Artykuł metodologiczny

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

DOI:

10.3791/55794

⸱

14 czerwca 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt opisuje sposób wzbogacania progenitorów nerwowych z populacji komórek zrębu szpiku (MSC), a następnie kierowania ich do losu dojrzałych komórek Schwanna. Poddaliśmy MSC szczurów i ludzi przejściowym warunkom niedotlenienia (1% tlenu przez 16 godzin), a następnie ekspansji jako neurosfery na podłożu o niskim przyczepie z suplementacją naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) / podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Neurosfery wysiewano na plastikowej kulturze tkankowej pokrytej poli-D-lizyną/lamininą i hodowano w koktajlu glejowym zawierającym β-heregulinę, bFGF i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) w celu wytworzenia komórek podobnych do komórek Schwanna (SCLC). SCLC skierowano do zobowiązania losu poprzez kokulturę przez 2 tygodnie z oczyszczonymi neuronami zwojów korzenia grzbietowego (DRG) uzyskanymi od ciężarnych szczurów Sprague Dawley E14-15. Dojrzałe komórki Schwanna wykazują trwałość w ekspresji S100β/p75 i mogą tworzyć segmenty mieliny. Wygenerowane w ten sposób komórki mają potencjalne zastosowanie w autologicznym przeszczepie komórek po urazie rdzenia kręgowego, a także w modelowaniu chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczepienie progenitorów nerwowych i ich pochodnych okazuje się obiecującą strategią leczenia po urazowym uszkodzeniu nerwów1,2 i neurodegeneracja3,4. Przed zastosowaniem klinicznym konieczne jest upewnienie się: i) metody dostępu i ekspansji autologicznego źródła komórek macierzystych/progenitorowych oraz ii) sposobu kierowania ich do odpowiednich, dojrzałych typów komórek3. Nasze zainteresowanie terapią komórkową w przypadku uszkodzenia rdzenia kręgowego skłoniło nas do poszukiwania solidnego, autologicznego źródła komórek progenitorowych nerwowych z dorosłych tkanek.

Subpopulacja MSCs wywodzi się z grzebienia nerwowego i jest łatwo dostępna z jamy szpiku. Komórki te są neuronalnymi przodkami, które mogą generować neurony i glej5. Zwierzęce modele niedokrwienia mózgu pokazują, że niedotlenienie sprzyja proliferacji i multipotencji neuronalnych komórek progenitorowych w mózgu6. Było to podstawą do wykorzystania wstępnego kondycjonowania hipoksyjnego jako sposobu na ekspansję progenitorów nerwowych pochodzących ze szpiku.

Przeszczepienie komórek Schwanna do uszkodzonego rdzenia kręgowego sprzyja regeneracji2. SCLC mogą być generowane z MSC poprzez suplementację czynnikami glejowymi (tj. β-hereguliną, bFGF i PDGF-AA), ale wykazują niestabilność fenotypową. Po wycofaniu czynników wzrostu powracają do fenotypu podobnego do fibroblastów7. Niestabilność fenotypowa jest niepożądana w transplantacji komórek ze względu na ryzyko nieprawidłowego różnicowania i kancerogenezy. Ponieważ prekursory komórek Schwanna są związane z wiązkami aksonów w obrębie embrionalnego nerwu obwodowego8, zostaliśmy doprowadzeni do kokultury SCLC z oczyszczonymi embrionalnymi neuronami DRG7,9. Powstałe w ten sposób dojrzałe komórki Schwanna są zaangażowane w los i wykazują funkcję in vitro7,9 oraz in vivo10.

Nasz protokół wzbogacania neuronalnych komórek progenitorowych z MSC jest prosty i skuteczny i powoduje wzrost liczby komórek do kolejnych testów. Wyprowadzenie komórek Schwanna zaangażowanych w los za pomocą platformy kokultury pozwala na badanie różnicowania glejowego oraz generowanie stabilnych i funkcjonalnych komórek Schwanna do potencjalnego zastosowania klinicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt do Nauczania i Badań, Wydział Medycyny Li Ka Shing, Uniwersytet w Hongkongu. Próbki ludzkiego szpiku kostnego pobrano z grzebienia biodrowego zdrowych dawców po uzyskaniu świadomej zgody. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Hongkongu.

1. Przygotowanie kultur MSC szczurów

  1. Pobieranie MSCs z kości udowej
    1. Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. cienkie nożyczki do preparowania, nożyczki tnące z końcówkami i kleszcze zębate) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
    2. Przygotować pożywkę MSC składającą się z minimalnej ilości niezbędnej pożywki - modyfikacji alfa (αMEM) uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną/streptomycyną (P/S, 1% v/v).
    3. Ofiarować młode samce szczurów Sprague Dawley (200-250 g masy ciała) przez przedawkowanie pentobarbitonu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo).
      UWAGA: Próbki szpiku od różnych szczurów powinny być przetwarzane oddzielnie.
    4. Ułóż ofiarowane zwierzęta w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch i kończyny dolne 70% etanolem.
    5. Usuń skórę i tkankę podskórną nad przyśrodkowymi udami za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Usuń mięśnie ud obwodowo, aż kość udowa zostanie odsłonięta. Kontynuuj to proksymalnie i dystalnie, aż zobaczysz stawy kolanowe i biodrowe. Odłącz kość udową przez staw biodrowy i kolanowy za pomocą nożyczek tnących z końcówką.
      UWAGA: Na tym etapie nie należy przekraczać kości udowej w celu odsłonięcia jamy szpiku. Przenieś nienaruszone kości udowe do okapu do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym w celu dalszego przetwarzania.
    6. Użyj nożyczek tnących z końcówką, aby przeciąć dystalne i proksymalne końce kości udowej przez przynasadę.
    7. Umieść sitko o pojemności 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Włożyć strzykawkę o pojemności 21 g i pojemności 10 ml zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) do odsłoniętego kanału udowego i przepłukać zawartość szpiku do stożkowej rurki przez wielokrotne płukanie.
      UWAGA: Około 20 ml PBS służy do przepłukania każdej kości udowej. Jeśli kolor zaczerwienionej zawartości pozostaje zabarwiony krwią i mętny, można użyć większej objętości.
    8. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 480 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ). Zapisz początkowy dzień posiewu jako dzień 0,
      UWAGA: Na wszystkich etapach związanych z wirowaniem należy ustawić hamulec na maksymalne opóźnienie.
  2. Zakładanie i rozbudowa kolonii MSC
    UWAGA: Protokół ten opiera się na przestrzeganiu zaleceń dotyczących tworzyw sztucznych w hodowlach tkankowych jako sposobie selekcji MSCs z jamy szpiku kostnego11. Zawartość szpiku kostnego może przylegać do plastiku hodowli tkankowej przez 2 dni.
    1. W drugim dniu przepłucz płytki hodowlane trzy razy 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po spłukaniu zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umyj komórki PBS i uzupełniaj pożywką MSC co 3 dni.
      UWAGA: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu (Rysunek 2A).
    2. Przejdź komórki do 10 dnia, usuwając pożywkę wzrostową i przepłukując komórki PBS. Dodać 1,5 ml rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 3 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min.
    3. Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.
    4. Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10-centymetrową płytkę hodowlaną w pożywce wzrostowej MSC.
      UWAGA: MSC szczurów powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od przejścia (Rysunek 2B). Komórki mogą być pasażowane zgodnie z opisem w kroku 1.2.2 dla maksymalnie 8 przejść. MSCs można scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego (Ryc. 3)12. Tylko posiewy MSC między pasażami 3 i 8 są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych progenitorów. MSC o większej liczbie pasaży przyjmują spłaszczoną morfologię (Rysunek 2C) i nie wytwarzają wystarczającej liczby neuronalnych komórek progenitorowych. Te kultury należy wyrzucić.

2. Przygotowanie ludzkich kultur BMSC

  1. Rozcieńczyć 1 ml ludzkiego szpiku kostnego w 9 ml pożywki wzrostowej MSC i umieścić komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Utrzymywać kultury w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ).
  2. Usuń pożywkę po 2 dniach i delikatnie spłucz kultury trzy razy 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po ostatnim płukaniu usuń PBS i zastąp go 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Uzupełniaj pożywkę po każdych 3 dniach hodowli po płukaniu PBS.
    UWAGA: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu. Liczba kolonii może się różnić w zależności od obiektu.
  3. Przejść przez komórki w 10 dniu, jak opisano w kroku 1.2.2. Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS. Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10 cm płytce hodowlanej w pożywce MSC.
    UWAGA: Ludzkie MSC (Rysunek 2D) wykazują podobną morfologię do MSC szczurów i podobnie powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od przejścia. Powinny być scharakteryzowane za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego12. Podobnie jak w przypadku MSC szczurów, ludzkie MSC, które znajdują się między pasażem 3 a 8, są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych komórek progenitorowych.

3. Kondycjonowanie wstępne hipoksyjne

  1. Zdemontuj elementy komory hipoksji (tj. podstawę, pokrywę, tace) po zwolnieniu zacisku pierścieniowego i wytrzyj poszczególne części do czysta 70% etanolem. Umieść elementy komory w okapie do hodowli tkanek z przepływem laminarnym w celu sterylizacji w świetle UV przez 15 minut.
  2. Przed wstępnym kondycjonowaniem hipoksyjnym należy usunąć pożywkę i przepłukać hodowle MSC szczurów i ludzi (sekcje 1 i 2) 10 ml PBS. Zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC uzupełnionej 25 mM HEPES.
    UWAGA: MSCs hodowane na 10-centymetrowych szalkach powinny osiągnąć 80-90% konfluencji, zanim zostaną poddane wstępnemu kondycjonowaniu hipoksyjnemu.
  3. Umieść szalki hodowlane w komorze hipoksji. Ponownie zmontuj elementy komory i dokręć pierścień clamp. Mieszaninę gazów o stężeniu 99% N2/1% O2 należy przepłukać do komory o natężeniu przepływu 10 l/min przez 5 minut.
  4. Uszczelnij końce łączące komorę hipoksji, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu. Umieścić komorę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 16 godzin.
  5. Po zakończeniu kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego należy usunąć kultury z komory, przygotowując się do późniejszej hodowli wzbogacającej neuronalne pregenitory.

4. Kultura wzbogacania neuronalnych przodków

  1. Przygotuj neuronalną pożywkę progenitorową składającą się ze zmodyfikowanej pożywki orła firmy Dulbecco/mieszanki składników odżywczych szynki F12 (DMEM/F12) uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF, 20 ng/mL) i P/S (1% v/v).
  2. Odłączyć wstępnie kondycjonowane do hipoksyjności MSCs szczura/człowieka, jak opisano w kroku 1.2.2. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.
  3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce progenitorowej neuronu i wysiać nasiona na 6-dołkowych płytkach o niskim przyleganiu o gęstości 6,000 komórek/cm2. Umieścić kulturę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 12 dni. Uzupełniaj 75% pożywki progenitorowej układu nerwowego co 3 dni.
    UWAGA: Duże skupiska nieprzylegających komórek należy obserwować do 6-7 dnia. W dniach 10-12 można zaobserwować neurosfery o średnicy ≥ 100 μm (Rysunek 4). Wstępnie kondycjonowane MSCs powinny dawać więcej neurosfer w porównaniu z MSCs hodowanymi w warunkach normoksyjnych9.
  4. Zbierz neurosfery w 12 dniu, odsysając je do pipety o pojemności 10 ml i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować neurosfery przy 250 x g przez 5 min.
    UWAGA: Neurosfery można scharakteryzować w dniu 12 dla markerów progenitorowych neuronów, takich jak nestin i GFAP7.

5. Generowanie komórek Schwanna zaangażowanych przez los poprzez kokulturę z neuronami DRG

  1. Przygotowanie oczyszczonych neuronów DRG szczura
    1. Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. nożyczki do preparowania, kleszcze, dwa kleszcze do mikrodysekcji i nożyczki do mikropreparacji) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
    2. Pokryć 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych poli-D-lizyną (PDL, 10 μg/ml w PBS) w temperaturze 4 °C przez noc. Usuń PDL i spłucz 1,5 ml PBS na studzienkę.
    3. Kontynuować powlekanie płytek lamininą (10 μg/ml w PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przepłukać płytki 1,5 ml PBS na studzienkę.
    4. Przygotuj pożywkę podtrzymującą neurony DRG, składającą się z pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1% v/v), czynnikiem wzrostu nerwów (NGF, 20 ng/mL) i P/S (1% v/v).
    5. Przygotuj pożywkę do oczyszczania neuronów DRG, składającą się z pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1%), NGF (20 ng/mL), P/S (1%), fluorodeoksyurydyną (FDU, 10 μg/ml) i urydyną (10 μg/ml).
    6. Uśmiercać ciężarne szczury w 14-15 dniu ciąży przez przedawkowanie pentobarbitalu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowe).
    7. Ułóż ofiarowane zwierzęta w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch 70% etanolem.
    8. Przetnij dolną ścianę brzucha zwierzęcia wzdłużnie za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Zidentyfikuj i usuń macicę za pomocą nożyczek do preparowania. Przetnij ścianę macicy, aby odsłonić i usunąć zarodki. Przenieś zarodki do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS. Umieść naczynie hodowlane na lodzie.
    9. Przenieść zarodek przeznaczony do sekcji do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS (temperatura pokojowa) i umieścić go pod mikroskopem preparacyjnym. Ułóż zarodek w pozycji leżącej.
      UWAGA: Białawy rdzeń kręgowy i dołączone DRG można zobaczyć nad grzbietową częścią zarodka, przez jego półprzezroczystą skórę.
    10. Włóż kleszcze do mikropreparowania po obu stronach rdzenia kręgowego i użyj sekcji, aby rozpocząć oddzielanie rdzenia kręgowego od otaczającej tkanki miękkiej. Odetnij rdzeń kręgowy od zwierzęcia za pomocą kleszczy do mikropreparowania wzdłuż otworu szyi i kikuta ogona. Wykonaj dalszą sekcję nad brzuszną częścią rdzenia, aby uwolnić ją od otaczających tkanek miękkich.
    11. Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby usunąć resztki tkanek miękkich nad grzbietową częścią uwolnionego rdzenia kręgowego.
      UWAGA: Na tym etapie powinien pozostać tylko rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przyczepiony DRG.
    12. Odłącz poszczególne DRG od łączących je korzeni nerwowych za pomocą kleszczy do mikropreparacji. Użyj pisaka do pipet dołączonego do końcówki o pojemności 1 ml, aby przenieść DRG do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej PBS.
      UWAGA: Na każdą probówkę o pojemności 1,5 ml można umieścić maksymalnie 100 DRG.
    13. Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w rekombinowanym odczynniku do dysocjacji komórek enzymatycznych (200 μl na probówkę). Inkubować (37 °C, 5% CO2 ) przez 10 min. Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce podtrzymującej neurony DRG. Oddzielić osad przez delikatne rozcieranie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
    14. Zasiać komórki o gęstości 5,000 komórek/cm2 do 6-dołkowych płytek pokrytych PDL/lamininą w 1,5 ml pożywki podtrzymującej neurony DRG na dołek. Po dwóch dniach hodowli usuń pożywkę podtrzymującą neurony DRG, spłucz PBS i zastąp pożywką do oczyszczania neuronów DRG.
      UWAGA: Dla każdego cyklu oczyszczania należy traktować kultury DRG pożywką oczyszczającą przez 2 dni, a następnie 1 dzień inkubacji w pożywce konserwującej. Po 3-4 cyklach oczyszczania oczekuje się usunięcia wszystkich endogennych komórek glejowych7. Powinno to zająć około 14 dni. Oczyszczone kultury dają wynik dodatni dla markera neuronalnego TUJ1 i nie występują w przypadku ekspresji S100β (Figura 5).
  2. Wytwarzanie komórek podobnych do komórek Schwanna
    1. Przygotować pożywkę do indukcji glejowej składającą się z αMEM uzupełnionego β-hereguliną (100 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), płytkowym czynnikiem wzrostu (PDGF-AA, 5 ng/ml), FBS (10%) i P/S (1% v/v).
    2. Umieść neurosfery przygotowane w sekcji 4 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL / lamininą o gęstości 5-10 kulek nacm2 w 1,5 ml pożywki do indukcji glejowej na dołek. Pożywkę do indukcji glejowej należy wymieniać co 2 dni po przepłukaniu komórek PBS.
      UWAGA: Obserwuje się, że komórki z zasianych neurosfer migrują na zewnątrz do 2 dnia. Do 7 dnia komórki migrujące mają zwężający się wygląd i powinny wykazywać immunopozytywność dla markerów komórek Schwanna receptora neurotrofiny p75 (p75) i S100β7. Komórki te są określane jako SCLC.
  3. Kokultura SCLC z neuronami DRG
    1. Przygotować pożywkę do kokultury składającą się z pożywki podtrzymującej neurony DRG (krok 5.1.4) i pożywki do indukcji glejowej (krok 5.2.1) w stosunku objętościowym 1:1.
    2. Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek Schwanna składającą się z DMEM/F12 uzupełnionego FBS (5%), β-hereguliny (10 ng / ml) i P/S (1% v/v).
    3. Usunąć pożywkę hodowlaną z SCLC dnia 7, przepłukać je PBS i inkubować z 0,5 ml/studzienkę rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić SCLC w pożywce do kokultury.
    4. Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
    5. Zasiaj SCLC na oczyszczonych kulturach neuronów DRG o gęstości 1,000 komórek/cm2. Utrzymuj kokultury przez 14 dni, z wymianą pożywki co 2 dni.
      UWAGA: Podczas kohodowli SCLC uzyskały wrzecionowatą morfologię, która jest typowa dla dojrzałych komórek Schwanna (Ryc. 6). Komórki te utrzymują się w swoim fenotypie po wycofaniu czynników wzrostu i są zdolne do mielinizacji aksonów in vitro i in vivo7,10. Dodatniość markerów komórek Schwanna (tj. p75 i S100β) powinna być monitorowana za pomocą immunofluorescencji.
    6. Po zakończeniu kohodowli pasują komórki Schwanna zaangażowane w los, jak opisano w kroku 1.2.2. Użyj 0,5 ml odczynnika dysocjacyjnego na studzienkę. Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
    7. Ponownie zawiesić komórki Schwanna zaangażowane w los w pożywce podtrzymującej komórki Schwanna o gęstości 10 000 komórek/cm2. Komórki nasienne na 6-dołkowe płytki pokryte PDL/lamininą w celu immunofluorescencji.
      UWAGA: Kokultury nieuchronnie zawierają MSC, które przyjęły los komórek fibroblastów7. Komórki te są pasażowane razem z komórkami Schwanna zaangażowanymi w los po zakończeniu kokultury. Komórki Schwanna leżące na tym podłożu fibroblastów mogą być łatwo odłączone i dalej namnażane po przepłukaniu "zimnymi strumieniami" PBS (4 °C), jak opisano w innym miejscu13. Komórki Schwanna zaangażowane w los można namnażać w pożywce podtrzymującej przez 1 miesiąc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd kluczowych etapów naszego protokołu jest zilustrowany w Rysunek 1. Podsumowując, MSCs u szczurów i ludzi są wybierane na podstawie przestrzegania zaleceń dotyczących plastiku w kulturach tkankowych. Rozszerzone MSCs są wstępnie kondycjonowane hipoksją, a następnie poddawane warunkom tworzenia neurosfery. Neurosfery są powlekane i mogą różnicować się w SCLC. SCLC są hodowane wspólnie z oczyszczonymi neuronami DRG w celu wytworzenia komórek Schwanna, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezbędne jest zachowanie "macierzystości" MSC przed wzbogaceniem neuronalnych komórek progenitorowych poprzez hipoksyjne warunkowanie wstępne i hodowlę neurosfery. Z naszego doświadczenia wynika, że multipotencjalne MSCs można wiarygodnie zidentyfikować na podstawie ich wydłużonej morfologii podobnej do fibroblastów. W przeciwieństwie do tego, MSC, które przyjęły bardziej spłaszczoną, czworokątną morfologię, z wyraźnymi włóknami stresu cytoszkieletu, nie przyjmują łatwo losów komórek nerwowych i powinny zostać odrzucone...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy tego manuskryptu nie mają żadnych oświadczeń do oświadczeń.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować dr Nai-Sum Wong za dostarczenie aparatu do komory hipoksyjnej oraz Pani Alice Lui za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
&alfa; MEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Podłoże neuropodstawoweThermofisher scientific21103-049
FBSBiosuràFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)Thermofisher scientific
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) Peprotech100-18B/100UG
Czynnik wzrostu nerwów (NGF) MilliporeNC011
Płytkopochodny czynnik wzrostu-AA (PDGF-AA)Peprotech100-13A
Heregulina beta-3, domena EGF (β-Her)Milipore01-201
UrydynaSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - deoksyurydyna (FDU)SigmaaldrichF0503
Poli-D-lizyna (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininThermofisher 23017015
naukowy GlutaMAXThermofisher35050061
naukowy Penicylina / streptomycyna (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
10 cm talerz do hodowliadherentówTPP93100Używany do selekcji MSCs według adherencji kultur tkankowych
6-dołkowa płytka do hodowli adherentnejTPP92006Używana do namnażania MSCs po pasażowaniu
UltraLow 6-dołkowa płytka do hodowli nieprzylegającejCorning3471Używana do wzbogacania neuronalnych progenitorów
anty-ludzka CD90(Thy-1)BD Biosciences555593
anty-ludzka CD73BD Biosciences550256
anty-człowiek/szczur STRO-1R& D SystemsMAB1038
anty-ludzkie gniazdo wR& D SystemsMAB1259
anty-ludzkim CD45BD Biosciences555480
anty-szczurzy CD90(Thy-1)BD Biosciences554895
antyszczurzy CD73BD Biosciences551123
antyszczurzy nestinBD BiosciencesMAB1259
antyszczurzy CD45BD Biosciences554875
Anty-S100 i wersja beta;DakoZ031101
Anty-p75MilliporeMAB5386
Anty-GFAPSigmaaldrichG3893
Anty-klasa III-beta tubulina (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Anty-ludzkie jądraMiliporyMAB1281
Komora hipoksjiBillups-RothenbergMIC-101
HEPES buforSigmaaldrichH4034-100G
PHG0313

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation? J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
  4. Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
  5. Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
  6. Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
  7. Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
  8. Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
  9. Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).
  10. Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
  11. Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
  12. Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
  13. Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Marrow Stromal CellsNeural ProgenitorsSchwann Cell DifferentiationNeurosphere CultureDorsal Root GangliaCo culture TechniqueGlial Induction MediumS100 Beta ExpressionMyelin Segment Formation

Powiązane artykuły