Artykuł metodologiczny

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

21 lipca 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo

.

Streszczenie

Pojawienie się wysokiej jakości linii mikrofokusowych w wielu obiektach synchrotronowych umożliwiło rutynową analizę kryształów mniejszych niż 10 μm w ich największym wymiarze, co kiedyś stanowiło wyzwanie. Przedstawiamy dwa alternatywne procesy oznaczania struktury mikrokryształów białek za pomocą krystalografii rentgenowskiej, ze szczególnym uwzględnieniem kryształów hodowanych in vivo. Mikrokryształy są ekstrahowane z komórek za pomocą sonikacji i oczyszczane przez wirowanie różnicowe lub analizowane w celulo po sortowaniu komórek za pomocą cytometrii przepływowej komórek zawierających kryształy. Opcjonalnie oczyszczone kryształy lub komórki zawierające kryształy są moczone w roztworach ciężkich atomów w celu fazowania eksperymentalnego. Próbki te są następnie przygotowywane do eksperymentów dyfrakcyjnych w podobny sposób poprzez nałożenie na podłoże z mikrosiatki i błyskawiczne chłodzenie w ciekłym azocie. Pokrótce opisujemy i porównujemy seryjne eksperymenty dyfrakcyjne izolowanych mikrokryształów i komórek zawierających kryształy przy użyciu synchrotronowej linii badawczej z mikroogniskowaniem w celu uzyskania zestawów danych odpowiednich do fazowania, budowania modelu i udoskonalania.

Te przepływy pracy są zilustrowane kryształami polihedryny Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) powstałymi w wyniku zakażenia komórek owadów rekombinowanym bakulowirusem. W tym studium przypadku analiza w celulo jest bardziej wydajna niż analiza oczyszczonych kryształów i daje strukturę w ciągu ~8 dni od ekspresji do uszlachetnienia.

Wprowadzenie

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej do określania struktur makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości przez ostatnie dwie dekady stale się rozwijało. Rosnące zainteresowanie krystalografią rentgenowską przez badaczy niebędących ekspertami jest przykładem demokratyzacji tego podejścia w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych1.

Historycznie rzecz biorąc, kryształy o wymiarach poniżej ~10 μm były uważane za trudne, jeśli nie bezużyteczne, do określenia struktury. Rosnąca na całym świecie dostępność dedykowanych linii mikrofokusowych do źródeł promieniowania synchrotronowego oraz postęp technologiczny, taki jak rozwój narzędzi do manipulowania mikrokryształami, usunęły wiele z tych barier, które utrudniały szerokie zastosowanie mikrokrystalografii rentgenowskiej. Postępy w seryjnej mikrokrystalografii rentgenowskiej2,3 i mikro dyfrakcja elektronów4 pokazały, że wykorzystanie mikro- i nanokryształów do określania struktury jest nie tylko wykonalne, ale czasami nawet lepsze niż użycie dużych kryształów5,6,7.

Te postępy zostały po raz pierwszy zastosowane do badania peptydów8 i naturalnych kryształów wytwarzanych przez wirusy owadów9,10. Są one obecnie używane w różnych makrocząsteczkach biologicznych, w tym w najtrudniejszych systemach, takich jak białka błonowe i duże kompleksy11. Aby ułatwić analizę tych mikrokryształów, zostały one przeanalizowane w mezo, w szczególności w białkach błonowych12 oraz w mikrofluidyce chips13.

Dostępność tych nowatorskich metodologii mikrokrystalografii zwiększyła możliwość wykorzystania krystalizacji in vivo jako nowej drogi dla biologii strukturalnej14,15,16 oferując alternatywę dla klasycznej krystalogenezy in vitro. Niestety, nawet jeśli kryształy in vivo mogą być wyprodukowane, pozostaje kilka przeszkód, takich jak degradacja lub utrata ligandów podczas oczyszczania z komórek, trudności w manipulacji i wizualizacji kryształów na linii synchrotronowej oraz żmudne eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej. Alternatywnie, kryształy zostały również przeanalizowane bezpośrednio w komórce, bez żadnego etapu oczyszczania17,18,19. Analiza porównawcza sugeruje, że takie podejścia w celulo mogą być bardziej efektywne niż analiza oczyszczonych kryształów i dawać dane o wyższej rozdzielczości20.

Ten protokół ma na celu pomóc badaczom nowym w mikrokrystalografii białek. Dostarcza metodologii koncentrujących się na przygotowaniu próbek i manipulacji nimi do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej na linii synchrotronowej. Zaproponowano dwie opcje z wykorzystaniem izolowanych kryształów do klasycznej mikrokrystalografii lub komórek zawierających kryształy posortowanych za pomocą cytometrii przepływowej do analizy w celulo (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Krystalizacja in vivo była raportowana u wielu organizmów, w tym u bakterii, drożdży, roślin, owadów i ssaków (przegląd w referencji 21). Krystalizację białek rekombinowanych osiągnięto również w laboratorium, wykorzystując przejściową transfekcję komórek ssaków oraz infekcję komórek owadzich bakulowirusami. Poniższy protokół opracowano z wykorzystaniem genu poliedryny wirusa poliedrycznego 1 Bombyx mori (BmCPV1), sklonowanego w rekombinowanym bakulowirusie pod promotorem poliedryny bakulowirusa, zgodnie z instrukcjami w referencji 22. W związku z tym, choć protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek (np. komórek ssaków), opisujemy tutaj procedury dla komórek owadzie. Protokół zakłada, że nadekspresja białka zainteresowania została już osiągnięta. Metody produkcji rekombinowanego bakulowirusa i jego wykorzystania do ekspresji białka zainteresowania są dostępne w referencjach 23,24,25,26,27.

1. Identyfikacja komórek zawierających kryształy

  1. Jeśli komórki są hodowane w monowarstwie, należy bezpośrednio sprawdzić je w kolbie. Jeśli komórki są hodowane w kulturze płynnej, należy zastosować poniższy protokół.
    1. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść 500 µL komórek do probówki do mikrowirówki. Należy zadbać o zachowanie sterylności głównej kultury; komórki należy obsługiwać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, stosując standardowe techniki aseptyczne.
    2. Nabrać pipetą 5 µL komórek z probówki do mikrowirówki i nanieść na szkiełko przedmiotowe.
    3. Ostrożnie położyć szkiełko nakrywkę na cieczy, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Jeśli wizualizacja preparatu ma potrwać powyżej 15 min, należy uszczelnić szkiełko nakrywkę smarem próżniowym, aby zapobiec parowaniu.
  2. Wykonać obrazowanie kolby lub szkiełka za pomocą mikroskopu odwróconego. Jeśli jest dostępne, należy zastosować mikroskopię kontrastową fazową i/lub mikroskopię kontrastową różnicową (DIC). Obie techniki zwiększają kontrast w przezroczystych próbkach i podkreślają linie oraz krawędzie, co ułatwia identyfikację kryształów in vivo.
  3. Dokładnie zbadać komórki. Rozpocząć przy powiększeniu 200X i zwiększyć powiększenie do maksymalnego po wykryciu potencjalnego kryształu. Obecność kryształów może być sugerowana pośrednio przez zmiany w morfologii komórek (Rysunek 2). Należy szukać ostrych krawędzi i zmian w refrakcyjności (w przypadku stosowania kontrastu fazowego lub DIC). Znane kryształy in vivo przyjmują różne kształty, w tym pręciki, stosy igieł, sześciany, piramidy i wielościany (patrz Rysunek 2 oraz Tabela 1 w celu zapoznania się z przykładami).
    Uwaga: Proporcja komórek zawierających kryształy będzie różna w każdym przypadku i może się różnić nawet między preparatami, jednak ogólnie nie należy spodziewać się znalezienia kryształów we wszystkich komórkach. Podobnie liczba kryształów na komórkę jest zmienna (patrz Tabela 1), a w jednej komórce może znajdować się więcej niż jeden kryształ. Czynniki te należy w możliwościach zoptymalizować poprzez dostosowanie wielokrotności infekcji, zmianę czasu ekspresji oraz modyfikację konstruktu białkowego. Z jednej strony warunki ekspresji białka i wzrostu komórek, które maksymalizują liczbę komórek zawierających kryształy, poprawią wydajność (np. wyższa wielokrotność infekcji i późne zbieranie kultury komórkowej). Z drugiej strony warunki, w których komórki zawierają pojedynczy kryształ, ułatwiają gromadzenie danych (np. niska wielokrotność infekcji). Biorąc pod uwagę wzbogacenie uzyskane dzięki sortowaniu przepływowemu opisanemu w kroku 2.2, zalecamy dążenie do uzyskania większych kryształów (np. pojedynczego kryształu na komórkę), nawet jeśli proporcja komórek zawierających kryształy jest niska.
  4. W przypadku zidentyfikowania kryształów należy zapisać ich położenie (podczas obrazowania monowarstwy w kolbie) i oszacować procent komórek zawierających kryształy. Jeśli jest dostępny, należy użyć mikroskopu wyposażonego w kamerę zdolną do śledzenia zmian na poziomie pojedynczej komórki.
  5. Dla komórek w zawiesinie należy określić stopień żywotności komórek zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w referencji 28. Dla komórek hodowanych w monowarstwie należy oszacować poprzez inspekcję wizualną przybliżony stopień konfluencji oraz ilość odseparowanych komórek.
  6. Monitorować wzrost kryształów, wzrost komórek oraz ich żywotność dwa razy dziennie.
  7. Zebrać komórki natychmiast po tym, jak wzrost kryształów wyda się zatrzymany. W przypadku wyjątkowo trwałych kryształów, takich jak wirusowe wielościany, przedłużony czas inkubacji (>4 dni) zwiększa liczbę dużych kryształów. Jednak w przypadku typowych kryształów białkowych zalecamy zbieranie komórek, gdy żywotność spadnie poniżej 80%, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym lizą komórek.
  8. Wyjąć kolbę z inkubatora i jak najszybciej przejść do kroku 2.2. Przechowywać komórki w lodzie podczas kolejnych etapów, chyba że wskazano inaczej.

2. Oczyszczanie próbek

Uwaga: Opisujemy dwie metody analizy kryształów in vivo – odpowiednio z kryształów oczyszczonych oraz in cellulo.

  1. Oczyszczanie kryształów
    Uwaga: O ile nie istnieją dowody na to, że interesujące nas kryształy są wrażliwe na niską temperaturę, należy pracować na lodzie i stosować schłodzone bufory, aby zapobiec degradacji kryształów.
    1. Odpipetować 50 ml zainfekowanych komórek Sf9 do 50-mililitrowej stożkowatej probówki do wirowania. Odpowiada to ok. 4 x 108 komórki w typowym eksperymencie.
    2. Wirować komórki przy 450 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzuć supernatant i resuspenduj pellet w 40 ml schłodzonego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) o pH 7,4.
      Uwaga: PBS jest proponowany jako punkt wyjścia do oczyszczania jako standardowy bufor izotoniczny, z celem odtworzenia środowiska komórkowego, w którym rosły kryształy in vivo. Był on stosowany w większości in vivo kryształy hodowane w kulturach komórkowych do chwili obecnej9,14,29Alternatywnie, do oczyszczania stosowano z powodzeniem również pożywkę DMEM. in vivo kryształy z komórek ssaków 19Jeśli kryształy wykazują widoczne uszkodzenia po przeniesieniu do PBS lub dają słabą dyfrakcję, parametr ten należy zbadać jako potencjalne źródło degradacji.
    4. Poddaj resuspendowany osad sonikacji przez 30 s przy natężeniu 10 mA, używając sonikatora wyposażonego w sondę o średnicy 19 mm. Aby zapobiec przegrzaniu próbki, podczas sonikacji umieść ją w zlewce wypełnionej lodem. W przypadku stwierdzenia uszkodzenia kryształów w wyniku sonikacji (zgodnie z oceną w kroku 2.1.7), można zastosować alternatywnie chemiczną lub mechaniczną lizę komórek.
    5. Wirować przy 450 x g przez 10 min w temperaturze 4 °CPo wirowaniu widoczne są dwie warstwy: górna warstwa resztek komórkowych o bladobrązowym kolorze oraz dolny osad kryształów poliedryny, który jest biały i kredowy.
    6. Odrzucić supernatant i usunąć górną warstwę, ostrożnie odpipetowując ją. Przesuspender dolny osad w 40 ml schłodzonego PBS.
    7. Ocenić jakość próbek za pomocą obrazowania pod mikroskopem świetlnym.
      1. Pipeta 5 µL komórek lub oczyszczonych kryształów na szkiełko przedmiotowe. Można to przeprowadzić w temperaturze pokojowej.
      2. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywki na ciecz, unikając powstania pęcherzyków powietrza.
      3. Wykonaj obrazowanie preparatu za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 200x. Obrazowanie próbki należy przeprowadzić w ciągu 15 minut od jej przygotowania na szkiełku. Jeśli wizualizacja preparatu nie będzie możliwa w ciągu 15 minut, należy uszczelnić szkiełko nakrywkę smarem próżniowym, aby zapobiec odparowaniu.
        UWAGA: W przypadku wielościanów kryształy będą widoczne jako dwójłomne sześciany o rozmiarze ~1– 10 µm na stronę. Sprawdź integralność kryształów, szukając oznak utraty ostrości (np. zaokrąglone krawędzie), pęknięcia lub lizę. Należy również monitorować obecność szczątków komórkowych, które będą widoczne jako skupiska oraz obiekty o nieregularnych rozmiarach i kształtach.
    8. Powtórz kroki od 2.1.5 do 2.1.7, zmniejszając o połowę objętość PBS używanego do resuspensji osadu w każdym cyklu, aż kryształy będą wolne od zanieczyszczeń. Resuspenduj końcowy osad w 1 ml schłodzonego PBS i przenieś kryształy do probówki do mikrocentryfugi. Przechowuj oczyszczone kryształy w 4 °C.
    9. Oszacuj stężenie kryształów, używając komory licznikowej (hemocytometru) zgodnie z instrukcją producenta. Odliczaj kryształy w taki sam sposób, w jaki odlicza się komórki.

figure-protocol-1
Rysunek 3: Oczyszczone mikrokryształy In Vivo. Reprezentatywne oczyszczanie kryształów poliedryny BmCPV1 z komórek owadziech Sf9, przedstawiające (a) osad z debris komórkowych i kryształów po sonikacji oraz (b) powiększenie warstw debris i kryształów. Warstwę debris można ostrożnie resuspenderować w supernatancie i usunąć, aby przyspieszyć oczyszczanie kryształów. (c) Obraz z mikroskopii optycznej oczyszczonych poliedrów. Pasek skali = 50 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Izolacja komórek zawierających kryształy przy użyciu cytometrii przepływowej
    Uwaga: Aby ułatwić definiowanie bramkowania w cytometrii przepływowej, zaleca się równoległe prowadzenie hodowli kontrolnej oraz hodowli wykazującej ekspresję białka docelowego. Można to osiągnąć poprzez zainfekowanie kolby komórek Sf9 nieistotnym rekombinowanym bakulowirusem lub poprzez przygotowanie komórek poddanych pozornej infekcji (mock-infected). Sortowanie i obrazowanie próbek wykonuje się zazwyczaj w temperaturze pokojowej.
    OSTRZEŻENIE: Jodek propidynyum jest podejrzenie rakotwórczy i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
    1. Pipetować 4 ml zainfekowanych komórek Sf9 – odpowiadających ~3 x 107 komórki – w probówce przystosowanej do analizy cytometrycznej. Należy również przygotować drugą probówkę z równą liczbą komórek Sf9 zainfekowanych nierekombinowanym bakulowirusem.
    2. Dodaj jodek propidyny (PI) do obu próbek do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 1 µg/mL bezpośrednio przed oceną cytometryczną. Krok ten jest niezbędny do zidentyfikowania martwych komórek, agregatów komórkowych oraz zanieczyszczeń, które mogą zmienić lub zamaskować rozkład komórek na wykresie rozproszenia światła przedniego i bocznego. Przygotować roztwory zapasowe PI o stężeniu 1 mg/ml w wodzie i przechowywać w 4 °C chronić przed światłem.
    3. Przenieś komórki do standardowego cytometru przepływowego z możliwością sortowania komórek na podstawie rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). Przeanalizuj co najmniej 20 000 zdarzeń dla próby kontrolnej (t.j. próbki (niezawierającej kryształów). Po odrzuceniu z analizy martwych komórek, skupisk komórkowych i debris, wygeneruj wykres FSC względem SSC.
    4. Przeanalizuj co najmniej 20 000 zdarzeń z próbki zawierającej kryształy. Porównaj wykres FSC względem SSC z wykresem z próby kontrolnej (mock). Poszukaj pojawienia się wyraźnej populacji odpowiadającej komórkom zawierającym kryształy. Zazwyczaj komórki z kryształami wewnątrzkomórkowymi wykazują wyższe SSC ze względu na zwiększoną złożoność morfologiczną. FSC może również wzrosnąć, jeśli wzrost kryształów spowoduje zwiększenie objętości komórki. Zdefiniuj bramki w sorterze przepływowym, aby wyizolować populacje komórek odpowiadające obszarom wykresu rozproszenia, które różnią się od wykresu z próby kontrolnej. Przeanalizuj posortowane próbki pod mikroskopem świetlnym zgodnie z opisem w kroku 1, aby potwierdzić, która populacja jest powiązana z komórkami zawierającymi kryształy.
    5. Korzystając z bram zdefiniowanych w kroku 2.2.4, należy wyizolować komórki zawierające kryształy w PBS lub w innym buforze izotonicznym. Należy zapisać liczbę wyizolowanych komórek zawierających kryształy oraz końcową objętość, aby ułatwić kolejne etapy. Wyizolowane komórki należy przechowywać w lodzie lub w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: W ciągu godziny, >300 000 komórek zawierających wielościany jest sortowanych za pomocą sortera komórkowego z dyszą 100 mm (138 kPa przy częstotliwości 39 kHz). Taka liczba komórek jest wystarczająca do przygotowania >1000 oczek.
    6. Zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w kroku 2.1.7, należy wykonać obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić wzbogacenie frakcji w komórki zawierające kryształy. Przygotowanie próbek do gromadzenia danych powinno zostać przeprowadzone jak najszybciej po sortowaniu komórek, ponieważ kryształy mogą z czasem ulegać degradacji lub zostać uwolnione w wyniku lizy komórek.

figure-protocol-2
Rysunek 4: Sortowanie komórek.Reprezentatywne wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej dla (a) komórek niezakażonych (kontrola), które nie zawierają kryształów, oraz (b) komórek Sf9 zakażonych rekombinowanym baculowirusem nadeksponującym poliedrin BmCPV1. Różnice w wzorcu rozproszenia między dwiema populacjami pozwoliły na wyznaczenie bramki dla populacji komórek zawierających kryształy (czerwona bramka, wysokie wartości SSC). Każdy wykres przedstawia 20 000 zdarzeń sortowania. SSC: rozproszenie boczne; FSC: rozproszenie przednie. (c) Obraz z mikroskopii optycznej reprezentatywnej populacji posortowanych komórek, wykazujący obecność kryształów wewnątrzkomórkowych. Skala = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie próbek do pozyskiwania danych

Uwaga: Jeśli komórki lub kryształy mają zostać poddane derywatyzacji w celu eksperymentalnego wyznaczenia fazy, należy postępować zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w sekcji 3.1. W przeciwnym razie należy przejść bezpośrednio do sekcji 3.2 w przypadku oczyszczonych kryształów lub do sekcji 3.3 w celu analizy in cellulo.

  1. Derywatyzacja oczyszczonych mikrokryształów lub mikrokryształów in cellulo
    OSTRZEŻENIE: Przed użyciem należy zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Większość chemikaliów stosowanych do fazowania eksperymentalnego jest silnie toksyczna. Należy stosować wszelkie odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym pracę w dygestorium chemicznym oraz stosowanie środków ochrony indywidualnej. Odpady należy utylizować zgodnie z polityką danej instytucji.
    Uwaga: Rodzaj ciężkich atomów, ich stężenie i czas inkubacji podano orientacyjnie dla kryształów poliedryny BmCPV1. Parametry te muszą zostać określone eksperymentalnie dla każdego nowego celu. Kolejne barwienie błękitem trypanu w kroku 3.3.2 można pominąć, jeśli komórki są łatwo barwione przez związek chemiczny użyty do fazowania.
    1. Przygotować nasycone roztwory wybranych ciężkich atomów (lub roztwory innych chemikaliów stosowanych do fazowania eksperymentalnego). Zazwyczaj dla każdego ciężkiego atomu wymagane będą objętości mniejsze niż 100 µL. Nierozpuszczone sole i zanieczyszczenia należy usunąć poprzez wirowanie z maksymalną prędkością w mikrowirówce przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować alikwoty zawierające ~50 000 kryształów lub posortowanych komórek na każdy związek ciężkiego atomu. Jeśli PBS nie jest kompatybilny z odczynnikiem używanym doL derywatyzacji (tj. tworzy się osad i roztwór staje się mętny), należy odwirować kryształy przy 4 000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirówce lub komórki przy 150 x g przez 3 min, usunąć nadsącz i delikatnie resuspender kryształy lub komórki w 20 µL odpowiedniego buforu. Proces wirowania i resuspensji należy powtórzyć, aby upewnić się, że nie pozostały ślady PBS. Objętość końcową dla wszystkich alikwotów należy dostosować do 20 µL.
    3. Do kryształów lub komórek dodać 20 µL roztworu ciężkiego atomu lub innego wybranego związku chemicznego. Optymalne stężenie ciężkiego atomu będzie zależało od kombinacji parametrów komórkowych (przepuszczalność, białka poza celem...) oraz natury kryształu badanego białka. Jako punkt wyjścia należy przetestować 3 różne stężenia: pełne nasycenie, 1/10e i 1/100e.
    4. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 dni. Kryształy poliedryny są bardzo odporne i gęste, przez co wymagają długiego moczenia w celu wbudowania ciężkich atomów; dla innych typów kryształów czas inkubacji i stężenie ciężkich atomów należy określić eksperymentalnie. Zbyt krótki czas inkubacji nie pozwoli na wbudowanie odpowiedniej ilości ciężkiego atomu, natomiast zbyt długa inkubacja może wpłynąć na integralność kryształów, obniżając ich jakość dyfrakcyjną lub nawet prowadząc do ich rozpuszczenia. Jako punkt wyjścia należy przetestować 3 różne czasy inkubacji dla każdego roztworu ciężkiego atomu (np. 1 min, 1 h i przez noc). Skuteczność derywatyzacji ocenia się na podstawie analizy danych dyfrakcyjnych, jak krótko opisano w sekcji 5 i cytowanych tam źródłach.
    5. Nadmiar roztworu ciężkiego atomu należy usunąć, odwirując kryształy przy 4 000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirówce lub komórki przy 150 x g przez 3 min, usuwając nadsącz i delikatnie resuspenderując kryształy lub komórki w 10 µL buforu.
  2. Przygotowanie podłoża micromesh z oczyszczonymi mikrokryształami
    OSTRZEŻENIE: Stosowanie ciekłego azotu wiąże się z zagrożeniami takimi jak uduszenie, oparzenia zimnem, pożar w atmosferze wzbogaconej tlenem oraz wybuch. Prosimy zapoznać się z zasadami zarządzania ryzykiem i bezpiecznymi praktykami pracy w danej instytucji.
    1. W oparciu o stężenie kryształów obliczone w kroku 2.1.9, należy dostosować stężenie do 107 kryształów/mL poprzez rozcieńczenie próbki lub poprzez odwirowanie kryształów przy 4 000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirówce, dostosowanie objętości końcowej przez usunięcie nadsączu i delikatne resuspenderowanie kryształów.
    2. Jeśli próbki mają zostać zamrożone wcześniej, należy schłodzić transporter suchy lub naczynie Dewar za pomocą ciekłego azotu. Przygotować fiolki lub pucki, zależnie od potrzeb, i schłodzić je ciekłym azotem.
    3. Resuspender osad kryształów i nanieść kroplę 0,5 µL kryształów na siatkę micromesh za pomocą pipety. Jako punkt wyjścia należy stosować siatki 700 µm z kwadratowymi otworami o wymiarach 25 µm. Powierzchnia siatki nie jest krytyczna, ale większa powierzchnia zapewnia więcej kryształów na siatce i prowadzi do wolniejszego parowania podczas przygotowania. Rozmiar otworów może wymagać optymalizacji, aby dopasować go do rozmiaru kryształów większych niż 25 µm. Jeśli są wymagane badania systematyczne, dostępne są siatki indeksowane, ułatwiające metodyczne skanowanie siatki podczas zbierania danych.
    4. Większość nadmiaru cieczy należy usunąć poprzez odsączanie za pomocą papierowego knotka. Kryształy powinny być równomiernie rozłożone na siatce, nie dotykając się nawzajem. Powtórzyć krok 3.1.1 w celu optymalizacji stężenia próbki. Należy działać szybko i nie usuwać zbyt dużej ilości cieczy. W przypadku braku krioprotektanta ciecz szybko paruje, co grozi powstaniem kryształów soli i/lub utratą filmu.
    5. Dodać krioprotektant: nanieść pipetą 0,5 µL roztworu 50% glikolu etylenowego w wodzie na siatkę (skład buforu krio należy dostosować do próbki; sugestie dotyczące optymalizacji krioprotektanta znajdują się w źródle30). Nadmiar cieczy usunąć przez odsączanie papierowym knotkiem. W przeciwieństwie do poprzedniego kroku, pozostały film rozpuszczalnika powinien być tutaj jak najcieńszy, aby zredukować efekty paralaksy utrudniające wyrównanie między kryształem, drogą wiązki a goniometrem oraz zminimalizować tło spowodowane rozpraszaniem promieni Rentgena przez ciecz na drodze wiązki.
    6. Natychmiast schłodzić siatkę micromesh w ciekłym azocie i przenieść do fiolki lub pucka robotycznego, a następnie do transportera suchego lub naczynia Dewar w celu przechowywania.
  3. Przygotowanie siatki micromesh z komórkami zawierającymi kryształy
    OSTRZEŻENIE: Stosowanie ciekłego azotu wiąże się z zagrożeniami takimi jak uduszenie, oparzenia zimnem, pożar w atmosferze wzbogaconej tlenem oraz wybuch. Prosimy zapoznać się z zasadami zarządzania ryzykiem i bezpiecznymi praktykami pracy w danej instytucji.
    1. Przenieść posortowane komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Na podstawie liczby komórek zarejestrowanej przez sorter komórkowy, dostosować stężenie do 107 komórek/mL poprzez rozcieńczenie próbki PBS lub poprzez odwirowanie komórek przy 150 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirówce, dostosowanie objętości końcowej przez usunięcie nadsączu i delikatne resuspenderowanie komórek.
    2. Wymieszać komórki z taką samą objętością roztworu błękitu trypanu (0,4% w/v) do stężenia końcowego 0,2% w/v.
    3. Jeśli próbki mają zostać zamrożone wcześniej, schłodzić transporter suchy lub naczynie Dewar ciekłym azotem. Przygotować fiolki lub pucki i również schłodzić je ciekłym azotem.
    4. Delikatnie resuspender komórki i nanieść pipetą 0,5 µL posortowanych komórek na siatkę micromesh.
    5. Nadmiar cieczy usunąć poprzez odsączanie papierowym knotkiem. Komórki powinny być równomiernie rozłożone na siatce, nie dotykając się nawzajem. W przypadku nieużywania krioprotektanta (krok 3.3.6), pozostały film rozpuszczalnika powinien być jak najcieńszy, aby zredukować efekty paralaksy utrudniające wyrównanie między kryształem, drogą wiązki a goniometrem oraz zminimalizować tło spowodowane rozpraszaniem promieni Rentgena przez ciecz na drodze wiązki.
    6. Opcjonalnie dodać krioprotektant do komórek: nanieść pipetą 0,5 µL roztworu 50% glikolu etylenowego i 50% PBS na siatkę. Skład buforu krio należy dostosować do próbki; sugestie dotyczące optymalizacji krioprotektanta znajdują się w źródle30. Nadmiar cieczy usunąć poprzez odsączanie papierowym knotkiem, pozostawiając jedynie cienki film rozpuszczalnika.
      Uwaga: Pominięcie etapu krioprotekcji nie zmieniło jakości dyfrakcji rentgenowskiej podczas analizy kryształów poliedryny in cellulo, natomiast etap ten był wymagany dla kryształów oczyszczonych20. Dotyczy to wyłącznie inkubacji komórek z roztworem krioprotektanta; próbka powinna być nadal analizowana w temperaturze 100K, aby zminimalizować skutki uszkodzeń radiacyjnych w kryształach.
    7. Natychmiast schłodzić siatkę micromesh w ciekłym azocie i przenieść do fiolki lub pucka robotycznego, a następnie do transportera suchego lub naczynia Dewar do przechowywania, zależnie od potrzeb.

4. Gromadzenie danych

Uwaga: Parametry wykorzystywane podczas gromadzenia danych służą jako wytyczne i powinny zostać zoptymalizowane dla każdego rodzaju kryształu oraz linii wiązki synchrotronu.

  1. Zbierz dane na linii beamline do krystalografii mikroogniskowej (por. odniesienie 7 (dla listy linii wiązek mikroogniskowych i ich charakterystyki). Jeśli to możliwe, należy użyć wiązki kolimowanej, której rozmiar odpowiada rozmiarowi kryształów.
  2. W przypadku wyznaczania faz doświadczalnie metodą dyspersji anomalnej z wykorzystaniem jednej długości fali (SAD), dane należy zbierać przy energii maksymalizującej sygnał anomalny wybranego atomu ciężkiego. W przypadku wyznaczania faz metodą wielokrotnego zastąpienia izomorficznego (MIR), dane należy zbierać powyżej energii odpowiedniej krawędzi absorpcyjnej dla wybranego atomu ciężkiego (dostępne na stronie http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html).
  3. Po zamocowaniu siatki na goniometrze należy rozpocząć od centrowania mikrosiatki względem ścieżki wiązki, wykorzystując orientacje czołową (strona wypukła) oraz boczną. Następnie, przy orientacji czołowej mikrosiatki, należy precyzyjnie dostroić wyrównanie, centrując konkretną poziomą ścieżkę mikrosiatki (na przykład zaczynając od środkowej). Następnie należy zebrać dane wzdłuż tej poziomej ścieżki, wprowadzając jedynie niewielkie korekty wyrównania. Jeśli jest to możliwe, do precyzyjnego dostrojenia wyrównania należy wykorzystać centrowanie oparte na rastrowaniu przy niskiej dawce dyfrakcji rentgenowskiej (w tym celu należy skonsultować się z osobą kontaktową w danej linii wiązki synchrotronu).
    Uwaga: ze względu na uszkodzenia radiacyjne możliwe jest zebranie ograniczonej ilości danych z mikrokryształów (zazwyczaj od 10 do 30 obrazów z 1 ° oscylacji), w teorii kryształ musi być wyrównany z drogą wiązki jedynie przez 10-30 °Jednakże kluczowe jest, aby wyrównanie było precyzyjne, ponieważ mikrowiązka (zazwyczaj kolimowana do średnicy ok.10 µm lub mniejszych).
  4. Zbieraj dane dyfrakcyjne aż do momentu utraty dyfrakcji na skutek uszkodzeń radiacyjnych. W przypadku kryształów poliedryny zazwyczaj stosuje się czas ekspozycji wynoszący 10 s dla 1° oscylacja dla strumienia wynoszącego około 3,6 x 1011 fotonów/s przy 13 keV z detektorem CCD (całkowita dawka <30 MGy). Należy zoptymalizować te ustawienia w zależności od linii wiązki oraz rodzaju użytego kryształu. W szczególności w przypadku pikselowych detektorów rentgenowskich zaleca się stosowanie niskiej dawki oraz cienkich plastrów (fine slicing).
    Uwaga: W przypadku stosowania in cellulo strategia, komórki zabarwione błęknitem trypanu będą widoczne jako niebieskie kropki na tle podłoża, co ułatwi ich ustawienie w osi wiązki. Jeśli skolimowana mikrowiązka ma rozmiar zbliżony do rozmiaru komórek (~10 µm), wszystkie kryształy znajdujące się w komórce zostaną oświetlone jednocześnie. W przypadku komórek zawierających wiele mikrokryształów prowadzi to do zaobserwowania wielu wzorów dyfrakcyjnych, co może utrudniać przetwarzanie danych. Często jednak dyfrakcja z jednego z kryształów dominuje we wzorze dyfrakcyjnym i jest preferencyjnie indeksowana podczas przetwarzania danych. W przypadku linii wiązki, w których wiązka promieniowania rentgenowskiego jest znacznie mniejsza od komórki, skanowanie rastrowe przy bardzo niskim strumieniu promieniowania rentgenowskiego (>(tłumienie 95%) należy użyć w celu scentrowania pojedynczego kryształu przed rozpoczęciem zbierania danych.
  5. Przejdź do następnego kryształu w ścieżce.
  6. Po przetestowaniu wszystkich kryształów w danej ścieżce należy przejść do następnej ścieżki i powtórzyć procedurę centrowania. Postępuj w ten sposób do momentu zebrania wystarczającej ilości danych lub przetestowania wszystkich kryształów.
    1. Należy upewnić się, że przetworzone ścieżki są wyraźnie oznaczone, aby uniknąć pominięcia kryształów lub ponownego ich naświetlenia (w razie potrzeby należy sporządzić schemat). Zazwyczaj błękit trypanowy zmienia kolor na żółty po naświetleniu komórki, co może służyć jako marker.

figure-protocol-3
Rysunek 5: Strategia zbierania danych z próbek na podłożu z mikrosiatki. (a) Strategia zbierania danych w każdej ścieżce; wyrównanie jest wykonywane na początku każdej ścieżki (kropki), a dane są zbierane wzdłuż ścieżki. (b) Powiększenie komórki zawierającej kryształy, barwionej błękitem trypanu, na siatce, widocznej na ekranie linii wiązki mikrokrystalograficznej. (c) Powiększenie oczyszczonego poliedra na siatce, widocznego na ekranie linii wiązki mikrokrystalograficznej. Kwadraty siatki mają wymiary 25 µm x 25 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przetwarzanie danych

UWAGA: W tym miejscu krótko omawiamy jedynie etapy przetwarzania danych specyficzne dla seryjnej mikrokrystalografii, w której łączone są dane z wielu kryształów. Dostępnych jest wiele doskonałych artykułów szczegółowo opisujących przetwarzanie danych31,32,33,34,35,36, a wyznaczanie struktury wykracza poza zakres niniejszego protokołu.

  1. Wybierz kryształ o najlepszej rozdzielczości dyfrakcyjnej i najwyższej jakości jako referencyjny.
  2. Przetwórz poszczególne kryształy oddzielnie, korzystając ze standardowych pakietów krystalograficznych, takich jak HKL-200031, Mosflm32 lub XDS33. Aby zapobiec pogorszeniu jakości zestawu danych przez uszkodzenia radiacyjne, starannie wybierz ostatni obraz z akceptowalnym poziomem uszkodzeń radiacyjnych. Kryteria odcięcia wskazujące na nadmierne uszkodzenia radiacyjne są specyficzne dla każdego typu kryształu, praktyki przetwarzania oraz celu eksperymentu. W przypadku wyznaczania faz dla kryształów poliedryny BmCPV1, dane odrzucano, gdy stosunek sygnału do szumu <I>/<σ(I)> na obraz spadł poniżej 2 lub wartość Rsym przekroczyła 50% zgodnie z raportem programu HKL-200031.
  3. Dla każdego kryształu określ limit rozdzielczości oraz liczbę klatek, a następnie ponownie przetwórz dane z poprawnymi parametrami, aby uniknąć całkowania danych o słabym lub zerowym sygnale.
  4. Skaluj i łącz dane z najlepszych kryształów z kryształem (lub kryształami) referencyjnym, używając standardowych pakietów, takich jak Scalepack w HKL-200031, SCALA w CCP434,35 lub XSCALE w XDS33. Dodawaj dane z różnych kryształów progresywnie, monitorując globalną jakość zestawu danych, idealnie aż do osiągnięcia akceptowalnej kompletności (>95%). Odrzuć kryształy wykazujące słaby izomorfizm z najlepszym/referencyjnym kryształem, co stwierdza się na podstawie różnic w parametrach komórki elementarnej oraz słabych wartości Rmerge/chi-square na obraz. Jeśli zbyt wiele wysokiej jakości zestawów danych nie daje się przeskalować do kryształu (kryształów) referencyjnych, użyj programu takiego jak BLEND36, który wykorzystuje hierarchiczne grupowanie do zdefiniowania najlepszej kombinacji zestawów danych do połączenia.
    Uwaga: W niektórych grupach przestrzennych konieczne może być przetestowanie alternatywnych opcji indeksowania, aby dopasować je do kryształu referencyjnego.
  5. Przejdź do eksperymentalnego wyznaczania faz, zamiany molekularnej lub rafinacji, korzystając ze standardowych pakietów krystalograficznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono przegląd obu alternatywnych metod wyznaczania struktury z wykorzystaniem mikrokryształów in vivo (Rycina 1). Wielościenne kryształy można łatwo oczyścić poprzez sonikację i wirowanie. Ze względu na swoją gęstość tworzą one warstwę na dnie probówki pod warstwą zanieczyszczeń, którą można usunąć za pomocą pipety (Rycina 3a i 3b). Następnie próbkę poddaje się kilku cyklom sonikacji i przemywan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia dwa podejścia do analizy mikrokryształów w celu ułatwienia analizy bardzo małych kryształów, które w przeszłości zostałyby przeoczone.

Kluczowe etapy oczyszczania mikrokryształów
Prezentowany protokół został zoptymalizowany przy użyciu wielościanu Bombyx mori CPV1 ulegającego ekspresji w komórkach Sf9 jako układu modelowego. Jednak mikrokryształy in vivo wykazują dużą zmienność odporności mechanicznej. Na przykład kryształy przypomi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Chan-Sien Lay za dostarczenie zdjęć oczyszczonych mikrokryształów, Danielowi Erikssonowi i Tomowi Caradoc-Daviesowi za wsparcie na linii badawczej MX2 australijskiego synchrotronu, oraz Kathryn Flanagan i Andrew Fryga z ośrodka FlowCore na Uniwersytecie Monash za ich nieocenioną pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki Sf9Life Technologies
SF900-SFM pożywka dla owadówLife Technologies
1 L kolba do hodowli komórkowychThermofisher Scientific
Inkubator wstrząsowy do hodowli komórek owadówEppendorf
50 ml probówki stożkoweFalcon
z uchylnymi wiadrami do 50 ml RurkiEppendorf
Sonicator wyposażone w sondę 19 mmMSE Soniprep 150 
Szkiełkaszklane Hampton Research
HemacytometerSigma-Aldrich
Jodek PropidiumThermofisher Scientific
BD Sorter komórek napływowych BD Biosciences
Hampton Sita atomowe HeavyHampton Research
MicrowirifugeEppendorf
MicromeshSiatki Mitigen700/25 oferują większą powierzchnię. Siatki indeksowane można zakupić do systematycznych badań.
papierowyMitigenRozmiar papierowego można zmieniać w celu uzyskania optymalnego przepływu. Będzie to w dużej mierze zależało od charakteru zastosowanych kryształów i krioprotektantu.
Glikol etylenowySigma-Aldrich
Trypan blueLife Technologies
MX2 linia mikrofokusowaAustralijski synchrotronListę dostępnych linii mikrofokusowych można znaleźć w Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Aspects of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.

Bibliografia

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345(2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451(2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463(2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Krystalografia rentgenowskacytometria przep ywowaizolacja kryszta wlinia wi zki mikroogniskowejdyfrakcja seryjnanamaczanie w ci kich atomachmonta na mikrosiatce

Powiązane artykuły