównego programu w zależności od wyborów użytkownika dokonanych w systemie 2.

PłytkiObjętość kropli (nL)Próbka(-i)Wymagania dotyczące końcówekCzas trwania
LiczbaTypObj. 1 (µL)Obj. 2 (µL)Końcówki 50 µLMikroszczepy
1096-dołkowa10024008010401 h 12 min
2096-dołkowa100440016020802 h 20 min
1096-dołkowa10024024016020801 h 45 min
2096-dołkowa10044044032041603 h 05 min
1048-dołkowa10006240805601 h 10 min
2048-dołkowa10001208016011202 h 16 min

Tabela 2: Przykłady głównych opcji programu dostępnych w systemie 2 do przygotowywania kropelek do krystalizacji. Wymagana ilość próbki białka, tipów i mikroszczecianek zależy od wybranego programu. Objętości próbki „obj. 1” (kropla 1) i „obj. 2” (kropla 2) oblicza się według wzoru: (8 tipów × wymagana objętość na dołek płytki PCR + 4 µL objętości utraconej) × liczba plytek do krystalizacji + 40 µL objętości martwej w mikroprobówce. Wymagana objętość na dołek płytki PCR dla kropelek 100 nL na 96-dołkowej płytce do krystalizacji wynosi 2 µL, natomiast dla kropelek 1000 nL na 48-dołkowej płytce wymagane jest 6,8 µL (objętość martwa w dołkach płytki PCR: 0,8 µL). Dodatkowa objętość próbki jest uwzględniana („objętość utracona”) ze względu na parowanie z mikroprobówki oraz inne straty (np. próbka przylegająca do tipów). Na przykład dla 20 plytek MRC, protokołu z kroplą 100 nL, jedna kropla, wymagana objętość próbki wynosi: (8 × 2 + 4) × 20 + 40 = 440 µL (tj. 22 µL na płytke). Do każdej płytki i każdej próbki potrzeba ośmiu jednorazowych tipów 50 µL. Na przykład dla 10 plytek i protokołu z dwiema kroplami liczba potrzebnych tipów wynosi 8 × 10 × 2 = 160 tipów. Liczbę mikroszczecianek oblicza się według wzoru: (8 + liczba warunków na płytke) × liczba próbek × liczba plytek. Na przykład dla 10 plytek 48-dołkowych liczba tipów do dozowania cieczy wynosi: (8 + 48) × 1 × 10 = 560 tipów.

3. Formułowanie, przygotowanie i obsługa roztworów czterech narożników

Oba sformułowania roztworów narożnych („A, B, C i D”) oraz odpowiadający im ekran optymalizacyjny (Rycina 3A) są generowane automatycznie za pomocą arkusza kalkulacyjnego Excel. Istnieją różne arkusze przeznaczone na różną liczbę warunków — zasadniczo 24, 48 i 96 warunków — a także arkusze umożliwiające przygotowanie dwóch różnych ekranów optymalizacyjnych na jednej plycie. Zwykle przygotowuje się zestaw 4 x 10 mL roztworów narożnych w probówkach, z których można przygotować 2–3 ekrany optymalizacyjne, w zależności od liczby i objętości potrzebnych warunków. Roztwory te są wlewane do żłobków, z których są pobierane przez urządzenie do dawkowania cieczy z użyciem strzykawek, a następnie bezpośrednio dozowane do płytek (Rycina 3B). Dwa gradienty liniowe stężeń powstają w wyniku mieszania roztworów A, B, C i D w systematycznie zmieniających się proporcjach (Rycina 3C).

Wysokoprzepustowe badania; schemat i układ systemu automatycznego pipetowania; wyniki analizy danych.
Rysunek 3: Metoda czterech narożników przygotowania ekranów optymalizacyjnych. (A) Schemat dwóch gradientów stężeń w układzie płytki 96-dołkowej. (B) Obsługa cieczy oparta na strzykawkach, gotowa do przygotowania ekranu z czterema strzykawkami umieszczonymi w głowicy robota. Płyta krystalizacyjna znajduje się w napędzanym nośniku SBS, a cztery roztwory wyjściowe (A, B, C i D) zostały już dozowane do odpowiednich żłobków (roztwory zostały zabarwione na czerwono wyłącznie w celach demonstracyjnych). (C) Stosunki roztworów A, B, C i D w 96 dołkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 3 przedstawia wymagania dotyczące programów dostępnych dla użytkowników na urządzeniu do dawkowania cieczy z wykorzystaniem strzykawek.

Typ płytkiLiczba warunkówObjętość na płytce (rezervoary, µL)Objętość w zlewkach (mL)Czas trwania
96-dołkowa48801,62 min 5 sek
96-dołkowa96802,53 min 50 sek
96-dołkowa2 x 48801,62 min 50 sek
48-dołkowa242001,82 min 25 sek
48-dołkowa4820034 min 20 sek

Tabela 3: Programy dostępne w dozowniku cieczy opartym na strzykawkach do przygotowywania ekranów optymalizacyjnych zgodnie z metodą czterech narożników. Płytkę 96-dołkową można wykorzystać do przygotowania ekranu optymalizacyjnego składającego się z 96 lub 48 warunków (gdy przygotowuje się jednocześnie dwa ekrany 48-warunkowe, robot musi być wyposażony w 8 strzykawek i 8 zbiorników). Inne programy umożliwiają wykorzystanie płytek 48-dołkowych. Wymienione objętości w zbiornikach obejmują wymaganą objętość martwą (0,5 mL).

4. Badanie addytywów

Rycina 4 przedstawia kroki prowadzące do wykonania ekraningu addytywnego, rozpoczynając od 96 roztworów addytyw już umieszczonych w zbiornikach płytki krystalizacyjnej (protokół 1) lub w dołkach płytki hodowlanej o niskim profilu, używanej jako wielokrotnego użytku ekran addytywny (protokół 2). Tabela 4 zawiera listę programów dostępnych w dispenserze nanolitrowym w zależności od dwóch typów protokołów.

Diagram procesu krystalizacji, protokoły z wykorzystaniem płyt MRC, dozowanie w skali nanolitrowej, dyfuzja parowa.
Rycina 4: Dwa typy protokołów stosowane w ekranowaniu dodatków. Siatki 96-dodatkowe przechowuje się w temperaturze -20 °C. Zgodnie z protokołem 1, siatkę dodatków dodaje się początkowo do zbiorników płyt do krystalizacji (najlepiej, gdy są one już w ten sposób przygotowane). Do dozowania warunków do zbiorników zawierających roztwory dodatków używa się dozownika cieczy lub wielokanałowej pipety (objętość siatki dodatków stanowi 10% końcowej objętości w zbiornikach: 8 µL przy końcowej objętości 80 µL). Po wymieszaniu warunków na mikserze do płytek (nie pokazano), do przygotowania kropelek stosuje się nanolitrowy dozownik oparty na mikroszczycie (Tabela 4). Zgodnie z protokołem 2, siatkę dodatków dodaje się dopiero później, podczas przygotowywania kropelek do krystalizacji. Tym razem do przygotowania kropelek z dodatkowym składnikiem na platformie urządzenia wykorzystuje się nanolitrowy dozownik (ponownie używana płyta do hodowli komórkowej zawierająca siatkę dodatków). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

ProtokółRozmiar kropli (nL)Typ paskaObjętość próbki (µL)Liczba mikroszczecCzas trwania
TypŹródło dodatkówBiałkoWarunekDodatekW każdej studzience (pasek)Łącznie
196-studzienkowa płyta do krystalizacji10010002 µL2161042 min
196-studzienkowa płyta do hodowli komórkowej20020005 µL3.8311042 min 10 s
296-studzienkowa płyta do hodowli komórkowej2002001005 µL3.8312003 min 45 s
296-studzienkowa płyta do hodowli komórkowej5005001005 µL7.4602004 min 15 s

Tabela 4: Programy dostępne w dispenserze nanolitrowym z mikroszczypcami do badania addytywów. Wymaganą objętość próbki w każdej studzience wstążki 8-studzienkowej oblicza się według wzoru: objętość martwa + 12 × objętość kropli. Istnieją dwa typy wstążek (2 µL i 5 µL). Objętości martwe wynoszą 0,8 µL dla studzianek 2 µL (które mogą faktycznie pomieścić maksymalnie 3,2 µL) oraz 1,4 µL dla studzianek 5 µL (maksymalnie 7,5 µL). Całkowita objętość białka potrzebna do badania to: 8 × objętość w studzience wstążki (wartość zaokrąglona w górę). Objętość martwa studzianek w kształcie litery V w płytce hodowlanej 96-studzienkowej wynosi 2,5 µL. Wymagana liczba mikroszczypcow zależy od wybranego programu (8 + 96 = 104; lub 8 + 2 × 96 = 200).

Ze względu na rozcieńczenie warunku przez dodatek w trakcie protokołu 1, warunek należy przygotować w proporcjonalnie wyższym stężeniu niż początkowo. Zwiększenie stężeń końcowych najłatwiej osiągnąć, zmniejszając końcową objętość dodanej wody do obliczonej objętości końcowej. Następnie postępuje się zgodnie z normalnym przygotowaniem kropelek mieszających warunek z próbką (n.p., 100 nL białka + 100 nL warunku już zmieszanego z dodatkami). Protokół 2 (n.p., 200 nL białka + 200 nL warunku + 100 nL dodatku) ułatwia badanie przy różnych stężeniach dodatków poprzez po prostu zmianę objętości dodawanego ekranu dodatku. Protokół 2 wiąże się z większym lub mniejszym rozcieńczeniem kropelek (co może wpływać na krystalizację).

Dyspensator cieczy z systemu 2 może służyć do pobrania wystarczającej ilości roztworu za pomocą 12 końcówek i naniesienia 8 porcji do zbiorników płytki 96-well (zobacz Protokół, krok 2.2.2), choć krok ten można oczywiście wykonać ręcznie przy użyciu pipety wielokanałowej (Rycina 4). W przypadku stosowania dyspensatora cieczy można jednocześnie wypełnić kilka plytek tym samym roztworem (w celu późniejszego przetestowania różnych warunków dodatkowych). Przygotowując 2 płytki, należy wypełnić pojemnik odczynnika co najmniej 23 mL, a przygotowując 3 płytki – co najmniej 31 mL.

5. Płytki do krystalizacji i urządzenia towarzyszące

Projekt talii krystalizacyjnych MRC do krystalizacji metodą dyfuzji par w układzie z kroplą osiadłą (96-well 2-drop i 48-well 1-drop, Rysunek 5A oraz Rysunek 5B) zapewnia cechy umożliwiające niezawodne i efektywne automatyczne eksperymenty krystalizacyjne, w szczególności sferyczny kształt górnych dołków i lekki kształt litery V zbiorników, które ułatwiają dokładne dawkowanie, a także wirowanie, gdy wymagane jest wyśrodkowanie kropelek. Dodatkowo, górne dołki wykazują efekt soczewki, zapewniający optymalne oświetlenie pod stereoskopem (polimer przepuszcza promieniowanie UV, umożliwiając wykrywanie kryształów pochłaniających promieniowanie UV lub fluorescencyjnych23).

Niestandardowe uszczelnienie (ryc. 5C) umożliwia przygotowanie eksperymentów krystalizacji w kropli zawieszonej w obu typach płytek przy użyciu dozownika nanolitrowego (protokoły nie pokazane). Oba płytki MRC mają identyczne wymiary zewnętrzne i brzegi. Brzegi te pasują do rowków naszego własnoręcznie wykonanego uchwytu do płytek (ryc. 5D), który służy do ręcznego nakładania/usuwania taśmy uszczelniającej bez rozpryskiwania cieczy.

Wymiary płytki i układ do wysokoprzepustowego badania; A/B: pomiary siatki; C/D: system mocowania.
Rysunek 5: Płytki krystalizacyjne MRC i powiązane urządzenia opracowane w LMB. (A) Róg A1 płytki 96-dołkowej. Zbiornik (owalny) znajduje się po lewej stronie dołka krystalizacyjnego, dwa kuliste górne dołki – po prawej. Wymiary podano w milimetrach. (B) Róg A1 płytki 48-dołkowej. Zbiornik znajduje się po prawej stronie dołka (tylko jeden duży górny dołek). (C) Uszczelka MRC do zawieszanego kroplowego układu krystalizacji. (D) Wewnętrzny, niestandardowy uchwyt na płytkę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Kryształy białek

Rycina 6 przedstawia przykłady przydatnych kryształów uzyskanych za pomocą naszych zautomatyzowanych protokołów.

Obrazy mikroskopowe procesu krystalizacji w różnych skalach, pokazujące dynamikę formowania kryształów.
Rycina 6: Mikrofotografie optyczne kropelek zawierających kryształy uzyskane zgodnie z protokołami automatycznymi. (A, B) Kryształy z wstępnego ekranowania OmpF i MreB z płytek przygotowanych przy użyciu dwóch w pełni zautomatyzowanych systemów (zobacz sekcje Protokołu 1.1 i 1.2, warunki: LMB07, studzienka A4 oraz LMB20, studzienka D12, odpowiednio; objętość kropelek wynosi 100 nL białka + 100 nL warunku, praca Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Kryształy domeny Bar przed i po optymalizacji wstępnych warunków metodą czterech narożników (krok 2.1, LMB02 B6, 1 000 nL + 1 000 nL, niepublikowana praca Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Kryształy ciężkiej domeny N-terminalnej ludzkiego dyneiny 1 przed i po optymalizacji warunków początkowych metodą czterech narożników (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, następnie 500 nL + 500 nL, niepublikowana praca Edgara Morales-Ríos, LMB). (G, H) Kryształy czynnika D dopełniacza przed i po optymalizacji warunku za pomocą ekranowania addytywów (krok 2.2, warunek początkowy z własnego ekranu niestandardowego, 200 nL + 200 nL, addytyw D6 z 96-warunkowego ekranu addytywów, niepublikowana praca Matthiasa Bauera, LMB). (I, J) Kryształy wirusowego glikoproteiny powłoki25 przed i po optymalizacji warunku za pomocą ekranowania addytywów (krok 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, następnie 200 nL + 200 nL + 100 nL addytywu E5 z 96-warunkowego ekranu addytywów, niepublikowana praca Yorgo Modis, Uniwersytet w Cambridge, Wielka Brytania). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

1- Przygotowanie i wykorzystanie wstępnych sit przechowywanych na płytkach

Zestawy do przesiewania należy wymieszać przed dozowaniem do płytek, ponieważ podczas przechowywania w niektórych probówkach dochodzi do lekkiego wytrącania się lub separacji faz. Gdy ekran składa się z dwóch zestawów (2 x 48 rurek), pierwsza rurka drugiego zestawu jest umieszczana w miejscu E1 nośnika chłodzącego. Gdy ekran składa się z 4 zestawów (4 x 24 rurki), pierwsza rura drugiego zestawu jest umieszczana w lokalizacji C1, pierwsza rura trzeciego zestawu jest umieszczana w lokalizacji E1, a pierwsza rura czwartego zestawu jest umieszczana w lokalizacji G1. Podczas wkładania probówek do ich nośnika chłodzącego, pokrywki są umieszczane na tacy zgodnie ze standardowym 96-dołkowym układem poziomym. Ponieważ numery studzienek są podane przez producentów na górze pokryw, umożliwia to sprawdzenie krzyżowe, czy wszystkie probówki zostały umieszczone we właściwej kolejności. Pomaga to również w wymianie odpowiednich pokrywek na tubkach podczas napełniania zmniejszonej liczby płytek.

Wstępnie napełnione płytki przechowujemy w temperaturze 10 °C, co jest kompromisem, aby uniknąć zamarzania i przechowywania w temperaturze 4 °C, co może spowodować pogorszenie warunków i problemy z uszczelnieniem. Płyty są przechowywane przez okres do kilku miesięcy, zwykle bez zauważalnej kondensacji na wewnętrznej powierzchni uszczelki. Jest to mniej prawdziwe w przypadku płytek LMB05, LMB06, LMB09 i LMB10, ponieważ zawierają one warunki o stosunkowo wysokich stężeniach lotnych odczynników (tabela 1). Niewielka ilość kondensatu po wewnętrznej stronie uszczelki zmniejsza skuteczność uszczelniania i może powodować zanieczyszczenie krzyżowe między studzienkami podczas rozszczelniania płyt. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej podczas wstępnego chłodzenia, płyty można najpierw przenieść z karuzeli do izolowanej chłodziarki piknikowej, która jest przechowywana przez noc w chłodni o temperaturze 4 °C. Bardzo powolne chłodzenie minimalizuje powstawanie gradientów temperatury w uszczelnionych studzienkach, a tym samym zmniejsza ogólną kondensację15. Ponadto, po przechowywaniu płytek w inkubatorze w temperaturze 10 °C, na płytce na górze każdego stosu umieszcza się niestandardową pokrywę z polistyrenu SBS (nie pokazano).

Cały zestaw naszych wstępnie napełnionych płytek może być używany jako duże sito początkowe w stosunku do nowej, rozpuszczalnej w wodzie próbki białka. Alternatywnie można wybrać mniejszą liczbę płyt, aby dopasować je do określonych wymagań. Na przykład LMB15 i LMB19 są ekranami opracowanymi specjalnie dla próbek białek błonowych26,27, lub LMB20 to badanie przesiewowe sformułowane z ciężkimi atomami w celu ułatwienia eksperymentalnego fazowania danych dyfrakcyjnych28 (patrz również: Formułowanie ekranów krystalizacji białek MORPHEUS).

2. Ustawianie kropelek krystalizacji

W przypadku korzystania z systemu 2 w pierwszej kolejności należy przetworzyć zestawy do badań przesiewowych ze znacznymi ilościami odczynników lotnych. Pozwala to uniknąć tworzenia się kondensatu na gumie pokryw SBS, co mogłoby wpłynąć na obsługę pokrywy i uszczelnienie płyty. Pokrywka SBS ma niewielki prześwit, gdy znajduje się na wierzchu płyty, dlatego należy je początkowo wyrównać (patrz Protokół, krok 1.2.6). Martwe objętości białka w dołkach płytki PCR są stosunkowo duże (0,8 μl, patrz legenda w tabeli 2). Należy zauważyć, że równie duże objętości martwe są stosowane w przypadku stosowania dozownika nanolitrów pojedynczo z białkiem w 8-dołkowych paskach (Tabela 4). Mniejsze objętości martwe mogą działać, jednak niektóre próbki przylegają do końcówek, kalibracja robota może stać się nieco niedokładna, pomieszczenie może być cieplejsze niż zwykle itp. Wszystko to prowadzi do ubytków próbek pokrywanych przez duże objętości martwe w celu utrwalenia podejścia.

Ostatnie osiągnięcia umożliwiły dalszą miniaturyzację eksperymentów, dzięki czemu objętość próbki wymagana do badania przesiewowego warunków krystalizacji może zostać znacznie zmniejszona poprzez integrację odpowiedniej technologii29,30. Jednak niektóre aspekty dalszej miniaturyzacji wymagają starannego rozważenia, takie jak parowanie kropel31 i manipulacja mikrokryształami32.

Wreszcie, odwirowanie płytki (2 000 obr./min, 1 min) może być zintegrowane jako rutynowy ostatni etap tworzenia kropel krystalizacji (w sferycznych studzienkach górnych). Bardziej spójna wielkość i kształt kropelek wynikający z wirowania może zmniejszyć problemy z odtwarzalnością33,34. Z pewnością wyśrodkowane krople ułatwią późniejszą ocenę eksperymentów przy użyciu mikroskopu, ponieważ wymagana ogniskowa będzie podobna na całej płycie.

3. Zalety metody 4-narożnej

Najważniejszą zaletą metody 4-corner jest jej prostota, która minimalizuje błędy i ułatwia proste automatyczne protokoły. Na przykład 4 rozwiązania narożne będą zawsze umieszczane na pokładzie maszyny do obsługi cieczy zgodnie z tym samym układem. Ponadto wszystkie programy opierają się na stałych proporcjach między roztworami (rysunek 3C).
Ręczne przygotowanie 4 roztworów narożnych jest preferowane w stosunku do zautomatyzowanego obchodzenia się z roztworami o wysokich stężeniach, które mogą mieć wysoką lepkość. Stosunkowo szybkie i dokładne zasysanie/dozowanie jest możliwe w większości typów urządzeń do obsługi cieczy przy minimalnych wymaganiach dotyczących optymalizacji klas cieczy. Niemniej jednak niektóre rozwiązania narożne mogą być nadal zbyt lepkie, aby robot pracujący z systemem cieczowym mógł działać wydajnie. Z tego powodu zdecydowaliśmy się na wózek do obsługi cieczy pracujący z wypornością (ilustracja 3B).

Oprócz 2 liniowych gradientów stężeń, trzeci składnik (tj. zestaw/dodatków) może być testowany w stałym stężeniu w wygodny sposób. W tym celu najpierw przygotowuje się stosunkowo dużą objętość rdzeniowego zestawu roztworów narożnych o odpowiednio wyższym stężeniu, z wyłączeniem składnika, który ma być zmieniany. Następnie dodaje się roztwory podstawowe zawierające ten składnik w celu dostosowania końcowych stężeń. Na przykład przygotowuje się 50 ml zestawu 4 roztworów narożnych w stężeniach o 10% wyższych niż początkowo. Ten zestaw podstawowy jest następnie dzielony na 5 mniejszych podzbiorów po 4. Na koniec do każdego podzestawu dodaje się 10% objętości różnych roztworów buforowych pH.

4. Formaty i rodzaje sit addytywnych

Sita są zwykle przechowywane w temperaturze -20 °C (rysunek 4), ponieważ nie są regularnie używane i zawierają lotne/niestabilne związki. Użycie sita z zamrożonymi dodatkami przechowywanymi w bloku głębokiej studzienki (1 ml w studzienkach) musi być zaplanowane wcześnie, ponieważ całkowite rozmrożenie wszystkich roztworów dodatków w temperaturze pokojowej zajmie 12-24 godziny. Ponadto wielu użytkowników korzysta z tego samego sita dodatków, co może powodować problemy z zanieczyszczeniem krzyżowym. Wreszcie, wysokość bloków studni głębinowych sprawia, że nie nadają się one do większości dozowników nanolitrowych. Wygodnym rozwiązaniem pozwalającym obejść te problemy jest przeniesienie ekranu z bloku studni głębinowej na płyty niskoprofilowe (rysunek 4).

Historycznie rzecz biorąc, badania addytywne, które obejmują szeroką gamę pojedynczych odczynników (o pojedynczych stężeniach), były bardzo popularne35,36. Opracowano jednak inne rodzaje przesiewów dodatków, które integrują mieszaniny dodatków37 lub zmniejszoną liczbę pojedynczych dodatków występujących w różnych stężeniach38. Wreszcie, podejściem uzupełniającym jest zbadanie wpływu dodatków na próbki przed krystalizacją39,40.

5. Więcej uwag

Dobra praktyka: Większość ekranów zawiera szkodliwe, a nawet toksyczne substancje, dlatego podczas protokołów należy stosować odpowiednią ochronę osobistą. Podobnie, ruchome części robotów mogą prowadzić do obrażeń, zwłaszcza podczas próby ręcznego zakłócenia podczas działania programu (chociaż większość robotów ma przycisk/system zatrzymania awaryjnego). Ze względu na złożoność techniczną, regularne sprawdzanie robotów, ekranów i programów z wcześniej scharakteryzowanymi próbkami testowymi jest ważne dla utrzymania wysokiego poziomu odtwarzalności.

Przepustowość: Orientacyjnie, za pomocą systemu 1 produkuje się od 4 000 do 8 000 płytek LMB rocznie (a następnie wykorzystuje się je przez użytkowników do wstępnych badań przesiewowych). Nie jest przystosowany do przechowywania dużej ilości wstępnie napełnionych płytek w temperaturze 10 °C, gdy oczekiwany obrót jest znacznie niższy, ponieważ po 4-5 miesiącach niektóre warunki zaczną się pogarszać i parować. W małych i średnich laboratoriach wdrożono różne podejścia do protokołów automatyzacji41.

Przechowywanie i ocenianie eksperymentów: Po przygotowaniu kropel talerze są przechowywane na półkach o niskim poziomie wibracji w pomieszczeniu o temperaturze 4 lub 18 °C o ściśle kontrolowanej temperaturze (maksymalne odchylenie +/- 0,5 °C). Eksperymenty są oceniane przy użyciu mikroskopów z zimnym źródłem światła. Na rynku dostępne są różne zautomatyzowane systemy obrazowania, jednak należy dokładnie rozważyć wszystkie aspekty: Czy prędkość wymagana do zeskanowania płytki będzie wystarczająca do uzyskania wysokiej przepustowości? Czy obiekty inne niż kryształy będą zakłócać działanie autofokusa? Czy uzyskana jakość obrazów będzie wystarczająca do dostrzeżenia bardzo małych kryształów (zwłaszcza wokół krawędzi kropel)? 42,43,44

Porównanie warunków krystalizacji: Po dokładnym zbadaniu natury początkowo otrzymanych kryształów, można przeanalizować trendy i podobieństwa w różnych warunkach, korzystając z bazy danych ekranu LMB lub C6 Web Tool45.

Oświadczenia

Niniejszym stwierdzamy sprzeczny interes komercyjny, ponieważ LifeArc komercjalizuje następujące elementy: 96- i 48-dołkowe płytki MRC, wiszącą uszczelkę kroplową MRC, ekrany krystalizacji MORPHEUS, Pi, ANGSTROM i LMB.

Podziękowania

Ośrodek krystalizacji MRC-LMB jest uprzejmie wspierany przez Radę Badań Medycznych (UK). Dziękujemy członkom LMB za ich wsparcie: Oldze Perisic (PNAC), Tony'emu Warne'owi, Fusinicie Van den Ent i Patowi Edwardsowi (Badania Strukturalne), Steve'owi Scotcherowi i pozostałym członkom Warsztatu Mechanicznego, Neilowi Grantowi i Jo Westmoreland (Pomoce wizualne), Paulowi Hartowi i Tomowi Prattowi (IT). Chcielibyśmy również podziękować Steve'owi Elliotowi (Tecan, Wielka Brytania), Mitchellowi Stuartowi i Heather Ringrose (Hamilton Robotics, Wielka Brytania), Paulowi Thawowi, Robertowi Lewisowi i Joby'emu Jenkinsowi (TTP Labtech, Wielka Brytania), Paulowi Reardonowi (Swissci AG, Szwajcaria), George'owi Stephensowi i Donaldowi Oggowi (Alphabiotech, Wielka Brytania), Neilowi Williamsowi (Markem Imaje, Wielka Brytania) oraz Grahamowi Harrisowi (The Cleveland Agency) za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robots
Freedom EVO®Tecannie dotyczyMaszyna do obsługi cieczy (System 1). Aspiracja/dozowanie w oparciu o płyn systemowy. Integruje automatyczną karuzelę. Oprogramowanie sterujące EVOware plus v.2.4.12.0. 
Mikrolab® STAR & handel;Hamiltonnie dotyczyMaszyna do obsługi cieczy (System 2). Aspiracja/dozowanie w oparciu o wyporność (technologia CO-RE&trade). Oprogramowanie sterujące Hamilton STAR v.4.3.5.4785 z interfejsem zarządzania metodami.
Komar®TTP Labtechn/aDozownik nanolitrowy na bazie mikrostrzykawki służący do ustawiania kropelek (System 2 i samodzielny), 3-pozycyjny pokład. Oprogramowanie sterujące v.3.11.0.1422. 
Ważka®TTP Labtechn/aStrzykawkowy wózek do obsługi cieczy stosowany do produkcji sit optymalizacyjnych (metoda 4-kątna). Oprogramowanie sterujące v.1.2.1.10196. 
Samoprzylepna zgrzewarka do płytBrandeln/aZintegrowana z systemami 1 i 2 (używana również jako samodzielny robot).
Drukarka atramentowa 9232Markem-Imajen/aZintegrowana z Systemem 1. Interfejs ekranu dotykowego.
< silne>Ekrany krystalizacji< / strong>
Crystal Screen™ 1Hampton ResearchHR2-110(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB01
Crystal Screen 2&handel;Zestaw doHR2-112(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB01
Wizard™ Klasyczny zestaw do1 Rigaku 1009530(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02
Wizard™ Klasyczny zestaw do2 Rigaku 1009531(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02
Grid Screen™ Siarczan amonuHampton ResearchHR2-211Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ PEG/LiClHampton ResearchHR2-217Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB03
Quick Screen™Zestaw doHR2-221(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ Chlorek soduHampton ResearchHR2-219Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ PEG 6000Hampton ResearchHR2-213Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04
Grid Screen™ MPDHampton ResearchHR2-215Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB04
MemFac i handlu;Zestaw doHR2-114(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04
PEG/Ion™Zestaw doHR2-126(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB05
Natrix™Zestaw doHR2-116(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB05
Crystal Screen Lite™Hampton ResearchHR2-128Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w ekranie LMB06
Custom LiteMolecular Dimensions Ltdnie dotyczyZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB06
Wizard™ ZestawCryo 1 Rigaku1009536(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07
Wizard™ Cryo 2Rigaku1009537Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07
JBS1JenaBioScienceCS-101LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS2JenaBioScienceCS-102LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS3JenaBioScienceCS-103LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS4JenaBioScienceCS-104LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS5JenaBioScienceCS-105LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS6JenaBioScienceCS-106LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS7JenaBioScienceCS-107LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB09
JBS8JenaBioScienceCS-108LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS9JenaBioScienceCS-109LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10
JBS10JenaBioScienceCS-110LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 4,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 5,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 6,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 7,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 8,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 4,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 5,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 6,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 7,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 8,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w indeksie LMB12
i handlu;Hampton ResearchHR2-144(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB13
SaltRX™ 1Hampton ResearchHR2-107(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB14
SaltRX™ 2Hampton ResearchHR2-109Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB14
MemStar i handlu;Molecular Dimensions LtdMD1-21Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15
MemSys™Molecular Dimensions LtdMD1-25Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15
JCSG-plus™ ZestawQiagen130720(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB16
MORPHEUS® screenMolecular Dimensions LtdMD1-46Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w minimalnym ekranie LMB17
PiJenaBioScienceCS-127Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na stan) stosowany w ekranie LMB18
Pi-PEGJenaBioScienceCS-128Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB19
MORPHEUS® II ekranMolecular Dimensions LtdMD1-91Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w
ekranie krystalizacji LMB20 LMB i handlu;Molecular Dimensions LtdMD1-98Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w
ekranach addytywnych LMB21Additive
HTHampton ResearchHR2-138Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).
MORPHEUS® przesiewanie dodatkówMolecular Dimensions LtdMD1-93-500Mrożone w 96-dołkowym bloku studni głębinowej (500 &mikro; L na studzienkę).
Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel;  Molecular Dimensions LtdMD1-100Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).
MORPHEUS® przesiewacz dodatkówMolecular Dimensions LtdMD1-93Mrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar® płytka z dołkami w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).
Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel;  Molecular Dimensions LtdMD1-100-FXZamrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar i reg; płytka z dołkiem w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).
Siatka dodatków HIPPOCRATESMolecular Dimensions Ltdn/a48 pojedynczych dodatków (związki lecznicze znalezione w MORPHEUS® III).
Inne materiały eksploatacyjne
96-dołkowa płyta MRC 2-kroplowaSwissciMRC 96T-UVPSitting-drop, płyta dyfuzyjna parowa. Zalecana pojemność zbiornika: 80  µL. Zakres użytecznych objętości kropli: 10-1000 nL. Przepuszczalny dla promieni UV.
48-dołkowa płytka MRC 1-kroplowa  ("Tabliczka MAXI")SzwajcariaMMX01-UVP Płyta dyfuzyjna do montażu w pozycji siedzącej do zwiększania skali/optymalizacji. Zalecana objętość zbiornika: 200  µL. Zakres użytecznych objętości kropel: 0,1-10 µL. Przepuszczalność UV.
Wisząca uszczelka kroplowa MRCSwisscin/aWisząca-kroplowa, kompatybilna z obiema płytami dyfuzyjnymi MRC (MRC 96T-UVP i MMX01-UVP). Przepuszczalne promieniowanie UV i rentgenowskie.
Taśma klejącaHampton ResearchHR4-50o szerokości 3 cali Duck® HD Clear™ do zgrzewania i ręcznego uszczelniania.
Samoprzylepna blacha aluminiowaBeckman Coulter538619Służy do ponownego uszczelniania sit dodatkowych.
Wkład atramentowyMarkem-Imaje9651System 1 (drukarka atramentowa).
Kartridż rozpuszczalnikowyMarkem-Imaje8652System 1 (drukarka atramentowa).
50 &mikro; L porady Hamilton235947System 2 (STAR & trade; maszyna do obsługi cieczy). Pudełko z 6 zestawami z 1920 x CO-RE™ końcówki w jednorazowych stosach.
Pojemnik na odczynnikHamilton194052Służy do dozowania warunku do płytki (płytek) podczas protokołów przesiewania dodatków. 
Płytka PCRThermo Scientific™AB-2150System 2 (zawiera białko do przeniesienia do Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 studnie w kształcie litery V.
mikrostrzykawkiTTP Labtech4150-03020Szpula 26 000 mikrostrzykawek do dozownika Mosquito® nanolitr (rozstaw 9mm).
blok uchwytu paskowegoTTP Labtech3019-05013Urządzenie SSB do pasków Mosquito®, znane również jako "4-kierunkowy uchwyt na odczynnik".
2 i mikro; L 8-dołkowy pasekTTP Labtech4150-03110Zawiera białko na pokładzie Mosquito®. Pudełko zawierające 40 pasków, maksymalna objętość w studzience wynosi 3,2 &mikrolitra.
5 & mikro; L 8-dołkowy pasekTTP Labtech4150-03100Zawiera białko na pokładzie Mosquito®. Pudełko z 40 paskami, maksymalna objętość w studni wynosi 7,5 &mikro;L.
Strzykawki 5 mlTTP Labtech4150-07100Korpus strzykawki i tłok do płynu Dragonfly®. Opakowanie 100 szt.
Koryta/zbiornikiTTP Labtech4150-07103Zawiera roztwory podstawowe na pokładzie Dragonfly®. Opakowanie 50 szt.
Wytrząsarka orbitalna do mikropłytekCamLab Limitedn/aVariomag® do mieszania warunków na jednej płytce (0-2000 obr./min).
Mieszalnik do mikropłytekTTP Labtech3121-01015MxOne. Warunki mieszania na jednej płytce z 96 kołkami wibracyjnymi.
Zestaw do krystalizacji krystalizacji Hampton Research krystalizacji krystalizacji krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research do krystalizacji Zestaw do krystalizacji Zestaw do krystalizacji do krystalizacji

Bibliografia

  1. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  2. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  3. Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  4. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).
  5. Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
  6. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
  7. Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
  8. Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
  9. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  10. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
  11. Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
  12. Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
  13. Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
  14. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
  15. Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
  16. Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
  17. Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
  18. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  19. DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
  20. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
  21. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).
  22. Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).
  23. Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
  24. Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
  25. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
  26. Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
  27. Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
  28. Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
  29. Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
  30. Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
  31. Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
  32. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
  33. Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
  34. Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
  35. McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
  36. Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
  37. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
  38. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
  39. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
  40. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
  41. Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
  42. Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
  43. Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
  45. Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dyfuzja parnanolitrowe kropelkiprzesiewanie krystalizacjiuszczelniacz płytekrobot do obsługi cieczydozowanie zestawów MRCpłytki do krystalizacjidyfrakcja rentgenowska
Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.