Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

DOI:

10.3791/55790

⸱

24 stycznia 2018

 , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promieniowanie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej. Nie można jednak przewidzieć warunków krystalizacji białek, DNA, RNA i ich kompleksów. Stosowanie szerokiej gamy warunków jest sposobem na zwiększenie wydajności wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych. W Laboratorium Biologii Molekularnej MRC (Cambridge, Anglia, MRC-LMB) opracowano dwa w pełni zautomatyzowane systemy, które ułatwiają badanie przesiewowe krystalizacji w stosunku do 1920 warunków początkowych poprzez dyfuzję pary w nanolitrowych kropelkach. Opracowano również półautomatyczne protokoły w celu optymalizacji warunków poprzez zmianę stężeń odczynników, pH lub wprowadzenie dodatków, które potencjalnie poprawiają właściwości otrzymanych kryształów. Wszystkie odpowiednie protokoły zostaną szczegółowo opisane i pokrótce omówione. Podsumowując, umożliwiają one wygodną i wysoce wydajną krystalizację makromolekularną w obiekcie dla wielu użytkowników, dając jednocześnie użytkownikom kontrolę nad kluczowymi parametrami ich eksperymentów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krystalografia rentgenowska jest szeroko stosowana, aby dalej rozwijać nasze zrozumienie mechanizmów biologicznych i chorobowych na poziomie atomowym, a następnie wspomagać racjonalne podejścia do odkrywania leków1. W tym celu oczyszczone i skoncentrowane (2-50 mg/ml) makrocząsteczkowe próbki białek, DNA, RNA, innych ligandów i ich kompleksów są testowane pod kątem ich skłonności do tworzenia uporządkowanych trójwymiarowych sieci poprzez krystalizację2,3,4. Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promienie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej5,6. Co najważniejsze, nie można przewidzieć warunków krystalizacji nowej próbki, a wydajność kryształów wysokiej jakości jest zwykle bardzo niska. Podstawowym powodem jest to, że wiele interesujących próbek ma trudne właściwości biochemiczne, które sprawiają, że są niestabilne w odpowiedniej skali czasowej krystalizacji (zwykle kilka dni). Wreszcie, proces ten jest spotęgowany przez czas potrzebny do wyprodukowania próbek i wariantów próbek oraz optymalizacji ich oczyszczania i krystalizacji7,8.

Warunek krystalizacji to roztwór z precydentem, który zmniejsza rozpuszczalność próbki, a warunki często zawierają również i dodatki. Setki takich odczynników są dobrze przystosowane do zmiany parametrów eksperymentów krystalizacji, ponieważ mają niską skłonność do ingerowania w integralność próbki (takiej jak rozwijanie białka lub kwasu nukleinowego). Podczas gdy testowanie milionów kombinacji odczynników do krystalizacji nie jest wykonalne, testowanie od kilku do wielu zestawów przesiewowych - opracowanych przy użyciu różnych strategii9,10 - jest możliwe dzięki zminiaturyzowanym próbom i zautomatyzowanym protokołom. W tej perspektywie najbardziej podatną techniką jest prawdopodobnie dyfuzja pary wodnej z kropelkami o wielkości 100-200 nL osadzonymi na małej studni nad zbiornikiem zawierającym stan krystalizacji (25-250 μL), zaimplementowana w specjalistycznych płytkach krystalizacyjnych11,12. Próbka i stan białka są często łączone w stosunku 1:1 w celu uzyskania całkowitej objętości 200 nL podczas umieszczania kropelek w górnych studzienkach. Zrobotyzowana krystalizacja białek w nanolitrach może być realizowana za pomocą alternatywnych technik i płytek, takich jak under-oil batch13 i Lipidic Cubic Phase14 (najnowsza z nich jest stosowana specjalnie do białek transbłonowych, które są bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie).

Instalacja krystalizacji w MRC-LMB została uruchomiona na początku 2000 roku, a wczesne podsumowanie naszych automatycznych protokołów zostało przedstawione w 2005 roku15. Przedstawiono historyczne wprowadzenie do krystalizacji białek, a także zarys zalet robotycznego podejścia nanolitrowego (wówczas nowatorskiego podejścia do rutynowych eksperymentów). Ponieważ krystalizacja makromolekularna jest zasadniczo procesem stochastycznym, w którym nie ma zbyt wielu użytecznych informacji wstępnych, zastosowanie szerokiej gamy (odpowiednich) warunków początkowych zwiększa wydajność wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych16. Poza tym często pomijaną zaletą dużego ekranu początkowego jest w wielu przypadkach znaczne zmniejszenie potrzeby optymalizacji próbek i kryształów. Oczywiście, może być jeszcze konieczne przystąpienie do optymalizacji niektórych warunków początkowych w późniejszym czasie. Zazwyczaj stężenie odczynników i pH są następnie systematycznie badane. Do zoptymalizowanych warunków można również wprowadzić więcej odczynników, aby jeszcze bardziej zmienić parametry krystalizacji. Z pewnością należy podjąć próbę krystalizacji ze świeżo przygotowaną próbką, stąd odpowiednie protokoły muszą być proste i dostępne w każdej chwili.

Tutaj w pełni opisane są dwa w pełni zautomatyzowane systemy zaprojektowane w MRC-LMB (systemy 1 i 2) oraz odpowiadające im protokoły. Głównym zastosowaniem tych dwóch systemów jest wstępne przesiewanie przez dyfuzję pary w płytkach krystalizacyjnych w kropli siedzącej. System 1 integruje urządzenie do obsługi cieczy, automatyczną karuzelę do magazynowania płyt, drukarkę atramentową do etykietowania płyt oraz samoprzylepną zgrzewarkę do płyt. W systemie 1 72 96-dołkowe płytki są wypełnione dostępnymi na rynku zestawami przesiewowymi (80 μl stanu przeniesionego do zbiornika z początkowej objętości 10 ml w probówkach), oznakowanymi i zaplombowanymi. Płytki są następnie przechowywane w inkubatorze o temperaturze 10 °C, gdzie są dostępne dla użytkowników w dowolnym momencie (jako początkowe sita zwane "płytkami LMB").

System 2 integruje obsługę płynów, dozownik nanolitrów i samoprzylepny uszczelniacz do płyt. W systemie 2 siedzące kropelki (100-1000 nL) do eksperymentów dyfuzji parowej są wytwarzane przez połączenie warunków i próbki w górnych studzienkach 20 48- lub 96-dołkowych płytek wstępnie wypełnionych warunkami. Oznacza to, że testowanych jest 1 920 wstępnych warunków przesiewowych przy użyciu 20 płytek LMB w systemie 2.

Roboty są również używane indywidualnie do optymalizacji wybranych warunków, a odpowiednie protokoły półautomatyczne są również opisane. Metoda 4-rogowa17 jest rutynowo stosowana do tworzenia ekranów optymalizacyjnych. Odpowiedni protokół wymaga najpierw ręcznego przygotowania 4 roztworów ("A, B, C i D"). Dwa liniowe gradienty stężeń (dla dwóch głównych czynników krystalizacyjnych) są następnie automatycznie generowane bezpośrednio do zbiorników płytki krystalizacyjnej. W tym celu strzykawka do obsługi płynów dozuje 4 roztwory narożne w różnych proporcjach.

Aby jeszcze bardziej zoptymalizować warunek, można zastosować sita addytywne, które potencjalnie poprawiają właściwości powstałych kryształów18. Dostępne są dwa podejścia do badania przesiewowego dodatków: protokół rozpoczynający się od dodatków dozowanych do zbiorników płytek krystalizacyjnych przed ustawieniem kropelek (protokół 1) oraz drugi protokół, w którym sitko dodatku jest dozowane bezpośrednio na kropelki (protokół 2).

Inne użyteczne rozwiązania, które zostały zainicjowane w MRC-LMB w celu ułatwienia automatycznej krystalizacji makromolekularnej, są również prezentowane. Zasadniczo płytki krystalizacyjne i związane z nimi urządzenia, takie jak pokrywka Society of Biomolecular Screening (SBS), która minimalizuje parowanie warunków podczas korzystania z systemu 2.

Dla zwięzłości, zakłada się, że użytkownicy są zaznajomieni z podstawowymi funkcjami i obsługą dozownika nanolitrów, drukarki atramentowej i samoprzylepnego uszczelniacza do płyt. O ile nie określono inaczej, tabliczki znamionowe na pokładzie robotów są umieszczone w taki sposób, aby studzienka A1 ("narożnik A1") była skierowana w stronę lewego tylnego rogu plate carriera.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Dwa w pełni zautomatyzowane systemy (wstępne badanie)

  1. System 1: przygotowanie 72 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych wypełnionych zestawami do przesiewania (płytki LMB)
    1. Przed wykonaniem procedury należy upewnić się, że roboty systemu są zainicjowane, a ich oprogramowanie sterujące jest otwarte. Włączyć agregat chłodniczy nośnika chłodzenia rurowego na około 30 minut przed rozpoczęciem programu głównego.
    2. Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy folia jest prawidłowo nałożona. Powtórz ten test jeszcze dwa razy, aby sprawdzić, czy uszczelniacz do płyt jest gotowy.
    3. Następnie dodaj 20 l wody dejonizowanej do głównego pojemnika urządzenia do obsługi cieczy. Odłączyć wkładki sprzęgające od małego pojemnika (20% roztwór płuczący etanolu) i podłączyć wkładki do głównego pojemnika.
    4. Wprowadź odpowiednią nazwę ekranu (Tabela 1) na ekranie dotykowym drukarki atramentowej. Następnie otwórz i zamknij drzwi karuzeli, aby uruchomić obrót karuzeli. Otwórz drzwi, gdy pojawi się pierwszy stos.
    5. Całkowicie załaduj pierwszy stos 22 płytkami krystalizacyjnymi, każda z kolumną 1 skierowaną na zewnątrz. W ten sam sposób w pełni załaduj kolejne dwa stosy.
    6. Załaduj pozostałe 6 talerzy na najwyższe pozycje czwartego stosu. Następnie zamknij drzwi karuzeli.
    7. Sprawdź, czy wyświetlacz agregatu chłodniczego wskazuje 14 °C. Delikatnie i wielokrotnie odwracaj wybrane zestawy przesiewcze przez 1 minutę. Następnie otwórz przedni panel uchwytu do cieczy.
    8. Otwórz rurki i umieść je w nośniku chłodzącym zgodnie ze standardowym układem 96 dołków (A1, A2 itd.). Po umieszczeniu każdej probówki w nosidełku umieść jej pokrywkę na tacy w tym samym układzie 96 dołków.
    9. Sprawdź krzyżowo pozycje rur i upewnij się, że wszystkie rurki są wypoziomowane i osadzone w nośniku. Następnie zamknij panel przedni.
    10. W oknie "Uruchamianie" oprogramowania do obsługi cieczy wybierz opcję "Uruchom konserwację" i otwórz program płukania. Uruchom program, aby wypłukać 20% etanol z systemu i umyć zewnętrzną część końcówek dozujących płyn
      11. .
    11. Po zakończeniu opróżniania kliknij "Anuluj", aby powrócić do "Uruchamiania". Wybierz opcję "Uruchom istniejący proces" i kliknij "Rozpocznij wybór". Otwórz program "Dozowanie zestawu MRC". Wpisz "18" dla "Instancji" na ekranie konfiguracji i uruchom program.
    12. Monitoruj system, gdy pierwsze cztery płytki są etykietowane, napełniane i plombowane.
    13. Po przygotowaniu wszystkich 72 płytek i umieszczeniu ich z powrotem w karuzeli, zmień wkładki sprzęgające z głównego pojemnika na mały pojemnik. Uruchom program 'Start up flush' (patrz krok 1.1.10).
    14. Wyłącz agregat chłodniczy i wyrzuć puste rurki zestawu przesiewającego. Ostrożnie wyjmij 72 przygotowane talerze z karuzeli. Wyrzuć nieprawidłowo wypełnione lub źle uszczelnione talerze. Gotowe do użycia talerze należy przechowywać w temperaturze 10 °C.
  2. System 2: ustawienie kropelek krystalizacji (stan 100 nL białka + 100 nL) z pojedynczej próbki na 20 płytkach LMB
    1. Najpierw upewnij się, że roboty systemu są włączone, dozownik nanolitrów jest zainicjowany z otwartym oprogramowaniem, a menedżer metod obsługi cieczy jest otwarty. Włącz nośnik chłodzący mikrorurki na około 15 minut przed rozpoczęciem programu głównego.
    2. Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy płyta jest prawidłowo uszczelniona. Przetestuj zgrzewarkę do płyt trzy razy.
    3. Następnie uruchom dozownik nanolitrów, aby ustawić 100-nL kropelki roztworu testowego na płytce testowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropelki są prawidłowo ustawione. Zamknij oprogramowanie dozownika nanolitrów i wyjmij blok uchwytu paska z pokładu.
    4. Następnie włożyć do specjalnie zaprojektowanego uchwytu płytki (patrz Reprezentatywne wyniki: Urządzenia do krystalizacji opracowane w LMB) płytkę LMB z największą względną ilością lotnych odczynników w swoich warunkach (Tabela 1). Usuń folię samoprzylepną z płytki.
    5. Otwórz przedni panel wózka do obsługi cieczy i umieść nieuszczelnioną płytę na pokładzie, z tyłu pierwszego przesuwnego nośnika (przesuwne nośniki można wyciągnąć w celu ułatwienia dostępu).
    6. Przykryj talerz aluminiową pokrywką SBS. Ustaw pokrywę w kierunku tylnego lewego rogu nosidełka, delikatnie naciskając na przeciwległy róg pokrywy.
    7. Rozszczelnić, załadować do przesuwnych nośników i przykryć pozostałe 19 płyt w ten sam sposób, pracując w warunkach największej do najmniej lotnej. Gdy nośnik chłodzący mikrorurki osiągnie temperaturę 4 °C, co sygnalizuje zielone światło, zdejmij jego pokrywę.
    8. Odciąć pokrywkę mikroprobówki zawierającej (co najmniej) 440 μl próbki białka (tabela 2). Upewnij się, że próbka nie ma piany powyżej menisku, ponieważ będzie to kolidować z systemem wykrywania cieczy. Umieść rurkę w pozycji 1 nośnika chłodzącego mikrorurki.
    9. Umieść płytkę PCR na pokładzie do obsługi cieczy przed nośnikiem adaptera do przesuwania płyty. Następnie zamknij panel przedni.
    10. Po załadowaniu pokładu upewnij się, że pokład dozownika nanolitrów jest wolny od bloku uchwytu paska i że nośniki z tyłu stosów końcówek o pojemności 50 μl są wolne od aluminiowych pokryw SBS.
    11. W interfejsie "Zarządzanie metodami" w module obsługi cieczy wybierz opcję "Płyty nastawcze". Monitoruj inicjalizację obu systemów i wypełnij parametry uruchamiania. Postępuj zgodnie ze wskazówkami interfejsu zarządzania metodą (podpowiedzi, rysunki i system zarządzania końcówkami pomagają w przygotowaniu).
    12. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie wymagane komponenty są gotowe, a następnie rozpocznij proces.
    13. Monitoruj system, gdy dozownik nanolitrów ustawia krople w pierwszej płytce, a następnie zgrzewarka do płytek uszczelnia płytkę.
    14. Gdy wszystkie 20 płytek zostanie przygotowanych z kropelkami krystalizacji i automatycznie zwróconych do przesuwanych nośników, otwórz panel przedni i delikatnie wyjmij płytki. Sprawdź, czy płytki są prawidłowo zamknięte przed przechowywaniem ich do krystalizacji.
    15. Oczyść pokrywki SBS 20% roztworem etanolu przed ułożeniem ich po lewej stronie pojemnika na płyny do przechowywania. Wyrzucić płytkę PCR i mikroprobówkę.
    16. Wyłącz nośnik chłodzący mikrorurki i zetrzyj kondensację. Pozostaw ręcznik papierowy na chłodniejszej powierzchni, aby wchłonąć dalszą kondensację. Następnie załóż pokrywę bagażnika i zamknij panel przedni.

2. Optymalizacja warunków

  1. Strzykawkowy płyn: wytwarzanie dwóch liniowych gradientów stężeń w zbiornikach płytki krystalizacyjnej (metoda 4-kątna).
    1. Najpierw upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest włączone i zainicjowane z otwartym oprogramowaniem.
    2. Na karcie 'GRADIENT': Otwórz żądany program, wybierz typ płytki krystalizacyjnej i końcową objętość w zbiornikach (Tabela 3). Zaawansowane ustawienie "maksymalnej objętości strzału" należy obniżyć z 6 000 do 3 000 w przypadku stosowania roztworów zawierających [izopropanol] > 10% v/v i [MPD] > 20% v/v.
    3. Przygotować strzykawki. Umieść tłok w każdej strzykawce (spiczastymi końcami do dołu) i włóż tylną część strzykawek do wyznaczonych rowków pod głowicą robota. Przekręcić strzykawkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować ją na miejscu (program rozpocznie się tylko wtedy, gdy wszystkie wymagane strzykawki są prawidłowo podłączone).
    4. Przygotuj koryta. Zdejmij ramę ze stali nierdzewnej i włóż koryta. 4 pozycje po lewej stronie odpowiadają 4 rogom A, B, C, D. Przełącz na zakładkę "SET UP", która wyświetla objętości roztworów wymagane w każdej strzykawce (w Tabeli 3 do wyświetlanych objętości dodano 0,5 ml martwej objętości). Wlej roztwory narożne do odpowiednich koryt i umieść ramę z powrotem na pokładzie (rama utrzymuje się na miejscu za pomocą 2 małych magnesów umieszczonych z przodu pokładu). Alternatywnym sposobem wykonania tego kroku jest wlanie roztworów do koryt, gdy są już umieszczone na pokładzie.
    5. Umieścić płytkę krystalizacyjną na zmotoryzowanym nośniku SBS.
    6. Kliknij "ASPIRATE" i poczekaj, aż ten krok zostanie zakończony (gdy tłoki zatrzymają się w drodze do góry).
    7. Przejdź do zakładki "URUCHOM" i uruchom program.
    8. Po zakończeniu programu wróć do zakładki SET UP i kliknij "USUŃ": system oczyszcza strzykawki z resztek roztworów, a następnie podnosi tłoki do góry. Zamiast "REMOVE" można zażądać "PURGE"; spowoduje to pozostawienie tłoków w dolnym położeniu, gotowych do zasysania większej liczby roztworów za pomocą tych samych strzykawek.
    9. Wyjąć strzykawki, przekręcając je w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
    10. Wyrzuć strzykawki i koryta do odpowiedniego pojemnika (lub spłucz je wodą dejonizowaną, a następnie 20% v/v roztworem etanolu do ponownego użycia).
    11. Uszczelnij płytkę i umieść ją na mieszalniku do mikropłytek na 3 minuty przy 1 000 obr./min lub 10 minut, gdy mieszane są roztwory o dużej lepkości. Płytka jest gotowa do ustawiania kropelek krystalizacji na dozowniku nanolitrów.
  2. Protokół badania przesiewowego dodatków 1 (umieszczanie kropelek krystalizacji w 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej wstępnie wypełnionej sitkiem z dodatkami)
    1. Najpierw należy przygotować warunek z początkowymi stężeniami odczynników zwiększonymi o 10% (min. obj. 15 ml przy przenoszeniu stanu z pojemnika na sito dodatku z płynem).
    2. Upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest gotowe do pracy. Otwórz program 'Dodaj sitko do dodatków' dla pojedynczej płytki (w zbiornikach wpisać objętość: '72 μL'). Podpowiedzi, cyfry i system zarządzania końcówkami (wymagane końcówki 12 x 1 000 μl) pomagają upewnić się, że robot jest gotowy do pracy zgodnie z wybranymi opcjami.
    3. Wyjmij sitko z dodatkiem z inkubatora o temperaturze -20 °C i natychmiast zdejmij jego aluminiową uszczelkę (użyj uchwytu na płytkę), a następnie umieść płytkę na pokładzie urządzenia do obsługi cieczy. Program działa w układzie pionowym (tabliczka jest umieszczona z rogiem A1 znajdującym się z przodu po lewej stronie nośnika). Umieść również pojemnik wypełniony stanem. Uruchom program.
    4. Po napełnieniu zbiorników płytki umieść ją na wytrząsarce do mikropłytek i uruchom program. Wypłukać pojemnik z kondycją wodą dejonizowaną i 20 % etanolem do ponownego użycia.
    5. Ustaw kropelki na dozowniku nanolitrów. Najpierw rozszczelnić płytkę krystalizacyjną (użyć uchwytu płytki). Następnie umieść płytkę i 8-dołkowy pasek białkowy w pierwszej pozycji bloku uchwytu paska. Zakładka "Ustawienia" w oprogramowaniu sterującym wyświetla rzeczywiste pozycje każdego elementu na pokładzie. Załadować każdą studzienkę paska próbką białka zgodnie z wymaganą wielkością kropli (Tabela 4). Uruchom program, aby przygotować kropelki.
    6. Po zakończeniu programu zdejmij płytkę z pokładu i natychmiast ją uszczelnij (użyj uszczelniacza do płyt, taśmy klejącej o szerokości 3 cali). Wyrzuć pasek do odpowiedniego pojemnika.
    7. Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.
  3. Protokół przesiewania dodatków 2 (umieszczanie kropelek krystalizacji na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej z sitkiem do wielokrotnego użytku)
    1. Najpierw przygotuj sitko z dodatkiem: pozostaw odpowiednią zamrożoną 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie odwirować przesiewanie dodatku o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
    2. Przygotować warunek (min. 15 ml przy przenoszeniu warunku z pojemnika na sito dodatków za pomocą urządzenia do obsługi cieczy).
    3. Napełnij zbiorniki 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej warunkiem. Na urządzeniu do obsługi cieczy postępować w taki sam sposób, jak w protokole 1, krok 2.2.2, ale wprowadzić "80 μl" dla objętości w zbiornikach.
    4. Umieść kropelki na dozowniku nanolitrów z 3 składnikami na pokładzie (płytka zawierająca sitko z dodatkiem, wraz z płytką krystalizacyjną i 8-dołkowym paskiem białkowym w pierwszej pozycji bloku uchwytu na paski, tabela 4).
    5. Uszczelnić płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sito blachą aluminiową i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze -20 °C.
    6. Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Płyty Systemu 1 i LMB

Rysunek 1A przedstawia system 1 oparty na urządzeniu do obsługi cieczy działającym z systemem cieczy (woda dejonizowana). System cieczowy składa się z pojemnika, pompy, rurki, 8 strzykawek wyposażonych w zawory i 8 stałych końcówek. Ustawienia klas cieczy zostały zoptymalizowane pod kątem aspiracji/dozowania szerokiej gamy roztworów i wielokrotnego dozowania do 4 płytek (dozowanie wielokrotne wymaga stosunkowo dużego nadmiaru zasysanej objętości). Pojemnik na wodę o pojemności 22 litrów i mniejszy pojemnik (5 l) z 20 % v/v etanolem są przechowywane pod systemem w celu zasilania układu cieczowego. Każdy kontener wyposażony jest w dwie wkładki sprzęgające. Jedna wkładka (w kolorze niebieskim) zasila układ cieczą, druga (czerwona) to przepływ zwrotny w celu zmniejszenia nadciśnienia. Po użyciu spłukiwanie wodą, a następnie 20% v/v roztworem etanolu zapobiega rozwojowi drobnoustrojów. Jednostka chłodząca (również znajdująca się pod systemem) jest podłączona do specjalnie zbudowanego nośnika chłodzenia rurowego. System 1 ma szerokość 2050 mm wraz z karuzelą 760 mm głębokości i 88 mm wysokości. Dodatkowe 550 mm jest wymagane z przodu dla stołu roboczego, na którym znajduje się jednostka sterująca drukarki atramentowej i zgrzewarka do płyt samoprzylepnych. Potrzebne jest również dodatkowe miejsce obok systemu na komputer sterujący. Program do wyprodukowania 72 wstępnie napełnionych płytek (tj. 18 rund po 4 płytki) trwa 3 godziny i 50 minut.

Rysunek 1B to zbliżenie głównego pokładu, który jest wyposażony w 8 stałych końcówek (Rysunek 1C) zamontowanych na automatycznym ramieniu pipetującym, drugie ramię z chwytakiem, stację mycia końcówek, 2 x 4-pozycyjne nośniki dla płytek SBS i nośnik chłodzenia rury. Główny program przetwarza jednocześnie 4 płytki, które są automatycznie wyjmowane z karuzeli i umieszczane na pokładzie, gdzie są napełniane warunkami krystalizacji (80 μL w zbiornikach, Rysunek 1D). Poziomy cieczy są wykrywane automatycznie, ponieważ końcówki są przewodzące. Podczas gdy osoba zajmująca się cieczami dozuje warunki do zestawu talerzy, inny zestaw pustych talerzy jest wyjmowany z karuzeli, oznaczany i umieszczany na głównym pokładzie. Mały, specjalnie skonstruowany uchwyt i okienko w tylnym panelu urządzenia do obsługi cieczy były potrzebne do umieszczenia głowicy drukarki i jej czujnika z tyłu głównego pokładu. 8 końcówek jest przepłukiwanych i mytych wodą z głównego pojemnika po każdym etapie dozowania, który składa się z 4 porcji w odpowiednich kolumnach zbiorników. Po napełnieniu 4 płytek są one automatycznie zamykane i umieszczane z powrotem w swojej pierwotnej pozycji w karuzeli. Zgrzewarka do płytek jest uruchamiana przez określony sterownik (wywoływany przez oprogramowanie sterujące). Zgrzewarka wykorzystuje rolkę taśmy klejącej o szerokości 3 cali, którą nakłada się na płytę za pomocą rolek pod naciskiem mechanicznym. Po zakończeniu programu wstępnie napełnione płytki są ręcznie wyjmowane ze stosów karuzelowych i przechowywane w inkubatorze o temperaturze 10 °C znajdującym się na terenie obiektu.

figure-results-1
Rysunek 1: Napełnianie zbiorników za pomocą zestawów do wstępnego przesiewania. (A) Przegląd w pełni zautomatyzowanego systemu 1. Karuzela jest oddzielną zautomatyzowaną jednostką ze stosami płyt i jest umieszczona w studni wykonanej z przezroczystych arkuszy akrylowych po prawej stronie głównego pokładu. (B) Główny pokład urządzenia do obsługi cieczy w trakcie pracy z a) nośnikiem chłodzącym rurkę (podłączonym do urządzenia chłodzącego znajdującego się poniżej, niepokazanym), b) stacją szybkiego mycia (podłączoną do drenażu, nie pokazano), c) ramieniem pipetującym napełniającym 8 zbiorników 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej, d) ramieniem chwytaka przenoszącym napełnioną płytkę na (e) zmotoryzowany nośnik SBS zgrzewarki do płyt. Z tyłu pokładu znajduje się (f) głowica drukująca drukarki atramentowej podłączona do (g) jednostki sterującej atramentem pod zgrzewarką. (C) Oznakowana tabliczka (nazwa sita i data produkcji) wypełniona warunkami krystalizacji za pomocą 8 przewodzących stałych końcówek wykonanych ze stali nierdzewnej pokrytej politetrafluoroetylenem. (D) Przekrój poprzeczny szczelnej studzienki krystalizacyjnej. Zbiornik zawiera 80 μl warunków krystalizacji (podczas gdy górna studzienka jest pusta). Specyfikacje głębokości zbiornika i górnej studni są podane w milimetrach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1 pokazuje różne formuły dostępnych na rynku zestawów do badań przesiewowych w probówkach. Zestawy służą do regularnego napełniania zbiorników 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych (LMB01-LMB22) systemem 1.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział:
Nazwa tablicy rejestracyjnejNazwa zestawudostawcanumer katalogowyRurypodstawowy opis
Zobacz materiał LMB01Kryształowy ekran 1Badania HamptonPrzekaźnik HR2-110Rozdział 48Rzadki Macierz (pH 4,6-8,5)
Kryształowy ekran 2Badania HamptonHR2-112Rozdział 48Stochastyczne pobieranie próbek (pH 4,6-9,0)
Zobacz materiał LMB02Czarodziej 1Rigaku1009530Rozdział 48Stochastyczne pobieranie próbek (pH 4,5-10,5)
Czarnoksiężnik 2Rigaku1009531Rozdział 48Stochastyczne pobieranie próbek (pH 4,5-10,5)
Zobacz materiał LMB03Siatka siatkowa Siarczan amonuBadania HamptonHR2-21124Siatka ekranu, [AmS] = 0.8-3.2 M i buforuje pH 4.0-9.0
Siatka sitowa PEG/LiClBadania HamptonHR2-21724Siatka sitowa, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, stężenie LiCl = 1,0 M i pH 4,0-9,0
Szybki ekranBadania HamptonHR2-22124Siatka sitowa, [NaKPO4] = 0,8-1,8 M przy pH 5,0-8,2
Chlorek sodu na siatceBadania HamptonHR2-21924Siatka ekranu, [NaCl] = 1.0-4.0 M i buforuje pH 4.0-9.0
Zobacz materiał LMB04Sito siatkowe PEG 6000Badania HamptonHR2-21324Siatka sitowa, [PEG 6000] = 5-30 % w/v i pH 4,0-9,0
Ekran siatki MPDBadania HamptonPrzekaźnik HR2-21524Siatka ekranu [MPD] = 10-65 % w/v i buforuje pH 4,0-9,0
MemFac (Pamięć GłównaBadania HamptonHR2-114Rozdział 48Rzadki Macierz dla białek błonowych (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał LMB05PEG-Ion (Czujnik PEG-Ion)Badania HamptonHR2-126Rozdział 48Siatka sitowa, [PEG 3350] = 20 % w/v i różne sole na 0,2 M (bez)
NatrixBadania HamptonHR2-116Rozdział 48Niepełna silnia (pH 5,6-8,5)
Zobacz materiał LMB06Kryształowy ekran LiteBadania HamptonHR2-128Rozdział 48Crystal Screen 1 z połową pierwotnych stężeń strącacza
Niestandardowy ekran LiteWymiary molekularneN/aRozdział 48Dodatkowe warunki z niskimi stężeniami opadów
Zobacz materiał LMB07Czarodziej Cryo 1Rigaku1009536Rozdział 48Stochastyczne pobieranie próbek w warunkach kriochronionych przy użyciu PEG-ów o niskiej mocy MW (pH 4,5-9,4)
Czarodziej Cryo 2Rigaku1009537Rozdział 48Stochastyczne pobieranie próbek w warunkach kriochronionych przy użyciu PEG-ów o niskiej MW (pH 4,5-10,1)
Zobacz materiał LMB08Zobacz materiał JBS1JenaBioScienceCS-101L24Niekompletna silnia na podstawie różnych PEG (pH 4,6-9,0)
JBS2JenaBioScienceCS-102L24Niekompletna silnia na podstawie PEG 4000 (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał JBS3JenaBioScienceCS-103L24Niekompletna silnia na podstawie PEG 4000 (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał JBS4JenaBioScienceCS-104L24Niekompletna silnia na podstawie średnich MW PEG (pH 6,5-8,5)
Zobacz materiał LMB09Zobacz materiał JBS5JenaBioScienceCS-105L24Niekompletna silnia oparta na ciężkich MW PEG (pH 6,5-9,5)
JBS6JenaBioScienceCS-106L24Niepełna silnia na podstawie AmS (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał JBS7JenaBioScienceCS-107L24Niekompletna silnia na podstawie MPD (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał JBS8JenaBioScienceCS-108L24Niepełna silnia na podstawie MPD i etanolu (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał LMB10Zobacz materiał JBS9JenaBioScienceCS-109L24Niekompletna silnia na bazie soli kuchennych i 2-propanolu (pH 4,6-8,5)
Zobacz materiał JBS10JenaBioScienceCS-110L24Niekompletna silnia na bazie soli kuchennych (pH 4,6-8,5)
Przejrzysty ekran strategii 1 pH 4,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 1 pH 5,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Zobacz materiał LMB11Przejrzysty ekran strategiczny 1 pH 6,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 1 pH 7,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 1 pH 8,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 2 pH 4,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Zobacz materiał LMB12Wyczyść ekran strategii 2 pH 5,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 2 pH 6,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategii 2 pH 7,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Wyczyść ekran strategiczny 2 pH 8,5Wymiary molekularneMD1-16LMB (Jednostka pływająca)24Siatka ekranu z różnymi PEG-ami
Zobacz materiał LMB13indeksBadania HamptonHR2-14496 Rozdział 96Małe rzadkie ekrany matrycowe i siatkowe (pH 3,0-9,0)
Zobacz materiał LMB14Sól RX 1Badania HamptonPrzekaźnik HR2-107Rozdział 48Siatka zawierająca 22 unikalne sole w porównaniu ze stężeniem soli i pH (4.1-9.0)
Sól RX 2Badania HamptonHR2-109Rozdział 48Siatka zawierająca 22 unikalne sole w porównaniu ze stężeniem soli i pH (4.1-9.0)
Zobacz materiał LMB15MemStartWymiary molekularneZobacz materiał MD1-21Rozdział 48Rzadki matrix dla białek błonowych (pH 4,0-10,0)
Pamięć MemSysWymiary molekularneMD1-25Rozdział 48Siatka przesiewowa dla białek błonowych (głównie PEG, pH 3,5-9,5)
Zobacz materiał LMB16JCSG+Qiagen powiedział:Numer katalogowy: 13072096 Rozdział 96Rzadki Macierz (pH 4,0-10,0)
Zobacz materiał LMB17Ekran MORPHEUSWymiary molekularneZobacz materiał MD1-4696 Rozdział 96Siatka z uwzględnieniem mieszanek dodatków i warunków kriochronionych (pH 6,5-8,5)
Zobacz materiał LMB18Minimalny ekran liczby PiJenaBioScienceZobacz materiał CS-12796 Rozdział 96Niepełna silnia (pH 4,0-9,5)
Zobacz materiał LMB19Ekran Pi-PEGJenaBioScienceZobacz materiał CS-12896 Rozdział 96Niekompletna silnia dla białek błonowych (pH 4,8-8,8)
Zobacz materiał LMB20Ekran MORPHEUS IIWymiary molekularneZobacz materiał MD1-9196 Rozdział 96Siatka zawierająca mieszanki dodatków (ciężkie atomy) i warunki kriochronione (pH 6,5-8,5)
Zobacz materiał LMB21Ekran krystalizacji LMBWymiary molekularneZobacz materiał MD1-9896 Rozdział 96Rzadki macierz z uwzględnieniem warunków wybranych z publikacji LMB
Zobacz materiał LMB22Ekran MORPHEUS IIIWymiary molekularneN/a96 Rozdział 96Siatka zawierająca mieszanki dodatków (związki leków) i warunki kriochronione (pH 6,5-8,5)

Tabela 1: Formuły zestawów znalezionych na płytkach LMB. Każdy komercyjny zestaw przesiewowy składa się z warunków 24/48/96 początkowo w probówkach. Płytki LMB są przechowywane w inkubatorach o temperaturze 10 °C znajdujących się na terenie obiektu, gdzie są dostępne dla użytkowników w dowolnym momencie.

2. System 2 i wymagania dotyczące ustawiania kropel

Rysunek 2A przedstawia system 2 oparty na urządzeniu do obsługi cieczy19 działającym z wypornością i jednorazowymi końcówkami. Jednorazowe końcówki są dostarczane w stojakach z możliwością układania w stosy, odpowiednich do automatycznej obsługi. Po prawej stronie systemu zintegrowano 3-pozycyjny dozownik nanolitrowy pokładu20. Aspirat/dozownik na dozowniku nanolitrowym działa również z wypornością za pomocą jednorazowych mikrostrzykawek (dostarczanych w dużych szpulach). Jako samodzielny robot, wyjmowany blok uchwytu na paski służy do ładowania próbki białka. W przypadku w pełni zautomatyzowanego procesu 384-dołkowa płytka do PCR zastępuje uchwyt na paski. Podobna zgrzewarka do płyt samoprzylepnych do systemu 1 została zintegrowana po lewej stronie. Zgrzewarka i dozownik w nanolitrach stoją na specjalnie zbudowanych, podniesionych stołach roboczych, aby główny chwytak mógł dotrzeć do nośników płyt tych dwóch zintegrowanych robotów (w obu bocznych panelach maszyny do obsługi cieczy trzeba było wyciąć okno, aby chwytak mógł uzyskać dostęp na zewnątrz głównego pokładu). Główny program wywołuje określone sterowniki, aby w odpowiednim czasie uruchomić programy dozowania nanolitrów i zgrzewarkę. System 2 ma 2 850 mm szerokości, 800 mm głębokości i 800 mm wysokości. Obok robota potrzebna jest dodatkowa przestrzeń na wyświetlacz komputera sterującego. Pod systemem znajdują się dwa pojemniki na odpady na końcówki i mikrostrzykawki wyrzucane podczas procesu (pod spodem przechowywany jest również komputer sterujący). Ważną cechą systemu 2 jest ogólny układ, który zachowuje łatwy dostęp do trzech robotów, dzięki czemu mogą być one używane indywidualnie do opisanych wcześniej protokołów optymalizacyjnych lub innych protokołów opisanych w innym miejscu, takich jak krystalizacja białek błonowych w mezofazach lipidowych21 i losowe przesiewanie matryc mikronasion22.

Rysunek 2B to zbliżenie pokładu, który jest wyposażony w pojedyncze ramię robota. Ramię integruje 12 niezależnych sond pipetujących i główny chwytak. Pozycje sond mogą być sterowane indywidualnie w jednym kierunku, aby uzyskać dostęp do różnych miejsc wzdłuż osi między sondami, a nawet pojedynczymi rurkami. Sondy mogą być wyposażone w jednorazowe końcówki (1-12) lub parę adapterów z ruchomą płytą. Początkowo ładowane są dwa zestawy po 4 stosy zawierające jednorazowe końcówki o pojemności 50 μl. Poziomy cieczy są wykrywane automatycznie, ponieważ końcówki są przewodzące. Adaptery do ruchomych płyt są zaprojektowane z 2 ostrymi kołkami po wewnętrznej stronie, które w razie potrzeby tworzą opcjonalny chwytak. Na głównym pokładzie znajduje się 24-pozycyjny nośnik chłodzący mikrorurki dla próbki, chociaż tutaj używane są tylko 1-2 pozycje. Ponadto dostępny jest nośnik na płytkę PCR, a także 2 pojemniki do przechowywania na składane w stosy, niestandardowe pokrywki SBS (Rysunek 2C). Wreszcie są 4 przesuwne nośniki, każdy z 5 miejscami na płytki krystalizacyjne (4 x 5 = 20 płytek).

figure-results-2
Rysunek 2: Ustawianie kropelek do eksperymentów z dyfuzją pary. (A) Przegląd w pełni zautomatyzowanego systemu 2. (B) główny pokład urządzenia do obsługi cieczy w działaniu: a) nośnikami do przechowywania stosów pokryw SBS, b) końcówkami do układania w stosy, c) nośnikiem chłodzącym z próbką w mikroprobówce, d) nośnikiem dla 2 adapterów do przesuwania płytek, e) płytką PCR do przenoszenia białka do robota manipulacyjnego o nanolitrach, f) 9 zaplombowanymi płytkami, które zostały umieszczone z powrotem w ich początkowych pozycjach, g) opcjonalny chwytak zdejmujący pokrywę SBS z 10. płytki, która ma być transportowana na pokład urządzenia do obsługi cieczy, h) 10 następnych płytek, które należy przygotować z pokrywkami SBS na górze, (i) główny chwytak, który jest używany do transportu płytek PCR i krystalizacyjnych, j) główne zautomatyzowane ramię wyposażone w 12 sond pipetujących (2 z nich są używane jako opcjonalne chwytaki) i główny chwytak; oraz k) pokład dozownika w nanolitrach. (C) Własne niestandardowe pokrywy SBS wykonane z aluminium. Pokrywy są wyposażone w gumową folię, aby uniknąć parowania w warunkach, oraz dwa małe otwory, które można dokładnie podnieść za pomocą opcjonalnego chwytaka. (D) Przekrój poprzeczny szczelnego dołka krystalizacyjnego, w którym zbiornik jest wypełniony kondycją, a górna studzienka zawiera kropelkę złożoną zarówno z próbki białka, jak i ze stanu. Ponieważ środek strącający w kropli jest mniej skoncentrowany niż w stanie, stężenia wszystkich składników w kropli rosną w wyniku utraty wody podczas procesu równoważenia przez dyfuzję pary (bardzo schematycznie przedstawionej przez strzałkę). (E) Mikrofotografie świetlne kropelek 100 nL i (F) 200 nL wytwarzanych przez dozownik nanolitrów z roztworem testowym (20% v/v glikol polietylenowy 400, 0,001% w/v Safranina jako czerwony barwnik). Wielkość i kształt kropli mogą się różnić w zależności od właściwości chemicznych schorzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Główny program rozpoczyna się od opcjonalnego chwytaka, który zdejmuje pokrywę SBS z pierwszej płytki krystalizacyjnej. Po przeniesieniu pokrywy na odpowiedni nośnik magazynujący, płytka krystalizacyjna jest transportowana na pokład dozownika nanolitrów. Następnie ramię pipetujące przenosi ilość próbki potrzebną do ustawienia kropelek z normalnie schłodzonej mikroprobówki do pierwszej kolumny płytki PCR. Następnie główny chwytak przesuwa płytkę PCR na pokład dozownika o pojemności nanolitrów, który przygotuje kropelki zgodnie z opcjami wybranymi przez użytkownika na początku (np. wielkość kropli). W tym celu próbka białka jest najpierw dozowana do górnych studzienek (przy użyciu pojedynczego zestawu 8 mikrostrzykawek i wielokrotnego dozowania), a następnie warunki krystalizacji są dozowane na kropelki białka (każdy rząd wymaga teraz 8 nowych mikrostrzykawek, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego). Po zakończeniu programu ustawiania kropel, główny chwytak transportuje odpowiednią płytkę do zgrzewarki do płytek, a następnie umieszcza płytkę PCR z powrotem w jej pierwotnej pozycji (więcej białka zostanie dozowane w następnej kolumnie płytki PCR dla następnej płytki). Na koniec uszczelniona płyta krystalizacyjna jest przesuwana z powrotem do swojej pierwotnej pozycji na pokładzie: Eksperymenty z dyfuzją pary już się rozpoczęły na tej płycie (Rysunek 2D). Ten cykl powtarza się w zależności od liczby płytek. W razie potrzeby opcjonalny chwytak umożliwia wyjęcie pustego stojaka na końcówki, dzięki czemu ramię pipetujące ma dostęp do większej liczby końcówek. Program zajmuje 2 godziny i 20 minut oraz 440 μl próbki do przygotowania pojedynczych kropel na 20 płytkach przy użyciu próbki 100 nL + 100 nL warunek (Rysunek 2E i 2F).

Podczas używania dozownika nanolitrów jako samodzielnego robota dla dwóch dodatkowych płytek (patrz Protokół, krok 1.2.3), można ustawić cały zestaw płytek do wstępnego przesiewania dostępnych w inkubatorze 10 °C (22 płytki LMB x 96 warunków = 2,112 warunków).

Tabela 2 pokazuje wymagania dla głównego programu zgodnie z wyborami użytkowników w systemie 2.

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. TGL szt. szt. szt.
PłytyWielkość kropli (nL)Próbka(i)Wymagania dotyczące napiwkówczas trwania
numertypObjętość 1 (μL) Objętość 2 (μL) Końcówki 50 μL Mikrostrzykawki
1096-dołkowy1002400Rozdział 80Numer katalogowy 10401 godz. 12 min
2096-dołkowy1004400160Rok 20802 godz. 20 min
1096-dołkowy100240240160Rok 20801 godz. 45 min
2096-dołkowy100440440320Numer katalogowy: 41603 godz. 05 min
1048-dołkowy10006240Rozdział 805601 godz. 10 min
2048-dołkowy1000Rozdział 12080160Numer katalogowy 11202 godz. 16 min

Tabela 2: Przykłady głównych opcji programu dostępnych w systemie 2 do ustawiania kropel krystalizacji. Niezbędna ilość próbki białka, końcówek i mikrostrzykawek różni się w zależności od programu. Objętości próbki "vol. 1" (kropla 1) i "vol. 2" (kropla 2) oblicza się w następujący sposób: (8 końcówek x wymagana objętość na dołek płytki PCR + 4 μl utraconej objętości) x liczba płytek krystalizacyjnych + 40 μl martwej objętości w mikroprobówce. Wymagana objętość na dołek płytki PCR dla kropelek o długości 100 nL na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej wynosi 2 μL, podczas gdy 6,8 μL jest wymagana dla kropelek 1,000 nL na płytce 48-dołkowej (objętość martwa w studzienkach płytki PCR: 0,8 μL). Uwzględniana jest dodatkowa objętość próbki ("objętość utracona") spowodowana parowaniem z mikroprobówki i innymi stratami (np. przywieraniem próbki do końcówek). Na przykład dla 20 płytek MRC, 100 nL, protokół 1 kropli, wymagana objętość próbki wynosi: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 μL (tj. odpowiednik 22 μL na płytkę). Do każdej płytki i każdej próbki wymaganych jest osiem jednorazowych końcówek o pojemności 50 μl. Na przykład dla 10 płytek, protokół 2-kroplowy, wymagana liczba końcówek wynosi 8 x 10 x 2 = 160 końcówek. Liczbę mikrostrzykawek oblicza się w następujący sposób: (8 + liczba warunków na płytkę) x liczba próbek x liczba płytek. Na przykład w przypadku płytek 10 x 48-dołkowych wymagana liczba końcówek do obsługi cieczy wynosi: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 końcówek.

3. Formułowanie, przygotowanie i obsługa roztworów 4-narożnych

Oba sformułowania 4 rozwiązań narożnych ('A, B, C i D') oraz odpowiadający im ekran optymalizacji (Rysunek 3A) są automatycznie generowane przez Arkusz kalkulacyjny Excel. Istnieją różne arkusze kalkulacyjne dla różnej liczby warunków — zasadniczo 24, 48 i 96 warunków — a także arkusze kalkulacyjne do przygotowania dwóch różnych ekranów optymalizacji na jednej płycie. Zazwyczaj przygotowuje się zestaw roztworów narożnych 4 x 10 ml w probówkach, z których można przygotować 2–3 sita optymalizacyjne, w zależności od liczby i objętości wymaganych warunków. Roztwory wlewa się do koryt, z których są zasysane za pomocą strzykawki do obsługi cieczy, a następnie dozowane bezpośrednio do płytek (Rysunek 3B). Dwa liniowe gradienty stężeń wynikają z mieszania A, B, C i D w systematycznie zmieniających się proporcjach (Rysunek 3C).

figure-results-3
Rysunek 3: 4-narożna metoda przygotowania ekranów optymalizacyjnych. (A) Reprezentacja dwóch gradientów stężeń w układzie płytek 96-dołkowych. (B) Maszyna do obsługi płynów na bazie strzykawki gotowa do przygotowania sita z 4 strzykawkami włożonymi do głowy robota. Płytka krystalizacyjna znajduje się w zmotoryzowanym nośniku SBS, a 4 roztwory wyjściowe (A, B, C i D) zostały już dozowane do odpowiednich rynien (roztwory zostały pokolorowane na czerwono wyłącznie w celach demonstracyjnych). (C) Proporcje roztworów A, B, C i D w 96 zbiornikach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 3 pokazuje wymagania dotyczące programów dostępnych dla użytkowników na strzykawce do obsługi płynów.

szt. szt. szt.
Typ płytyLiczba warunków Objętość w płytce (zbiorniki, μL) Objętość w korycie (ml)czas trwania
96-dołkowyRozdział 48Rozdział 801.62 min 5 sekund
96-dołkowy96 Rozdział 96Rozdział 80Rozdział 2.53 min 50 sekund
96-dołkowyWymiary: 2 x 48Rozdział 801.62 min 50 sekund
48-dołkowy242001.82 min 25 sek
48-dołkowyRozdział 4820034 min 20 sekund

Tabela 3: Programy dostępne w strzykawkowym urządzeniu do obsługi płynów do przygotowania ekranów optymalizacyjnych zgodnie z metodą 4-kątną. Płytka 96-dołkowa może być wykorzystana do przygotowania sita optymalizacyjnego w stanie 96 lub 48 (w przypadku jednoczesnego przygotowania dwóch ekranów w 48 warunkach, robot musi być wyposażony w 8 strzykawek i 8 koryt). Inne programy umożliwiają stosowanie płytek 48-dołkowych. Podane objętości w korytach obejmują wymaganą objętość martwą (0,5 ml).

4. Badanie przesiewowe addytywne

Rysunek 4 pokazuje kroki do przeprowadzenia przesiewu dodatków, zaczynając od 96 roztworów dodatków znajdujących się już w zbiornikach płytki krystalizacyjnej (protokół 1) lub w studzienkach niskoprofilowej płytki do hodowli komórkowej używanej jako sitko do wielokrotnego użytku (protokół 2). W tabeli 4 wymieniono programy dostępne w dozowniku nanolitrów według dwóch typów protokołów.

figure-results-4
Rysunek 4: Dwa rodzaje protokołów badań przesiewowych z użyciem addytywnym. Sita z 96 dodatkami są przechowywane w temperaturze -20 °C. Zgodnie z protokołem 1, sitko dodatku dodaje się początkowo do zbiorników płytek krystalizacyjnych (i najlepiej w ten sposób je magazynuje). Do dozowania warunku do zbiorników zawierających roztwory dodatków stosuje się maszynę do obsługi cieczy lub wielopipetę (objętość sita dodatków stanowi 10% końcowej objętości w zbiornikach: 8 μl dla 80 μl objętości końcowej). Po wymieszaniu warunków na mieszalniku do mikropłytek (nie pokazano), dozownik nanolitrowy na bazie mikrostrzykawki jest używany do ustawienia kropelek (Tabela 4). Zgodnie z protokołem 2, sitko addytywne jest dodawane dopiero później podczas ustawiania kropelek krystalizacji. Tym razem dozownik o pojemności nanolitrów służy do przygotowania kropelek z dodatkowym składnikiem na swoim pokładzie (płytką wielokrotnego użytku do hodowli komórkowych zawierającą sitko z dodatkiem). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział szt.
ProtokółWielkość kropli (nL)Rodzaj paskaObjętość próbki (μL)Liczba mikrostrzykawekczas trwania
typŹródło dodatkówbiałkowarunekdodatekW każdym dołku (pasie)łączny
196-dołkowa płytka krystalizacyjna10010002 μlcyfra arabska16Rozdział 104Czas trwania: 2 min
196-dołkowa płytka krystalizacyjna20020005 μL3.8Rozdział 31Rozdział 1042min 10 sek
cyfra arabska96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej2002001005 μL3.8Rozdział 312003min 45 sek
cyfra arabska96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej5005001005 μL7,4602004min 15 sek

Tabela 4: Programy dostępne w nanolitrowym dozowniku na bazie mikrostrzykawki do przesiewania dodatków. Wymaganą objętość próbki w każdym dołku z 8-dołkowego pasa oblicza się w następujący sposób: objętość martwa + 12 x wielkość kropli. Dostępne są 2 rodzaje pasków (2 μL i 5 μL). Martwe objętości wynoszą 0,8 μl dla studzienek 2 μl (które w rzeczywistości mogą zawierać maksymalnie 3,2 μl) i 1,4 μl dla studzienek 5 μl (maks. 7,5 μl). Całkowita wymagana objętość białka wynosi: 8 x objętość w studzience paska (wartość zaokrąglona). Objętość martwa studzienek w kształcie litery V 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej wynosi 2,5 μl. Wymagana liczba mikrostrzykawek różni się w zależności od wybranego programu (8 + 96 = 104; lub 8 + 2 x 96 = 200).

Ze względu na rozcieńczenie warunku dodatkiem podczas protokołu 1, warunek musi być przygotowany w proporcjonalnie wyższym stężeniu niż początkowo. Wzrost stężeń końcowych najłatwiej osiągnąć poprzez zmniejszenie końcowego dodatku wody do obliczonej objętości końcowej. Następnie po prostu przystępuje się do normalnego ustawiania kropel, które mieszają warunek i próbkę (np. 100 nL białka + 100 nL warunek już zmieszany z dodatkami). Protokół 2 (np. warunek 200 nL białka + 200 nL dodatek + 100 nL dodatku) ułatwia badanie przesiewowe przy różnych stężeniach dodatków poprzez prostą zmianę objętości dodawanego dodatku. Protokół 2 zakłada mniejsze lub większe rozcieńczenie kropelek (co może zmienić krystalizację).

Płyn z systemu 2 może być użyty do zasysania wystarczającej ilości płynów w 12 końcówkach i dozowania 8 porcji do zbiorników płytki 96-dołkowej (patrz Protokół, krok 2.2.2), chociaż ten krok można oczywiście wykonać ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej (Rysunek 4). Podczas korzystania z urządzenia do obsługi cieczy można jednocześnie napełnić kilka płytek w tym samym stanie (w celu późniejszego przetestowania różnych sit dodatków). Przygotowując 2 płytki, napełnij pojemnik na odczynnik co najmniej 23 ml. Przygotowując 3 płytki, napełnij pojemnik na odczynnik co najmniej 31 ml.

5. Płytki krystalizacyjne i związane z nimi urządzenia

Konstrukcja obu płytek krystalizacyjnych MRC do dyfuzji dyfuzji pary (96-dołkowa 2-kroplowa i 48-dołkowa 1-kroplowa, Rysunek 5A i Rysunek 5B) zapewnia cechy, które umożliwiają niezawodne i wydajne eksperymenty z automatyczną krystalizacją, w szczególności sferyczny kształt górnych studzienek i lekki kształt litery V zbiorników, które ułatwiają dokładne dozowanie, a także wirowanie podczas centrowania kropel. Wymagane. Ponadto górne studzienki mają efekt soczewki zapewniający optymalne oświetlenie pod mikroskopem stereoskopowym (polimer jest przepuszczalny dla promieniowania UV w celu wykrywania kryształów pochłaniających promieniowanie UV lub fluorescencyjnych23).

Niestandardowa pieczęć (Rysunek 5C) umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z krystalizacją wiszących kropel na obu typach płytek przy użyciu dozownika nanolitrów (protokoły nie pokazane). Wreszcie, obie płyty MRC mają te same wymiary zewnętrzne i obrzeże. Obręcz pasuje do rowków naszego specjalnie zbudowanego uchwytu na talerz (Rysunek 5D), który służy do ręcznego umieszczania/zdejmowania taśmy uszczelniającej bez rozpryskiwania płynów.

figure-results-5
Rysunek 5: Płytki krystalizacyjne MRC i związane z nimi urządzenia opracowane w LMB. (A) A1-róg płytki 96-dołkowej. Zbiornik (podłużny) znajduje się po lewej stronie studni krystalizacyjnej, a dwie kuliste studzienki górne po prawej. Wymiary podane są w milimetrach. (B) A1-róg płytki 48-dołkowej. Zbiornik znajduje się po prawej stronie studni (tylko 1 duża studnia górna). (C) Wisząca uszczelka kroplowa MRC. (D) Własny niestandardowy uchwyt na tablicę rejestracyjną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Kryształy białek

Rysunek 6 pokazuje przykłady użytecznych kryształów uzyskanych za pomocą naszych automatycznych protokołów.

figure-results-6
Ryc. 6: Mikrofotografie świetlne kropelek zawierających kryształy uzyskane zgodnie z protokołami automatycznymi. (A, B) Kryształy z początkowego przesiewu OmpF i MreB w płytkach przygotowanych za pomocą 2 w pełni zautomatyzowanych systemów (patrz sekcje protokołu 1.1 i 1.2, warunki: LMB07 dołek A4 i LMB20 dołek D12, odpowiednio, wielkość kropelek wynosi 100 nL białka + stan 100 nL, praca Andrzeja Szewczaka, LMB)24. (C, D) Kryształy w domenie prętowej przed i po optymalizacji warunków początkowych metodą 4-narożną (krok 2.1, LMB02 B6, 1,000 nL + 1,000 nL, niepublikowana praca Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Ciężki łańcuch ludzkich kryształów domeny N-końcowej dyneiny 1 przed i po optymalizacji warunków początkowych metodą 4-kątną (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, następnie 500 nL + 500 nL, niepublikowana praca Edgara Moralesa-Ríosa, LMB). (G, H) Kryształy czynnika dopełniacza D przed i po optymalizacji stanu za pomocą przesiewania addytywnego (krok 2.2, warunek początkowy z własnego niestandardowego przesiewu, 200 nL + 200 nL, dodatek D6 z przesiewu addytywnego w stanie 96, niepublikowana praca Matthiasa Bauera, LMB). (I, J) Glikoproteina otoczki wirusa25 kryształów przed i po optymalizacji stanu z dodatkowym badaniem przesiewowym (krok 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, następnie 200 nL + 200nL + 100 nL dodatek E5 z 96-warunkowego badania przesiewowego, niepublikowana praca Yorgo Modis, University of Cambridge, Wielka Brytania). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1- Przygotowanie i wykorzystanie wstępnych sit przechowywanych na płytkach

Zestawy do przesiewania należy wymieszać przed dozowaniem do płytek, ponieważ podczas przechowywania w niektórych probówkach dochodzi do lekkiego wytrącania się lub separacji faz. Gdy ekran składa się z dwóch zestawów (2 x 48 rurek), pierwsza rurka drugiego zestawu jest umieszczana w miejscu E1 nośnika chłodzącego. Gdy ekran składa się z 4 zestawów (4 x 24 rurki), pierwsza rura drugiego zestawu jest umieszczana w lokalizacji C1, pierwsza rura trzeciego zestawu jest umieszczana w lokalizacji E1, a pierwsza rura czwartego zestawu jest umieszczana w lokalizacji G1. Podczas wkładania probówek do ich nośnika chłodzącego, pokrywki są umieszczane na tacy zgodnie ze standardowym 96-dołkowym układem poziomym. Ponieważ numery studzienek są podane przez producentów na górze pokryw, umożliwia to sprawdzenie krzyżowe, czy wszystkie probówki zostały umieszczone we właściwej kolejności. Pomaga to również w wymianie odpowiednich pokrywek na tubkach podczas napełniania zmniejszonej liczby płytek.

Wstępnie napełnione płytki przechowujemy w temperaturze 10 °C, co jest kompromisem, aby uniknąć zamarzania i przechowywania w temperaturze 4 °C, co może spowodować pogorszenie warunków i problemy z uszczelnieniem. Płyty są przechowywane przez okres do kilku miesięcy, zwykle bez zauważalnej kondensacji na wewnętrznej powierzchni uszczelki. Jest to mniej prawdziwe w przypadku płytek LMB05, LMB06, LMB09 i LMB10, ponieważ zawierają one warunki o stosunkowo wysokich stężeniach lotnych odczynników (tabela 1). Niewielka ilość kondensatu po wewnętrznej stronie uszczelki zmniejsza skuteczność uszczelniania i może powodować zanieczyszczenie krzyżowe między studzienkami podczas rozszczelniania płyt. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej podczas wstępnego chłodzenia, płyty można najpierw przenieść z karuzeli do izolowanej chłodziarki piknikowej, która jest przechowywana przez noc w chłodni o temperaturze 4 °C. Bardzo powolne chłodzenie minimalizuje powstawanie gradientów temperatury w uszczelnionych studzienkach, a tym samym zmniejsza ogólną kondensację15. Ponadto, po przechowywaniu płytek w inkubatorze w temperaturze 10 °C, na płytce na górze każdego stosu umieszcza się niestandardową pokrywę z polistyrenu SBS (nie pokazano).

Cały zestaw naszych wstępnie napełnionych płytek może być używany jako duże sito początkowe w stosunku do nowej, rozpuszczalnej w wodzie próbki białka. Alternatywnie można wybrać mniejszą liczbę płyt, aby dopasować je do określonych wymagań. Na przykład LMB15 i LMB19 są ekranami opracowanymi specjalnie dla próbek białek błonowych26,27, lub LMB20 to badanie przesiewowe sformułowane z ciężkimi atomami w celu ułatwienia eksperymentalnego fazowania danych dyfrakcyjnych28 (patrz również: Formułowanie ekranów krystalizacji białek MORPHEUS).

2. Ustawianie kropelek krystalizacji

W przypadku korzystania z systemu 2 w pierwszej kolejności należy przetworzyć zestawy do badań przesiewowych ze znacznymi ilościami odczynników lotnych. Pozwala to uniknąć tworzenia się kondensatu na gumie pokryw SBS, co mogłoby wpłynąć na obsługę pokrywy i uszczelnienie płyty. Pokrywka SBS ma niewielki prześwit, gdy znajduje się na wierzchu płyty, dlatego należy je początkowo wyrównać (patrz Protokół, krok 1.2.6). Martwe objętości białka w dołkach płytki PCR są stosunkowo duże (0,8 μl, patrz legenda w tabeli 2). Należy zauważyć, że równie duże objętości martwe są stosowane w przypadku stosowania dozownika nanolitrów pojedynczo z białkiem w 8-dołkowych paskach (Tabela 4). Mniejsze objętości martwe mogą działać, jednak niektóre próbki przylegają do końcówek, kalibracja robota może stać się nieco niedokładna, pomieszczenie może być cieplejsze niż zwykle itp. Wszystko to prowadzi do ubytków próbek pokrywanych przez duże objętości martwe w celu utrwalenia podejścia.

Ostatnie osiągnięcia umożliwiły dalszą miniaturyzację eksperymentów, dzięki czemu objętość próbki wymagana do badania przesiewowego warunków krystalizacji może zostać znacznie zmniejszona poprzez integrację odpowiedniej technologii29,30. Jednak niektóre aspekty dalszej miniaturyzacji wymagają starannego rozważenia, takie jak parowanie kropel31 i manipulacja mikrokryształami32.

Wreszcie, odwirowanie płytki (2 000 obr./min, 1 min) może być zintegrowane jako rutynowy ostatni etap tworzenia kropel krystalizacji (w sferycznych studzienkach górnych). Bardziej spójna wielkość i kształt kropelek wynikający z wirowania może zmniejszyć problemy z odtwarzalnością33,34. Z pewnością wyśrodkowane krople ułatwią późniejszą ocenę eksperymentów przy użyciu mikroskopu, ponieważ wymagana ogniskowa będzie podobna na całej płycie.

3. Zalety metody 4-narożnej

Najważniejszą zaletą metody 4-corner jest jej prostota, która minimalizuje błędy i ułatwia proste automatyczne protokoły. Na przykład 4 rozwiązania narożne będą zawsze umieszczane na pokładzie maszyny do obsługi cieczy zgodnie z tym samym układem. Ponadto wszystkie programy opierają się na stałych proporcjach między roztworami (rysunek 3C).
Ręczne przygotowanie 4 roztworów narożnych jest preferowane w stosunku do zautomatyzowanego obchodzenia się z roztworami o wysokich stężeniach, które mogą mieć wysoką lepkość. Stosunkowo szybkie i dokładne zasysanie/dozowanie jest możliwe w większości typów urządzeń do obsługi cieczy przy minimalnych wymaganiach dotyczących optymalizacji klas cieczy. Niemniej jednak niektóre rozwiązania narożne mogą być nadal zbyt lepkie, aby robot pracujący z systemem cieczowym mógł działać wydajnie. Z tego powodu zdecydowaliśmy się na wózek do obsługi cieczy pracujący z wypornością (ilustracja 3B).

Oprócz 2 liniowych gradientów stężeń, trzeci składnik (tj. zestaw/dodatków) może być testowany w stałym stężeniu w wygodny sposób. W tym celu najpierw przygotowuje się stosunkowo dużą objętość rdzeniowego zestawu roztworów narożnych o odpowiednio wyższym stężeniu, z wyłączeniem składnika, który ma być zmieniany. Następnie dodaje się roztwory podstawowe zawierające ten składnik w celu dostosowania końcowych stężeń. Na przykład przygotowuje się 50 ml zestawu 4 roztworów narożnych w stężeniach o 10% wyższych niż początkowo. Ten zestaw podstawowy jest następnie dzielony na 5 mniejszych podzbiorów po 4. Na koniec do każdego podzestawu dodaje się 10% objętości różnych roztworów buforowych pH.

4. Formaty i rodzaje sit addytywnych

Sita są zwykle przechowywane w temperaturze -20 °C (rysunek 4), ponieważ nie są regularnie używane i zawierają lotne/niestabilne związki. Użycie sita z zamrożonymi dodatkami przechowywanymi w bloku głębokiej studzienki (1 ml w studzienkach) musi być zaplanowane wcześnie, ponieważ całkowite rozmrożenie wszystkich roztworów dodatków w temperaturze pokojowej zajmie 12-24 godziny. Ponadto wielu użytkowników korzysta z tego samego sita dodatków, co może powodować problemy z zanieczyszczeniem krzyżowym. Wreszcie, wysokość bloków studni głębinowych sprawia, że nie nadają się one do większości dozowników nanolitrowych. Wygodnym rozwiązaniem pozwalającym obejść te problemy jest przeniesienie ekranu z bloku studni głębinowej na płyty niskoprofilowe (rysunek 4).

Historycznie rzecz biorąc, badania addytywne, które obejmują szeroką gamę pojedynczych odczynników (o pojedynczych stężeniach), były bardzo popularne35,36. Opracowano jednak inne rodzaje przesiewów dodatków, które integrują mieszaniny dodatków37 lub zmniejszoną liczbę pojedynczych dodatków występujących w różnych stężeniach38. Wreszcie, podejściem uzupełniającym jest zbadanie wpływu dodatków na próbki przed krystalizacją39,40.

5. Więcej uwag

Dobra praktyka: Większość ekranów zawiera szkodliwe, a nawet toksyczne substancje, dlatego podczas protokołów należy stosować odpowiednią ochronę osobistą. Podobnie, ruchome części robotów mogą prowadzić do obrażeń, zwłaszcza podczas próby ręcznego zakłócenia podczas działania programu (chociaż większość robotów ma przycisk/system zatrzymania awaryjnego). Ze względu na złożoność techniczną, regularne sprawdzanie robotów, ekranów i programów z wcześniej scharakteryzowanymi próbkami testowymi jest ważne dla utrzymania wysokiego poziomu odtwarzalności.

Przepustowość: Orientacyjnie, za pomocą systemu 1 produkuje się od 4 000 do 8 000 płytek LMB rocznie (a następnie wykorzystuje się je przez użytkowników do wstępnych badań przesiewowych). Nie jest przystosowany do przechowywania dużej ilości wstępnie napełnionych płytek w temperaturze 10 °C, gdy oczekiwany obrót jest znacznie niższy, ponieważ po 4-5 miesiącach niektóre warunki zaczną się pogarszać i parować. W małych i średnich laboratoriach wdrożono różne podejścia do protokołów automatyzacji41.

Przechowywanie i ocenianie eksperymentów: Po przygotowaniu kropel talerze są przechowywane na półkach o niskim poziomie wibracji w pomieszczeniu o temperaturze 4 lub 18 °C o ściśle kontrolowanej temperaturze (maksymalne odchylenie +/- 0,5 °C). Eksperymenty są oceniane przy użyciu mikroskopów z zimnym źródłem światła. Na rynku dostępne są różne zautomatyzowane systemy obrazowania, jednak należy dokładnie rozważyć wszystkie aspekty: Czy prędkość wymagana do zeskanowania płytki będzie wystarczająca do uzyskania wysokiej przepustowości? Czy obiekty inne niż kryształy będą zakłócać działanie autofokusa? Czy uzyskana jakość obrazów będzie wystarczająca do dostrzeżenia bardzo małych kryształów (zwłaszcza wokół krawędzi kropel)? 42,43,44

Porównanie warunków krystalizacji: Po dokładnym zbadaniu natury początkowo otrzymanych kryształów, można przeanalizować trendy i podobieństwa w różnych warunkach, korzystając z bazy danych ekranu LMB lub C6 Web Tool45.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszym stwierdzamy sprzeczny interes komercyjny, ponieważ LifeArc komercjalizuje następujące elementy: 96- i 48-dołkowe płytki MRC, wiszącą uszczelkę kroplową MRC, ekrany krystalizacji MORPHEUS, Pi, ANGSTROM i LMB.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodek krystalizacji MRC-LMB jest uprzejmie wspierany przez Radę Badań Medycznych (UK). Dziękujemy członkom LMB za ich wsparcie: Oldze Perisic (PNAC), Tony'emu Warne'owi, Fusinicie Van den Ent i Patowi Edwardsowi (Badania Strukturalne), Steve'owi Scotcherowi i pozostałym członkom Warsztatu Mechanicznego, Neilowi Grantowi i Jo Westmoreland (Pomoce wizualne), Paulowi Hartowi i Tomowi Prattowi (IT). Chcielibyśmy również podziękować Steve'owi Elliotowi (Tecan, Wielka Brytania), Mitchellowi Stuartowi i Heather Ringrose (Hamilton Robotics, Wielka Brytania), Paulowi Thawowi, Robertowi Lewisowi i Joby'emu Jenkinsowi (TTP Labtech, Wielka Brytania), Paulowi Reardonowi (Swissci AG, Szwajcaria), George'owi Stephensowi i Donaldowi Oggowi (Alphabiotech, Wielka Brytania), Neilowi Williamsowi (Markem Imaje, Wielka Brytania) oraz Grahamowi Harrisowi (The Cleveland Agency) za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Robots
Freedom EVO®Tecannie dotyczyMaszyna do obsługi cieczy (System 1). Aspiracja/dozowanie w oparciu o płyn systemowy. Integruje automatyczną karuzelę. Oprogramowanie sterujące EVOware plus v.2.4.12.0. 
Mikrolab® STAR & handel;Hamiltonnie dotyczyMaszyna do obsługi cieczy (System 2). Aspiracja/dozowanie w oparciu o wyporność (technologia CO-RE&trade). Oprogramowanie sterujące Hamilton STAR v.4.3.5.4785 z interfejsem zarządzania metodami.
Komar®TTP Labtechn/aDozownik nanolitrowy na bazie mikrostrzykawki służący do ustawiania kropelek (System 2 i samodzielny), 3-pozycyjny pokład. Oprogramowanie sterujące v.3.11.0.1422. 
Ważka®TTP Labtechn/aStrzykawkowy wózek do obsługi cieczy stosowany do produkcji sit optymalizacyjnych (metoda 4-kątna). Oprogramowanie sterujące v.1.2.1.10196. 
Samoprzylepna zgrzewarka do płytBrandeln/aZintegrowana z systemami 1 i 2 (używana również jako samodzielny robot).
Drukarka atramentowa 9232Markem-Imajen/aZintegrowana z Systemem 1. Interfejs ekranu dotykowego.
< silne>Ekrany krystalizacji< / strong>
Crystal Screen™ 1Hampton ResearchHR2-110(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB01
Crystal Screen 2&handel;Zestaw doHR2-112(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB01
Wizard™ Klasyczny zestaw do1 Rigaku 1009530(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02
Wizard™ Klasyczny zestaw do2 Rigaku 1009531(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02
Grid Screen™ Siarczan amonuHampton ResearchHR2-211Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ PEG/LiClHampton ResearchHR2-217Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB03
Quick Screen™Zestaw doHR2-221(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ Chlorek soduHampton ResearchHR2-219Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03
Grid Screen™ PEG 6000Hampton ResearchHR2-213Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04
Grid Screen™ MPDHampton ResearchHR2-215Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB04
MemFac i handlu;Zestaw doHR2-114(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04
PEG/Ion™Zestaw doHR2-126(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB05
Natrix™Zestaw doHR2-116(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB05
Crystal Screen Lite™Hampton ResearchHR2-128Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w ekranie LMB06
Custom LiteMolecular Dimensions Ltdnie dotyczyZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB06
Wizard™ ZestawCryo 1 Rigaku1009536(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07
Wizard™ Cryo 2Rigaku1009537Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07
JBS1JenaBioScienceCS-101LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS2JenaBioScienceCS-102LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS3JenaBioScienceCS-103LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS4JenaBioScienceCS-104LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08
JBS5JenaBioScienceCS-105LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS6JenaBioScienceCS-106LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS7JenaBioScienceCS-107LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB09
JBS8JenaBioScienceCS-108LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09
JBS9JenaBioScienceCS-109LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10
JBS10JenaBioScienceCS-110LZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 4,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 5,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 6,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 7,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 1 pH 8,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 4,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 5,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 6,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 7,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB12
Clear Strategy™ Ekran 2 pH 8,5Molecular Dimensions LtdMD1-16LMBZestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w indeksie LMB12
i handlu;Hampton ResearchHR2-144(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB13
SaltRX™ 1Hampton ResearchHR2-107(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB14
SaltRX™ 2Hampton ResearchHR2-109Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB14
MemStar i handlu;Molecular Dimensions LtdMD1-21Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15
MemSys™Molecular Dimensions LtdMD1-25Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15
JCSG-plus™ ZestawQiagen130720(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB16
MORPHEUS® screenMolecular Dimensions LtdMD1-46Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w minimalnym ekranie LMB17
PiJenaBioScienceCS-127Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na stan) stosowany w ekranie LMB18
Pi-PEGJenaBioScienceCS-128Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB19
MORPHEUS® II ekranMolecular Dimensions LtdMD1-91Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w
ekranie krystalizacji LMB20 LMB i handlu;Molecular Dimensions LtdMD1-98Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w
ekranach addytywnych LMB21Additive
HTHampton ResearchHR2-138Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).
MORPHEUS® przesiewanie dodatkówMolecular Dimensions LtdMD1-93-500Mrożone w 96-dołkowym bloku studni głębinowej (500 &mikro; L na studzienkę).
Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel;  Molecular Dimensions LtdMD1-100Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).
MORPHEUS® przesiewacz dodatkówMolecular Dimensions LtdMD1-93Mrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar® płytka z dołkami w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).
Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel;  Molecular Dimensions LtdMD1-100-FXZamrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar i reg; płytka z dołkiem w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).
Siatka dodatków HIPPOCRATESMolecular Dimensions Ltdn/a48 pojedynczych dodatków (związki lecznicze znalezione w MORPHEUS® III).
Inne materiały eksploatacyjne
96-dołkowa płyta MRC 2-kroplowaSwissciMRC 96T-UVPSitting-drop, płyta dyfuzyjna parowa. Zalecana pojemność zbiornika: 80  µL. Zakres użytecznych objętości kropli: 10-1000 nL. Przepuszczalny dla promieni UV.
48-dołkowa płytka MRC 1-kroplowa  ("Tabliczka MAXI")SzwajcariaMMX01-UVP Płyta dyfuzyjna do montażu w pozycji siedzącej do zwiększania skali/optymalizacji. Zalecana objętość zbiornika: 200  µL. Zakres użytecznych objętości kropel: 0,1-10 µL. Przepuszczalność UV.
Wisząca uszczelka kroplowa MRCSwisscin/aWisząca-kroplowa, kompatybilna z obiema płytami dyfuzyjnymi MRC (MRC 96T-UVP i MMX01-UVP). Przepuszczalne promieniowanie UV i rentgenowskie.
Taśma klejącaHampton ResearchHR4-50o szerokości 3 cali Duck® HD Clear™ do zgrzewania i ręcznego uszczelniania.
Samoprzylepna blacha aluminiowaBeckman Coulter538619Służy do ponownego uszczelniania sit dodatkowych.
Wkład atramentowyMarkem-Imaje9651System 1 (drukarka atramentowa).
Kartridż rozpuszczalnikowyMarkem-Imaje8652System 1 (drukarka atramentowa).
50 &mikro; L porady Hamilton235947System 2 (STAR & trade; maszyna do obsługi cieczy). Pudełko z 6 zestawami z 1920 x CO-RE™ końcówki w jednorazowych stosach.
Pojemnik na odczynnikHamilton194052Służy do dozowania warunku do płytki (płytek) podczas protokołów przesiewania dodatków. 
Płytka PCRThermo Scientific™AB-2150System 2 (zawiera białko do przeniesienia do Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 studnie w kształcie litery V.
mikrostrzykawkiTTP Labtech4150-03020Szpula 26 000 mikrostrzykawek do dozownika Mosquito® nanolitr (rozstaw 9mm).
blok uchwytu paskowegoTTP Labtech3019-05013Urządzenie SSB do pasków Mosquito®, znane również jako "4-kierunkowy uchwyt na odczynnik".
2 i mikro; L 8-dołkowy pasekTTP Labtech4150-03110Zawiera białko na pokładzie Mosquito®. Pudełko zawierające 40 pasków, maksymalna objętość w studzience wynosi 3,2 &mikrolitra.
5 & mikro; L 8-dołkowy pasekTTP Labtech4150-03100Zawiera białko na pokładzie Mosquito®. Pudełko z 40 paskami, maksymalna objętość w studni wynosi 7,5 &mikro;L.
Strzykawki 5 mlTTP Labtech4150-07100Korpus strzykawki i tłok do płynu Dragonfly®. Opakowanie 100 szt.
Koryta/zbiornikiTTP Labtech4150-07103Zawiera roztwory podstawowe na pokładzie Dragonfly®. Opakowanie 50 szt.
Wytrząsarka orbitalna do mikropłytekCamLab Limitedn/aVariomag® do mieszania warunków na jednej płytce (0-2000 obr./min).
Mieszalnik do mikropłytekTTP Labtech3121-01015MxOne. Warunki mieszania na jednej płytce z 96 kołkami wibracyjnymi.
Zestaw do krystalizacji krystalizacji Hampton Research krystalizacji krystalizacji krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research krystalizacji Hampton Research do krystalizacji Zestaw do krystalizacji Zestaw do krystalizacji do krystalizacji

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  2. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  3. Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  4. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).
  5. Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
  6. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
  7. Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
  8. Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
  9. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  10. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
  11. Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
  12. Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
  13. Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
  14. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
  15. Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
  16. Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
  17. Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
  18. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  19. DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
  20. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
  21. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).
  22. Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).
  23. Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
  24. Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
  25. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
  26. Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
  27. Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
  28. Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
  29. Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
  30. Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
  31. Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
  32. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
  33. Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
  34. Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
  35. McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
  36. Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
  37. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
  38. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
  39. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
  40. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
  41. Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
  42. Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
  43. Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
  45. Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dyfuzja parnanolitrowe kropelkiprzesiewanie krystalizacjiuszczelniacz p ytekrobot do obs ugi cieczydozowanie zestaw w MRCp ytki do krystalizacjidyfrakcja rentgenowska

Powiązane artykuły