Method Article

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

DOI:

10.3791/55794

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje sposób wzbogacania progenitorów nerwowych z populacji komórek zrębu szpiku (MSC), a następnie kierowania ich do losu dojrzałych komórek Schwanna. Poddaliśmy MSC szczurów i ludzi przejściowym warunkom niedotlenienia (1% tlenu przez 16 godzin), a następnie ekspansji jako neurosfery na podłożu o niskim przyczepie z suplementacją naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) / podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Neurosfery wysiewano na plastikowej kulturze tkankowej pokrytej poli-D-lizyną/lamininą i hodowano w koktajlu glejowym zawierającym β-heregulinę, bFGF i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) w celu wytworzenia komórek podobnych do komórek Schwanna (SCLC). SCLC skierowano do zobowiązania losu poprzez kokulturę przez 2 tygodnie z oczyszczonymi neuronami zwojów korzenia grzbietowego (DRG) uzyskanymi od ciężarnych szczurów Sprague Dawley E14-15. Dojrzałe komórki Schwanna wykazują trwałość w ekspresji S100β/p75 i mogą tworzyć segmenty mieliny. Wygenerowane w ten sposób komórki mają potencjalne zastosowanie w autologicznym przeszczepie komórek po urazie rdzenia kręgowego, a także w modelowaniu chorób.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczepienie progenitorów nerwowych i ich pochodnych okazuje się obiecującą strategią leczenia po urazowym uszkodzeniu nerwów1,2 i neurodegeneracja3,4. Przed zastosowaniem klinicznym konieczne jest upewnienie się: i) metody dostępu i ekspansji autologicznego źródła komórek macierzystych/progenitorowych oraz ii) sposobu kierowania ich do odpowiednich, dojrzałych typów komórek3. Nasze zainteresowanie terapią komórkową w przypadku uszkodzenia rdzenia kręgowego skłoniło nas do poszukiwania solidnego, autologicznego źródła komórek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt do Nauczania i Badań, Wydział Medycyny Li Ka Shing, Uniwersytet w Hongkongu. Próbki ludzkiego szpiku kostnego pobrano z grzebienia biodrowego zdrowych dawców po uzyskaniu świadomej zgody. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Hongkongu.

1. Przygotowanie kultur MSC szczurów

  1. Pobieranie MSCs z kości udowej
    1. Wszystkie narzędzia do preparowania (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd kluczowych etapów naszego protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1. Podsumowując, MSCs u szczurów i ludzi są wybierane na podstawie przestrzegania zaleceń dotyczących plastiku w kulturach tkankowych. Rozszerzone MSCs są wstępnie kondycjonowane hipoksją, a następnie poddawane warunkom tworzenia neurosfery. Neurosfery są powlekane i mogą różnicować się w SCLC. SCLC są hodowane wspólnie z oczyszczonymi neuronami DRG w celu wytworzenia komórek Schwanna, k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezbędne jest zachowanie "macierzystości" MSC przed wzbogaceniem neuronalnych komórek progenitorowych poprzez hipoksyjne warunkowanie wstępne i hodowlę neurosfery. Z naszego doświadczenia wynika, że multipotencjalne MSCs można wiarygodnie zidentyfikować na podstawie ich wydłużonej morfologii podobnej do fibroblastów. W przeciwieństwie do tego, MSC, które przyjęły bardziej spłaszczoną, czworokątną morfologię, z wyraźnymi włóknami stresu cytoszkieletu, nie przyjmują łatwo losów komórek nerwowych i powinny zostać odrzucone.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy tego manuskryptu nie mają żadnych oświadczeń do oświadczeń.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Nai-Sum Wong za dostarczenie aparatu do komory hipoksyjnej oraz Pani Alice Lui za wsparcie techniczne.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
&alfa; MEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Podłoże neuropodstawoweThermofisher scientific21103-049
FBSBiosuràFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Thermofisher scientific
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) Peprotech100-18B/100UG
Czynnik wzrostu nerwów (NGF) MilliporeNC011
Płytkopochodny czynnik wzrostu-AA (PDGF-AA)Peprotech100-13A
Heregulina beta-3, domena EGF (β-Her)Milipore01-201
UrydynaSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - deoksyurydyna (FDU)SigmaaldrichF0503
Poli-D-lizyna (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininThermofisher 23017015
naukowy GlutaMAXThermofisher35050061
naukowy Penicylina / streptomycyna (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
10 cm talerz do hodowliadherentówTPP93100Używany do selekcji MSCs według adherencji kultur tkankowych
6-dołkowa płytka do hodowli adherentnejTPP92006Używana do namnażania MSCs po pasażowaniu
UltraLow 6-dołkowa płytka do hodowli nieprzylegającejCorning3471Używana do wzbogacania neuronalnych progenitorów
anty-ludzka CD90(Thy-1)BD Biosciences555593
anty-ludzka CD73BD Biosciences550256
anty-człowiek/szczur STRO-1R& D SystemsMAB1038
anty-ludzkie gniazdo wR& D SystemsMAB1259
anty-ludzkim CD45BD Biosciences555480
anty-szczurzy CD90(Thy-1)BD Biosciences554895
antyszczurzy CD73BD Biosciences551123
antyszczurzy nestinBD BiosciencesMAB1259
antyszczurzy CD45BD Biosciences554875
Anty-S100 i wersja beta;DakoZ031101
Anty-p75MilliporeMAB5386
Anty-GFAPSigmaaldrichG3893
Anty-klasa III-beta tubulina (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Anty-ludzkie jądraMiliporyMAB1281
Komora hipoksjiBillups-RothenbergMIC-101
HEPES buforSigmaaldrichH4034-100G
PHG0313

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hypoxic PreconditioningMarrow Stromal CellsNeural ProgenitorsSchwann Cell DifferentiationNeurosphere CultureDorsal Root GangliaCo culture TechniqueGlial Induction MediumS100 Beta ExpressionMyelin Segment Formation

Related Articles