Artykuł metodologiczny

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55792

⸱

20 września 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Streszczenie

Mikrotubule (MT) to dynamiczne i delikatne struktury, które są trudne do zobrazowania in vivo, szczególnie w zarodkach kręgowców. Opisano tutaj metody znakowania immunologicznego w celu analizy odrębnych populacji MT w rozwijającej się cewie nerwowej zarodka danio pręgowanego. Chociaż nacisk kładziony jest na tkankę nerwową, metodologia ta ma szerokie zastosowanie do innych tkanek. Procedury są zoptymalizowane dla zarodków we wczesnym i średnim stadium somitogenezy (od 1 somitu do 12 somitów), jednak można je dostosować do szeregu innych stadiów przy stosunkowo niewielkich korektach. Pierwszy protokół zawiera metodę oceny przestrzennego rozmieszczenia stabilnych i dynamicznych MT oraz przeprowadzenia analizy ilościowej tych populacji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Podejście to uzupełnia istniejące narzędzia do obrazowania dynamiki i dystrybucji mikrotubul w czasie rzeczywistym, przy użyciu linii transgenicznych lub przejściowej ekspresji oznakowanych konstruktów. Rzeczywiście, takie narzędzia są bardzo przydatne, jednak nie rozróżniają łatwo między dynamicznymi i stabilnymi MT. Możliwość obrazowania i analizowania tych odrębnych populacji mikrotubul ma ważne implikacje dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw polaryzacji i morfogenezy komórek. Drugi protokół przedstawia technikę analizy powstających MT. Osiąga się to poprzez uchwycenie właściwości wzrostu de novo MT w czasie, po depolimeryzacji mikrotubul z lekiem nocodazolem i okresie rekonwalescencji po wypłukaniu leku. Technika ta nie została jeszcze zastosowana do badania MT w zarodkach danio pręgowanego, ale jest cennym testem do badania funkcji in vivo białek zaangażowanych w tworzenie mikrotubul.

Wprowadzenie

Mikrotubule (MTs) to polimery α- i β-tubuliny, które łączą się w liniowe protofilamenty, z których kilka łączy się w pustą rurkę1,2. MT są spolaryzowanymi strukturami, z szybko rosnącymi końcami dodatnimi i wolno rosnącymi końcami ujemnymi, które są zakotwiczone w centrosomie lub innym centrum organizującym mikrotubule (MTOC)3. De novo Tworzenie MT jest inicjowane przez zarodkowanie w kompleksie pierścieniowym γ-tubulina (γ-TURC), który stanowi szablon dla MT assembly4. W każdej komórce można wyróżnić dwie populacje MT, które obracają się w różnym tempie. Dynamiczne MT badają swoje środowisko komórkowe, przełączając się między fazami wzrostu i kurczenia się w procesie znanym jako dynamiczna niestabilność5. W przeciwieństwie do dynamicznych MT, stabilne MT nie rosną i mają dłuższy okres półtrwania niż dynamiczne MTs6.

Dziesięciolecia badań nad biologią komórki dostarczyły wyrafinowanego zestawu narzędzi do badania struktury i funkcji MT i zaowocowały dużą ilością wiedzy na temat tych elementów cytoszkieletu. Na przykład MT odgrywają kluczową rolę w ustalaniu i utrzymywaniu polaryzacji komórek, co można przypisać nie tylko ich wewnętrznej polaryzacji, ale także zróżnicowanemu subkomórkowemu rozkładowi stabilnych i dynamicznych MTs7,8. W przeciwieństwie do tego, znacznie mniej wiadomo o architekturze i funkcji MT w bardziej złożonych środowiskach trójwymiarowych (3D), takich jak zarodek kręgowców, częściowo ze względu na wyzwanie związane z obrazowaniem cytoszkieletu MT w wysokiej rozdzielczości. Pomimo tego ograniczenia, najnowsza generacja linii transgenicznych wykazujących ekspresję GFP, które znakują MT lub przejściową ekspresję markerów MT znakowanych fluorescencyjnie, zwiększyła naszą wiedzę na temat dynamicznych zmian, jakie przechodzą MT oraz ich roli komórkowej i rozwojowej w zarodku danio pręgowanego. Cała sieć MT może być zobrazowana w liniach transgenicznych, w których tubulina jest albo bezpośrednio znakowana9, albo polimery tubuliny są pośrednio znakowane za pomocą białek związanych z MT Kinaza podobna do Doublecortin-like (Dclk) lub Ensconsin (EMTB)10,11. Wygenerowano inne linie (i konstrukcje), które umożliwiają ocenę wewnętrznej polaryzacji MT poprzez specyficzne oznaczanie końców MT plus lub końców ujemnych zakotwiczonych w centrosomach11,12,13,14. Siła tych narzędzi polega na możliwości badania dynamiki MT w żywych, rozwijających się organizmach. Badania te ujawniły na przykład przestrzenne i dynamiczne rozmieszczenie MT w określonych populacjach komórek, orientację wrzecion mitotycznych w tkankach ulegających morfogenezie (wskaźnik płaszczyzny podziału komórki), polarność polimeru MT w odniesieniu do procesów takich jak wydłużanie i migracja komórek oraz tempo wzrostu MT określone przez prędkość komety9, 13,15. Ograniczeniem tych narzędzi jest to, że nie pozwalają one łatwo na rozróżnienie między stabilnymi i dynamicznymi populacjami MT.

Czerpiąc z bogatej literatury z zakresu biologii komórki, opisano tutaj metody immunoznakowania do obrazowania stabilnych i dynamicznych MT w zarodku danio pręgowanego, które są komplementarne do stosowania linii transgenicznych. Powszechne stosowanie takich metod znakowania immunologicznego u danio pręgowanego było nieco utrudnione ze względu na trudności w zachowaniu integralności MT podczas procedury utrwalania. Protokół 1 przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego całkowitych, dynamicznych i stabilnych MT w przekrojach poprzecznych rozwijającego się tyłomózgowia danio pręgowanego. Ponadto opisano prostą metodę wykorzystującą komercyjnie dostępne oprogramowanie do ilościowego określania tych populacji MT. Stabilne MT różnią się od dynamicznych MT opartych na kilku potranslacyjnych modyfikacjach α-tubuliny, takich jak acetylacja i detyrozynacja, które gromadzą się na stabilnych MT w czasie16,17. W zarodku danio pręgowanego acetylacja zachodzi na rzęskach i aksonach MT, ale nie na stabilnych MT interfazowych18, co ogranicza przydatność tego markera do podzbioru ustabilizowanych MT. W przeciwieństwie do tego, detyrozynacja wydaje się zachodzić na wszystkich stabilnych MT w danio pręgowanym embryo18. Ta potranslacyjna modyfikacja odsłania karboksylowo-końcowy kwas glutaminowy α-tubuliny (tubulina zdetyrozynowana)18 i może być wykryty za pomocą anty-Glu-tubuliny19. Chociaż detyrozynacja zachodzi preferencyjnie na stabilnych MT, dowody eksperymentalne wskazują, że ta modyfikacja potranslacyjna jest raczej wynikiem, niż przyczyną stabilności MT16. Wzajemna populacja MT, składająca się z dynamicznych MT, jest rozróżniana za pomocą przeciwciała, anty-tubuliny, które specyficznie rozpoznaje tyrozynową formę α-tubuliny19. Po znakowaniu immunologicznym za pomocą tych markerów i obrazowaniu konfokalnym, można przeprowadzić analizę ilościową MT (długość, liczba i względna obfitość) w określonych obszarach rozwijającej się cewy nerwowej. W tym miejscu przedstawiono uproszczoną metodę przeprowadzania tej analizy przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D. Metoda ta może być stosowana w celu odpowiedzi na pytania dotyczące morfogenezy oraz ustalania lub dojrzewania polarności komórek20. Rzeczywiście, opracowanie spolaryzowanych układów stabilnych MT towarzyszy wielu zdarzeniom rozwojowym, w tym morfogenezie fotoreceptorów21, epitelializacji komórek w rozwijającej się cewce nerwowej18 i tworzeniu aksonów8.

Protokół 2 opisuje adaptację in vivo testu biologii komórki do analizy MT podczas ich fazy składania (zarodkowanie/zakotwiczenie i wzrost)22,23. Powstające MT są zarodkowane w centrosomie, a następnie zakotwiczone w subdystalnych przydatkach macierzystego centriole23. Opisano metodę analizy powstającego odrostu MT po depolimeryzacji. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat leczenia nokodazolem w celu depolimeryzacji MT, procedury wymywania leku i okresu rekonwalescencji po leczeniu. Ponowny wzrost MT jest monitorowany w regularnych odstępach czasu po wypłukaniu przez znakowanie immunologiczne za pomocą markerów całkowitej liczby MT (anty β-tubuliny) wraz z markerami dla centrosomu (anty γ-tubulina) i jądra (4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)), zgodnie z ogólnymi procedurami opisanymi w Protokole 1. Etap depolimeryzacji MT w tym protokole jest niezbędny, ponieważ umożliwia ocenę wzrostu MT de novo, a nie rozszerzenie wcześniej istniejących MT. Technika ta różni się zatem od innych opublikowanych procedur pomiaru szybkości wzrostu MT (przy braku depolimeryzacji) przy użyciu markera końcówki dodatniej, takiego jak białko wiążące koniec 3 połączone z białkiem zielonej fluorescencji (EB3-GFP), jak pokazano w Tran i wsp., 201211. Co więcej, test ten jest szczególnie przydatny do analizy zarodków wadliwych w składaniu de novo MT, takich jak wcześniej opisane mutanty NEDD1, w których rekrutacja γ-tubuliny do centrosomu jest upośledzona, co skutkuje niepełnym tworzeniem cewy nerwowej i wadami neuronów24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury opisane poniżej są zgodne z wytycznymi University of Maryland Baltimore County dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Analiza stabilnych i dynamicznych MT za pomocą znakowania immunologicznego (Protokół 1)

  1. Manualna dechorionacja zarodków przed utrwaleniem
    1. Uzyskać świeżo odrodki poprzez odlanie nadmiaru wody systemowej, a następnie zebranie pozostałych zarodków na plastikową szalkę Petriego (patrz Tabela Materiałów).
    2. Usuń wszelkie zanieczyszczenia z wody systemu i przenieś zarodki do nowego naczynia wypełnionego pożywką dla zarodków (patrz Tabela materiałów), aby upewnić się, że zarodki rozwijają się w czystym środowisku.
    3. Pozwolić zarodkom rozwinąć się do pożądanego etapu w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze 28,5 °C.
    4. Umieść zarodki młodsze niż 24 godziny po zapłodnieniu (hpf) w szklanym naczyniu przed dechorionacją.
      UWAGA: Dekorionate zarodki przed utrwaleniem, aby zmaksymalizować szybką penetrację utrwalacza i zachować integralność MT. Użyj pożywki dla zarodków zamiast wody systemowej, aby zapewnić dodatkowe Ca2+ wymagane podczas dechorionacji.
    5. Ręcznie usuń kosmówkę z zarodków na szalce Petriego, używając cienkich kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym.
      1. Ściśnij mały obszar w okrągłej, przezroczystej kosmówce, która otacza zarodek, za pomocą kleszczy i delikatnie rozsuń kleszcze, aby spowodować pęknięcie błony.
      2. Powiększ otwór, delikatnie podważając pękniętą kosmówkę za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie dotykać zarodka kleszczami, ponieważ może pęknąć.
  2. Utrwalanie zarodków w stadium
    1. Przenieś etapowe, zdekorionowane zarodki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Usunąć jak najwięcej pożywki z zarodków za pomocą szklanej pipety Pasteura.
      UWAGA: Wykonaj utrwalenie i leczenie farmakologiczne na młodych (w środkowej somitogenezie) zarodkach, przed utworzeniem ośrodków nerwowych pośredniczących w odczuwaniu bólu, które nie wymagają dodatkowej procedury w celu złagodzenia bólu podczas eutanazji. Etapy rozwojowe są zdefiniowane w Kimmel et al., 199525. Etapy somitu 4-5 i 11-12 zostały użyte do uzyskania obrazów dla Rysunki 2 i 3.
    2. Przygotować 4% utrwalacz buforu montażowego paraformaldehydu (PFA)/MT (MAB) (patrz Tabela materiałów), łącząc 1 ml 8% PFA na 1 ml 2X MAB i dodając 2 μl 100% Triton X-100 na 1 ml całkowitej objętości.
      UWAGA: Nosić rękawice podczas pracy z roztworami zawierającymi PFA i Triton X-100, które działają drażniąco na skórę.
    3. Utrwalić zarodki w 1 ml 4% utrwalacza PFA/MAB przez 5 minut w temperaturze 28,5 °C. Odessać utrwalacz za pomocą pipety, zastąpić go 1 ml świeżego utrwalacza i inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na bujaku.
      UWAGA: Próbki muszą być szybko ustabilizowane w ich temperaturze biologicznej (28,5 °C dla danio pręgowanego), aby zapobiec depolimeryzacji MT zależnej od temperatury.
  3. Odessać utrwalacz i dodać 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris z buforem NP40 (TBS-NP40). Delikatnie mieszaj przy RT na bujaku trzy razy przez 5 minut każdy. Przechowuj zarodki w temperaturze 4 °C w 1 ml świeżego 1X TBS-NP40 nie dłużej niż 7 dni.
    UWAGA: Podczas pracy z roztworami zawierającymi NP-40, substancję drażniącą skórę, należy nosić rękawice.
  4. Cięcie zarodków w celu znakowania immunologicznego
    1. Podgrzewać pożywkę RT 4% o niskiej temperaturze topnienia (LMP) agarozy w zamkniętym pojemniku, aż roztwór stanie się klarowny, za pomocą płyty grzejnej ustawionej na 50 °C umieszczonej w pobliżu mikroskopu preparacyjnego. Przechowywać pojemnik zamknięty między próbkami i podgrzewany przez cały proces zatapiania (etapy 1.4.4–1.4.6).
    2. Przenieść zarodki z probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml na szalkę Petriego za pomocą szklanej pipety i napełnić ją 1X TBS-NP40.
    3. Usuń duże komórki żółtka z zarodków w stadium somitogenezy (4-5 i 11-12 somitów) na szalce Petriego za pomocą cienkich kleszczy pod powiększeniem mikroskopu preparacyjnego26. Przytrzymaj zarodek za pączek ogonowy jedną parą kleszczy i oderwij komórki żółtka drugą parą, aby zachować tkankę tylnego mózgu. Przenieść pozbawione żółtek zarodki na obszar szalki Petriego wolny od resztek żółtka.
      UWAGA: Osadź zarodki w formie wypełnionej agarozą pojedynczo, aby zapobiec przedwczesnemu stwardnieniu agarozy LMP.
    4. Napełnić jedną studzienkę formy do cięcia o wymiarach 12 mm x 5 mm x 3 mm 200 μl stopionej agarozy LMP za pomocą mikropipety. Wykonaj kroki 1.4.5.-1.4.6. szybko (w ciągu 20 s od napełnienia formy) do osadzenia zarodka, zanim agaroza LMP ostygnie do RT i zestali się.
    5. Użyj cienkich kleszczyków, aby przenieść pozbawiony żółtka zarodek za pączek ogonowy z szalki Petriego do formy wypełnionej agarozą w kierunku jej zwężającego się końca pod mikroskopem preparacyjnym
      6. .
    6. Użyj cienkich kleszczy, aby zorientować zarodek w formie tak, aby wibratom ciął w pożądanej płaszczyźnie. Utwórz przekroje poprzeczne, ustawiając zarodek tak, aby tkanka tylnego mózgu przebiegała równolegle do długości formy, z powierzchnią grzbietową skierowaną w stronę krawędzi, a przednią powierzchnią skierowaną w stronę zwężającego się końca obszaru. Powtórzyć kroki 1.4.4-1.4.6 dla pozostałych zarodków.
    7. Pozostaw osadzoną agarozę do zestalenia się przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Wygeneruj 40 μm skrawki najwyższej osi zarodków osadzonych w agarozie (kroki 1.4.1-1.4.7) za pomocą wibratomu z naczyniem do cięcia wypełnionym 1x TBS-NP40. Przenieś interesujące Cię sekcje na 24-dołkową płytkę w 500 μl 1x TBS-NP40 za pomocą drobnych kleszczy. Umieść skrawki tylko jednego zarodka w każdym dołku.
      UWAGA: Więcej informacji można znaleźć w reference18. Upewnij się, że sekcje pozostają uwodnione przez cały czas w co najmniej 250 μl buforu i skalują się przy niskiej prędkości (10-25 obr./min) dla pozostałych etapów, aby zapobiec oddzieleniu się od osadzania agarozy. Detergenty obecne w roztworach blokujących i myjących powinny zmniejszać napięcie powierzchniowe ciekłego medium i umożliwiać zanurzenie sekcji. Sprawdź, czy sekcje pozostały w studzienkach podczas i po wszystkich manipulacjach. Zachowaj ostrożność, aby zapobiec przypadkowemu wyrzuceniu skrawków podczas prania.
  5. Usunąć bufor i dodać 500 μl roztworu blokującego. Kołysz się przez co najmniej 1 godzinę przy RT.
    UWAGA: Należy użyć roztworu blokującego, który zawiera 5% surowic od gatunków gospodarzy każdego przeciwciała drugorzędowego, które ma być użyte (patrz Tabela materiałów).
  6. Inkubować w 300 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w buforze blokującym przez 36-72 godzin w temperaturze 4 °C na kołysce. Prać dwukrotnie w 600 μL 1x TBS-NP40 na bujaku przez 30 minut każdy, w temperaturze RT.
    UWAGA: Sekcje podwójnie wymuszone przez inkubację w pierwszorzędowych przeciwciałach przeciwko całkowitej MT (anty β-tubulinie lub anty α-tubulinie) i stabilnym MT (anty-glutubulinie) lub dynamicznym MT (tubulinie anty-Tyr). Wybierz przeciwciała pierwszorzędowe, które zostały wyhodowane u różnych gatunków gospodarzy podczas podwójnego znakowania dla całkowitych i zmodyfikowanych potranslacyjnie populacji α-tubuliny. Patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń przeciwciał.
  7. Inkubować w 300 μl sprzężonych z fluoroforem przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w buforze blokującym na kołysce przez 16-24 godziny, w temperaturze 4 °C w ciemności. Prać dwukrotnie w 600 μL 1x TBS-NP40 na bujaku przez 30 minut każdy, w temperaturze RT.
    UWAGA: Naczynie wielodołkowe zawierające przeciwciało drugorzędowe należy owinąć folią od tego momentu i po każdej manipulacji, aby zapobiec wygaszaniu. Wybierz przeciwciała drugorzędowe, które reagują z immunoglobuliną gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego. Wybierz drugorzędowe fluorofory przeciwciał, które mają oddzielne, nienakładające się widma emisyjne. Patrz Tabela materiałów dla rozcieńczeń przeciwciał.
  8. Inkubować zarodki w 500 μl roztworu DAPI na kołysce przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Umyć trzy razy w TBS-NP40, kołysząc w temperaturze pokojowej przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Znakowanie jądrowe zapewnia kontekst komórkowy dla kwantyfikacji MT przeprowadzonej w kroku 1.12.
  9. Umieść kroplę medium montażowego ze środkiem zapobiegającym blaknięciu na środku bezpyłowego szkiełka. Użyj drobnych kleszczyków, aby przenieść sekcje do kropli medium montażowego. Umieść bezpyłowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki. Preparaty należy przechowywać w suchym, ciemnym i chłodnym miejscu, owinięte w folię, do czasu wykonania obrazowania.
    UWAGA: Okrążenie sekcji z tyłu szkiełka za pomocą markera permanentnego z cienką końcówką przed obrazowaniem pomoże zidentyfikować skrawki podczas korzystania z mikroskopu.
  10. Obrazowanie konfokalne
    1. Zamontuj sekcje na odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym, przymocowując szkiełko do stolika z szkiełkiem nakrywkowym skierowanym w stronę obiektywu. Określ odpowiednią optykę (ustawienia obiektywu, lasera i kanału, takie jak wzmocnienie i przesunięcie) na suwaku kontrolnym i utrzymuj je spójne między próbkami27. Unikaj przesycenia pikseli, aby zapobiec utracie danych.
    2. Przechwyć obrazy konfokalne stosów Z, korzystając z ustawień kanału dla wybranych drugorzędowych fluoroforów przeciwciał i zapisz pliki obrazów27. Zdobądź stosy Z dla każdej sekcji.
      UWAGA: Zreplikuj parametry używane do pozyskiwania obrazów w Rysunki 2 i 3, używając następujących ustawień akwizycji: mode = XYZ; powiększenie obiektywu = 63-krotna soczewka olejkowa; obiektywna apertura numeryczna = 1,4; Krok Z = 0,1 μm; Głębokość Z = 16,23 μm. Użyj następujących ustawień kanałów: wzbudzenie DAPI laserem o zasięgu 20% UV, zakres filtra emisyjnego = 430-480 nm, wzmocnienie fotopowielacza (PMT) = 525 V i przesunięcie PMT = -1.72%; wzbudzenie fluoroforu 448 nm (patrz tabela materiałów) laserem 20% 488 nm, zakres filtra emisyjnego = 493-573 nm, wzmocnienie PMT = 689 V i przesunięcie PMT = -0,2%; Wzbudzenie fluoroforu 594 nm laserem 32% 594 nm, zakres filtra emisyjnego = 608-706 nm, wzmocnienie PMT = 768 V i przesunięcie PMT = -6,8%.
    3. Zapisz surowe pliki danych z unikalnymi, opisowymi nazwami plików i utwórz kopię do edycji w oprogramowaniu do analizy obrazu.
  11. Kompilacja stosów Z w celu wyświetlenia maksymalnych projekcji
    1. Otwórz kopię pliku danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D w domenie publicznej (np. ImageJ). Sprawdź, czy każdy kanał jest wyświetlany jako indywidualna sekwencja obrazów (stosy Z).
    2. Podziel kanały obrazu, korzystając z następującej sekwencji menu: "Obrazy/Kolor/Podziel kanały".
    3. Utwórz scalony obraz, nakładając na siebie interesujące go kanały za pomocą następującej sekwencji menu: "Obrazy/Kolor/Scal kanały". Wybierz kanały 594 nm, 488 nm i DAPI, które mają być fałszywie pokolorowane odpowiednio na czerwono, zielono i niebiesko. Zaznacz "Utwórz kompozyt" i wybierz "OK"28.
      UWAGA: Pomiń kanał DAPI, aby lepiej przekazać szczegóły specyficzne dla MT w maksymalnej projekcji, jak w Rysunek 2 i 3, wybierając tylko fałszywe kolory dla pozostałych dwóch kanałów.
    4. Zbadaj scalony stos Z i zanotuj początkową i końcową pozycję najlepszych wewnętrznych płaszczyzn Z dla wszystkich widocznych kanałów. Odrzuć zewnętrzne płaszczyzny Z, które zwykle mają nieoptymalny sygnał ze względu na nierówne powierzchnie sekcji. Szczegółowe informacje można znaleźć w pliku reference29.
    5. Zwizualizuj scalony stos Z jako pojedynczy obraz 2D, wykonując projekcję maksymalnej intensywności stosu Z, korzystając z następującej sekwencji menu analizy obrazu 3D: "Obrazy/Stos/Projekt Z". Wprowadź pozycję początkową i końcową najlepszych wewnętrznych płaszczyzn Z z kroku 1.11.3 jako "Wycinek początkowy" i "Plasterek końcowy", " odpowiednio. Wybierz "Maksymalna intensywność" jako typ projekcji i kliknij "OK". Więcej informacji można znaleźć w pliku reference28.
  12. Analiza etykietowania MT
    1. Otwórz komercyjne oprogramowanie do analizy obrazów 3D. Wybierz opcję "Utwórz bibliotekę" i podaj opisową nazwę biblioteki obrazów. Kliknij "Utwórz". Przeciągnij do biblioteki surowe pliki obrazów wygenerowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Większe pliki wymagają więcej czasu na przesłanie.
    2. Wybierz plik do analizy. Wybierz "Rozszerzona ostrość" z menu "widok", aby wyświetlić obraz scalony z kanałami w oknie głównym.
    3. Dostosuj progowanie, przeciągając suwak dla każdego kanału w lewo lub w prawo, aż sygnał tła zostanie zredukowany, a prawdziwy sygnał będzie solidny. Obserwuj, że każdy kanał pokazuje prawdziwy sygnał dla znakowanej cząsteczki (np. kanał DAPI pokazujący podłużne lub mitotyczne jądra, ale nie autofluorescencję z cytoplazmy lub agarozy).
    4. Wybierz narzędzie "Odręczny obszar zainteresowania (ROI)" i nakreśl obszar zainteresowania, który ma zostać przeanalizowany. Wybierz zakładkę "Akcje", a następnie "Przytnij do zaznaczenia", aby przyciąć obraz. Zapisz przycięty plik obrazu pod nową nazwą. Kliknij zakładkę "Pomiary", aby utworzyć protokół do filtrowania określonych obiektów istotnych dla analizy 3D.
    5. Przeciągnij "Znajdź obiekty" do okna protokołu. Zmień nazwę pierwszego protokołu na "DAPI". Wybierz kanał DAPI z menu rozwijanego. Przeciągnij następujące ustawienia do protokołu DAPI i umieść je poniżej "Znajdź obiekty" w następującej kolejności (Tabela 1): "Wypełnij otwory w obiektach"; "Oddzielne przedmioty stykające się"; "Wyklucz obiekty według rozmiaru"; "Wyklucz niedotykanie ROI".
      UWAGA: Celem ustawień w Tabeli 1 jest najpierw ustawienie progu, który odrzuca sygnały, których rozkład i rozmiar są niezgodne z rozmiarem analizowanych obiektów. Na przykład, podczas liczenia jąder wyeliminuj sygnał, który nie jest wystarczająco duży, aby być jądrem.
    6. Wykonaj sekwencję (krok 1.12.9), aby zmontować pozostałe filtry dla β-tubuliny i innych markerów, korzystając z ustawień w Tabeli 1.
    7. Wybierz "Zmierz" u dołu każdego protokołu. Wybierz "Pomiar intensywności i objętości" oraz "Długość szkieletu" dla wszystkich etykiet tubuliny, ale tylko dla sygnału DAPI.
    8. Narysuj ROI wokół obszaru, który ma być mierzony. Obserwuj pomiary w zakładce "Podsumowanie" po tym, jak oprogramowanie przetworzy region. Skopiuj dane i zapisz je w działającym arkuszu kalkulacyjnym, jak w Tabeli 2. Utwórz kopię zapasową arkusza kalkulacyjnego do późniejszej analizy.
    9. Wybierz interesujące Cię pomiary (na przykład długość wiązki MT, liczba wiązek MT/jądra, ujawnionych za pomocą różnych markerów) w arkuszu kalkulacyjnym i przeanalizuj, aby określić średnie dla każdej grupy.
      UWAGA: Średnia długość pęczka MT = suma "średniej długości szkieletu dla β-tubuliny" dla każdego zarodka podzielona przez całkowitą liczbę zarodków. Patrz wiersz 20 tabeli 2. Sformatuj arkusz kalkulacyjny tak, aby zmienne i grupy eksperymentalne były łatwo przedstawiane na wykresach.

2. Test montażowy De Novo MT (Protokół 2)

  1. Skonstruuj i przetestuj wielostudzienkowy aparat przepływowy (Rysunek 1) 2 dni przed eksperymentem.
    UWAGA: Aparatura umożliwia jednoczesne wymywanie wielu grup doświadczalnych po leczeniu nokodazolem przy użyciu materiałów z Tabeli Materiałów. Uszczelniacz silikonowy wymaga co najmniej 24 godzin schnięcia, zanim nie będzie stanowił zagrożenia toksyczności dla zarodków.
    1. Podziel probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na pół wzdłuż za pomocą przyrządówki lub piły taśmowej.
    2. Wytnij 7 półokręgów o promieniu 3 cm z siatki nylonowej o grubości 70 μm i przytnij je tak, aby ściśle pasowały do jednej połowy dzielonej probówki wirówkowej. Przyklej półkola do probówki wirówkowej równolegle do oznaczeń gradacji 10 ml za pomocą bezpiecznego dla akwarium uszczelniacza silikonowego. Pozostaw urządzenie do wyschnięcia na 2 dni i spłucz, mocząc je w zlewce z wodą przez 2-3 godziny.
    3. Wyłóż górny (gwintowany) koniec przeciętej rurki wirówkowej plasteliną tak, aby wysokość cieczy zatrzymanej w urządzeniu przepływowym miała głębokość 1/4 cala (Rysunek 1, widoki 2 i 3).
    4. Przygotuj aparat do wymłukiwania, wyjmując tłok ze strzykawki o pojemności 50 ml i wkładając 12 cali cienkiej rurki do końcówki. Wciśnij rurkę tak daleko, jak to możliwe i uszczelnij wokół złącza za pomocą plasteliny.
    5. Wstępnie zwilż siatkę za pomocą pożywki dla zarodków, aby płyn mógł przepływać przez całe urządzenie przepływowe. Ustaw urządzenie pod kątem na lodzie tak, aby płyn gromadził się we wszystkich komorach, ale nadal opróżniał się z przodu, gdzie znajduje się gliniana obręcz. Za pomocą stojaka pierścieniowego zawieś urządzenie do wymywania nad urządzeniem przepływowym na lodzie ( Rysunek 1).
    6. Schłodzić 200 ml pożywki dla zarodków na lodzie i wlać tyle do aparatu do wymłukiwania, aby upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte i że natężenie przepływu wynosi około 7 ml/min. Wyreguluj natężenie przepływu, zmieniając wysokość strzykawki.
  2. Zarodki detaklimatycznie dechorionate
    1. Przygotować roztwór roboczy nieswoistej proteazy, rozcieńczając 1 ml 10 mg/ml nieswoistej proteazy w 20 ml pożywki zarodkowej.
    2. Przeprowadzić dechorionację chemiczną na zarodkach na 1 godzinę przed momentem, w którym spodziewane jest osiągnięcie pożądanego etapu rozwoju. Trawienie kosmówki poprzez usunięcie pożywki zarodkowej ze 100 mm szalek Petriego zawierających zarodki w stadium zaawansowania i dodanie 20 ml niespecyficznego roztworu roboczego proteazy.
    3. Inkubować zarodki w temperaturze 37 °C przez 5 min.
      UWAGA: Nie należy przekraczać 5 minut ani stosować wyższego stężenia nieswoistego roztworu proteazy, ponieważ spowoduje to rozpadnięcie się zarodków po leczeniu nokodazolem.
    4. Szybko odpipetować niespecyficzną proteazę i ponownie napełnić szalki około 25 ml pożywki zarodkowej. Powtórz raz.
    5. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 1 ml przenieś zarodki o wielkości mniejszej niż 24 hpf do szklanych naczyń, aby chronić je przed uszkodzeniem.
    6. Zakończ dechorionację, ręcznie usuwając kosmówkę za pomocą pary cienkich kleszczy, jak opisano w kroku 1.1.5.
    7. Umieścić szklane szalki Petriego zawierające zarodki z odkorzówką w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C na co najmniej 30 minut, aż osiągną pożądane stadium rozwoju.
  3. Depolimeryzacja istniejących MT
    1. Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 5 μg/ml nokodazolu, łącząc 50 μl 1 mg/ml nokodazolu z 10 ml lodowatego podłoża dla zarodków.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z nokodazolem, który działa drażniąco na skórę, należy używać rękawiczek.
    2. Wymienić pożywkę zarodkową w grupie leczonej nokodazolem na 10 ml zimnego roztworu roboczego nokodazolu. Umieść szalki Petriego na lodzie na czas odpowiedni dla etapu rozwoju (na przykład 1 godzina dla 4-5 zarodków somitu). Odłożyć nieleczone zarodki kontrolne na szalkę Petriego na lodzie w celu utrwalenia wraz z próbkami wymywania w kroku 2.3.4.1.
    3. Przenieść zarodki za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety o pojemności 1 ml do aparatu przepływowego, używając oddzielnych komór dla każdej grupy doświadczalnej. Wymywanie nokodazolu należy rozpocząć od wlania lodowatego podłoża z zarodków do górnej części strzykawki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Należy użyć co najmniej 30 zarodków w grupie doświadczalnej. Grupy eksperymentalne mogą składać się z zarodków kontrolnych lub różnych zarodków z morfoliną lub zarodkami wstrzykniętymi do RNA. Wymywanie będzie wymagało w sumie około 150 ml pożywki dla zarodków, którą należy dodawać co 8-10 minut. Wypłukać nokodazol, kontynuując hamowanie wzrostu MT za pomocą lodu. Utrzymanie zarodków na lodzie ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia tego testu, ponieważ MT są niestabilne w niskich temperaturach, a zimno opóźnia rozwój we wczesnych zarodkach.
    4. Pozwolić MT odrosnąć po 20 minutach wymywania w temperaturze pokojowej, przenosząc zarodki na szklane szalki Petriego zawierające ciepłą (28,5 °C) pożywkę dla zarodków za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety o pojemności 1 ml. Jak tylko zarodki zostaną przeniesione, uruchom minutnik.
      1. Utrwalić kontrolę i wypłukanie zarodków po 1 minutach, 5 minutach i 10 minutach, pipetując około 10 zarodków do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 1 ml 4% PFA/MAB fix (28,5 °C) i postępując zgodnie ze wskazówkami w kroku 1.2.3.
  4. Przygotować próbki do znakowania immunologicznego zgodnie z opisem w punktach 1.3-1.5.
  5. Znakowane immunologicznie pływające skrawki i obrazowane zarodki zgodnie z opisem w punktach 1.6-1.10 z następującymi zmianami w specyfikacji przeciwciał pierwszorzędowych: użyć anty-γ-tubuliny królika w skali 1:500 i mysiej anty β tubuliny w skali 1:200
    6. .
  6. Przetwarzaj i analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D, zgodnie z opisem w kroku 1.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza stabilnych i dynamicznych MT za pomocą immunoznakowania
W Protokole 1, wykorzystując Glu-tubulinę i Tyr-tubulinę jako markery odpowiednio stabilnych i dynamicznych MT, wykazano rozkład subpopulacji MT podczas wczesnych (stadium grzebienia neuronalnego) i późnych (stadium pręta neuronalnego) etapów rozwoju rurki neuralnej. Dynamiczne MT przeważają w rombencephalonie w stadium grzebienia neuronalnego (4-5 somity) (Rycina 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie istnieje wiele metod obrazowania dynamiki MT we wczesnym rozwoju danio pręgowanego, począwszy od obrazowania na żywo oznakowanych cząsteczek, a skończywszy na znakowaniu immunologicznym utrwalonej tkanki 11,12,13,14. Chociaż MT w pojedynczej komórce mogą istnieć w stanie dynamicznym lub stabilnym, epitelializacja jest procesem, w którym MT są stopniowo stabilizowane w czasie. Użycie mar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Mikroskop konfokalny został zakupiony dzięki funduszom z U.S. National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. Badania były wspierane przez U.S. National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) grant #GM085290 oraz grant Departamentu Obrony USA (DOD) #W81XWH-16-1-0466 przyznany R.M. Brewsterowi. E. Vital otrzymał grant dla UMBC z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach programu edukacji przedszkolnej i licencjackiej w zakresie nauk ścisłych, grant #52008090. S.P. Brown był wspierany przez stypendium GAANN Departamentu Edukacji Stanów Zjednoczonych, stypendium Meyerhoff Graduate Fellowship ufundowane przez #GM055036 grantu NIH/NIGMS oraz asystenturę badawczą ufundowaną przez grant Departamentu Edukacji Stanów Zjednoczonych #W81XWH-16-1-0466.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaStosowana w leczeniu pestek.   Przygotować 1% agarozy
przez podgrzanie roztworu  1 gram agarozy na 100 ml 1X pożywka dla zarodków w kuchence mikrofalowej
aż do polimeryzacji. 
KpipesSigmaP7643
NaClSigmaS7653
Tris-HClSigmaT3253-500G
KClSigmaP9333-500G
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
NP-40Amerykańskie bioanalityczneAB01424
EGTASigmaE3889-25G
MgCl2SigmaM2670-500G
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)FisherBP1605
Triton-xAmerican BioanalyticalsAB02025
Montaż Anti-Fade mediumInvitrogenP10144
Mysia anty-β-tubulinaBadania rozwojowe Hybridoma BankE71/200
Królicza anty-γ-tubulinaGenetexGTX1132861/500
Królicza anty-&alfa;-tubulinaGenetexGTX1087841/1000*
Królicza tubulina anty-detyrozynowanaMilliporeAB32011/200-1/1000*  Miareczkować przeciwciała przy pierwszym użyciu nowej partii.
Królik anty-tyrozynowana-tubulinaMilliporeABT1711/500
Mysz anty-centrinMillipore04-16241/1000
Koza 488 anty-królikThermofisherA110081/500
Koza 594 anty-królikThermofisherA110121/500
Koza 594 anty-myszThermofisherA110051/500
Koza 488 przeciw myszomThermofisherA110011/500
VibratomeVibratome1500
KleszczeWorld Precision Instruments555227F
Szalka Petriego 100 mmCell treat229693
szalka Petriego 35 mmCell treat229638
50 ml rurka sokołaFisher14-432-22
Siatka nylonowa tkana 70 umAmazon.comB0043D1SZG 
MikropipetaGilsonF123602
Szklana pipetaFisherNC-999363-9
Uszczelniacz akwariowyAmazon.com, firmy MarineLandSilicone Sealer 1 uncja (tuba) 
Stojak na pierścionkiFisher14-675BO
Microbore PTFE Rurka, 0,022"IDCole-ParmerWU-06417-21
ModelinaAmazon.comSargent Art 22-4000Wystarczy dowolna nietoksyczna modelina na bazie wosku lub oleju
ClampFisher02-215-466
Strzykawka 60mlFisher14-820-11
Pożywka dla zarodków (E3)34,8 g NaCl
1,6 g KCl
5,8 g CaCl2· 2H2O
9,78 g MgCl2· 6H2O

Aby przygotować 60-krotny bulion, rozpuść składniki w H2O do końcowej objętości 2 l. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH. Autoklaw. Aby przygotować pożywkę 1X, rozcieńczyć 16,5 ml bulionu 60X do 1 l. 
Roztwórblokujący 50 ml TBS-NP-40
2,5 ml normalna surowica kozia
1 g BSA
625 &mikro; l Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7,6)155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0,1% NP-40
2x MAB (pH6,4)160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Komercyjne oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3DPerkinElmerVolocity (V 6.2)
Suchy grzejnik blokowy VWR12621-108Używany jako płyta grzejna do topienia agarozy w Protokole 1.
Mikroskop preparacyjnyLeicaMZ12
LeicaSP5
Płaska forma do zatapianiaemsdiasum.comBEEM 70904-01
Oprogramowanie do przetwarzania obrazów w domenie publicznejNIHImageJ (V 1.5)
* Sukces różni się w zależności od numeru partii
Mikroskop konfokalny

Bibliografia

  1. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
  2. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Kaverina, I., Straube, A. Regulation of cell migration by dynamic microtubules. Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).
  4. Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).
  5. Howard, J., Hyman, A. A. Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).
  6. Schulze, E., Kirschner, M. Dynamic and stable populations of microtubules in cells. J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).
  7. Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 38 (3), 779-789 (1984).
  8. Li, R., Gundersen, G. G. Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).
  9. Asakawa, K., Kawakami, K. A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).
  10. Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos. Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).
  11. Tran, L. D., Hino, H., et al. Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish. Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).
  12. Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia. Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).
  13. Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish. J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).
  14. Andersen, E. F., Halloran, M. C. Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity. Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).
  15. Lee, S. -J. Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly. Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).
  16. Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).
  17. Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).
  18. Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation. Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).
  19. Westermann, S., Weber, K. Post-translational modifications regulate microtubule function. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).
  20. Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube. Neural Develop. 11, 1(2016).
  21. Nam, S. -C. Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis. Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).
  22. Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. Microtubule release from the centrosome in migrating cells. J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).
  23. Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).
  24. Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development. Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development. JoVE J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  27. FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).
  28. Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2010).
  29. Z-functions - ImageJ. , Available from: https://imagej.net/Z-functions (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza mikrotubulmikrotubule stabilnemikrotubule dynamicznewyp ukiwanie nocodazoluobrazowanie konfokalneanaliza w programie ImageJmarkery tubuliny

Powiązane artykuły