Artykuł metodologiczny

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

21 lipca 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo

.

Streszczenie

Pojawienie się wysokiej jakości linii mikrofokusowych w wielu obiektach synchrotronowych umożliwiło rutynową analizę kryształów mniejszych niż 10 μm w ich największym wymiarze, co kiedyś stanowiło wyzwanie. Przedstawiamy dwa alternatywne procesy oznaczania struktury mikrokryształów białek za pomocą krystalografii rentgenowskiej, ze szczególnym uwzględnieniem kryształów hodowanych in vivo. Mikrokryształy są ekstrahowane z komórek za pomocą sonikacji i oczyszczane przez wirowanie różnicowe lub analizowane w celulo po sortowaniu komórek za pomocą cytometrii przepływowej komórek zawierających kryształy. Opcjonalnie oczyszczone kryształy lub komórki zawierające kryształy są moczone w roztworach ciężkich atomów w celu fazowania eksperymentalnego. Próbki te są następnie przygotowywane do eksperymentów dyfrakcyjnych w podobny sposób poprzez nałożenie na podłoże z mikrosiatki i błyskawiczne chłodzenie w ciekłym azocie. Pokrótce opisujemy i porównujemy seryjne eksperymenty dyfrakcyjne izolowanych mikrokryształów i komórek zawierających kryształy przy użyciu synchrotronowej linii badawczej z mikroogniskowaniem w celu uzyskania zestawów danych odpowiednich do fazowania, budowania modelu i udoskonalania.

Te przepływy pracy są zilustrowane kryształami polihedryny Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) powstałymi w wyniku zakażenia komórek owadów rekombinowanym bakulowirusem. W tym studium przypadku analiza w celulo jest bardziej wydajna niż analiza oczyszczonych kryształów i daje strukturę w ciągu ~8 dni od ekspresji do uszlachetnienia.

Wprowadzenie

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej do określania struktur makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości przez ostatnie dwie dekady stale się rozwijało. Rosnące zainteresowanie krystalografią rentgenowską przez badaczy niebędących ekspertami jest przykładem demokratyzacji tego podejścia w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych1.

Historycznie rzecz biorąc, kryształy o wymiarach poniżej ~10 μm były uważane za trudne, jeśli nie bezużyteczne, do określenia struktury. Rosnąca na całym świecie dostępność dedykowanych linii mikrofokusowych do źródeł promieniowania synchrotronowego oraz postęp technologiczny, taki jak rozwój narzędzi do manipulowania mikrokryształami, usunęły wiele z tych barier, które utrudniały szerokie zastosowanie mikrokrystalografii rentgenowskiej. Postępy w seryjnej mikrokrystalografii rentgenowskiej2,3 i mikro dyfrakcja elektronów4 pokazały, że wykorzystanie mikro- i nanokryształów do określania struktury jest nie tylko wykonalne, ale czasami nawet lepsze niż użycie dużych kryształów5,6,7.

Te postępy zostały po raz pierwszy zastosowane do badania peptydów8 i naturalnych kryształów wytwarzanych przez wirusy owadów9,10. Są one obecnie używane w różnych makrocząsteczkach biologicznych, w tym w najtrudniejszych systemach, takich jak białka błonowe i duże kompleksy11. Aby ułatwić analizę tych mikrokryształów, zostały one przeanalizowane w mezo, w szczególności w białkach błonowych12 oraz w mikrofluidyce chips13.

Dostępność tych nowatorskich metodologii mikrokrystalografii zwiększyła możliwość wykorzystania krystalizacji in vivo jako nowej drogi dla biologii strukturalnej14,15,16 oferując alternatywę dla klasycznej krystalogenezy in vitro. Niestety, nawet jeśli kryształy in vivo mogą być wyprodukowane, pozostaje kilka przeszkód, takich jak degradacja lub utrata ligandów podczas oczyszczania z komórek, trudności w manipulacji i wizualizacji kryształów na linii synchrotronowej oraz żmudne eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej. Alternatywnie, kryształy zostały również przeanalizowane bezpośrednio w komórce, bez żadnego etapu oczyszczania17,18,19. Analiza porównawcza sugeruje, że takie podejścia w celulo mogą być bardziej efektywne niż analiza oczyszczonych kryształów i dawać dane o wyższej rozdzielczości20.

Ten protokół ma na celu pomóc badaczom nowym w mikrokrystalografii białek. Dostarcza metodologii koncentrujących się na przygotowaniu próbek i manipulacji nimi do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej na linii synchrotronowej. Zaproponowano dwie opcje z wykorzystaniem izolowanych kryształów do klasycznej mikrokrystalografii lub komórek zawierających kryształy posortowanych za pomocą cytometrii przepływowej do analizy w celulo (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Krystalizacja in vivo została opisana u wielu organizmów, w tym u bakterii, drożdży, roślin, owadów i ssaków (przegląd w referencji 21). Krystalizację białek rekombinowanych osiągnięto również w laboratorium, wykorzystując przejściową transfekcję komórek ssaków oraz infekcję komórek owadzich bakulowirusami. Poniższy protokół opracowano z wykorzystaniem genu poliedryny cypowirusa 1 Bombyx mori (BmCPV1), sklonowanego w rekombinowanym bakulowirusie pod promotorem poliedryny bakulowirusa, zgodnie z instrukcjami w referencji 22. W związku z tym, choć protokół ten można dostosować do innych typów komórek (np. komórek ssaków), opisujemy tutaj procedury dla komórek owadzich. Protokół zakłada, że nadekspresja białka zainteresowania została już osiągnięta. Metody produkcji rekombinowanego bakulowirusa i jego zastosowania do ekspresji białka zainteresowania są dostępne w referencjach 23,24,25,26,27.

1. Identyfikacja komórek zawierających kryształy

  1. Jeśli komórki są hodowane w monowarstwie, należy je zbadać bezpośrednio w kolbie. Jeśli komórki są hodowane w kulturze płynnej, należy zastosować poniższy protokół.
    1. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść 500 µL komórek do probówki do mikrocentryfugi. Należy zadbać o zachowanie sterylności kultury głównej; komórki należy obsługiwać w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, stosując standardowe techniki aseptyczne.
    2. Nabrać pipetą 5 µL komórek z probówki do mikrocentryfugi i nanieść na szkiełko przedmiotowe.
    3. Ostrożnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na ciecz, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Jeśli wizualizacja preparatu ma potrwać dłużej niż 15 min, należy uszczelnić nakrywkę smarem próżniowym, aby zapobiec parowaniu.
  2. Wykonać obrazowanie kolby lub szkiełka za pomocą mikroskopu odwróconego. Jeśli jest dostępny, należy użyć mikroskopii kontrastowej fazowej i/lub mikroskopii kontrastowej interferencyjnej (DIC). Obie techniki zwiększają kontrast w przezroczystych próbkach i podkreślają linie oraz krawędzie, co ułatwia identyfikację kryształów in vivo.
  3. Dokładnie zbadać komórki. Rozpocząć od powiększenia 200X, a następnie przejść na maksymalne powiększenie po wykryciu potencjalnego kryształu. Obecność kryształów może być sugerowana pośrednio przez zmiany w morfologii komórek (Rycina 2). Należy szukać ostrych krawędzi i zmian w refrakcyjności (w przypadku użycia kontrastu fazowego lub DIC). Znane kryształy in vivo przyjmują różne kształty, w tym pręciki, stosy igieł, sześciany, piramidy i wielościany (niektóre przykłady przedstawiono na Rycina 2 oraz w Tabeli 1).
    Uwaga: Procent komórek zawierających kryształy będzie różny w każdym przypadku i może się nawet różnić między preparatami, jednak ogólnie nie należy oczekiwać znalezienia kryształów we wszystkich komórkach. Podobnie zmienna jest liczba kryształów na komórkę (patrz Tabela 1), a w jednej komórce można znaleźć więcej niż jeden kryształ. Czynniki te należy w miarę możliwości zoptymalizować poprzez dostosowanie wielokrotności infekcji, zmianę czasu ekspresji oraz modyfikację konstruktu białkowego. Z jednej strony warunki ekspresji białka i wzrostu komórek, które maksymalizują liczbę komórek zawierających kryształy, poprawią wydajność (np. wyższa wielokrotność infekcji i późne zbieranie kultury komórkowej). Z drugiej strony warunki, w których komórki zawierają pojedynczy kryształ, ułatwiają gromadzenie danych (np. niska wielokrotność infekcji). Biorąc pod uwagę wzbogacenie uzyskane dzięki sortowaniu przepływowemu opisanemu w kroku 2.2, zalecamy dążenie do uzyskania większych kryształów (np. pojedynczy kryształ na komórkę), nawet jeśli odsetek komórek zawierających kryształy jest niski.
  4. W przypadku zidentyfikowania kryształów należy zapisać ich położenie (przy obrazowaniu monowarstwy w kolbie) i oszacować procent komórek zawierających kryształy. Jeśli jest dostępny, należy użyć mikroskopu wyposażonego w kamerę zdolną do śledzenia zmian na poziomie pojedynczej komórki.
  5. Dla komórek w zawiesinie należy określić stopień żywotności komórek zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w referencji 28. Dla komórek hodowanych w monowarstwie należy oszacować poprzez inspekcję wizualną przybliżony stopień konfluencji oraz liczbę odklejonych komórek.
  6. Monitorować wzrost kryształów, wzrost komórek oraz ich żywotność dwa razy dziennie.
  7. Zebrać komórki, gdy tylko wzrost kryształów zdaje się zatrzymać. W przypadku wyjątkowo trwałych kryształów, takich jak wielościany wirusowe, wydłużony czas inkubacji (>4 dni) zwiększa liczbę dużych kryształów. Jednak w przypadku typowych kryształów białkowych zaleca się zbieranie komórek, gdy żywotność spadnie poniżej 80%, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym lizą komórek.
  8. Wyjąć kolbę z inkubatora i jak najszybciej przejść do kroku 2.2. Komórki należy trzymać w lodzie podczas kolejnych etapów, chyba że wskazano inaczej.

2. Oczyszczanie próbek

Uwaga: Opisujemy dwie metody analizy kryształów in vivo: odpowiednio z kryształów oczyszczonych oraz in cellulo.

  1. Oczyszczanie kryształów
    Uwaga: O ile nie ma dowodów na to, że badane kryształy są wrażliwe na niską temperaturę, należy pracować w lodzie i stosować schłodzone bufory, aby zapobiec degradacji kryształów.
    1. Pipetuj 50 ml zainfekowanych komórek Sf9 do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odpowiada to około 4 x 108 komórki w typowym eksperymencie.
    2. Wirować komórki w celu ich osadzenia przy 450 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    3. Odlej nadsącz i resuspenduj osad w 40 ml schłodzonego roztworu soli fosforanowo-buforowanego (PBS), pH 7,4.
      Uwaga: PBS proponuje się jako punkt wyjścia dla oczyszczania, ponieważ jest to standardowy bufor izotoniczny, którego celem jest naśladowanie środowiska komórkowego, w którym rosły kryształy in vivo. Był on stosowany w większości in vivo kryształy hodowane w kulturach komórkowych do chwili obecnej9,14,29Alternatywnie, w procesie oczyszczania z powodzeniem stosowano również pożywkę DMEM. in vivo kryształy z komórek ssaków 19Jeśli kryształy ulegają widocznemu uszkodzeniu podczas przenoszenia do PBS lub wykazują słabą dyfrakcję, parametr ten należy zbadać jako potencjalne źródło degradacji.
    4. Poddaj resuspendowany osad sonikacji przez 30 s przy natężeniu 10 mA, używając sonikatora wyposażonego w sondę o średnicy 19 mm. Aby zapobiec nagrzaniu próbki, podczas sonikacji umieść ją w zlewce wypełnionej lodem. W przypadku stwierdzenia uszkodzenia kryształów w wyniku sonikacji, ocenionego w kroku 2.1.7, można zastosować alternatywnie chemiczną lub mechaniczną lize komórek.
    5. Wirować przy 450 x g przez 10 min w temperaturze 4 °CPo wirowaniu widoczne są dwie warstwy: górna warstwa szczątków komórkowych o bladobrązowym kolorze oraz dolny osad z kryształów polyhedryny, który jest biały i kredowy.
    6. Odrzuć nadsącz i usuń górną warstwę, ostrożnie pipetując. Resuspenduj dolny osad w 40 ml schłodzonego PBS.
    7. Ocenić jakość próbek za pomocą obrazowania pod mikroskopem świetlnym.
      1. Pipeta 5 µL komórek lub oczyszczonych kryształów na szkiełko przedmiotowe. Można to wykonać w temperaturze pokojowej.
      2. Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywki na ciecz, unikając powstania pęcherzyków powietrza.
      3. Wykonaj obrazowanie preparatu za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 200X. Obrazowanie próbki należy przeprowadzić w ciągu 15 min od momentu przygotowania preparatu na szkiełku. Jeśli wizualizacja preparatu nie będzie możliwa w ciągu 15 min, należy uszczelnić szkiełko nakrywkę smarem próżniowym, aby zapobiec odparowaniu.
        UWAGA: W przypadku wielościanów kryształy będą widoczne jako refringentne sześciany o rozmiarze ok. 1 - 10 µm na stronę. Sprawdzić integralność kryształów, szukając oznak utraty ostrości (np. zaokrąglone krawędzie), pęknięcia lub rozpuszczanie. Należy również monitorować obecność szczątków komórkowych, które będą widoczne jako skupiska oraz obiekty o nieregularnym rozmiarze i kształcie.
    8. Powtórz kroki od 2.1.5 do 2.1.7, zmniejszając dwukrotnie objętość PBS używanego do resuspensji osadu w każdym cyklu, aż kryształy będą wolne od zanieczyszczeń. Resuspenduj końcowy osad w 1 ml schłodzonego PBS i przenieś kryształy do probówki do mikrocentryfugi. Przechowuj oczyszczone kryształy w 4 °C.
    9. Oszacuj stężenie kryształów, używając komory countingowej (hemocytometru) zgodnie z instrukcją producenta. Policz kryształy w taki sam sposób, w jaki liczy się komórki.

Proces krystalizacji białka; probówka do wirowania, schemat zanieczyszczeń i kryształów, obraz mikroskopowy.
Rycina 3: Oczyszczone mikrokryształy In Vivo. Reprezentatywne oczyszczanie kryształów poliedryny BmCPV1 z komórek owadów Sf9, przedstawiające (a) osad z zanieczyszczeń komórkowych i kryształów po sonikacji oraz (b) zbliżenie na warstwy zanieczyszczeń i kryształów. Warstwę zanieczyszczeń można ostrożnie resuspenderować w nadsączu i usunąć, aby przyspieszyć oczyszczanie kryształów. (c) Obraz z mikroskopii optycznej oczyszczonych poliedrów. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Izolacja komórek zawierających kryształy metodą cytometrii przepływowej
    Uwaga: Aby ułatwić definiowanie bramek w cytometrii przepływowej, zaleca się prowadzenie hodowli kontrolnej równolegle do hodowli wykazującej ekspresję białka docelowego. Można to osiągnąć poprzez zainfekowanie kolby komórek Sf9 nieistotnym rekombinowanym bakulowirusem lub poprzez przygotowanie komórek poddanych infekcji pozorowanej (mock-infected). Sortowanie i obrazowanie próbek zazwyczaj odbywa się w temperaturze pokojowej.
    OSTROŻNIE: Jodek propidyny jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
    1. Do probówki przystosowanej do analizy cytometrii przepływowej pipetować 4 mL zainfekowanych komórek Sf9 – reprezentujących ok. 3 x 107 komórek. Przygotować również drugą probówkę z równą liczbą komórek Sf9 zainfekowanych nie-rekombinowanym bakulowirusem.
    2. Bezpośrednio przed oceną cytometryczną dodać do obu próbek jodek propidyny (PI) do końcowego stężenia 1 µg/mL. Krok ten jest niezbędny do zidentyfikowania martwych komórek, agregatów komórkowych i debris, które mogą zmienić lub zamaskować rozkład komórek na wykresie rozproszenia przedniego i bocznego. Przygotować roztwory stokowe PI o stężeniu 1 mg/mL w wodzie i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Próbki poddać analizie w standardowym cytometrze przepływowym z funkcją sortowania komórek na podstawie rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC). Przeanalizować co najmniej 20 000 zdarzeń w próbce kontrolnej (t.j. niezawierającej kryształów). Po odrzuceniu z analizy martwych komórek, agregatów komórkowych i debris, wygenerować wykres FSC względem SSC.
    4. Przeanalizować co najmniej 20 000 zdarzeń w próbce zawierającej kryształy. Porównać wykres FSC względem SSC z wykresem z próbki kontrolnej. Poszukiwać pojawienia się odrębnej populacji odpowiadającej komórkom zawierającym kryształy. Zazwyczaj komórki z kryształami wewnątrzkomórkowymi będą wykazywać wyższe SSC ze względu na zwiększoną złożoność morfologiczną. FSC może również wzrosnąć, jeśli wzrost kryształów spowoduje zwiększenie objętości komórki. Zdefiniować bramki sortera przepływowego, aby wyizolować populacje komórek odpowiadające obszarom wykresu rozproszenia, które różnią się od wykresu kontrolnego. Próbki posortowane obrazować za pomocą mikroskopii świetlnej zgodnie z opisem w kroku 1, aby potwierdzić, która populacja jest związana z komórkami zawierającymi kryształy.
    5. Korzystając z bramek zdefiniowanych w kroku 2.2.4, posortować komórki zawierające kryształy do buforu PBS lub innego buforu izotonicznego. Zapisać liczbę posortowanych komórek zawierających kryształy oraz końcową objętość, aby ułatwić kolejne etapy. Posortowane komórki przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: W ciągu godziny sortuje się >300 000 komórek zawierających poliedry za pomocą sortera komórkowego z dyszą 100 mm (138 kPa przy częstotliwości 39 kHz). Taka liczba komórek jest wystarczająca do przygotowania >1 000 siatek.
    6. Postępując zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w kroku 2.1.7, obrazować komórki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby potwierdzić wzbogacenie w komórki zawierające kryształy. Przygotowanie próbek do zbierania danych powinno odbyć się jak najszybciej po sortowaniu komórek, ponieważ kryształy mogą z czasem ulec degradacji lub zostać uwolnione w wyniku lizy komórek.

Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej porównujące FSC i SSC; zaznaczone bramkowanie cząstek; wyniki analizy rozproszenia.
Rycina 4: Sortowanie komórek. Reprezentatywne wykresy rozproszenia cytometrii przepływowej z (a) komórek niezinfekowanych (mock), które nie zawierają kryształów, oraz (b) komórek Sf9 zainfekowanych rekombinowanym baculowirusem nadekspresującym poliedrynę BmCPV1. Różnice w obrazie rozproszenia między dwiema populacjami pozwoliły na bramkowanie populacji komórek zawierających kryształy (czerwona bramka, wysokie wartości SSC). Każdy wykres reprezentuje 20 000 zdarzeń sortowania. SSC: boczne rozproszenie światła; FSC: przednie rozproszenie światła. (c) Obraz mikroskopii optycznej reprezentatywnej populacji posortowanych komórek, wykazujący obecność kryształów wewnątrzkomórkowych. Skala = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Przygotowanie próbek do gromadzenia danych

Uwaga: Jeśli komórki lub kryształy mają zostać poddane pochodnowaniu w celu eksperymentalnego wyznaczenia fazy, należy postępować zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w sekcji 3.1. W przeciwnym razie należy przejść bezpośrednio do sekcji 3.2 w przypadku oczyszczonych kryształów lub do sekcji 3.3 w celu analizy in cellulo.

  1. Deriwatyzacja oczyszczonych mikrokryształów lub mikrokryształów in cellulo
    OSTRZEŻENIE: Przed użyciem należy zapoznać się z wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki materiałów (MSDS). Większość chemikaliów stosowanych w fazowaniu eksperymentalnym jest silnie toksyczna. Należy stosować wszelkie odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym pracę pod wyciągiem chemicznym oraz stosowanie środków ochrony osobistej. Odpady należy utylizować zgodnie z polityką danej instytucji.
    Uwaga: Rodzaj ciężkich atomów, ich stężenie oraz czas inkubacji podano orientacyjnie dla kryształów polihdryny BmCPV1. Parametry te muszą zostać określone eksperymentalnie dla każdego nowego celu. Kolejne barwienie błękitem trypanu w kroku 3.3.2 można pominąć, jeśli komórki są łatwo barwione przez związek chemiczny użyty do fazowania.
    1. Przygotować nasycone roztwory wybranych ciężkich atomów (lub roztwory innych chemikaliów stosowanych do fazowania eksperymentalnego). Zazwyczaj dla każdego ciężkiego atomu wymagane będą objętości mniejsze niż 100 µL. Nierozpuszczone sole i zanieczyszczenia usunąć poprzez wirowanie z maksymalną prędkością w mikrowirowarce przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować alikwoty zawierające ok. 50 000 kryształów lub posortowanych komórek na każdy związek ciężkiego atomu. Jeśli PBS nie jest kompatybilny z odczynnikiem używanym do deriwatyzacji (t.j. powstaje osad, a roztwór staje się mętny), należy zwirować kryształy przy 4,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirowarce, a komórki przy 150 x g przez 3 min, usunąć nadosad i delikatnie resuspender kryształy lub komórki w 20 µL odpowiedniego buforu. Powtórzyć wirowanie i resuspensję, aby upewnić się, że nie pozostały ślady PBS. Dostosować objętość końcową do 20 µL dla wszystkich alikwotów.
    3. Do kryształów lub komórek dodać 20 µL roztworu ciężkiego atomu lub innego wybranego związku chemicznego. Optymalne stężenie ciężkiego atomu będzie zależało od kombinacji parametrów komórkowych (przepuszczalność, białka niecelowe itd.) oraz natury kryształu badanego białka. Jako punkt wyjścia należy przetestować 3 różne stężenia: pełne nasycenie, 1/10e, 1/100e.
    4. Próbki przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 dni. Kryształy polihdryny są bardzo odporne i gęste i wymagają długiego moczenia w celu wbudowania ciężkich atomów; dla innych rodzajów kryształów czas inkubacji i stężenie ciężkich atomów należy określić eksperymentalnie. Zbyt krótki czas inkubacji nie pozwoli na wbudowanie odpowiedniej ilości ciężkiego atomu, natomiast zbyt długa inkubacja może wpłynąć na integralność kryształów, obniżając ich jakość dyfrakcyjną lub prowadząc do ich rozpuszczenia. Jako punkt wyjścia należy wypróbować 3 różne czasy inkubacji dla każdego roztworu ciężkiego atomu (np. 1 min, 1 h i przez noc). Prawidłową deriwatyzację ocenia się na podstawie analizy danych dyfrakcyjnych, jak krótko opisano w sekcji 5 i cytowanej tam literaturze.
    5. Nadmiar roztworu ciężkiego atomu usunąć poprzez wirowanie kryształów przy 4,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirowarce, a komórek przy 150 x g przez 3 min, usunięcie nadosadu i delikatne resuspender kryształy lub komórki w 10 µL buforu.
  2. Przygotowanie podłoża micromesh z oczyszczonymi mikrokryształąmi
    OSTRZEŻENIE: Stosowanie ciekłego azotu wiąże się z zagrożeniami takimi jak uduszenie, oparzenia zimnem, pożar w atmosferze wzbogaconej w tlen oraz wybuch. Należy zapoznać się z zasadami zarządzania ryzykiem i bezpiecznej pracy obowiązującymi w danej instytucji.
    1. W oparciu o stężenie kryształów obliczone w kroku 2.1.9, dostosować stężenie do 107 kryształów/mL poprzez rozcieńczenie próbki lub poprzez wirowanie kryształów przy 4,000 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirowarce, dostosowanie objętości końcowej poprzez usunięcie nadosadu i delikatną resuspensję kryształów.
    2. Jeśli próbki mają zostać zamrożone z wyprzedzeniem, schłodzić transporter suchy lub naczynie Dewara ciekłym azotem. Przygotować probówki lub pucki, zależnie od potrzeb, i schłodzić je ciekłym azotem.
    3. Resuspender osad kryształów i nanieść za pomocą pipety kroplę 0,5 µL kryształów na micromesh. Jako punkt wyjścia stosować siatki 700 µm z kwadratowymi otworami o boku 25 µm. Powierzchnia siatki nie jest krytyczna, ale większa powierzchnia pozwala na nanieienie większej liczby kryształów na siatkę i spowalnia parowanie podczas przygotowania. Rozmiar otworów może wymagać optymalizacji, aby dopasować go do kryształów większych niż 25 µm. W przypadku badań systematycznych dostępne są siatki indeksowane, które ułatwiają metodyczne skanowanie siatki podczas zbierania danych.
    4. Usunąć większość nadmiaru cieczy poprzez odsączanie papierowym knotem. Kryształy powinny być równomiernie rozłożone na siatce, nie dotykając się nawzajem. Powtórzyć krok 3.1.1 w celu optymalizacji stężenia próbki. Postępować szybko i nie usuwać zbyt dużej ilości cieczy. W przypadku braku krioprotektanta ciecz szybko paruje, co niesie ryzyko powstania kryształów soli i/lub utraty filmu cieczy.
    5. Dodać krioprotektant: nanieść pipetą 0,5 µL roztworu 50% glikolu etylenowego w wodzie na siatkę (skład buforu krioprotekcyjnego należy dostosować do próbki; sugestie dotyczące optymalizacji krioprotektanta można znaleźć w literaturze30). Nadmiar cieczy usunąć poprzez odsączanie papierowym knotem. W przeciwieństwie do poprzedniego kroku, tutaj pozostały film rozpuszczalnika powinien być jak najcieńszy, aby zredukować efekty paralaksy utrudniające wyrównanie kryształu, drogi wiązki i goniometru, oraz aby zminimalizować tło spowodowane rozpraszaniem promieni rentgenowskich przez ciecz na drodze wiązki.
    6. Natychmiast schłodzić micromesh w ciekłym azocie (flash-cooling) i przenieść do probówki lub pucka robotycznego, a następnie do transportera suchego lub naczynia Dewara w celu przechowywania.
  3. Przygotowanie micromesh z komórkami zawierającymi kryształy
    OSTRZEŻENIE: Stosowanie ciekłego azotu wiąże się z zagrożeniami takimi jak uduszenie, oparzenia zimnem, pożar w atmosferze wzbogaconej w tlen oraz wybuch. Należy zapoznać się z zasadami zarządzania ryzykiem i bezpiecznej pracy obowiązującymi w danej instytucji.
    1. Przenieść posortowane komórki do probówki do mikrowirowarki o pojemności 1,5 mL. W oparciu o liczbę komórek zarejestrowaną przez sorter komórkowy, dostosować stężenie do 107 komórek/mL poprzez rozcieńczenie próbki w PBS lub poprzez wirowanie komórek przy 150 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej w mikrowirowarce, dostosowanie objętości końcowej poprzez usunięcie nadosadu i delikatną resuspensję komórek.
    2. Wymieszać komórki z równą objętością roztworu błękitu trypanu (0,4% w/v) do stężenia końcowego 0,2% w/v.
    3. Jeśli próbki mają zostać zamrożone z wyprzedzeniem, schłodzić transporter suchy lub naczynie Dewara ciekłym azotem. Przygotować probówki lub pucki, zależnie od potrzeb, i również schłodzić je ciekłym azotem.
    4. Delikatnie resuspender komórki i nanieść pipetą 0,5 µL posortowanych komórek na micromesh.
    5. Nadmiar cieczy usunąć poprzez odsączanie papierowym knotem. Komórki powinny być równomiernie rozłożone na siatce, nie dotykając się nawzajem. Jeśli nie stosuje się krioprotektanta (krok 3.3.6), pozostały film rozpuszczalnika powinien być jak najcieńszy, aby zredukować efekty paralaksy utrudniające wyrównanie kryształu, drogi wiązki i goniometru, oraz aby zminimalizować tło spowodowane rozpraszaniem promieni rentgenowskich przez ciecz na drodze wiązki.
    6. Opcjonalnie dodać do komórek krioprotektant: nanieść pipetą 0,5 µL roztworu 50% glikolu etylenowego i 50% PBS na siatkę. Skład buforu krioprotekcyjnego należy dostosować do próbki; sugestie dotyczące optymalizacji krioprotektanta można znaleźć w literaturze30. Nadmiar cieczy usunąć poprzez odsączanie papierowym knotem, pozostawiając jedynie cienki film rozpuszczalnika.
      Uwaga: Pominięcie etapu krioprotekcji nie wpłynęło na jakość dyfrakcji rentgenowskiej podczas analizy kryształów polihdryny in cellulo, podczas gdy etap ten był wymagany dla kryształów oczyszczonych20. Dotyczy to wyłącznie inkubacji komórek z roztworem krioprotekcyjnym; próbkę należy jednak analizować w temperaturze 100K, aby zminimalizować efekty uszkodzeń radiacyjnych kryształów.
    7. Natychmiast schłodzić micromesh w ciekłym azocie (flash-cooling) i przenieść do probówki lub pucka robotycznego, a następnie do transportera suchego lub naczynia Dewara do przechowywania, zależnie od potrzeb.

4. Gromadzenie danych

Uwaga: Parametry stosowane podczas zbierania danych mają charakter orientacyjny i powinny zostać zoptymalizowane dla każdego rodzaju kryształu oraz linii wiązki synchrotronowej.

  1. Zbierz dane na linii wiązki krystalografii mikroogniskowej (patrz odnośnik 7 w celu uzyskania listy linii mikroogniskowych i ich charakterystyk). Jeśli jest dostępna, użyj wiązki kolimowanej, której rozmiar odpowiada rozmiarowi kryształów.
  2. W przypadku eksperymentalnego wyznaczania faz metodą dyspersji anomalnej przy pojedynczej długości fali (SAD), zbierz dane przy energii maksymalizującej sygnał anomalny wybranego ciężkiego atomu. Dla wyznaczania faz metodą wielokrotnego zastąpienia izomorficznego (MIR), zbierz dane powyżej energii odpowiedniej krawędzi absorpcyjnej dla wybranego ciężkiego atomu (dostępne pod adresem http://skuld.bmsc.washington.edu/scatter/AS_periodic.html).
  3. Po zamocowaniu siatki na goniometrze, rozpocznij od centrowania mikro-siatki względem drogi wiązki, stosując orientacje przodem (strona wypukła) i bokiem. Następnie, z mikro-siatką ustawioną przodem, precyzyjnie dostrój wyrównanie, ustawiając środek konkretnego poziomego pasma mikro-siatki (na przykład zacznij od środkowego). Następnie zbierz dane wzdłuż tego poziomego pasma, wprowadzając jedynie niewielkie korekty wyrównania. Jeśli jest dostępna, użyj centrowania opartego na rastrowaniu przy niskiej dawce dyfrakcji rentgenowskiej do precyzyjnego dostrojenia wyrównania (skonsultuj się z osobą kontaktową w linii synchrotronowej).
    Uwaga: Ponieważ ze względu na uszkodzenia radiacyjne można zebrać ograniczoną ilość danych z mikrokryształów (zazwyczaj od 10 do 30 obrazów przy oscylacji 1°), w teorii kryształ musi być wyrównany do drogi wiązki tylko w zakresie 10-30°. Jest jednak krytyczne, aby wyrównanie było dokładne, ponieważ mikro-wiązka (zazwyczaj kolimowana do średnicy ~10 µm lub mniejszej) może łatwo pominąć kryształ.
  4. Zbieraj dane dyfrakcyjne aż do utraty dyfrakcji z powodu uszkodzeń radiacyjnych. Dla kryształów poliedryny zazwyczaj stosuje się czas ekspozycji 10 s przy oscylacji 1° dla strumienia około 3,6 x 1011 fotonów/s przy 13 keV z detektorem CCD (całkowita dawka <30 MGy). Zoptymalizuj te ustawienia w zależności od linii wiązki i natury użytego kryształu. W szczególności zaleca się niską dawkę i gęste plastrowanie dla pikselowych detektorów rentgenowskich.
    Uwaga: W przypadku stosowania strategii in cellulo, komórki barwione błękitem trypanu będą widoczne jako niebieskie kropki na tle podłoża, co ułatwi ich wyrównanie do wiązki. Jeśli kolimowana mikro-wiązka ma rozmiar zbliżony do rozmiaru komórek (~10 µm), wszystkie kryształy zawarte w komórce zostaną naświetlone jednocześnie. W przypadku komórek zawierających wiele mikrokryształów prowadzi to do obserwacji wielu wzorów dyfrakcyjnych, które mogą być trudne do przetworzenia. Jednak dyfrakcja z jednego z kryształów często dominuje we wzorze dyfrakcyjnym i jest preferencyjnie indeksowana podczas przetwarzania danych. Dla linii wiązki z wiązką rentgenowską znacznie mniejszą niż komórka, do centrowania na pojedynczym krysztale przed zbiorem danych należy zastosować rastrowanie przy bardzo niskim strumieniu promieni rentgenowskich (>95% tłumienia).
  5. Przejdź do następnego kryształu w pasmie.
  6. Po przetestowaniu wszystkich kryształów w pasmie, przejdź do następnego pasma i powtórz procedurę wyrównania. Kontynuuj, aż zostanie zebrana wystarczająca ilość danych lub zostaną przetestowane wszystkie kryształy.
    1. Upewnij się, że przetworzone pasma są wyraźnie zidentyfikowane, aby nie pominąć kryształów ani nie naświetlić ich dwukrotnie (w razie potrzeby narysuj schemat). Zazwyczaj błękit trypanu zmienia kolor na żółty po naświetleniu komórki, co może służyć jako marker.

Inspekcja siatki mikroskopowej; schemat wyrównania siatki z koncentracją na wzorach strukturalnych; badanie naukowe.
Rysunek 5: Strategia zbierania danych z próbek na podłożu z mikrosiatki. (a) Strategia zbierania danych w obrębie jednego pasa; wyrównanie jest wykonywane na początku każdego pasa (kropki), a następnie dane są zbierane wzdłuż pasa. (b) Powiększenie komórki zawierającej kryształy, barwionej błękitem trypanu na siatce, widoczne na ekranie linii mikro-krystalografii. (c) Powiększenie oczyszczonego poliedru na siatce, widoczne na ekranie linii mikro-krystalografii. Kwadraty siatki mają wymiary 25 µm x 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przetwarzanie danych

UWAGA: W tym miejscu krótko opisujemy jedynie etapy przetwarzania danych specyficzne dla seryjnej mikrokrystalografii, w której dane z wielu kryształów są łączone. Dostępnych jest wiele znakomitych artykułów szczegółowo opisujących przetwarzanie danych31,32,33,34,35,36, a wyznaczanie struktury wykracza poza zakres niniejszego protokołu.

  1. Wybierz kryształ o najlepszej rozdzielczości dyfrakcyjnej i jakości jako referencyjny.
  2. Przetwórz każdy kryształ indywidualnie, korzystając ze standardowych pakietów krystalograficznych, takich jak HKL-200031, Mosflm32 lub XDS33. Aby zapobiec pogorszeniu jakości zbioru danych przez uszkodzenia radiacyjne, starannie wybierz ostatni obraz z akceptowalnym poziomem uszkodzeń. Kryteria odcięcia wskazujące na nadmierne uszkodzenia radiacyjne są specyficzne dla każdego rodzaju kryształu, praktyki przetwarzania i celu eksperymentu. W przypadku wyznaczania faz dla kryształów poliedryny BmCPV1, dane odrzucano, gdy stosunek sygnału do szumu /<σ(I)> na obraz spadł poniżej 2 lub gdy Rsym przekroczył 50%, zgodnie z raportem programu HKL-200031.
  3. Dla każdego kryształu określ limit rozdzielczości oraz liczbę klatek i przetwórz dane ponownie z poprawnymi parametrami, aby uniknąć całkowania danych z niewielkim lub żadnym sygnałem.
  4. Skaluj i scal dane z najlepszych kryształów do kryształu(-ów) referencyjnego, używając standardowych pakietów, takich jak Scalepack w HKL-200031, SCALA w CCP434,35 lub XSCALE w XDS33. Dodawaj dane z różnych kryształów progresywnie, monitorując globalną jakość zbioru danych, idealnie aż do osiągnięcia akceptowalnej kompletności (>95%). Odrzuć kryształy wykazujące słaby izomorfizm z najlepszym/referencyjnym kryształem, co można stwierdzić na podstawie różnic w parametrach komórki elementarnej oraz słabych wartości Rmerge/chi-square na obraz. Jeśli zbyt wiele wysokiej jakości zbiorów danych nie skaluje się z kryształem(-ami) referencyjnym, użyj programu takiego jak BLEND36, który wykorzystuje hierarchiczne grupowanie w celu zdefiniowania najlepszej kombinacji zbiorów danych do scalenia.
    Uwaga: W niektórych grupach przestrznych należy przetestować alternatywne opcje indeksowania, aby dopasować je do kryształu referencyjnego.
  5. Przejdź do eksperymentalnego wyznaczania faz, wymiany molekularnej lub udoskonalania struktury (refinement) przy użyciu standardowych pakietów krystalograficznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono przegląd obu alternatywnych metod wyznaczania struktury z wykorzystaniem mikrokryształów in vivo (Rysunek 1). Poliedry można łatwo oczyścić poprzez sonikację i wirowanie. Ze względu na swoją gęstość tworzą one warstwę na dnie probówki, pod warstwą zanieczyszczeń, którą można usunąć za pomocą pipety (Rysunek 3a i 3b). Następnie próbkę poddaje się kilku cyklom sonikacji i przemywania, aż do o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia dwa podejścia do analizy mikrokryształów w celu ułatwienia analizy bardzo małych kryształów, które w przeszłości zostałyby przeoczone.

Kluczowe etapy oczyszczania mikrokryształów
Prezentowany protokół został zoptymalizowany przy użyciu wielościanu Bombyx mori CPV1 ulegającego ekspresji w komórkach Sf9 jako układu modelowego. Jednak mikrokryształy in vivo wykazują dużą zmienność odporności mechanicznej. Na przykład kryształy przypomi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Chan-Sien Lay za dostarczenie zdjęć oczyszczonych mikrokryształów, Danielowi Erikssonowi i Tomowi Caradoc-Daviesowi za wsparcie na linii badawczej MX2 australijskiego synchrotronu, oraz Kathryn Flanagan i Andrew Fryga z ośrodka FlowCore na Uniwersytecie Monash za ich nieocenioną pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki Sf9Life Technologies
SF900-SFM pożywka dla owadówLife Technologies
1 L kolba do hodowli komórkowychThermofisher Scientific
Inkubator wstrząsowy do hodowli komórek owadówEppendorf
50 ml probówki stożkoweFalcon
z uchylnymi wiadrami do 50 ml RurkiEppendorf
Sonicator wyposażone w sondę 19 mmMSE Soniprep 150 
Szkiełkaszklane Hampton Research
HemacytometerSigma-Aldrich
Jodek PropidiumThermofisher Scientific
BD Sorter komórek napływowych BD Biosciences
Hampton Sita atomowe HeavyHampton Research
MicrowirifugeEppendorf
MicromeshSiatki Mitigen700/25 oferują większą powierzchnię. Siatki indeksowane można zakupić do systematycznych badań.
papierowyMitigenRozmiar papierowego można zmieniać w celu uzyskania optymalnego przepływu. Będzie to w dużej mierze zależało od charakteru zastosowanych kryształów i krioprotektantu.
Glikol etylenowySigma-Aldrich
Trypan blueLife Technologies
MX2 linia mikrofokusowaAustralijski synchrotronListę dostępnych linii mikrofokusowych można znaleźć w Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Aspects of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.

Bibliografia

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345(2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451(2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463(2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Krystalografia rentgenowskacytometria przep ywowaizolacja kryszta wlinia wi zki mikroogniskowejdyfrakcja seryjnanamaczanie w ci kich atomachmonta na mikrosiatce

Powiązane artykuły